Пептид, обладающий ростостимулирующей активностью фактора роста гепатоцитов (hgf)

Авторы патента:

Голубович Владимир Петрович (BY)

Горанов Виталий Анатольевич (BY)

Коваленко Александр Павлович (RU)

Мельник Ольга Викторовна (BY)

Шутова Ирина Владимировна (BY)

C07K14/475 - факторы роста; регуляторы роста

Владельцы патента RU 2426740:

ИБМЕД ХОЛДИНГС ЛИМИТЕД (CY)

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к пептиду, который обладает ростостимулирующей активностью фактора роста гепатоцитов HGF. Данный пептид имеет общую формулу I: , где X1 представляет собой Q или V; Х2 представляет собой Р; Х3 представляет собой G или (β-А); Х4 представляет собой R или Х4 представляет собой K при X1 - Q или при X1 - V и Х3 - (β-А); Х5 представляет собой G, где G - глицин, (β-А) - β-аланин, Р - пролин, V - валин, Q - глутамин, K - лизин, R - аргинин. Предложенное изобретение позволяет расширить арсенал эффективных терапевтических средств, участвующих в регенерации печени. 4 ил., 1 табл.

Изобретение относится к области биоорганической химии, биохимии и медицины, а именно к биологически активным веществам пептидной природы, обладающим ростостимулирующей активностью фактора роста гепатоцитов, и может найти применение в медицине, ветеринарии, а также в экспериментальной биохимии.

Процесс регенерации печени можно разделить на три фазы: инициацию, пролиферацию и ингибирование. На этапе пролиферации преимущественно функционирует фактор роста гепатоцитов HGF [1], который обеспечивает переход гепатоцитов из G1 в S-фазу. Показано, что фактор роста гепатоцитов HGF участвует в регенерации печени in vivo и является митогеном для гепатоцитов [2]. Фактор роста гепатоцитов ("рассеивающий фактор", scatter factor, SF) представляет собой гликопротеин, состоящий из двух ковалентно связанных субьединиц с молекулярной массой 62 kDa и 34 kDa [3-4].

Заявляемый пептид обладает ростостимулирующей активностью фактора роста гепатоцитов HGF и стимулирует пролиферацию гепатоцитов.

Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала эффективных терапевтических средств, участвующих в регенерации печени.

Основной технический результат, который может быть получен при осуществлении настоящего изобретения, заключается в реализации данного назначения и достигается за счет создания нового синтетического пептида, обладающего ростостимулирующей активностью фактора роста гепатоцитов HGF, общей формулы I:

где Х1 представляет собой Q или V;

Х2 представляет собой Р;

Х3 представляет собой G или β-А;

Х4 представляет собой R или K;

Х5 представляет собой G,

где G - глицин, (β-А) - β-аланин, Р - пролин, V - валин, Q - глутамин, K - лизин, R - аргинин.

Таким образом, выявлено 8 (восемь) последовательностей олигопептидов, которые проявляют активность фактора роста гепатоцитов.

Формула заявляемого пептида была выявлена по результатам компьютерного конструирования участков связывания фактора роста гепатоцитов HGF с рецепторами поверхности стволовых клеток. Компьютерное конструирование участков связывания фактора роста гепатоцитов HGF с его рецептором проводили с помощью программного комплекса, осуществляющего компьютерное моделирование пространственной структуры белковых молекул и дизайн низкомолекулярных соединений, ответственных за биологическую функцию белка.

Нижеследующие чертежи составляют часть описания настоящего изобретения и включены для дополнительной демонстрации некоторых аспектов настоящего изобретения. Настоящее изобретение можно лучше понять путем обращения к одному или нескольким из этих чертежей в сочетании с подробным описанием представленных здесь конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения.

На фиг.1 представлена пространственная структура фактора роста гепатоцитов HGF [5].

На фиг.2 представлена пространственная структура белка фактора роста гепатоцитов HGF с идентифицированным функциональным сайтом (функциональный сайт выделен).

На фиг.3 представлена пространственная структура комплекса HGF/рецептор (PDB ID 1SHY) [6].

На фиг.4 представлена пространственная структура комплекса HGF/рецептор (PDB ID 1SHY) с идентифицированным функциональным сайтом белка Г-КСФ (функциональный сайт выделен).

Пример 1. In silico конструирование функционального сайта HGF на основе пространственной структуры белка HGF.

Для осуществления конструирования функционального сайта HGF использовалась компьютерная программа.

Исходными данными для работы послужили первичные и пространственные структуры белков, импортированные из банка данных Protein Data Bank [7]. В базе данных банка проводили поиск пространственной структуры фактора роста гепатоцитов HGF. В результате для компьютерного конструирования отобрали пространственную структуру фактора роста гепатоцитов HGF [5] (фиг.1).

Далее проводили компьютерное моделирование, которое позволило идентифицировать аминокислотные остатки белка фактора роста гепатоцитов HGF, принимающие участие во взаимодействии фактора роста гепатоцитов HGF с его рецептором (фиг.2). На основе полученных данных спрогнозировали формулу заявляемого пептида.

Пример 2. In silico конструирование функционального сайта фактора роста гепатоцитов HGF на основе пространственной структуры комплекса HGF/рецептор.

Для осуществления конструирования функционального сайта HGF использовалась компьютерная программа.

Исходными данными для работы послужили первичные и пространственные структуры белков, импортированные из банка данных Protein Data Bank [7]. В базе данных банка проводили поиск пространственной структуры комплекса HGF/рецептор. В результате для компьютерного конструирования отобрали пространственную структуру комплекса HGF/рецептор [6] (фиг.3).

Из представленных на фиг.2 и фиг.4 данных, по результатам компьютерного моделирования можно сделать вывод, что заявляемый олигопептид представляет собой функциональный сайт фактора роста гепатоцитов HGF, принимающий участие в связывании с рецепторами на поверхности стволовых клеток и стимулирующий пролиферацию гепатоцитов. Данное соединение может найти применение в медицине и экспериментальной биохимии.

В качестве сведений, подтверждающих возможность осуществления изобретения, исследовано (Пример 3) влияние полипептидного препарата, созданного синтетическим путем, на эксплантаты печени крыс в возрасте 14 суток, полученные в соответствии с методиками, описанными в работах Хавинсона В.Х. и сотр. [8, 9]. Эксперименты проведены на 90 образцах эксплантов тканей. Методика культивирования подробно описана ранее [10].

Пример 3. Исследование биологической активности синтезированных пептидов.

Исследуемые пептиды добавляли в культуральную среду в концентрациях 20 нг/мл. Контролем служили эксплантаты без добавления пептидов в культуральную среду. Чашки Петри с эксплантатами тканей помещали в термостат при температуре 37°C и через 3 суток просматривали в фазово-контрастном микроскопе. Затем определяли индекс площади (ИП), который рассчитывали в условных единицах как соотношение площади всего эксплантата, вместе с зоной выселяющихся клеток, к исходной площади эксплантата. Значения ИП выражали в процентах, контрольное значение ИП принимали за 100%. Достоверность различий ИП в контрольных и опытных образцах оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.

Результаты биологических испытаний выбранных олигопептидов приведены в таблице.

Соединение	QPGRG	QPGKG	VPGRG	VPGKG	QPβ-ARG	QPβ-AKG	VPβ-ARG	VPβ-AKG
Площадь, % к контролю	170	175	150	145	180	185	160	155
Достоверность	*	*	*	*	*	*	*	*
* - Р<0,05 по сравнению с контролем

По результатам проведенных исследований можно сделать вывод о том, что при применении заявляемых пептидов в качестве ростовых факторов возрастает пролиферация клеток гепатоцитов.

Источники информации

1. Michalopoulos G.K., De Frances M.C. Liver regeneration. Science 1997; 276: 60-66.

2. Michalopoulos G.K. Liver regeneration: molecular mechanisms of growth control. // FASEB J., 4, 176-187, 1990. FASEB J. 1990.

3. Gherardi E., Coffer, Purification and characterization of scatter factor. // Cell and Motilty factors, ed. I.D.Goldberg. Birkhauser Verlag, Cell and Motilty factors, ed. I.D.Goldberg. Birkhauser Verlag, Basel, 53-62, 1991.

4. Weidner K.M., Behrens J., Vandekerckhove J., Birchmeier W. Scatter factor: molecular characteristics and effect on the invasiveness of epithelial cells. // J. Cell. Biol., 111, 2097-2108, 1990. J. Cell. Biol. 1990.

5. http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureld=1SI5

6. http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureld=1SHY

7. http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do

8. Хавинсон В.Х., Малинин В.В., Чалисова Н.И., Григорьев Е.И. Тканеспецифическое действие пептидов в культуре тканей крыс разного возраста // "Успехи геронтологии", 2002 г., выпуск 9, Т.3, с.278-285.

9. Хавинсон В.Х. Тканеспецифическое действие пептидов // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2001. - Т.132, N 8. - С.228-229.

10. Хавинсон В.Х., Морозов В.Г., Чалисова Н.И., Окулов В.Б. Влияние пептидов головного мозга на клетки нервной ткани in vitro // Цитология. - 1997. - Т.39, N 7. - С.571-575.

Перечень последовательностей аминокислот (в однобуквенном коде):

1. Q-P-G-R-G

2. Q-P-G-K-G

3. Q-P-(β-A)-R-G

4. Q-P-(β-A)-K-G

5. V-P-G-R-G

6. V-P-G-K-G

7. V-P-(β-A)-R-G

8. V-P-(β-A)-K-G

Пептид, обладающий ростостимулирующей активностью фактора роста гепатоцитов HGF, общей формулы I:
,
где X1 представляет собой Q или V;
Х2 представляет собой Р;
Х3 представляет собой G или (β-А);
Х4 представляет собой R или
Х4 представляет собой K при X1 - Q или при X1 - V и Х3 - (β-А);
Х5 представляет собой G,
где G - глицин, (β-А) - β-аланин, Р - пролин, V - валин, Q - глутамин, K - лизин, R - аргинин.

Похожие патенты:

Варианты бета-цепи hgf // 2403261

Штамм клеток escherichia coli bl21 (pvegf-a165), секретирующих рекомбинантный фактор роста эндотелия сосудов (vegf) // 2395568

Изобретение относится к биотехнологии. .

Способ блокирования сигнального пути, активируемого tgf-beta фактором vgi в клетках животных // 2391352

Изобретение относится к области молекулярной биологии, конкретно к белкам, регулирующим клеточную дифференцировку путем ингибирования белков надсемейства TGF-beta. .

Способ блокирования активности activin с помощью ноггин2 // 2354662

Активная иммунотерапия против ангиогенеза // 2329824

Изобретение относится к области медицины и касается иммунотерапии против ангиогенеза. .

Рилизинг-пептиды ростового гормона // 2323941

Очищенный иммуногенный белок, его фрагменты и производные // 2304585

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии и может быть использовано в медицине в диагностических и лечебных целях. .

Рекомбинантный плацентарный фактор роста и способ его получения // 2295535

Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии и может быть использовано в фармацевтической промышленности и медицине. .

Ингибитор и стимулятор пролиферации стволовой клетки и их использование // 2292352

Антитело к фактору hldf, способ его получения (варианты), пептид с антигенными и нк-гидролизующими свойствами и способ диагностики анапластического состояния клетки человека // 2276672

Изобретение относится к области биохимии, к получению биологически активных веществ, способам их получения, а именно - к получению веществ, обладающих антигенными и иммуноспецифичными свойствами, и к медицине, а именно к способам диагностики анапластического состояния клетки человека, в частности, при онкологических заболеваниях.

Способ очистки раствора тромбина от инфекционных частиц // 2468032

Изобретение относится к области биохимии

Способ блокирования сигнального пути, активируемого фактором wnt8 в клетках животных с помощью белков семейства noggin // 2473561

Изобретение относится к области молекулярной биологии, конкретно, к белкам, регулирующим клеточную дифференцировку путем ингибирования белка семейства Wnt, и может быть использовано в медицине для профилактики и лечения связанных с нарушениями активности Wnt сигнального пути заболеваний, например рака толстой кишки, меланомы, карциномы

Оптимизированный способ очистки рекомбинантного белка фактора роста // 2491290

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу получения очищенного рекомбинантного GDF-5-подобного белка

Слитый белок или пептид с увеличенным временем полужизни in vivo, поддерживаемый за счет замедленного высвобождения in vivo, и способ увеличения времени полужизни in vivo с его применением // 2503688

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к созданию лекарственных препаратов с замедленным высвобождением белковых или пептидных лекарственных средств, и может быть использовано в медицине. Физиологически активный белок или полипептид сливают с вариантом альфа-1-антитрипсина, имеющим по меньшей мере один мутированный аминокислотный остаток. Мутации производят в следующих положениях: остаток аспарагина вместо остатка пролина в положении 357; или остаток аспарагина вместо остатка пролина в положении 357 и остаток треонина вместо серина в положении 359; или остаток аспарагина вместо остатка пролина в положении 357 и остаток серина вместо цистеина в положении 232; или остаток аспарагина вместо остатка пролина в положении 357, остаток треонина вместо серина в положении 359 и остаток серина вместо цистеина в положении 232. Изобретение позволяет увеличить время полужизни физиологически активного белка или полипептида in vivo путем поддержания его устойчивой циркуляции в крови. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 13 ил., 7 пр.

Антитела, содержащие терапевтические пептиды-миметики тро/еро // 2559526

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Предложено терапевтическое антитело и терапевтический фрагмент антитела для повышения продукции тромбоцитов, включающие пептид-миметик тромбопоэтина (ТРО), содержащий последовательность IEGPTLRQWLAARA и встроенный как дополнение к С-концу константной области легкой цепи и/или в положении менее 20 аминокислот ниже С-конца шарнирной области тяжелой цепи. Кроме того, рассмотрена композиция, содержащая антитело или его терапевтически активный фрагмент, и способ повышения продукции тромбоцитов у индивидуума, включающий введение такой композиции, а также нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид антитела, содержащий пептид-миметик ТРО. Данное изобретение обеспечивает более высокую и быструю продукцию тромбоцитов по сравнению с известными конструкциями антитела, где пептид-миметик встроен вместо одного из CDR. 4 н. и 9 з.п. ф-лы, 4 ил., 9 пр.

Способ очистки белка фактора роста // 2571926

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу очистки G-CSF (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор) в последовательности очистки, применяющей хроматографию. Способ включает осуществление по меньшей мере одной хроматографии с использованием многомодальной смолы с отрицательно заряженным лигандом в виде 2-(бензоиламино)бутановой кислоты. G-CSF связывают с многомодальной смолой при pH в интервале 4-6,2. G-CSF элюируют при pH выше 6,3 или элюирующим агентом в элюирующем буфере, где указанный агент включает аминокислоту, имеющую основную боковую цепь и/или высокую ионную силу в элюирующем буфере, выбранную из группы, состоящей из аргинина, лизина и/или гистидина. Концентрация элюирующего агента находится в интервале от примерно 0,1 М до примерно 2,0 М. Предложенное изобретение позволяет получить очищенный G-CSF с высоким выходом. 13 з.п. ф-лы, 14 ил., 10 табл., 11 пр.

Антагонисты неурегулина и применение их в лечении злокачественного новообразования // 2587619

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу увеличения периода времени до рецидива опухоли, и может быть использовано в медицине. Получают антагонисты неурегулина, представляющие собой анти-NRG1 антитело, siPHK или shPHK, нацеленные на NRG1, или иммуноадгезин к NRG1 для введения пациенту, ранее получавшему противораковую терапию, в комбинации с терапевтическим средством, выбранным из паклитаксела, цисплатина или их комбинации для отсрочки времени до рецидива опухоли или предотвращения развития резистентности раковых клеток к лечению терапевтическим агентом. Изобретение позволяет увеличить период времени до рецидива опухоли, что повышает выживаемость пациентов. 9 з.п. ф-лы, 8 ил., 1 табл., 8 пр.

Генетические нуклеотидные последовательности искусственно модифицированного gdnf с делетированной pro-областью, продукт которых обладает повышенными свойствами нейрального индуктора и стимулятора образования нейральных отростков, пригодного для терапии нейральных травм, ишемических инсультов и нейродегенеративных заболеваний, вектор экспрессии, модифицированный gdnf // 2595377

Изобретение относится к области биохимии. Заявлена кДНК природного гена GDNF, искусственно модифицированная удалением pro-области, которая при попадании в клетки или ткани млекопитающих в составе стандартных векторов продуцирует активный специфический GDNF. Кроме того, изобретение относится к вектору экспрессии, содержащему указанную кДНК, а также к активному специфическому GDNF, кодированному указанной кДНК. При трансляции в клетках и тканях указанный GDNF стимулирует нейральную дифференцировку стволовых и прогениторных клеток с образованием нейральных отростков. Изобретение позволяет повысить активность GDNF в качестве нейрального индуктора и стимулятора образования нейральных отростков и может применяться при терапии нейродегенеративных заболеваний, травматических нарушений иннервации, а также ишемических инсультов головного мозга млекопитающих, в том числе человека. 3 н.п. ф-лы, 13 ил., 5 пр.

Рекомбинантный белок мио-гсд, способ его получения, инъекционный препарат для повышения мышечной массы сельскохозяйственных животных, птицы и животных семейства псовых, а также способ использования препарата // 2613420

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для повышения мышечной массы сельскохозяйственных животных, птицы и животных семейства псовых. Получают слитый белок, состоящий из миостатина, Гли-Сер спейсера и глюкансвязывающего домена из альфа-глюкансвязывающего домена гена Streptococcus mutans (Мио-ГСД), который используют для получения инъекционного препарата для подкожных или внутримышечных инъекций в дозе 50-200 мкг указанного белка на один килограмм массы тела животного или птицы. Для получения рекомбинантного белка выращивают клетки штамма Е. coli M15 [рМио-ГСД] - продуцента рекомбинантного белка Мио-ГСД, который получают путем трансформации клеток Е. coli М15 плазмидой рМио-ГСД M15, содержащей нуклеотидную последовательность гена, кодирующего Мио-ГСД, затем связывают белок Мио-ГСД по п.1 в составе клеточных экстрактов штамма Е. coli M15 [рМио-ГСД] с альфа-гликансодержащим сорбентом за счет аффинного взаимодействия при процедуре инкубации, с последующей отмывкой от несвязавшихся бактериальных белков и выделением целевого продукта. Изобретение позволяет эффективно индуцировать синтез специфических аутоантител к миостатину, блокировать его действие и, как следствие, стимулировать рост мышечной ткани. 4 н.п. ф-лы, 7 табл., 6 пр.

Пептиды ledgf и их композиции для лечения дегенеративных заболеваний // 2617964

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению фрагментов полноразмерного фактора роста эпителия хрусталика глаза (LEDGF), и может быть использовано в медицине. Получают фрагмент LEDGF с SEQ ID NO: 2, который используют в фармацевтических композициях для лечения заболеваний, связанных с агрегацией белка. Изобретение позволяет эффективно лечить заболевания, связанные с агрегацией белка, в частности глазные заболевания. 4 н. и 11 з.п. ф-лы, 31 ил.