Способ моделирования и исследования последствий сахарного диабета "in vitro"

Изобретение относится к области медицины, а именно к неврологии и эндокринологии. Для моделирования и исследования последствий сахарного диабета in vitro воздействуют раствором D-глюкозы в разных высоких концентрациях от 6,0 до 25,0 мМ в течение 30 мин на переживающие нервные клетки мозга. Определяют параметры биоэлектрической активности подготовленных переживающих нервных клеток при моделировании сахарного диабета до и после воздействия D-глюкозы. Предварительно инкубируют переживающие срезы в растворе D-глюкозы с концентрацией 5,5 мМ в течение 15 мин, регистрируют параметры вызванной биоэлектрической активности. Затем сопоставляя параметры клеток до и после инкубации концентрацией от 6,0 до 25,0 мМ D-глюкозы, определяют степень их повреждения. Способ позволяет проследить in vitro динамику изменения электрогенеза в переживающих срезах мозга при моделировании сахарного диабета на разных этапах развития, изучить отдаленные последствия диабетической нейропатии и проводить скрининг фармакологических препаратов для защиты нервных клеток при развитии сахарного диабета. 2 табл.

 

Изобретение относится к медицине, неврологии и эндокринологии.

Известны способы моделирования сахарного диабета многократным введением целым животным аллоксана, стрептозотоцина, флуридзина (1, 2, 4), а также воздействием высокой концентрации глюкозы на клетки в культуре нервных клеток in vitro (5-10).

Аналогом является способ моделирования и исследования последствий геморрагического инсульта (3). Способ заключается в том, что на нервные клетки переживающих срезов воздействуют инкубационным раствором с аутокровью. Регистрируют вызванную биоэлектрическую активность до и после воздействия, в результате получают модель геморрагического инсульта. В качестве другого аналога принят способ, предложенный в работе Salameh A. (7). В нем использовано влияние высокой концентрации D-глюкозы (20,0 мМ) на структурные изменения ненервных (эндотелиальных) несвязанные между собой клеток. Недостатки обоих аналогов при их применении проявляются в том, что они не отражают возникновение, динамику развития, а также механизмы электрогенеза, наиболее подверженные воздействию высоких доз D-глюкозы, т.е. они мало информативны при изучении диабетической нейропатии.

Известно, что нервные структуры наиболее подвержены необратимым изменениям при развитии сахарного диабета, а глюкоза в высокой концентрации обладает токсическим действием на нервные клетки.

Задачей настоящего изобретения является создание надежной и воспроизводимой модели сахарного диабета in vitro для исследования молекулярно-клеточных механизмов его последствий, возникающих в нервной ткани.

Сущность предложенного способа моделирования и исследования последствий сахарного диабета заключается в том, что нервные клетки переживающих срезов мозга инкубируют раствором D-глюкозы с нормальной физиологической концентрацией 5,5 мМ в течение 15 мин, а затем воздействуют на них раствором D-глюкозы с высокой концентрацией от 6,0 до 25,0 мМ в течение 30 мин. Регистрируют параметры вызванной биоэлектрической активности клеток в нервных структурах до и после воздействия на них высокой концентрации D-глюкозы. Сопоставляя параметры активности клеток до и при воздействиях D-глюкозы, определяют степень их повреждения.

Пример

Готовят растворы D-глюкозы 5,5 мМ концентрации и 6,0 мМ концентрации. Помещают приготовленные срезы на 15 мин в 5,5 мМ раствор D-глюкозы, регистрируют фокальные потенциалы (ФП): АМПА - (α-амино-3-гидрокси-5-метилиоксазол-4-пропионовая кислота) - первый ответный суммарный активирующий потенциал компактной группы нейронов и от рецептора НМДА-(N-метил-D-аспартат) - последующий после АМПА ответный активирующий потенциал группы нейронов, потенциал действия (ПД) и тормозный постсинаптический потенциал (ТПСПм) для определения последствий биологического активного воздействия растворов D-глюкозы на клетки в нервной ткани. Затем помещают срезы на 30 мин в 6,0 мМ раствор D-глюкозы и регистрируют ФП. Результаты измерений представлены в таблице 1.

Таблица 1
Параметры ФП в переживающих срезах обонятельной коры мозга крыс до и после их инкубации в растворе с высокой концентрацией D-глюкозы 6,0 мМ в течение 30 мин
Параметры ФП	Параметры после 15-мин предварительной инкубации в растворе с нормальной концентрацией D-глюкозы 5,5мМ (мкВ)	Параметры после 30-мин последующей инкубации в растворе с концентрацией D-глюкозы 6,0 мМ (мкВ)
ПД ЛОТ	280	266
АМПА ВПСП	240	194
НМДА ВПСП	90	52
ТПСПм	30	15

Как видно из представленных данных в Таблице 1, D-глюкоза воздействует одинаковым образом на отдельные механизмы электрогенеза нервных клеток срезов: снижение амплитуды всех механизмов электрогенеза. Так, пресинаптические процессы, оцениваемые по величине ПД ЛОТ, снижаются на 5% по сравнению с исходным. Постсинаптические (АМПА и НМДА ВПСП), в отличие от пресинаптических процессов, угнетаются значительнее. Депрессия амплитуды АМПА ВПСП составляет 20% по сравнению с исходным. Активность НМДА ВПСП падала на 42%. Активность ТПСПм снижалась на 50%.

Под действием D-глюкозы в концентрации, превышающей нормальную физиологическую концентрацию на клетки срезов, их активность угнетается.

Как видно из Таблицы 2, D-глюкоза в "диабетической" концентрации воздействует одинаковым образом на отдельные механизмы электрогенеза нервных клеток срезов. Проявляется выраженная депрессия возбуждающих механизмов электрогенеза (ПД ЛОТ, АМПА). Активность возбуждающих НМДА-зависимых механизмов (НМДА ВПСП) и тормозных механизмов (ТПСПм, ГАМК-эргические) блокируется.

Во всех протестированных по предлагаемому способу в срезах получали стабильные результаты, что свидетельствует о высоком 100% уровне надёжности и воспроизводимости предложенной модели. Во всех срезах развивались признаки депрессии биоэлектрической активности, сопровождающие развитие сахарного диабета. Проведенные исследования позволяют проследить динамику развития депрессии и последующей блокады отдельных механизмов биоэлектрической активности в мозге in vitro при сахарном диабете. Способ позволяет осуществить поиск и оценку эффективности препаратов для защиты активности механизмов электрогенеза, наиболее подверженных действию высокой концентрации D-глюкозы.

Технический эффект в том, что способ позволяет проследить in vitro динамику изменения электрогенеза на начальных этапах развития сахарного диабета, а также изучать отдаленные последствия диабетической нейропатии: развитие депрессии и последующей блокады отдельных возбуждающих и тормозных механизмов биоэлектрической активности в мозге. Способ дает возможность провести скрининг фармакологических препаратов для защиты нервных клеток при сахарном диабете.

Способ моделирования и исследования последствий сахарного диабета in vitro путем воздействия раствором D-глюкозы в разных высоких концентрациях от 6,0 до 25,0 мМ в течение 30 мин и определения параметров биоэлектрической активности подготовленных переживающих нервных клеток при моделировании сахарного диабета до и после воздействия D-глюкозы, отличающийся тем, что
- предварительно инкубируют переживающие срезы нервных клеток мозга в растворе D-глюкозы с концентрацией 5,5 мМ в течение 15 мин,
- регистрируют параметры вызванной биоэлектрической активности, затем
- сопоставляя параметры клеток до и после инкубации концентрацией от 6,0 до 25,0 мМ D-глюкозы определяют степень их повреждения.