Способ моделирования инфицированной кожной раны
Владельцы патента RU 2431890:
Учреждение Российской академии медицинских наук Научный центр реконструктивной и восстановительной хирургии Сибирского отделения РАМН (НЦРВХ СО РАМН) (RU)
Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной хирургии и патофизиологии. Для этого иссекают кожный покров с последующим подшиванием краев раны к подлежащим тканям. При этом каждый угол раны дополнительно прошивают отдельным диагональным швом. Образовавшийся струп и некротизированные ткани иссекают в пределах здоровых тканей. Затем рану обрабатывают антисептиком и промывают физиологическим раствором. После этого на обработанную поверхность раны под угловые диагональные швы устанавливают полупроницаемую мембрану, под которую вводят бактериальную взвесь, содержащую 0,5 мл E.coli 109 и 0,5 мл Ps.aeraginosa 109. Способ обеспечивает получение модели инфицированной кожной раны с заданной бактериальной обсемененностью, по своим характеристикам максимально приближенной к реальному клиническому течению раневого процесса. 3 табл., 7 ил.
Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной хирургии и патофизиологии.
Известны различные способы моделирования гнойных ран. Так известен способ моделирования инфицированной раны мягких тканей. Для этого половозрелым кроликам (массой 3-4 кг) на спину накладывают пластину, внутри которой выполнено отверстие диаметром 2,0 см. Под общим обезболиванием в отверстие вытягивают шкуру в виде конуса высотой 0,9-1,1 см и его иссекают. Очаг некроза формируют наложением на рану на 3-5 секунд марлевого тампона, смоченного в 70% растворе уксусной кислоты. Через 3-5 суток некротический струп удаляют. Затем рану орошают культурой St.aureus в концентрации 5×105 КОЕ (Способ моделирования инфицированной раны мягких тканей /Суховей Ю.Г., Цирятьева С.Б., Минин А.С., Самусев Р.С., Сыч А.С., Костоломова Е.Г. // патент РФ №2321898 от 10.04.2008 г., опубл. Бюл. №1).
К недостаткам данного способа следует отнести получение модели раны, имеющей смешанный характер повреждения, т.е. химический ожог с бактериальной обсемененностью. Кроме этого к недостаткам известного способа следует также отнести и раннее закрытие раневой поверхности, за счет отсутствия фиксации краев раны. Указанные недостатки не позволяют стандартизировать течение и процесс заживления раны.
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ моделирования инфицированной кожно-мышечной раны, включающий иссечение кожного покрова, удаление струпа через 3-е суток после нанесения кожного дефекта и введение бактериальной взвеси в рану.
Известный способ осуществляют следующим образом. На спине лабораторного животного (крысы) иссекают участок кожи размером 2×2 см. Для образования грануляционной ткани кожный дефект оставляют без повязки - «под корочкой». Через 3-е суток корочку удаляют, дно раны надсекают лезвием, после чего в рану вносят 1 млрд микробных тел суточной культуры St.aureus. На рану с инфектом накладывают окклюзирующую повязку (Иммунногистохимическое изучение гнойных ран у крыс после аппликации коллагеназы краба / И.Ю.Сахаров, Б.М.Шехонин, С.П.Глянцев, Ф.Е.Литвин // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1993, - №4, - с.267).
К недостаткам известного способа следует отнести:
- невозможность получения «стандартной» раны, необходимой для изучения течения и процессов заживления раны под воздействием антибактериальных препаратов;
- невозможность динамического контроля за количественным содержанием штаммов инфекта, внесенного в рану;
- присоединение инфекции, так как перед внесением инфекта рана инфицирована, как собственной микрофлорой, так и микрофлорой окружающей среды;
- неконтролируемая глубина поражения, за счет выполнения насечек дна раны лезвием;
- неконтролируемая площадь раны, за счет отсутствия фиксации краев раны.
Следовательно, известный способ не позволяет получить модель инфицированной кожной раны с контролируемым микробным пейзажем и контролируемой площадью и глубиной раны.
Задачей заявляемого изобретения является разработка способа моделирования инфицированной кожной раны с заданным микробным пейзажем, а также с контролируемой глубиной и площадью повреждения.
Техническим результатом предлагаемого способа является обеспечение возможности получения инфицированной кожной раны с заданной бактериальной обсемененностью раны, а также обеспечение контролируемой глубины и площади поражения раны.
Технический результат достигается тем, что способ моделирования инфицированной кожной раны включает иссечение кожного покрова, удаление струпа и введение инфекта в рану.
Отличительными приемами предлагаемого способа являются:
- подшивание краев раны к подлежащим тканям после иссечения кожного покрова,
- каждый угол раны дополнительно прошивают отдельным диагональным швом,
- иссечение струпа и некротизированных тканей в пределах здоровых тканей,
- обработка раны антисептиком с последующим промыванием ее физиологическим раствором,
- закрытие обработанной поверхности раны полупроницаемой мембраной, концы которой вставляют под угловые диагональные швы,
- введение под полупроницаемую мембрану бактериальной взвеси, содержащей 0,5 мл E.coli 109 и 0,5 мл Ps.aeraginosa 109.
Проведенный сопоставительный анализ с прототипом показал, что предлагаемый способ отличается от известного вышеперечисленными приемами и, следовательно, соответствует критерию изобретения «новизна».
Сравнение заявляемого технического решения не только с прототипом, но и другими техническими решениями в экспериментальной медицине не позволило выявить в них признаки, отличающие заявленное решение от прототипа.
Использование вышеперечисленных приемов заявляемого способа позволяет получить модель инфицированной кожной раны с заданным микробным пейзажем, а также с контролируемой глубиной и площадью повреждения.
Так, фиксация краев раны путем их подшивания к подлежащим тканям позволяет предупредить преждевременное стягивание краев раны, что дает возможность «стандартизировать» площадь раны, независимо от индивидуальных особенностей процесса заживления у экспериментального животного, а также оценить воздействие изучаемого препарата.
Иссечение струпа и некротизированных тканей в пределах здоровых тканей обеспечивает контролируемую глубину и площадь повреждения.
Обработка раны антисептиком, после удаления некротизированных тканей, позволяет исключить развитие в ране как собственной микрофлоры животного, так и микрофлоры окружающей среды. Этим приемом создаются оптимальные условия для развития микрофлоры внесенного инфекта - госпитальных штаммов E.coli и Ps.aeraginosa.
Последующее промывание физиологическим раствором позволяет исключить негативное влияние оставшегося в ране антисептика на вносимую микрофлору.
Введение и размещение в ране полупроницаемой мембраны (для мембранно-сорбирующих дренажных комплексов) предупреждает вытекание бактериальной взвеси из раны, исключает загрязнение раны в раннем послеоперационном периоде и создает оптимальные условия для развития внесенной микрофлоры.
Введение бактериальной суспензии, содержащей микробные культуры E.coli 109 и Ps.aeraginosa 109 по 0,5 мл каждой, под полупроницаемую мембрану создает оптимальные условия для развития внесенного инфекта в раннем послеоперационном периоде. Кроме этого полупроницаемая мембрана препятствует попаданию в рану микрофлоры окружающей среды. Использование культур E.coli и Ps.aeraginosa обусловлено их распространенностью в гнойных ранах.
При анализе известных способов моделирования гнойных ран было выявлено в них отсутствие сведений о влиянии отличительных признаков заявляемого способа на достижение технического результата. Изложенное позволяет установить соответствие критерию «изобретательский уровень».
Способ, составляющий заявляемое изобретение, предназначен для использования в экспериментальной медицине. Возможность его осуществления подтверждена описанными в заявке приемами и средствами. Из вышеизложенного следует, что заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности «промышленная применимость».
Заявляемый способ осуществляют следующим образом. Экспериментальному животному - крысе под общим обезболиванием проводят иссечение кожного лоскута 2×2 см (фиг.1). По квадрату дефекта края раны подшивают непрерывным швом к подлежащим тканям (атравматикой 4/0) (фиг.2). При этом каждый угол раны дополнительно прошивают отдельным диагональным швом.
Через 3-е суток под общим обезболиванием выполняют иссечение струпа и некротизированных тканей в пределах здоровых тканей (фиг.3). Санацию раны проводят раствором антисептика (0,02% «Анавидин»), промывают физиологическим раствором, после чего на обработанную поверхность раны с размещением под угловые диагональные швы устанавливают полупроницаемую мембрану для мембранно-сорбирующих дренажных комплексов. Под полупроницаемую мембрану вводят бактериальную суспензию, содержащую 0,5 мл E.coli 109 и 0,5 мл Ps.aeraginosa
109 (фиг.4).
Предлагаемый способ поясняется примером конкретного выполнения.
Исследование проводилось на белых крысах-самцах породы «Вистар» 6-месячного возраста с массой тела 200-250 г. Животных содержали в условиях вивария при свободном доступе к воде и пище, что соответствует нормативам ГОСТа «Содержание экспериментальных животных в питомниках НИИ» (виварий I категории, вет. удостоверение 238 №0015220 от 25 марта 2009 г., служба ветеринарии Иркутской области). Опыты на животных выполняли в соответствии с правилами гуманного обращения с животными, регламентированными «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденными Приказом МЗ СССР №742 от 13.11.84 г. «Об утверждении правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» и №48 от 23.01.85 г. «О контроле за проведением работ с использованием экспериментальных животных». Все оперативные вмешательства проводили в стерильных условиях под общим обезболиванием.
В асептических условиях и под общей анестезией животное фиксировали на столике А.И.Сеченова в положении на животе. После подготовки операционного поля в области спины выполняли иссечение кожи и подкожно-жировой клетчатки площадью 4 см2. Края раны подшивали к подлежащим тканям атравматичной иглой с рассасывающейся лигатурой 4/0, с шагом 5 мм. Дополнительно каждый угол раны был прошит отдельным диагональным швом.
У каждого животного основной группы, состоящей из 40 животных, через 3-е суток иссекали струп и некротизированные ткани. Иссечение некротизированных тканей проводили в пределах здоровых тканей, на глубину 0,3 см. Каждому животному этой группы рану обрабатывали антисептиком «Анавидин», после чего промывали физиологическим раствором. Затем в рану устанавливали полупроницаемую мембрану (для дренажных композиций). Фиксация полупроницаемой мембраны на ране достигалась размещением ее углов под угловыми диагональными швами. Под полупроницаемую мембрану, т.е. в рану, вносили 1 мл суточной бактериальной взвеси, содержащей 0,5 мл E.coli 109 КОЕ/мли 0,5 мл P.aeruginosa 109 КОЕ/мл.
Контрольную группу составили животные, которым моделирование раны проводили по способу-прототипу. Количество животных в этой группе равнялось 10.
Отправной точкой эксперимента по суткам во всех группах было принято время инфицирования раны.
У всех животных основной и контрольной групп изучали микрофлору ран, площадь раневой поверхности, морфологические изменения в ране в динамике эксперимента на 1, 3, 7, 9, 11, 19 сутки.
Клиническая картина ран в обеих группах животных на 1-е сутки была одинаковой. Раны характеризовались подрытыми, рубцово-фибринозными краями, вялыми и тусклыми грануляциями, очагами некротических изменений.
Динамика микробной обсемененности инфицированной раны животных основной группы представлена в таблице 1 (Lg КОЕ/см2, медиана и квартили).
У всех животных основной группы на 1-е сутки была выявлена высокая микробная обсемененность ран ассоциацией внесенной микробной флоры с ростом более 107 КОЕ (E.Coli+P. Aeruginosa), с преобладанием Р. aeruginosa.
| Таблица 1 | |||||||
| Сутки исследования | |||||||
| 3 | 5 | 7 | 9 | 11 | 19 | ||
| Lg КОЕ | 7,0• •• | 5,5∗ | 5,0∗ | 5,5 | 5,5∗ | 4,0∗ | 4,0∗• •• |
| (7,0-7,0) | (5,0-6,0) | (4,0-5,0) | (4,0-6,0) | (4,0-6,0) | (3,0-5,0) | (4,0-4,0) | |
| Примечание ∗ - значимые различия по критерию Вилкоксона по сравнению с показателем в группе на 1 сутки (pw≤0,05); | |||||||
| • - по сравнению с показателем в группе на 3 сутки (pw≤0,05), | |||||||
| •• - по сравнению с показателем в группе на 5 сутки (pw≤0,05). |
Через 3-е суток отмечены положительные клинические изменения, заключающиеся в отторжении части некротических очагов, в усилении роста островков здоровой грануляционной ткани. При контрольном микробиологическом исследовании уровень обсемененности оставался высоким 105-6 КОЕ (E.Coli и P.aeruginosa), с преобладанием P. Aeruginosa, но был существенно ниже по сравнению с 1-ми сутками (Pw=0,007).
Выявленный уровень микробной обсемененности сохранялся без изменений до 11-х суток. Существенное снижение зарегистрировано к 19-м суткам (Pw=0,0002).
Оценку течения заживления ран проводили по двум критериям: по сроку начала эпителизации (в сутках) и по времени полузаживления - уменьшение площади раны в 2 раза (в сутках). Измерение площади раны проводили взвешиванием бумажного шаблона на торсионных весах. Результаты приведены в таблице 2.
| Таблица 2 | |
| Оцененный показатель | |
| Сроки начала эпителизации в сутках | 14,3 (14,0-15,0) |
| Время полузаживления (уменьшение площади раны в 2 раза) в сутках | 13 (12-15) |
При морфологическом исследовании животных основной группы в области раны на 1-е сутки выявлено: поверхностно колонии микробов, некротизированная ткань, лейкоциты, дейтрит, фибрин (Фиг.5, позиция 1). В подлежащей ткани: отек, плазматическое пропитывание, диффузно распределенные лейкоциты в подлежащей соединительной ткани (Фиг.5, позиция 2).
К 19-м суткам в области раны поверхностно расположен струп из клеточного дейтрита (Фиг.6, позиция 3). Под струпом новообразованная соединительная ткань с фибробластами и фиброцитами (Фиг.6, позиция 4). Рана поверхностная с морфологией заживления раны к 19-м суткам под струпом.
Динамика микробного пейзажа инфицированной раны кожи животных контрольной группы представлена в таблице 3 (Lg КОЕ/см2, медиана и квартили).
При оценке микрофлоры ран контрольных животных, кроме внесенной микрофлоры (St.aureus), было выявлено наличие дополнительных штаммов микроорганизмов.
| Таблица 3 | |
| Вид возбудителя | КОЕ |
| Proteus | 105 |
| Staphylococcus epidermidis | 5×104 |
| Staphylococcus aureus | 5×104 |
| Candida | 5×105 |
| Klebsiella oxytoca | 5×105 |
| Enterococcus faecalis | 5×105 |
| Escherichia coli | 5×106 |
| Pseodomonas aerug. | 5×106 |
Присоединение посторонней микрофлоры затрудняет динамическое и количественное исследование микробной обсемененности раны внесенным штаммом.
При морфологическом исследовании инфицированных ран контрольных животных на 1-е сутки поверхностно в области раны выявлено: колонии микробов, некротизированная ткань, лейкоциты, дейтрит, фибрин (Фиг.7, позиция 1). Апоневроз (Фиг.7, позиция 2) в подлежащей ткани, между апоневрозом и прилежащими волокнами скелетной мышцы отек, плазматическое пропитывание и умеренная лейкоцитарная инфильтрация. Рана стратефицирована, апоневроз отделяет воспаление поверхностных и глубоких отделов тканей до мышечного слоя. При морфологической оценке препаратов этой группы обнаружены микроабсцессы как поверхностные, так и в глубоких отделах тканей до мышц, в зоне насечек нанесенных скальпелем на дно раны. Все полученные данные подтверждают невозможность контроля глубины и площади поражения.
Анализ бактериологического и морфологического исследований подтвердил возможность получения модели инфицированной кожной раны с заданными параметрами.
Таким образом, предложенный способ позволяет получить модель инфицированной кожной раны, по своим характеристикам максимально приближенную к реальному клиническому течению раневого процесса. Воспроизводимость модели составляет 100%.
Модель может быть использована в хроническом эксперименте для получения инфицированной кожной раны с контролируемыми параметрами, включающими как бактериальную обсемененность раны, так и глубину и площадь повреждения.
Способ моделирования инфицированной кожной раны, включающий иссечение кожного покрова, удаление струпа и введение инфекта в рану, отличающийся тем, что после иссечения кожного покрова края раны подшивают к подлежащим тканям, при этом каждый угол раны дополнительно прошивают отдельным диагональным швом, образовавшийся струп и некротизированные ткани иссекают в пределах здоровых тканей, затем рану обрабатывают антисептиком и промывают физиологическим раствором, после чего на обработанную поверхность раны под угловые диагональные швы устанавливают полупроницаемую мембрану, под которую вводят бактериальную взвесь, содержащую 0,5 мл E.coli 109 и 0,5 мл Ps.aeraginosa 109.
