Способ прогнозирования площади миоматозных узлов при миоме матки

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и может быть использовано для определении тактики ведения больной с миомой матки. Способ включает выделение ДНК из периферической венозной крови, анализ генотипов локуса - 322 VNTR рецептора фактора некроза опухоли 2 типа. При выявлении генотипа 2/2-322 VNTR TNFR2 - прогнозируют небольшую площадь миоматозных узлов. При выявлении генотипов 1/1-322 VNTR TNFR2 или 2/1-322 VNTR TNFR2 прогнозируют большую площадь миоматозных узлов. Использование изобретения позволяет получить критерии оценки площади миоматозных узлов определелить тактику и индивидуализировать лечение на основании полученных данных. 2 табл.

 

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для определении тактики ведения больной с миомой матки.

Основная задача молекулярно-генетического типирования гена фактора некроза опухоли 2 типа - это определение единичной нуклеотидной замены в гене, которая вызывает изменение уровня продукции рецептора фактора некроза опухоли 2 типа, что может влиять на развитие опухолевого процесса при миоме матки.

Мультафакториальные заболевания (МФЗ), являясь наиболее распространенной группой болезней в структуре всей патологии человека (на их долю приходится до 90% всех заболеваний человека), находятся в центре постоянного внимания генетиков, служат предметом многочисленных генетических исследований, проводимых как зарубежом [1, 2, 3], так и в нашей стране [4, 5, 6, 7, 8, 9].

Развитие технологий генетического картирования мультифакториальных заболеваний, построение подробной генетической карты человека в результате успешной реализации международной программы «Геном человека», активное использование в исследованиях современных методов анализа ДНК-полиморфизма, разработка математических и компьютерных методов и моделей позволили начать систематическое картирование генов, ответственных за сложнонаследуемые (мультифакториальные) заболевания и признаки [10].

Одним из самых распространенных в гинекологической практике мультифакториальных заболеваний является миома матки. Ее рассматривают как доброкачественную, гормонально контролируемую гиперплазию мышечных элементов мезенхимального происхождения. По различным оценкам, она возникает у каждой второй-четвертой женщины в течение репродуктивного периода.

Следует отметить значительную вариабельность размеров миоматозных узлов: от совсем небольшого уплотнения, которое можно зафиксировать только с помощью ультразвукового исследования матки, до большой опухоли, весящей около килограмма и легко прощупывающейся при пальпаторном обследовании живота у гинеколога. Размеры миоматозных узлов имеют важное значение при определении тактики ведения больной с миомой матки: при больших размерах узлов, как правило, проводится оперативное лечение, из которых от 60% до 95% приходится на радикальные операции, т.е. около 1 млн женщин ежегодно подвергаются удалению матки по поводу миомы и процент операций в среднем не уменьшается.

Проблема изучения этиопатогенеза миомы матки и факторов его определяющих продолжает оставаться в центре внимания отечественных и зарубежных исследователей [11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18].

Несмотря на значительный прогресс, сделанный в последние десятилетия в этом направлении [19, 20] и многочисленные гипотезы, объясняющие возникновение и течение миомы матки, ряд ключевых положений генеза этого заболевания до настоящего времени остаются дискуссионными и недостаточно изученными, что затрудняет разработку новых органосохраняющих методов лечения данной патологии [21].

В последнее время накапливается все больше данных, свидетельствующих о том, что полиморфизм единичных нуклеотидов вследствие формирования специфических аллелей генов вносит важный вклад в предрасположенность к ряду заболеваний. Знание их роли в патогенезе многих заболеваний наряду с достижениями современной геномики позволяет, с одной стороны, прогнозировать риск развития патологии или тяжесть ее протекания, с другой стороны, разработать подходы к терапии. В отношении миомы матки изучено несколько генов, полиморфизм которых ассоциирован с повышенным риском развития заболевания в различных популяциях.

В конечном итоге характер роста опухоли определяется динамическим балансом между пролиферацией клеток и клеточной гибелью. Индукторами апоптоза являются факторы некроза опухоли - TNFα и Ltα. Связывание факторов некроза опухоли с рецепторами апоптоза активирует интрацеллюлярные "домены смерти" (DED - death effector domain) этих рецепторов: DED, DED1 и DED2 и ряд посредников. В регуляции пролиферативной активности клеток задействованы рецепторы фактора некроза опухоли 2 типа. TNFR2 не содержит «доменов смерти» и, вследствие этого, данный тип рецепторов преимущественно вовлечен в регуляцию экспрессии генов, ответственных за рост и дифференцировку клеток. Ген TNFR2 локализуется на 1 хромосоме в регионе р36.2. В изучаемом гене выявлен полиморфизм за счет микросателлитов (variable number tandem repeat - VNTR) [22].

В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе не было обнаружено способа прогнозирования площади миоматозных узлов при миоме матки на основе данных о генотипах - 322 VNTR полиморфизма рецептора фактора некроза опухоли 2 типа, т.к. исследования роли различных генотипов рецептора фактора некроза опухоли 2 типа в отношении миомы матки до сих пор не проведены.

Задачей изобретения является разработка способа прогнозирования площади миоматозных узлов при миоме матки на основе данных о генотипах - 322 VNTR полиморфизма рецептора фактора некроза опухоли 2 типа.

Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки площади миоматозных узлов, позволяющих в кратчайшие сроки определить тактику ведения больной с миомой матки: при прогностически небольших размерах миоматозных узлов осуществлять консервативное наблюдение с применением гормональных препаратов, при прогнозировании больших размеров миоматозных узлов - проведение своевременного оперативного органосохраняющего лечения в виде консервативной миомэктомии или эмболизации маточной артерии.

В соответствии с поставленной задачей был разработан способ прогнозирования площади миоматозных узлов при миоме матки, включающий:

1) выделение ДНК из периферической венозной крови;

2) анализ генотипов локуса - 322 VNTR рецептора фактора некроза опухоли 2 типа;

3) прогнозирование площади миоматозных узлов при выявлении генотипов 1/1, 2/1 или 2/2-322 VNTR TNFR2.

Например, при выявлении генотипа 2/2-322 VNTR TNFR2 прогнозируют небольшие размеры миоматозных узлов, что позволяет осуществлять консервативное наблюдение с применением гормональных препаратов. Выявление генотипов 1/1 или 2/1-322 VNTR TNFR2, позволяет прогнозировать большие размеры миоматозных узлов и своевременно проводить оперативное лечение в виде консервативной миомэктомии или эмболизации маточной артерии с максимальным сохранением самого органа.

Таким образом, осуществление предполагаемого изобретения позволяет разработать индивидуальную тактику ведения больной.

Новизна и изобретательский уровень заключается в том, что из уровня техники не известна возможность прогнозирования площади миоматозных узлов по наличию определенных генотипов локуса - 322 VNTR рецептора фактора некроза опухоли 2 типа.

Способ характеризуется следующими графическими материалами.

На Фиг.1 представлены результаты электрофоретического разделения продуктов амплификации локуса - 322 VNTR TNFR2, где

- 1, 3 - гомозиготы 1/1;

- 2, 5, 8, 10, 11 - гетерозиготы 1/2;

- 4, 6, 7, 9 - гомозиготы 2/2.

Способ осуществляют следующим образом.

На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl₂, 10 мМ трис-HCl (рН 7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4°С, 4000 об/мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН 8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37°С в течение 16 часов.

На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -20°С.

Анализ всех локусов осуществляют методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК на амплификаторе «Терцик-МС4» производства компании "ДНК-технология" с использованием ДНК-полимеразы Thermus aquaticus производства фирмы "Силекс-М" и олигонуклеотидных праймеров, синтезированных фирмой «Синтол» (таблица 1).

Таблица 1
Структура праймеров и зондов, используемых для генотипирования исследуемого ДНК-маркера методами ПЦР
Ген	Полиморфизм и его локализация в гене	Структура праймеров	Литература
TNFR2	-322VNTR (промотор)	F: 5'-CAGGGAAGCCTGTGGGAG-3' R: 5'-GGCCTTGGACACGCCT-3'	(Sainz J. et al., 2007)

Анализ VNTR полиморфизма гена TNFR2 проводят методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров. Реакцию проводят в 12,5 мкл общего объема смеси, содержащей 33,5 мМ трис-HCl (рН 8,8), 1,25 мМ MgCl₂, 0,5 мкг геномной ДНК, по 5 пМ каждого праймера, по 100 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации (5 мин при 94°С) выполняют 35 циклов амплификации по схеме: денатурация - 30 сек при 94°С; отжиг праймеров - 30 сек при 59°С; элонгация - 30 сек при 72°С. Затем пробы выдерживают 5 мин при 72°С и охлаждают. Продукты амплификации анализируют в 3%-ном агарозном геле, окрашенным бромистым этидием, в течение 40 минут при 150V. В качестве электрофорезного буфера используют 1xTAE (трис-ацетатный буфер). Затем пробы идентифицируют в проходящем УФ-свете. Определяют фрагменты ДНК длиной 208-223 п.н. Генотипу 1/1 соответствуют фрагменты ДНК длиной 208 п.н., генотипу 2/2 - 223 п.н. и генотипу 1/2 фрагменты длиной 208 и 223 п.н.

При выявлении генотипа 2/2-322 VNTR TNFR2 прогнозируют небольшие размеры миоматозных узлов, что позволяет осуществлять консервативное наблюдение с применением гормональных препаратов. Выявление генотипов 1/1 или 2/1-322 VNTR TNFR2, позволяет прогнозировать большие размеры миоматозных узлов и своевременно проводить оперативное лечение в виде консервативной миомэктомии или эмболизации маточной артерии с максимальным сохранением самого органа.

Достоверность и промышленную применимость заявленного технического решения подтверждают результатов наблюдений 240 женщин с миомой матки. Пациенты включались в группу обследования только после установления диагноза заболевания, подтвержденного с помощью клинических и лабораторно-инструментальных методов обследования.

При изучении площади (см²) миоматозных узлов в зависимости от генотипов локуса - 322 VNTR рецептора фактора некроза опухоли 2 типа (TNFR2), установлено, что параметры распределения этого количественного признака в исследуемой группе пациенток не соответствуют закону нормального распределения, о чем свидетельствуют значения критерия Шапиро-Уилка W=0,63 с уровнем их статистической значимости р<0,001. Поэтому для сравнительного анализа площади миоматозных узлов у пациенток с разными генотипами по изучаемым молекулярно-генетическим маркерам использовали медиану (M_e) и интерквартильный размах (Q25-Q75) (Реброва О.Ю., 2006). Полученные результаты показали, что у женщин с миомой медиана площади миоматозных узлов равна 107,55 см² (нижний квартиль Q25 - 50,63 см², верхний квартиль Q75 - 176,63 см²).

Выявлено, что женщины с миомой матки, имеющие генотипы 1/1 или 2/1-322 VNTR полиморфизма TNFR2 имеют достоверно (р=0,047) на 20,66% большую площадь миоматозных узлов (медиана равна 114,61 см²) по сравнению с пациентками с генотипом 2/2, у которых данный показатель составляет 94,98 см² (таблица 2).

Таблица 2
Ассоциации полиморфизма - 322 VNTR TNFR2 с площадью миоматознь при миоме матки, Me (Q25-Q75)
Генотипы	Площадь миоматозных узлов, см2
2/2	94,98 (50,24-176,63)
2/1 и 1/1	114,61 (63,58-176,62)
р	0,047

Приведенный пример подтверждает, что поставленная задача - разработка способа прогнозирования площади миоматозных узлов у женщин с миомой матки на основе данных о генотипах локуса - 322 VNTR рецептора фактора некроза опухоли 2 - типа решена. При выявлении у больной миомой матки генотипов 1/1 или 2/1 TNFR2 можно предсказать большую площадь миоматозных узлов у данной пациентки и на этой основе разработать индивидуальную тактику ведения данной больной путем осуществления оперативного лечения в виде консервативной миомэктомии, с последующим лечением гормональными препаратами с целью подавления оставшихся зачатков роста и предотвращения развития новых миоматозных узлов или проведение эмболизации маточных артерий. При обнаружении у больной миомой матки генотипа 2/2-322 VNTR TNFR2 можно предполагать меньшую площадь миоматозных узлов и, соответственно, в качестве индивидуальной тактики ведения данной больной следует избирать длительный прием оральных контрацептивов, профилактику инфекций, абортов и инвазивных вмешательств, а также проведение динамического наблюдения у гинеколога с ежегодным ультразвуковым исследованием органов малого таза.

Использование предложенного способа позволит прогнозировать площадь миоматозных узлов на ранних стадиях развития миомы матки, что позволит более уверенно использовать органосохраняющие методы лечения при данной патологии.

Примеры конкретного выполнения.

1. Больная С., 44 лет, наблюдалась в перинатальном центре ОКБ Святителя Иоасафа с диагнозом: Симптомная миома матки (с 2003 г по 2008 г.). Менструации с 12 лет, по 3-4 дня, регулярные, цикл 28 дней. В репродуктивном периоде 3 беременности: 2 родов, 1 аборт. Сопутствующая патология: НЦД по гипертоническому типу.

Из гинекологических заболеваний - в анамнезе эрозия шейки матки, хрон. сальпингоофорит.

Ультразвуковая диагностика проводилась на аппаратах Aloka SSD - α10, Aloka 5500: датчики - конвексный - 3,5 Мгц, вагинальный - 5 Мгц. Комплексное эхографическое трансабдоминальное и трансвагинальное сканирование проводилось в режиме «реального времени» на 5-7-й день цикла до предполагаемой менструации.

Миома матки диагностирована в 42 года (при первичной явке - матка с размерами 65×70×74 мм, размер миоматозного узла диаметр 36×40 мм, расположен по передней стенке матки). Ежегодно отмечался рост миоматозного узла около 2-3 см в год.

В 2007 году появились жалобы на болезненные длительные месячные со сгустками в течение 6 дней, учащенное мочеиспускание, общая слабость, снижение гемоглобина до 100-106 г/л. При контроле УЗИ малого таза - матка с размерами 116×110×94 мм, размер миоматозного узла радиус 5,75 см, расположение по передней стенке. Проведена влагалищная экстирпация матки без придатков.

Площадь миоматозного узла S_шapa=415,27 см² определена по формуле S_шара=4πr², где π (пи) ~ 3,14, а r - радиус миоматозного узла. Данный результат соответствует большой площади миоматозных узлов у данной пациентки

Типированием молекулярно-генетического маркера рецептора фактора некроза опухоли 2 типа у пациентки С определен генотип 1/1-322 VNTR TNFR2.

2. Больная К., 40 лет, наблюдалась в перинатальном центре ОКБ Святителя Иоасафа с диагнозом: Субсерозная миома матки в течение 6 лет (с 2002 по 2008 г.).

Менструации с 13 лет, по 3-4 дня, регулярные, цикл 30 дней. В репродуктивном периоде 2 беременности: 1 роды, 1 аборт. Сопутствующая патология: НЦД по гипертоническому типу, хр. пиелонефрит. Из гинекологических заболеваний - в анамнезе эрозия шейки матки (ДЭК в 1999 г.).

Ультразвуковая диагностика проводилась на аппаратах Aloka SSD - α10, Aloka 5500: датчики - конвексный - 3,5 Мгц, вагинальный - 5 Мгц. Комплексное эхографическое трансабдоминальное и трансвагинальное сканирование проводилось в режиме «реального времени» на 5-7-й день цикла до предполагаемой менструации.

Миома матки диагностирована в 34 года (при первичной явке - матка с размерами 65×68×78 мм, размер миоматозного узла радиус 3,25 см, расположен в области дна). Площадь миоматозного узла S_шapa=132 см² пределена по формуле S_шapa=4πr², где π (пи) ~ 3,14, а r - радиус миоматозного узла. За время наблюдения в течение 6 лет рост миоматозного узла не отмечен. В 2008 году поступила в гинекологическое отделение по поводу апоплексии кисты желтого тела правого яичника, геморрагическая форма.

Проведена операция - лапороскопия. Цистэктомия справа. Консервативная миомэктомия. Результаты операции подтвердили соответствие небольшой площади миоматозных узлов у данной пациентки.

Типированием молекулярно-генетического маркера рецептора фактора некроза опухоли 2 типа у пациентки К. определен генотип 2/2-322 VNTR TNFR2.

Данные примеры подтверждают промышленную применимость заявленного изобретения. Так, если бы больной из примера 1 было вовремя проведено генотипическое типирование, можно было бы спрогнозировать рост миоматозного узла, своевременно провести органосохраняющую операцию - консервативную миомэктомию и не допустить развития клинических проявлений метроррагии и развития анемии. Второй пример подтверждает небольшую площадь и отсутствие роста миоматозного узла при выявленном генотипе 2/2-322 VNTR TNFR2.

Литература

1. Mapping complex bisease loci in whole-genome association studies. / C.S.Carlson [et al.] // Nature. - 2004. - V.249. - P.446-452.

2. Genom-wide association studies: theoretical and practical concerns. / Y.S.Wang [et al.] // Nat. Rev. - 2005. - V.6. - P.109-118.

3. Genetic analysis of genom-wide variation in human gene expression. / M. Morley [et al.] // Nature. - 2004. - V.430. - P.743-747.

4. Баранов В.С. Геномика и молекулярная медицина. / В.С.Баранов // Молекулярная биология. - 2004. - Т.38, №1. - С.110-116.

5. Иванов В.И. Геномика - медицине. / В.И.Иванов. - M.: Академкнига, 2005. - 392 с.

6. Носиков В.В. Создание биочипа для анализа полиморфизма в генах системы биотрансформации. / В.В.Носиков // Молекулярная биология. - 2005. - Т.39. - С.403-412.

7. Янковский Н.К. Геном человека: научные и практические достижения и перспективы: аналит. обзор / Н.К.Янковский, С.А.Боринская // Вести. РФФИ. - 2003. - №2.

8. Выявление генов предрасположенности к распространенным сердечно-сосудистым заболеваниям: принципы, достижения и перспективы. / M.И.Воевода [и др.] // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике. - Новосибирск, 2006. - вып.9. - С.16-23..

9. Полоников А.В. Полиморфизм Ser311Cys в 9 экзоне гена парооксаназы 2 ассоциирован с подверженностью к гипертонической болезни у женщин. / А.В.Полоников // Мед. генетика. - 2006. - Т.5, №12. - С.589-592.

10. Гинтер Е.К. Перспективы развития медицинской генетики. / Е.К.Гинтер // Мед. генетика. - 2007. - Т.6, №1 (55). - С.3-9.

11. Пузырев В.П. Генетика мультифакториальных заболеваний: между прошлым и будущим. / В.П.Пузырев // Мед. генетика. - 2003. - Т.2, №12. - С.498-508.

12. Савицкий Г.А., Савицкий А.Г. Миома матки. Проблемы патогенеза и патогенетической терапии. / 3-е изд. - СПб.: Элби-СПб, 2003. - 236 с.

13. Сидорова И.С., Рыжова О.В. Роль факторов роста в патогенезе миомы матки // Акушерство и гинекология. - 2002. - №1. - С.12-13.

14. Сидорова И.С. Миома матки. - М., 2003. - 256 с.

15. Тихомиров А.Л., Лубнин Д.М; Миома матки. - МИА. - 2006. - 174 с.

16. Унанян А.Л., Сидорова И.С, Коган Е.А., Леваков С.А. Роль апоптоза и пролиферации в патогенезе миомы матки в сочетании с аденомиозом // Материалы VI Российского форума «Мать и дитя». - 2004. - С.512-513.

17. Asghar Т., Yoshida S., Kennedy S. et al. The tumor necrosis factor-alpha promoter-1031C polymorphism is associated with decreased risk of endometriosis in a Japanese population // Hum Reprod. - 2004. - Vol.19. - P.2509-2514.

18. Burroughs K.D., Kiguchi K., Howe S.R. et al. Regulation of apoptosis in uterine leiomyomata // Endocrinology. - 1997. - Vol.138. - P.3056-3064.

19. Flake G.P., Andersen J., Dison D. Etiology and pathogenesis of uterine leiomyomas: a review // Environ. Health. Perspect. - 2003. - Vol.111. - P.1037-1054.

20. Fujimoto J., Ffirose R., Sakaguchi Ff., Tamaya T. Expression of size-polymorphic androgen receptor gene in uterine leiomyoma according to the number of cytosine, adenine, and guanine repeats in androgen receptor alleles // Tumour Biol. - 2000. - Vol.21, №1. - P.33-37.

21. Hisaoka M., Sheng W.Q. et al. HMGIC alterations in smooth muscle tumors of soft tissues and other sites // Cancer Genet. Cytogenet. - 2002. - Vol.138, №1. - P.50-55.

22. Elmore, S. Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death: invited reviews./ Susan Elmore // Toxicol Pathol. - 2007. - Jun. (№35). - P.495-516.

Способ прогнозирования площади миоматозных узлов у больной миомой матки, включающий выделение ДНК из периферической венозной крови, анализ генотипов локуса - 322 VNTR рецептора фактора некроза опухоли 2-го типа, при выявлении генотипа 2/2-322 VNTR TNFR2 прогнозируют небольшую площадь миоматозных узлов, при выявлении генотипов 1/1-322 VNTR TNFR2 или 2/1-322 VNTR TNFR2 прогнозируют большую площадь миоматозных узлов.