Производные циклических алкиламинов в качестве ингибиторов взаимодействия между mdm2 и р53

Изобретение описывает соединение формулы (I)

его N-оксидную форму, аддитивную соль или стереохимически изомерную форму, где m равно 0, 1, и когда m равно 0, тогда подразумевается непосредственная связь; n равно 0, 1, 2 или 3, и когда n равно 0, тогда подразумевается непосредственная связь; р равно; t равно 0 или 1, и когда t равно 0, тогда подразумевается непосредственная связь; означает -CR⁸=C<, и тогда пунктирная линия представляет связь, где R⁸ представляет водород; R¹ и R² представляет водород; R³ и R⁴ представляет водород; R⁵ представляет водород; R⁶ и R⁷, каждый независимо, выбраны из водорода или C_1-6 алкила; Z представляет радикал, выбранный из

где R¹⁰ и R¹¹, каждый независимо, выбран из таких значений, как водород, гидрокси, C_1-6 алкилкарбонил, C_1-6 алкилкарбонилокси, C_1-6 алкил, C_1-6 алкилоксикарбонил, C_1-6 алкилкарбонилокси, гидрокси C_1-6 алкил. Кроме того, изобретение описывает фармацевтическую композицию для лечения рака на основе соединения формулы I, а также способ ее получения, а также применение соединения I, его комбинацию с противораковым средством и способ его получения. 9 н. и 5 з.п. ф-лы, 2 табл.

 

Область изобретения

Данное изобретение относится к соединениям и композициям, содержащим указанные соединения, действующие в качестве ингибиторов взаимодействия между MDM2 и p53. Более того, данное изобретение относится к способам получения описанных ингибиторов, композиций, содержащих их, и способам их применения, например, в качестве лекарственных средств.

р53 является белком-супрессором опухоли, который играет главную роль в регуляции баланса между клеточной пролиферацией и прекращением роста клеток/апоптозом. В нормальных условиях полупериод существования р53 очень короткий, и поэтому уровень содержания р53 в клетках очень низкий. Однако в ответ на повреждение клеточной ДНК или клеточный стресс (например, активация онкогена, эрозия теломера, гипоксия) уровни р53 повышаются. Это повышение уровней р53 ведет к активации транскрипции некоторых генов, что приводит клетку или к прекращению роста, или к процессам апоптоза. Таким образом, важной функцией р53 является предотвращение неконтролируемой пролиферации поврежденных клеток и, следовательно, защита организма от развития рака.

MDM2 является ключевым негативным регулятором функции р53. Он формирует негативную ауторегуляторную петлю путем связывания с аминоконцевым трансактивационным доменом р53, и, таким образом, MDM2 ингибирует способность р53 активировать транскрипцию и нацеливает р53 на протеолитическую деградацию. В нормальных условиях эта регуляторная петля ответственна за поддержание низких уровней р53. Однако в опухолях с р53 дикого типа равновесная концентрация активного р53 может быть повышена антагонизированием взаимодействия между MDM2 и р53. В результате будет иметь место восстановление опосредуемых р53 про-апоптотического и анти-пролиферативного эффектов в таких опухолевых клетках.

MDM2 является клеточным протоонкогеном. Сверхэкспрессия MDM2 наблюдается в ряде злокачественных заболеваний. MDM2 сверхэкспрессируется в разнообразных опухолях, благодаря генной амплификации или повышенной транскрипции или трансляции. Механизм, посредством которого амплификация MDM2 промотирует образование опухоли, по меньшей мере частично относится к его взаимодействию с р53. В клетках, сверхэкспрессирующих MDM2, защитная функция р53 блокирована, и поэтому клетки не способны реагировать на повреждение ДНК или клеточный стресс повышением уровней р53, приводящим к прекращению роста клеток и/или апоптозу. Таким образом, после повреждения ДНК и/или клеточного стресса клетки, сверхэкспрессирующие MDM2, являются свободными, чтобы продолжать пролиферировать и приобретать туморигенный фенотип. В таких условиях нарушение взаимодействия р53 и MDM2 способствовало бы высвобождению р53 и соответственно позволяло бы функционировать нормальным сигналам прекращения роста и/или апоптоза.

MDM2 может также иметь особые функции в дополнение к ингибированию р53. Например, было показано, что MDM2 взаимодействует непосредственно с pRb-регулируемым фактором транскрипции E2F1/DP1. Это взаимодействие могло бы быть решающим для р53-независимых онкогенных активностей MDM2. Домен E2F1 обнаруживает поразительное сходство с MDM2-связывающим доменом р53. Так как взаимодействия MDM2 и с р53, и с E2F1 имеют место на одном и том же сайте связывания на MDM2, можно предположить, что антагонисты MDM2/р53 будут не только активировать клеточный р53, но также модулировать активности E2F1, регулирование которых обычно прекращается в опухолевых клетках.

Кроме того, терапевтическая эффективность повреждающих ДНК агентов, используемых в настоящее время (химиотерапия и радиотерапия), может быть ограничена путем негативной регуляции р53 посредством MDM2. Так, если ингибирование р53 в ответ на MDM2 прерывается, повышение функциональных уровней р53 будет повышать терапевтическую эффективность таких агентов путем восстановления функции р53 дикого типа, что ведет к апоптозу и/или обратному развитию связанной с р53 лекарственной резистентности. Было продемонстрировано, что объединение ингибирования посредством MDM2 и обработок, повреждающих ДНК, in vivo приводит к синергическим противоопухолевым эффектам (Vousden K.H., Cell, Vol. 103, 691-694, 2000).

Таким образом, разрушение взаимодействия MDM2 и р53 представляет собой подход для терапевтического вмешательства в опухоли с р53 дикого типа, возможно даже выявляет антипролиферативные эффекты в опухолевых клетках, которые лишены функционального р53, и, более того, может сенсибилизировать туморигенные клетки к химиотерапии и радиотерапии.

Уровень техники

JP 11130750, опубликованный 18 мая 1999, описывает наряду с прочим замещенные фениламинокарбонилиндолил-производные в качестве антагонистов рецептора 5-НТ.

EP1129074, опубликованный 18 мая 2000, описывает амиды антраниловой кислоты в качестве ингибиторов рецепторов фактора роста сосудистого эндотелия (VEGFR) и как применимые при лечении ангиогенных расстройств.

EP1317443, опубликованный 21 марта 2002, раскрывает производные трициклических трет-аминов, применимые в качестве модуляторов рецептора химокина CXCR4 или CCR5 против вируса иммунодефицита человека и кошачьего вируса иммунодефицита.

EP1379239, опубликованный 10 октября 2002, раскрывает N-(2-арилэтил)бензиламины в качестве антагонистов рецептора 5-HT₆.

WO00/15357, опубликованный 23 марта 2000, предлагает пиперазин-4-фенил производные в качестве ингибиторов взаимодействия между MDM2 и p53. EP1137418, опубликованный 8 июня 2000, предлагает трициклические соединения для восполнения конформационной стабильности белка семейства p53.

EP 1443937, опубликованный 22 мая 2003, описывает замещенные 1,4-бензодиазепины и их применения в качестве ингибиторов взаимодействий MDM2-p53.

EP1458380, опубликованный 26 июня 2003, предлагает цис-2,4,5-трифенил-имидазолоны, которые ингибируют взаимодействие белка MDM2 с p53-подобными пептидами и имеют антипролиферативную активность.

EP1519932, опубликованный 15 января 2004, раскрывает соединения бисарилсульфонамида, которые связываются с MDM2 и могут быть применимыми в терапии рака.

Однако остается потребность в эффективных и сильных малых молекулах, которые ингибируют взаимодействия между MDM2 и p53.

Соединения по данному изобретению отличаются от соединений предшествующего уровня техники по структуре, по их фармакологической активности и/или по фармакологической эффективности.

Описание изобретения

Данное изобретение относится к соединениям, композициям и способам ингибирования взаимодействий между MDM2 и p53 для лечения рака. Кроме того, соединения и композиции по данному изобретению применимы для повышения эффективности химиотерапии и радиотерапии.

Данное изобретение относится к соединениям формулы (I)

к его N-оксидной форме, аддитивной соли или стереохимически изомерной форме, где

m равно 0, 1 или 2, и когда m равно 0, тогда подразумевается непосредственная связь;

n равно 0, 1, 2 или 3, и когда n равно 0, тогда подразумевается непосредственная связь;

p равно 0 или 1, и когда p равно 0, тогда подразумевается непосредственная связь;

t равно 0 или 1, и когда t равно 0, тогда подразумевается непосредственная связь;

означает -CR⁸=C<, и тогда пунктирная линия представляет связь, -C(=O)-CH<, -C(=O)-N<, -CHR⁸-CH< или -CHR⁸-N<; где

каждый R⁸ независимо представляет водород или С_1-6 алкил;

R¹ и R², каждый независимо, выбраны из водорода, галогена, С_1-6 алкила, С_1-6 алкилокси, арил С_1-6 алкилокси, гетероарил С_1-6 алкилокси, фенилтио, гидрокси С_1-6 алкилкарбонила, С_1-6 алкила, замещенного заместителем, выбранным из амино, арила и гетероарила; или С_3-7 циклоалкила, замещенного заместителем, выбранным из амино, арила и гетероарила;

R³ и R⁴, каждый независимо, выбраны из водорода, галогена, С_1-6 алкила, полигалоген С_1-6 алкила, циано, циано С_1-6 алкила, гидрокси, амино или С_1-6 алкилокси; или

R⁴ и R⁵ вместе могут необязательно образовывать двухвалентный радикал, выбранный из метилендиокси или этилендиокси;

R⁵ представляет водород, С_1-6 алкилоксикарбонил или С_1-6 алкил;

R⁶ и R⁷, каждый независимо, выбраны из водорода, С_1-6 алкилокси С_1-6 алкила или С_1-6 алкила; или

R⁶ и R⁷ вместе могут необязательно образовывать двухвалентный радикал, выбранный из

-(CH2)2-О-(CH2)2-

(b-1),

-(CH2)2-NR9-(CH2)2-

(b-2),

где R⁹ представляет водород, С_1-6 алкилокси-С_1-6 алкил или С_1-6 алкил;

Z представляет радикал, выбранный из

где

R¹⁰ и R¹¹, каждый независимо, выбраны из таких, как водород, галоген, гидрокси, амино, С_1-6 алкил, нитро, полигалоген С_1-6 алкил, циано, циано С_1-6 алкил, тетразоло С_1-6 алкил, арил, гетероарил, арил С_1-6 алкил, гетероарил С_1-6 алкил, арил(гидрокси) С_1-6 алкил, гетероарил(гидрокси) С_1-6 алкил, арилкарбонил, гетероарилкарбонил, С_1-6 алкилкарбонил, арил С_1-6 алкилкарбонил, гетероарил С_1-6 алкилкарбонил, С_1-6 алкилокси, С_3-7 циклоалкилкарбонил, С_3-7 циклоалкил (гидрокси) С_1-6 алкил, арил С_1-6 алкилокси С_1-6 алкил, С_1-6 алкилокси С_1-6 алкилокси С_1-6 алкил, С_1-6 алкилкарбонилокси С_1-6 алкил, С_1-6 алкилоксикарбонил С_1-6 алкилокси С_1-6 алкил, гидрокси С_1-6 алкилокси С_1-6 алкил, С_1-6 алкилоксикарбонил С_2-6 алкенил С_1-6 алкилокси С_1-6 алкил, С_1-6 алкилоксикарбонил, С_1-6 алкилкарбонилокси, аминокарбонил, гидрокси С_1-6 алкил, амино С_1-6 алкил, гидроксикарбонил, гидроксикарбонил С_1-6 алкил и -(CH₂)_v-(C(=O)_r)-(CHR^l7)_u-NR¹³R¹⁴; где

v равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6, и когда v равно 0, тогда подразумевается непосредственная связь;

r равно 0 или 1, и когда r равно 0, тогда подразумевается непосредственная связь;

u равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6, и когда u равно 0, тогда подразумевается непосредственная связь;

R¹⁷ представляет водород или С_1-6 алкил;

R¹² представляет водород, С_1-6 алкил, С_3-7 циклоалкил, С_1-6 алкил, замещенный заместителем, выбранным из гидрокси, амино, С_1-6 алкилокси и арила; или С_3-7 циклоалкил, замещенный заместителем, выбранным из гидрокси, амино, арила и С_1-6 алкилокси;

R¹³ и R¹⁴, каждый независимо, выбраны из таких, как водород, С_1-12 алкил, С_1-6 алкилкарбонил, С_1-6 алкилсульфонил, арил С_1-6 алкилкарбонил, C_3-7 циклоалкил, C_3-7 циклоалкилкарбонил, -(CH₂)_k-NR¹⁵R¹⁶, С_1-12 алкил, замещенный заместителем, выбранным из гидрокси, гидроксикарбонила, циано, С_1-6 алкилоксикарбонила, С_1-6 алкилокси, арила или гетероарила; или С_3-7 циклоалкил, замещенный заместителем, выбранным из гидрокси, С_1-6 алкилокси, арила, амино, арил С_1-6 алкила, гетероарила или гетероарил С_1-6 алкила; или

R¹³ и R¹⁴ вместе с атомом азота, к которому они присоединены, могут необязательно образовывать морфолинил, пиперидинил, пирролидинил, пиперазинил или пиперазинил, замещенный заместителем, выбранным из С_1-6 алкила, арил С_1-6 алкила, арил С_1-6 алкилоксикарбонила, гетероарил С_1-6 алкила, С_3-7 циклоалкила и С_3-7 циклоалкил С_1-6 алкила; где

k равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6, и когда k равно 0, тогда подразумевается непосредственная связь;

R¹⁵ и R¹⁶, каждый независимо, выбраны из таких, как водород, С_1-6 алкил, арил С_1-6 алкилоксикарбонил, С_3-7 циклоалкил, С_1-12 алкил, замещенный заместителем, выбранным из гидрокси, С_1-6 алкилокси, арила и гетероарила; и С_3-7 циклоалкил, замещенный заместителем, выбранным из гидрокси, С_1-6 алкилокси, арила, арил С_1-6 алкила, гетероарила и гетероарил С_1-6 алкила; или

R¹⁵ и R¹⁶ вместе с атомом азота, к которому они присоединены, необязательно могут образовывать морфолинил, пиперазинил или пиперазинил, замещенный С_1-6 алкилоксикарбонилом;

арил означает фенил или нафталинил;

каждый фенил или нафталинил необязательно может быть замещенным одним, двумя или тремя заместителями, каждый из которых независимо выбран из галогена, гидрокси, С_1-6 алкила, амино, полигалоген С_1-6 алкила и С_1-6 алкилокси; и

каждый фенил или нафталинил необязательно может быть замещенным двухвалентным радикалом, выбранным из метилендиокси и этилендиокси;

гетероарил означает пиридинил, индолил, хинолинил, имидазолил, фуранил, тиенил, оксадиазолил, тетразолил, бензофуранил или тетрагидрофуранил;

каждый пиридинил, индолил, хинолинил, имидазолил, фуранил, тиенил, оксадиазолил, тетразолил, бензофуранил или тетрагидрофуранил необязательно может быть замещенным одним, двумя или тремя заместителями, каждый из которых независимо выбран из галогена, гидрокси, С_1-6 алкила, амино, полигалоген С_1-6 алкила, арила, арил С_1-6 алкила или С_1-6 алкилокси; и

каждый пиридинил, индолил, хинолинил, имидазолил, фуранил, тиенил, бензофуранил или тетрагидрофуранил необязательно может быть замещенным двухвалентным радикалом, выбранным из метилендиокси или этилендиокси.

Соединения формулы (I) могут также существовать в их таутомерных формах. Такие формы, хотя и не показаны подробно в приведенной выше формуле, разумеется, должны быть включены в объем притязаний согласно данному изобретению.

Некоторые термины, используемые в предшествующих определениях, поясняются здесь далее. Эти термины используются иногда как таковые или в сложных терминах.

Используемый здесь в предшествующих определениях и далее термин галоген является общим для фтора, хлора, брома и иода; С_1-6 алкил означает насыщенные углеводородные радикалы с прямой или разветвленной цепью, имеющие от 1 до 6 атомов углерода, такие как, например, метил, этил, пропил, бутил, пентил, гексил, 1-метилэтил, 2-метилпропил, 2-метилбутил, 2-метилпентил и тому подобное; гидрокси С_1-6 алкил означает насыщенные углеводородные радикалы с гидрокси-заместителем на прямой или разветвленной цепи, имеющие от 1 до 6 атомов углерода; тригалогенметил представляет метил, содержащий три одинаковых или разных галоген-заместителя, например трифторметил; С_3-7 циклоалкил включает циклические углеводородные группы, имеющие от 3 до 10 атомов углерода, такие как циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклопентенил, циклогексил, циклогексенил, циклогептил и тому подобное.

Термин "аддитивная соль" содержит соли, которые соединения формулы (I) способны образовывать с органическими или неорганическими основаниями, такими как амины, основания щелочных металлов и основания щелочноземельных металлов или четвертичные аммониевые основания, или с органическими или неорганическими кислотами, такими как минеральные кислоты, сульфоновые кислоты, карбоновые кислоты или фосфорсодержащие кислоты.

Термин "аддитивная соль" дополнительно содержит фармацевтически приемлемые соли, комплексы металлов и сольваты и их соли, которые соединения формулы (I) способны образовывать.

Термин "фармацевтически приемлемые соли" означает фармацевтически приемлемые аддитивные соли с кислотой или основанием. Подразумевается, что указанные фармацевтически приемлемые аддитивные соли с кислотой или основанием содержат терапевтически активные аддитивные солевые формы с нетоксичной кислотой и нетоксичным основанием, которые соединения формулы (I) способны образовывать. Соединения формулы (I), которые имеют свойства основания, могут быть превращены в их фармацевтически приемлемые аддитивные соли с кислотой обработкой указанной формы основания соответствующей кислотой. Подходящие кислоты содержат, например, неорганические кислоты, такие как галогенводородные кислоты, например хлорводородная или бромводородная кислота; серная; азотная; фосфорная и тому подобные кислоты; или органические кислоты, такие как, например, уксусная, пропановая, гидроксиуксусная, молочная, пировиноградная, щавелевая, малоновая, янтарная (т.е. бутандиовая кислота), малеиновая, фумаровая, яблочная, виннокаменная, лимонная, метансульфоновая, этансульфоновая, бензолсульфоновая, п-толуолсульфоновая, цикламовая, салициловая, п-аминосалициловая, памовая и тому подобные кислоты.

Соединения формулы (I), которые имеют кислотные свойства, могут быть превращены в их фармацевтически приемлемые аддитивные соли с основанием обработкой указанной кислотной формы соответствующим органическим или неорганическим основанием. Подходящие солевые формы с основанием содержат, например, соли аммония, соли щелочных и щелочноземельных металлов, например соли лития, натрия, калия, магния, кальция и тому подобное, соли с органическими основаниями, например соли бензатина, N-метил-D-глюкамина, гидрабамина и соли с аминокислотами, такими как, например, аргинин, лизин и тому подобное.

Термины аддитивные соли с кислотой или основанием также содержат гидраты и аддитивные формы с растворителем, которые соединения формулы (I) способны образовывать. Примерами таких форм являются, например, гидраты, алкоголяты и тому подобное.

Термин "комплексы металлов" означает комплекс, образованный между соединением формулы (I) и одной или несколькими органическими или неорганическими солями металлов. Примеры указанных органических или неорганических солей содержат галогениды, нитраты, сульфаты, фосфаты, ацетаты, трифторацетаты, трихлорацетаты, пропионаты, тартраты, сульфонаты, например метилсульфонаты, 4-метилфенилсульфонаты, салицилаты, бензоаты и тому подобное металлов второй главной группы периодической системы, например соли магния или кальция, третьей или четвертой главной группы, например алюминия, олова, свинца, а также с первой по восьмую переходную группу периодической системы, такие как, например, хром, марганец, железо, кобальт, никель, медь, цинк и тому подобное.

Используемый здесь термин "стереохимически изомерные формы соединений формулы (I)" означает все возможные соединения, полученные из тех же атомов, связанных той же последовательностью связей, но имеющие различные трехмерные структуры, которые не являются взаимозаменяемыми, которыми могут обладать соединения формулы (I). Если не упомянуто и не указано иначе, химическое обозначение соединения охватывает смесь всех возможных стереохимически изомерных форм, которыми указанное соединение может обладать. Указанная смесь может содержать все диастереомеры и/или энантиомеры основной молекулярной структуры указанного соединения. Все стереохимически изомерные формы соединений формулы (I), будь то в чистой форме или в смеси друг с другом, считаются включенными в объем притязаний согласно данному изобретению.

Особый интерес представляют такие соединения формулы (I), которые являются стереохимически чистыми.

Упоминаемые здесь чистые стереоизомерные формы соединений и промежуточных соединений характеризуются как изомеры по существу свободные от других энантиомерных или диастереомерных форм той же основной молекулярной структуры указанных соединений или промежуточных соединений. В частности, термин "стереоизомерно чистый" относится к соединениям или промежуточным соединениям, имеющим стереоизомерный избыток по меньшей мере 80% (т.е. минимум 90% одного изомера и максимум 10% других возможных изомеров) вплоть до стереоизомерного избытка 100% (т.е. 100% одного изомера при отсутствии других), более конкретно, соединения или промежуточные соединения, имеющие стереоизомерный избыток 90% вплоть до 100%, еще конкретнее, имеющие стереоизомерный избыток 94% вплоть до 100% и, наиболее конкретно, имеющие стереоизомерный избыток 97% вплоть до 100%. Термины "энантиомерно чистый" и "диастереомерно чистый" следует понимать подобным образом, но как имеющие отношение к энантиомерному избытку, соответственно к диастереомерному избытку в рассматриваемой смеси.

Таутомерные формы соединений формулы (I) относятся к соединениям формулы (I), где, например, енольная группа превращается в кетогруппу (кето-енольная таутомерия).

N-оксидные формы соединений формулы (I) относятся к соединениям формулы (I), где один или несколько атомов азота окислены до так называемого N-оксида, особенно таких N-оксидов, где один или несколько атомов азота пиперидина, пиперазина или пиридазинила являются N-окисленными.

Соединения формулы (I) могут быть превращены в соответствующие N-оксидные формы следующими известными в технике процедурами превращения трехвалентного азота в его N-оксидные формы. Указанная реакция N-окисления, как правило, может быть проведена путем взаимодействия исходного соединения формулы (I) с соответствующим органическим или неорганическим пероксидом. Соответствующие неорганические пероксиды содержат, например, пероксид водорода, пероксиды щелочных металлов или щелочноземельных металлов, пероксид натрия, пероксид калия; соответствующие органические пероксиды могут содержать пероксикислоты, такие как, например, бензолкарбопероксикислота или замещенная галогеном бензолкарбопероксикислота, например 3-хлорбензолкарбопероксикислота, пероксоалкановые кислоты, например пероксоуксусная кислота, алкилгидропероксиды, например трет-бутил гидропероксид. Подходящими растворителями являются, например, вода, низшие спирты, например этанол и тому подобное, углеводороды, например толуол, кетоны, например 2-бутанон, галогенированные углеводороды, например дихлорметан, и смеси таких растворителей.

Данное изобретение также относится к любым изотопам атомов, присутствующих в соединениях по изобретению. Например, изотопы водорода включают тритий и дейтерий и изотопы углерода включают C-13 и C-14.

Где бы ни использовался здесь далее, термин "соединения формулы (I)" включает также N-оксидные формы, фармацевтически приемлемые аддитивные соли с кислотами или основаниями и все стереоизомерные формы.

Первая группа представляющих интерес соединений состоит из таких соединений формулы (I), где применяется одно или несколько из следующих ограничений:

a) m равно 0;

b) n равно 2;

c) p равно 1;

d) t равно 0;

e) означает -CH=C<;

f) R¹ и R², каждый независимо, представляют водород;

g) R³ и R⁴, каждый независимо, представляют водород;

h) R⁵ представляет водород;

i) R⁶ и R⁷, каждый независимо, представляют водород или С_1-6 алкил;

j) Z представляет радикал, выбранный из (a-1), (a-2) или (a-4); или

k) R¹⁰ и R¹¹, каждый независимо, выбраны из водорода, гидрокси, С_1-6 алкилоксикарбонила или гидрокси С_1-6 алкила.

Вторая группа представляющих интерес соединений состоит из таких соединений формулы (I) и тех соединений первой группы представляющих интерес соединений, где использованы одно или несколько следующих ограничений:

a) m равно 0;

b) n равно 2;

c) p равно 1;

d) t равно 0;

e) означает -CH=C<;

f) R¹ и R², каждый независимо, представляют водород;

g) R³ и R⁴, каждый независимо, представляют водород;

h) R⁵ представляет водород;

i) R⁶ и R⁷, каждый независимо, представляют водород,

j) Z представляет радикал, выбранный из (a-2) или (a-4); или

k) R¹⁰ и R¹¹, каждый независимо, выбраны из водорода, гидрокси или гидрокси С_1-6 алкила.

Группа предпочтительных соединений состоит из таких соединения формулы (I) или какой-либо их подруппы, где m равно 0; n равно 0; p равно 1; t равно 0; R¹ и R², каждый независимо, представляют водород; R³ и R⁴, каждый независимо, представляют водород; R⁵ представляет водород; R⁶ и R⁷, каждый независимо, представляют водород или С_1-6 алкил; Z представляет радикал, выбранный из (a-1), (a-2) или (a-4); или R¹⁰ и R¹¹, каждый независимо, выбраны из водорода, гидрокси, С_1-6 алкилоксикарбонила или гидрокси С_1-6 алкила.

Группа более предпочтительных соединений состоит из таких соединений формулы (I) или какой-либо их подруппы, где m равно 0; n равно 0; p равно 1; t равно 0; R¹ и R², каждый независимо, представляют водород; R³ и R⁴, каждый независимо, представляют водород; R⁵ представляет водород; R⁶ и R⁷, каждый независимо, представляют водород; Z представляет радикал, выбранный из (a-2) или (a-4); или R¹⁰ и R¹¹, каждый независимо, выбраны из водорода, гидрокси или гидрокси С_1-6 алкила.

Наиболее предпочтительными соединениями являются соединение No. 1, соединение No. 4 и соединение No. 5.

Соединения формулы (I), их фармацевтически приемлемые соли и N-оксиды и их стереохимически изомерные формы могут быть получены традиционным образом. Исходные продукты и некоторые из промежуточных соединений являются известными соединениями и коммерчески доступны или могут быть получены согласно обычным процедурам реакции, которые обычно известны в технике.

Некоторые такие способы получения будут описаны здесь далее более подробно. Другие способы получения конечных соединений формулы (I) описаны в примерах.

Соединения формулы (I) могут быть получены путем взаимодействия промежуточного соединения формулы (II) с промежуточным соединением формулы (III), где W представляет соответствующую уходящую группу, такую как, например, галоген, например, фтор, хлор, бром или иод, или сульфонилокси радикал, такой как метилсульфонилокси, 4-метилфенилсульфонилокси и тому подобное. Реакция может быть осуществлена в инертном для реакции растворителе, таком как, например, спирт, например метанол, этанол, 2-метоксиэтанол, пропанол, бутанол и тому подобное; простой эфир, например 4,4-диоксан, 1,1'-оксибиспропан и тому подобное; кетон, например 4-метил-2-пентанон; или N,N-диметилформамид, нитробензол, ацетонитрил, уксусная кислота и тому подобное. Добавление соответствующего основания, такого как, например, карбонат или гидрокарбонат щелочного или щелочноземельного металла, например триэтиламин или карбонат натрия, может быть использовано для улавливания кислоты, которая высвобождается в течение реакции. Небольшое количество соответствующего иодида металла, например иодида натрия или калия, может быть добавлено для промотирования реакции. Перемешивание может улучшать скорость реакции. Реакция легко может быть проведена при температуре в пределах между комнатной температурой и температурой кипения с возвращением флегмы реакционной смеси и, если желательно, реакция может быть проведена при повышенном давлении.

Соединения формулы (I), где p равно 1, упоминаемые здесь как соединения формулы (I-a), могут быть получены превращением промежуточных соединений формулы (IV) с применением смешанного гидрида лития-алюминия в подходящем растворителе, таком как тетрагидрофуран.

Соединения формулы (I-a) могут быть также получены путем взаимодействия соответствующего карбоксальдегида формулы (VI) с промежуточным соединением формулы (V) в присутствии соответствующего реагента, такого как боргидрид натрия, например тетрагидроборат натрия или цианотригидроборат на полимерном носителе, в подходящем растворителе, таком как спирт, например метанол.

Аналогичным образом соединения формулы (I), где t равно 1, упоминаемые здесь как соединения формулы (I-b), могут быть получены путем взаимодействия промежуточного соединения формулы (II) с соответствующим карбоксальдегидом формулы (VII).

Соединения формулы (I) могут быть также превращены друг в друга путем известных в технике реакций или преобразований функциональных групп. Некоторые такие преобразования описаны здесь выше. Другими примерами являются гидролиз сложных эфиров карбоновых кислот до соответствующей карбоновой кислоты или спирта; гидролиз амидов до соответствующих карбоновых кислот или аминов; гидролиз нитрилов до соответствующих амидов; аминогруппы на имидазоле или фениле могут быть замещены водородом известными в технике реакциями диазотирования и последующим замещением диазогрупп водородом; спирты могут быть превращены в сложные эфиры и простые эфиры; первичные амины могут быть превращены во вторичные или третичные амины; двойные связи могут быть гидрогенированы до соответствующей одинарной связи; иодный радикал на фенилгруппе может быть превращен в сложноэфирную группу введением монооксида углерода в присутствии подходящего палладиевого катализатора.

Промежуточные соединения формулы (V), где m равно 0, упоминаемые здесь как промежуточные соединения формулы (V-a), могут быть получены превращением промежуточного соединения формулы (VIII) с помощью гидразингидрата в подходящем растворителе, таком как метанол.

Промежуточные соединения формулы (V-a) могут быть также получены путем реакции восстановления нитрогруппы до амина, исходя из промежуточного соединения формулы (XVI), в присутствии металлического катализатора, такого как никель Ренея, и соответствующего восстановителя, такого как водород, в подходящем растворителе, таком как метанол или этанол.

Промежуточные соединения формулы (X) могут быть получены путем взаимодействия промежуточного соединения формулы (XI) с промежуточным соединением формулы (XII) в присутствии соответствующих реагентов, таких как N'-(этилкарбонимидоил)-N,N-диметил-1,3-пропандиамин, моногидрохлорид (EDC) и 1-гидрокси-1Н-бензотриазол (HOBT). Реакция может быть осуществлена в присутствии основания, такого как триэтиламин, в подходящем растворителе, таком как смесь дихлорметана и тетрагидрофурана.

Промежуточные соединения формулы (VI) могут быть получены путем взаимодействия промежуточных соединений формулы (XIII) со смешанным гидридом лития-алюминия в подходящем растворителе, таком как тетрагидрофуран.

Промежуточные соединения формулы (VIII) (то же для промежуточных соединений формулы (XVI)), где t равно 0, упоминаемые здесь как промежуточные соединения формулы (VIII-a), могут быть получены путем взаимодействия промежуточного соединения формулы (IX) с промежуточным соединением формулы (XIV), где L представляет соответствующую уходящую группу, такую как, например, галоген, например фтор, хлор, бром или иод, или

С_1-6 алкилокси, например метилокси, в присутствии раствора гидрохлорида в 2-пропаноле, в инертном для реакции растворителе, таком как N,N-диметилформамид.

Промежуточные соединения формулы (IX), где R⁶ и R⁷, оба, представлены водородом, упоминаемые здесь как промежуточные соединения формулы (IX-a), могут быть получены превращением промежуточного соединения формулы (XV) в присутствии цианоборгидрида натрия. Реакция может быть осуществлена в инертном для реакции растворителе, таком как, например, уксусная кислота.

Соединения формулы (I) и некоторые из промежуточных соединений могут иметь по меньшей мере один стереогенный центр в их структуре. Такой стереогенный центр может присутствовать в конфигурации R или S.

Некоторые из соединений формулы (I) и некоторые из промежуточных соединений по данному изобретению могут содержать асимметричный атом углерода. Стереохимически чистые изомерные формы указанных соединений и указанных промежуточных соединений могут быть получены с применением известных в технике процедур. Например, диастереоизомеры могут быть разделены физическими методами, такими как селективная кристаллизация или хроматографические методики, например распределение в противотоке, жидкостная хроматография и тому подобные методы. Энантиомеры могут быть получены из рацемических смесей вначале превращением указанных рацемических смесей соответствующими разрешающими агентами, такими как, например, хиральные кислоты, в смеси диастереомерных солей или соединений; затем физическим разделением указанных смесей диастереомерных солей или соединений путем, например, селективной кристаллизации, хроматографии с надкритической жидкостью или хроматографических приемов, например, жидкостной хроматографии, и подобных методов; и наконец превращением указанных отдельных диастереомерных солей или соединений в соответствующие энантиомеры. Чистые стереохимически изомерные формы могут быть также получены из чистых стереохимически изомерных форм соответствующих промежуточных соединений и исходных материалов при условии, что переходные реакции происходят стереохимически.

Соединения формулы (I), их фармацевтически приемлемые аддитивные соли с кислотами и стереоизомерные формы имеют полезные фармакологические свойства, так как они ингибируют взаимодействие между р53 и MDM2.

Используемый здесь термин "MDM2" означает белок, получаемый в результате экспрессии гена mdm2. В рамках значения этого термина MDM2 охватывает все белки, кодируемые геном mdm2, их мутанты, их альтернативные части белков и их фосфорилированные белки. Дополнительно используемый здесь термин "MDM2" включает аналоги MDM2, например MDMX, известный также как MDM4, и гомологи и аналоги MDM2 других животных, например гомолог HDM2 человека или аналог НDMХ человека.

Термин "ингибирование взаимодействия" или "ингибитор взаимодействия" используется здесь для обозначения предотвращения или уменьшения непосредственной или иной ассоциации одной или нескольких молекул, пептидов, белков, ферментов или рецепторов, или предотвращения или уменьшения нормальной активности одной или нескольких молекул, пептидов, белков, ферментов или рецепторов.

Термин "ингибитор взаимодействия р53 с MDM2" или "ингибитор р53-MDM2" используется здесь для описания агента, который усиливает экспрессию р53 в анализе, описанном в разделе С.1. Это усиление может быть вызвано, но без ограничения перечисленным, одним или несколькими следующими механизмами действия:

- ингибирование взаимодействия р53 с MDM2,

- непосредственная ассоциация либо с белком MDM2, либо с белком р53,

- взаимодействия с мишенями выше по потоку или ниже по потоку, например киназами или энзимными активностями, вовлекаемыми в убихитинирование или модификацию SUMO,

- пассивирование или транспортирование MDM2 и р53 в различные клеточные отделения,

- модуляция белков, ассоциирующихся с MDM2, например (но без ограничения) р73, E2F-1, Rb, p21waf1 или cip1,

- понижающая регуляция или интерференция экспрессией MDM2 и/или активностью MDM2, например (но без ограничения) воздействие на его клеточную локализацию, пост-трансляционную модификацию, нуклеарный экспорт или активность убихитиновой лигазы,

- непосредственная или опосредованная стабилизация белка р53, например, путем сохранения его функциональной структурной формы или предотвращения мисфолдинга,

- усовершенствование экспрессии р53 или экспрессии членов семейства р53, например р63 и р73,

- усиление активности р53, например (но без ограничения) усовершенствованием его транскрипционной активности, и/или

- усиление экспрессии генов и белков р53-сигнального пути, например (но без ограничения) p21waf1, cip1, MIC-1 (GDF-15), PIG-3 и ATF-3.

Следовательно, данное изобретение относится к соединениям формулы (I) для применения в качестве лекарственного средства.

Кроме того, изобретение также относится к применению соединения для получения лекарственного средства для лечения расстройства, опосредуемого взаимодействием р53-MDM2, где указанным соединением является соединение формулы (I).

Используемый здесь термин "способ лечения" или "лечение" охватывает любые мероприятия против заболевания и/или состояния животного, в особенности человека, и включает: (i) предупреждение возникновения заболевания и/или состояния у субъекта, который может быть предрасположен к заболеванию и/или состоянию, но которому еще не поставлен диагноз, что он имеет такое заболевание и/или состояние, (ii) ингибирование заболевания и/или состояния, т.е. прекращение его развития, (iii) облегчение заболевания и/или состояния, т.е. вызывание обратного развития заболевания и/или состояния.

Под термином "расстройство, опосредуемое через взаимодействие р53-MDM2," подразумевается любое нежелательное или пагубное состояние, которое имеет следствием или является результатом ингибирования взаимодействия между белком MDM2 и р53 или другими клеточными белками, которые вызывают апоптоз, вызывают гибель клеток или регулируют цикл клетки.

Изобретение также относится к способу лечения расстройства, опосредуемого через взаимодействие р53-MDM2, путем введения эффективного количества соединения по данному изобретению субъекту, например млекопитающему (и более конкретно человеку), при необходимости такого лечения.

Соединения по изобретению могут оказывать антипролиферативное действие в опухолевых клетках, даже если такие клетки лишены функционального р53. Более конкретно, соединения по изобретению могут иметь антипролиферативные эффекты в опухолях с р53 дикого типа и/или в опухолях, сверхэкспрессирующих MDM2.

Таким образом, данное изобретение относится к способу ингибирования роста опухоли введением эффективного количества соединения по данному изобретению субъекту, например млекопитающему (и более конкретно человеку), при необходимости такого лечения.

Примерами опухолей, которые могут быть ингибированы, являются, но без ограничения перечисленными, легочный рак (например, аденокарцинома и, в том числе, немелкоклеточный легочный рак), панкреатические злокачественные заболевания (например, панкреатическая карцинома, такая как, например, внешнесекреторная панкреатическая карцинома), злокачественные заболевания толстой кишки (например, колоректальные карциномы, такие как, например, аденокарцинома толстой кишки и аденома толстой кишки), эзофагеальный рак, сквамозная карцинома ротовой полости, карцинома языка, желудочная карцинома, назофарингеальный рак, гематопоэтические новообразования лимфоидного происхождения (например, острый лимфоцитарный лейкоз, В-клеточная лимфома, лимфома Буркитта), неходжкинская лимфома, болезнь Ходжкина, миелоидный лейкоз (например, острый миелогенный лейкоз (AML)), тироидный фолликулярный рак, миелодиспластический синдром (MDS), опухоли мезенхимального происхождения (например, фибросаркомы и рабдомиосаркомы), меланомы, тератокарциномы, нейробластомы, опухоли мозга, глиомы, доброкачественная опухоль кожи (например, кератоакантома), карцинома молочной железы (например, прогрессирующий рак молочной железы), почечная карцинома, карцинома яичника, цервикальная карцинома, эндометриальная карцинома, карцинома мочевого пузыря, рак простаты, в том числе прогрессирующая болезнь, тестикулярные новообразования, остеосаркома, рак головы и шеи и эпидермальная карцинома.

Соединения по данному изобретению могут быть также использованы для лечения и предупреждения воспалительных состояний.

Следовательно, данное изобретение относится к способу лечения и предупреждения воспалительных состояний введением эффективного количества соединения по данному изобретению субъекту, например млекопитающему (и более конкретно человеку), при необходимости такого лечения.

Соединения по данному изобретению могут быть также использованы для лечения и предупреждения аутоиммунных заболеваний и состояний. Под термином "аутоиммунные заболевания" подразумевается какое-либо заболевание, при котором иммунная система животного неблагоприятно реагирует на собственный антиген. Под термином "собственный антиген" подразумевается какой-либо антиген, который нормально находится в организме животного. Типичные аутоиммунные заболевания включают, но без ограничения: тироидиты Хашимото, болезнь Грейвса, рассеянный склероз, злокачественную анемию, болезнь Эддисона, инсулинзависимый сахарный диабет, ревматоидный артрит, системную застойную себорею (SLE или волчанку), дерматомиозит, болезнь Крона, грануломатоз Вегенера, антигломерулярную базальномембранную болезнь, антифосфолипидный синдром, герпетиформный дерматит, аллергический энцефаломиелит, гломерулонефрит, мембранозный гломерулонефрит, синдром Гудпасчера, миастенический синдром Ламберта-Итона, миастению тяжелой степени, буллезный пемфигоид, полиэндокринопатии, болезнь Рейтера и синдром негнущегося человека.

Поэтому данное изобретение относится также к способу лечения аутоиммунных заболеваний и состояний и лечения заболеваний, связанных с конформационными нестабильными или неправильно складчатыми белками, введением эффективного количества соединения по данному изобретению субъекту, например млекопитающему (и более конкретно человеку), при необходимости такого лечения.

Соединения по данному изобретению могут быть также использованы для лечения заболеваний, связанных с конформационными нестабильными или неправильно складчатыми белками.

Примерами заболеваний, связанных с конформационными нестабильными или неправильно складчатыми белками, являются, но без ограничения перечисленными: кистозный фиброз (CFTR), синдром Марфана (фибриллин), амиотрофический боковой склероз (супероксид-дисмутаза), цинга (коллаген), заболевание, при котором моча похожа на кленовый сироп (альфа-кетокислотный дегидрогеназный комплекс), неудовлетворительный остеогенез (тип 1 проколлаген про-альфа), болезнь Крейтцфельдта-Якоба (прион), болезнь Альцгеймера (бета-амилоид), семейный амилоидоз (лизоцим), катаракты (кристаллины), семейная гиперхолестеринемия (рецептор LDL), недостаточность αI-антитрипсина, болезнь Тея-Сакса (бета-гексозаминидаза), пигментная дегенерация сетчатки (родопсин) и лепречаунизм (инсулиновый рецептор).

Поэтому данное изобретение относится также к способу лечения заболеваний, связанных с конформационными нестабильными или неправильно складчатыми белками, введением эффективного количества соединения по данному изобретению субъекту, например млекопитающему (и более конкретно человеку), при необходимости такого лечения.

Ввиду их полезных фармакологических свойств данные соединения могут быть включены в состав различных фармацевтических форм для целей введения.

Для приготовления фармацевтических композиций по данному изобретению эффективное количество конкретного соединения в форме аддитивной соли с основанием или кислотой в качестве активного ингредиента объединяют при тщательном смешивании с фармацевтически приемлемым носителем, этот носитель может принимать разнообразные формы в зависимости от формы препарата, желательной для введения. Такие фармацевтические композиции желательны в унифицированной дозированной форме, подходящей, предпочтительно, для введения перорально, ректально, подкожно или парентеральной инъекцией. Например, при получении композиций в дозированной форме для перорального введения может быть использована какая-либо обычная фармацевтическая среда, такая как, например, вода, гликоли, масла, спирты и тому подобное, в случае жидких препаратов для перорального введения, таких как суспензии, сиропы, эликсиры и растворы, или твердые носители, такие как крахмалы, сахара, каолин, смазки, связующие, дезинтегрирующие агенты и тому подобное в случае порошков, пилюль, капсул и таблеток.

Исходя из простоты их введения таблетки и капсулы представляют наиболее благоприятную стандартную лекарственную форму для перорального введения, в этом случае явно используют твердые фармацевтические носители. Для парентеральных композиций носитель обычно будет содержать стерильную воду, по меньшей мере в его большей части, хотя могут быть включены другие ингредиенты, например, для улучшения растворимости. Растворы для инъекций, например, могут быть приготовлены с носителем, который содержит физиологический раствор, раствор глюкозы или смесь физиологического раствора и раствора глюкозы. Суспензии для инъекций также могут быть приготовлены, в этом случае могут быть использованы соответствующие жидкие носители, суспендирующие агенты и тому подобное. В композициях, предназначенных для подкожного введения, носитель необязательно содержит агент, улучшающий проницаемость, и/или подходящий смачивающий агент, необязательно объединенный с соответствующими добавками любого характера в небольших относительных количествах, эти добавки не должны оказывать заметного вредного воздействия на кожу. Указанные добавки могут облегчать введение в кожу и/или могут быть полезны при приготовлении желательных композиций. Указанные композиции могут быть введены различными путями, например с помощью трансдермального пластыря, нанесением в виде пятна, как мазь. Особенно выгодно готовить указанные фармацевтические композиции в стандартной лекарственной форме для легкости введения и равномерности дозирования. Используемый в описании и формуле изобретения термин "стандартная лекарственная форма" относится к физически дискретным единицам, применимым в качестве единичных доз, каждая единица содержит заданное количество активного ингредиента, рассчитанное так, чтобы получить желательный терапевтический эффект, в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем. Примерами таких стандартных лекарственных форм являются таблетки (в том числе таблетки с насечкой или с покрытием), капсулы, пилюли, пакетики порошка, облатки, растворы или суспензии для инъекций, формы, отмеряемые чайной ложкой, столовой ложкой и тому подобное.

Особенно выгодно готовить указанные фармацевтические композиции в стандартной лекарственной форме для легкости введения и равномерности дозирования. Используемый в описании и формуле изобретения термин "стандартная лекарственная форма" относится к физически дискретным единицам, применимым в качестве единичных доз, каждая единица содержит заданное количество активного ингредиента, рассчитанное так, чтобы получить желательный терапевтический эффект, в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем. Примерами таких стандартных лекарственных форм являются таблетки (в том числе таблетки с насечкой или с покрытием), капсулы, пилюли, пакетики порошка, облатки, растворы или суспензии для инъекций, формы, отмеряемые чайной ложкой, столовой ложкой и тому подобное.

Соединение по изобретению вводят в количестве, достаточном, чтобы ингибировать взаимодействие между MDM2 и р53 или другими клеточными белками, которые вызывают апоптоз, вызывают гибель клеток или регулируют цикл клетки.

Онкогенный потенциал MDM2 определяется не только его способностью подавлять р53, но также его способностью регулировать другие белки-супрессоры опухоли, например белок ретинобластомы pRb и тесно связанный фактор транскрипции E2F1.

Так, соединение по изобретению вводят в количестве, достаточном, чтобы модулировать взаимодействие между MDM2 и факторами транскрипции E2F.

Специалист в этой области может легко определить эффективное количество, исходя из результатов испытаний, представленных здесь далее. Как правило, предполагается, что терапевтически эффективное количество должно быть от 0,005 мг/кг до 100 мг/кг массы тела и, в частности, от 0,005 мг/кг до 10 мг/кг массы тела. Может быть подходящим вводить необходимую дозу как одну, две, три, четыре или более подразделенных доз с соответствующими интервалами в течение суток. Указанные подразделенные дозы могут быть оформлены как единичные дозированные формы, например, содержащие от 0,5 до 500 мг, и, в частности, от 10 мг до 500 мг активного ингредиента на единичную дозированную форму.

В другом аспекте данного изобретения рассматривается сочетание ингибитора р53-MDM2 с другим противораковым средством, особенно для применения в качестве лекарственного средства, более конкретно при лечении рака или родственных болезней.

Для лечения указанных состояний соединения по изобретению могут быть выгодно использованы в сочетании с одним или несколькими другими лекарственными средствами, более конкретно, с другими противораковыми средствами. Примеры противораковых средств включают, но без ограничения указанными, следующие:

- координационные соединения платины, например цисплатин, карбоплатин или оксалиплатин;

- соединения таксана, например паклитаксел или доцетаксел;

- ингибиторы топоизомеразы I, такие как соединения камптотецина, например иринотекан или топотекан;

- ингибиторы топоизомеразы II, такие как противоопухолевые эпиподофиллотоксины или производные подофиллотоксина, например этопозид или тенипозид;

- противоопухолевые винка-алкалоиды, например винбластин, винкристин или винорелбин;

- противоопухолевые нуклеозидные производные, например 5-фторурацил, лейковорин, гемцитабин или капецитабин;

- алкилирующие агенты, такие как азотная горечь или нитрозомочевина, например циклофосфамид, хлорамбуцил, кармустин, тиотепа, мефалан или ломустин;

- противоопухолевые антрациклиновые производные, например даунорубицин, доксорубицин, доксил, идарубицин или митоксантрон;

- молекулы, которые нацелены на рецептор IGF-1, например пикроподофилин;

- тетракарциновые производные, например тетрокарцин А;

- глюкокортиколиден, например преднизон;

- антитела, например трастузумаб (антитело HER2), ритуксимаб (антитело CD20), гемтузамаб, цетуксимаб, пертузумаб или бевацизумаб;

- антагонисты эстрогенового рецептора или селективные модуляторы эстрогенового рецептора, например тамоксифен, фулвестрант, торемифен, дролоксифен, фаслодекс или ралоксифен;

- ингибиторы ароматазы, такие как экземестан, анастрозол, летразол и ворозол;

- агенты дифференциации, такие как ретиноиды, витамин D или ретиноевая кислота, и агенты, блокирующие метаболизм ретиноевой кислоты, (RAMBA), например аккутан;

- ингибиторы ДНК метил трансферазы, например азацитидин или децитабин;

- антифолаты, например преметрексед динатрий;

- антибиотки, например антиномицин D, блеомицин, митомицин С, дактиномицин, карминомицин или дауномицин;

- антиметаболиты, например хлофарабин, аминоптерин, цитозин арабинозид или метотрексат;

- вызывающие апоптоз агенты и антиангиогенные агенты, такие как ингибиторы Bcl-2, например YC 137, BH 312, ABT 737, госсипол, НА 14-1, TW 37 или декановая кислота;

- связывающие тубулин агенты, например комбрестатин, колхицинины или нокодазол;

- ингибиторы киназы, например флавоперидол, иматиниб мезилат, эрлотиниб или гефитиниб;

- ингибиторы фарнезилтрансферазы, например типифарниб;

- ингибиторы гистон деацетилазы (HDAC), например бутират натрия, субероиланилид гидроксамидокислота (SAHA), депсипептид (FR 901228), NVP-LAQ824, R306465, JNJ-26481585 или трихостатин А;

- ингибиторы убихитин-протеасомного пути, например PS-341, MLN.41 или бортезомиб;

- йонделис;

- игибиторы теломеразы, например теломестатин;

- ингибиторы матричной металлопротеиназы, например батимастат, маримастат, приностат или метастат.

Как установлено выше, соединения по данному изобретению также имеют терапевтические применения в сенсибилизации опухолевых клеток к химиотерапии и радиотерапии.

Поэтому соединения по данному изобретению могут быть использованы в качестве "радиосенсибилизатора" и/или "хемосенсибилизатора" или могут быть даны в сочетании с другим "радиосенсибилизатором" и/или "хемосенсибилизатором".

Используемый здесь термин "радиосенсибилизатор" определяется как молекула, предпочтительно молекула низкой молекулярной массы, вводимая животным в терапевтически эффективных количествах для повышения чувствительности клеток к ионизирующему излучению и/или для промотирования лечения заболеваний, которые поддаются лечению ионизирующим излучением.

Используемый здесь термин "хемосенсибилизатор" определяется как молекула, предпочтительно молекула низкой молекулярной массы, вводимая животным в терапевтически эффективных количествах для повышения чувствительности клеток к химиотерапии и/или для промотирования лечения заболеваний, которые поддаются лечению химиотерапевтическими средствами.

Различные механизмы образа действия радиосенсибилизаторов выдвинуты в качестве предположения в литературе, в том числе: радиосенсибилизаторы гипоксических клеток (например, соединения 2-нитроимидазола и соединения бензотриазин диоксида), имитирующие кислород или проявляющие альтернативное поведение, подобное биоредуктивным агентам при гипоксии; радиосенсибилизаторы негипоксических клеток (например, галогенированные пиримидины) могут быть аналогами оснований ДНК и преимущественно включаются в ДНК раковых клеток и, тем самым, промотируют вызываемое излучением разрушение молекул ДНК и/или препятствуют нормальным механизмам восполнения ДНК, и различные другие потенциальные механизмы действия радиосенсибилизаторов в лечении заболевания были предложены в качестве гипотез.

Многие протоколы лечения рака в настоящее время используют радиосенсибилизаторы в сочетании с облучением рентгеновскими лучами. Примеры активируемых рентгеновскими лучами радиосенсибилизаторов включают, но без ограничения указанными, следующие: метронидазол, мисонидазол, десметилмисонидазол, пимонидазол, этанидазол, ниморазол, митомицин С, RSU 1069, SR 4233, EO9, RB 6145, никотинамид, 5-бромдезоксиуридин (BUdR), 5-иоддезоксиуридин (IUdR), бромдезоксицитидин, фтордезоксиуридин (FudR), гидроксимочевину, цисплатин и их терапевтически эффективные аналоги и производные.

Фотодинамическая терапия (PDT) злокачественных заболеваний использует видимый свет в качестве радиационного активатора сенсибилизирующего агента. Примеры фотодинамических радиосенсибилизаторов включают, но без ограничения указанными, следующие: гематопорфириновые производные, фотофрин, бензопорфириновые производные, олово этиопорфирин, феоборбид-а, бактериохлорофилл-а, нафталоцианины, фталоцианины, цинк фталоцианин и их терапевтически эффективные аналоги и производные.

Радиосенсибилизаторы могут быть введены в сочетании с терапевтически эффективным количеством одного или нескольких других соединений, включая, но без ограничения указанными, соединения, которые промотируют внедрение радиосенсибилизаторов в целевые клетки; соединения, которые регулируют поток терапевтических средств, питательных веществ и/или кислорода в целевые клетки; химиотерапевтические агенты, которые действуют на опухоль, с дополнительным облучением или без него, или другие терапевтически эффективные соединения для лечения рака или другого заболевания.

Хемосенсибилизаторы могут быть введены в сочетании с терапевтически эффективным количеством одного или нескольких других соединений, включая, но без ограничения указанными, соединения, которые промотируют внедрение хемосенсибилизаторов в целевые клетки; соединения, которые регулируют поток терапевтических средств, питательных веществ и/или кислорода в целевые клетки; химиотерапевтические агенты, которые действуют на опухоль, или другие терапевтически эффективные соединения для лечения рака или другого заболевания. Антагонист кальция, например верапамил, найден применимым в сочетании с действующими против новообразований агентами для придания хемочувствительности опухолевым клеткам, резистентным к признанным химиотерапевтическим агентам, и усиления эффективности указанных соединений в чувствительных к лекарству злокачественных новообразованиях.

Ввиду их полезных фармакологических свойств компоненты комбинаций по данному изобретению, т.е. другое лекарственное средство и ингибитор р53-MDM2, могут быть включены в состав различных фармацевтических форм для целей введения. Компоненты могут быть включены порознь в отдельные фармацевтические композиции или включены в единую фармацевтическую композицию, содержащую оба компонента.

Данное изобретение поэтому относится также к фармацевтической композиции, содержащей другое лекарственное средство и ингибитор р53-MDM2 вместе с одним или несколькими фармацевтическими носителями.

Данное изобретение относится также к применению комбинации по данному изобретению для получения фармацевтической композиции для ингибирования роста опухолевых клеток.

Данное изобретение дополнительно относится к продукту, содержащему в качестве первого активного ингредиента ингибитор р53-MDM2 по данному изобретению и в качестве второго активного ингредиента противораковое средство, как комбинированный препарат для одновременного, раздельного или последовательного применения при лечении пациентов, страдающих раком.

Другое лекарственное средство и ингибитор р53-MDM2 могут быть введены одновременно (например, в отдельных или единых композициях) или последовательно в любом порядке. В последнем случае два соединения следует вводить в течение такого периода и в таком количестве и таким способом, которые достаточны для гарантии того, что будет достигнут полезный или синергический эффект. Следует принимать во внимание, что предпочтительный способ и порядок введения и соответствующие дозированные количества и режимы для каждого компонента комбинации будут зависеть от конкретного другого лекарственного средства и ингибитора р53-MDM2, которые вводят, пути их введения, конкретной опухоли, подвергаемой лечению, и конкретного субъекта, подвергаемого лечению. Оптимальный способ и порядок введения и дозированные количества и режим легко могут быть определены специалистами с использованием традиционных методов и с учетом приводимой здесь информации.

Координационное соединение платины предпочтительно вводят в дозе от 1 до 500 мг на квадратный метр (мг/м²) площади поверхности тела, например от 50 до 400 мг/м², в частности для цисплатины в дозе около 75 мг/м² и для карбоплатины около 300 мг/м² на курс лечения.

Соединение таксана предпочтительно вводят в дозе от 50 до 400 мг на квадратный метр (мг/м²) площади поверхности тела, например от 75 до 250 мг/м², в частности для паклитакселя в дозе от около 175 до 250 мг/м² и для доцетакселя от около 75 до 150 мг/м² на курс лечения.

Соединение камптотецина предпочтительно вводят в дозе от 0,1 до 400 мг на квадратный метр (мг/м²) площади поверхности тела, например от 1 до 300 мг/м², в частности для иринотекана в дозе от около 100 до 350 мг/м² и для топотекана от около 1 до 2 мг/м² на курс лечения.

Противоопухолевое производное подофиллотоксина предпочтительно вводят в дозе от 30 до 300 мг на квадратный метр (мг/м²) площади поверхности тела, например от 50 до 250 мг/м², в частности для этопозида в дозе от около 35 до 100 мг/м² и для тенипозида от около 50 до 250 мг/м² на курс лечения.

Противоопухолевый винка-алкалоид предпочтительно вводят в дозе от 2 до 30 мг на квадратный метр (мг/м²) площади поверхности тела, в частности для винбластина в дозе от около 3 до 12 мг/м², для винкристина в дозе от около 1 до 2 мг/м² и для винорелбина в дозе от около 10 до 30 мг/м² на курс лечения.

Противоопухолевое производное нуклеозида предпочтительно вводят в дозе от 200 до 2500 мг на квадратный метр (мг/м²) площади поверхности тела, например от 700 до 1500 мг/м², в частности для 5-FU в дозе от 200 до 500 мг/м², для гемцитабина в дозе от около 800 до 1200 мг/м² и для капецитабина от около 1000 до 2500 мг/м² на курс лечения.

Алкилирующие агенты, такие как азотная горечь или нитрозомочевина, предпочтительно вводят в дозе от 100 до 500 мг на квадратный метр (мг/м²) площади поверхности тела, например от 120 до 200 мг/м², в частности для циклофосфамида в дозе от около 100 до 500 мг/м², для хлорамбуцила в дозе от около 0,1 до 0,2 мг/м², для кармустина в дозе от около 150 до 200 мг/м² и для ломустина в дозе от около 100 до 150 мг/м² на курс лечения.

Противоопухолевое производное антрациклина предпочтительно вводят в дозе от 10 до 75 мг на квадратный метр (мг/м²) площади поверхности тела, например от 15 до 60 мг/м², в частности для доксорубицина в дозе от около 40 до 75 мг/м², для даунорубицина в дозе от около 25 до 45 мг/м² и для идарубицина в дозе от около 10 до 15 мг/м² на курс лечения.

Антиэстрогеновый агент предпочтительно вводят в дозе от около 1 до 100 мг в сутки в зависимости от конкретного агента и состояния, подвергаемого лечению. Тамоксифен предпочтительно вводят перорально в дозе от 5 до 50 мг, предпочтительно от 10 до 20 мг дважды в сутки, продолжая лечение в течение достаточного времени, чтобы достичь и сохранить терапевтический эффект. Торемифен предпочтительно вводят перорально в дозе от около 60 мг раз в сутки, продолжая лечение в течение достаточного времени, чтобы достичь и сохранить терапевтический эффект. Анастрозол предпочтительно вводят перорально в дозе от около 1 мг раз в сутки. Дролоксифен предпочтительно вводят перорально в дозе около 20-100 мг раз в сутки. Ралоксифен предпочтительно вводят перорально в дозе около 60 мг раз в сутки. Экземестан предпочтительно вводят перорально в дозе около 25 мг раз в сутки.

Антитела предпочтительно вводят в дозе от около 1 до 5 мг на квадратный метр (мг/м²) площади поверхности тела или так, как принято в медицине, если отличается. Трастузумаб предпочтительно вводят в дозе от 1 до 5 мг на квадратный метр (мг/м²) площади поверхности тела, в частности от 2 до 4 мг/м² на курс лечения.

Указанные дозы можно вводить, например, один раз, два или более раз на курс лечения, который может быть повторен, например, каждые 7, 14, 21 или 28 дней.

Соединения формулы (I), их фармацевтически приемлемые аддитивные соли с кислотами и стереоизомерные формы могут иметь ценные диагностические свойства, благодаря которым они могут быть использованы для обнаружения или идентификации взаимодействия р53-MDM2 в биологическом образце, включая обнаружение или измерение образования комплекса между меченым соединением и/или р53, и/или MDM2, и/или другими молекулами, пептидами, белками, ферментами или рецепторами.

В методах обнаружения или идентификации могут быть использованы соединения, которые метят маркировочными агентами, такими как радиоизотопы, ферменты, флуоресцентные вещества, люминесцентные вещества и т.п. Примеры радиоизотопов включают ¹²⁵I, ¹³¹I, ³H и ¹⁴С. Ферменты обычно делают обнаруживаемыми путем объединения с соответствующим субстратом, который, в свою очередь, катализирует реакцию обнаружения. Примеры их включают, например, бета-галактозидазу, бета-глюкозидазу, щелочную фосфатазу, пероксидазу и малат дегидрогеназу, предпочтительно пероксидазу хрена. Люминесцентные вещества включают, например, люминол, производные люминола, люциферин, экворин и люциферазу.

Биологические образцы могут быть определены как ткань тела или жидкости тела. Примерами жидкостей тела являются цереброспинальная жидкость, кровь, плазма, сыворотка, моча, мокрота, слюна и тому подобное.

Следующие примеры поясняют данное изобретение.

Экспериментальная часть

Здесь далее "DMF" означает N,N-диметилформамид, "DCM" означает дихлорметан, "EtOAc" означает этилацетат, "EtOH" означает этанол, "MeOH" означает метанол и "THF" означает тетрагидрофуран.

Температуры плавления

Для некоторых соединений температуры плавления определяли с помощью термостенда Kofler, содержащего нагреваемую плиту с линейным температурным градиентом, дифференциальный указатель и температурную шкалу в градусах Цельсия.

LCMS

Метод А

Градиент HPLC обеспечивали системой Alliance HT 2795 (Waters), содержащей четырехступенчатый насос с дегазатором, автоматический прибор для взятия проб и диодный детектор (DAD). Поток из колонки отводили к MS детектору. MS детектору придавали форму с электрораспылительным источником ионизации. Напряжение капиллярного указателя было 3 кВ, и температуру источника поддерживали при 100°С на LCT (Время масс-спектрометра Flight-Z-spray от Waters). Азот использовали в качестве распылительного газа. Приобретение данных осуществляли информационной системой Waters-Micromass MassLynx-Openlynx data system. HPLC с обращенной фазой проводили на колонке n Xterra-RP C18 (5 мкм, 3,9 × 150 мм) со скоростью потока 1,0 мл/мин при температуре 30°С. Две подвижные фазы (подвижная фаза A: 100% 7 мМ ацетат аммония; подвижная фаза B: 100% ацетонитрил; использовали для создания условия градиента от 85% A, 15% B (удерживание в течение 3 минут) до 20% A, 80% B в течение 5 минут, удерживание при 20% A и 80% B в течение 6 минут и восстановление равновесия с первоначальными условиями в течение 3 минут. Использовали объем впрыска 20 мкл. Конусное напряжение было 20 В для режима положительной ионизации. Масс-спектр получали сканированием от 100 до 900 за 8 секунд, используя задержку (InterScan delay) 0,08 секунд.

Метод B

Градиент LC обеспечивали системой Acquity UPLC (Waters), содержащей бинарный насос, устройство для отбора проб, колонный нагреватель (настроенный на 55°C) и диодный детектор (DAD). Поток из колонки отводили к MS детектору. MS детектору придавали форму с электрораспылительным источником ионизации. Масс-спектр получали сканированием от 100 до 1000 за 0,18 секунды, используя задержку 0,02 секунды. Напряжение капиллярного указателя было 3,5 кВ, и температуру источника поддерживали при 140°С. Азот использовали в качестве распылительного газа. Приобретение данных осуществляли информационной системой Waters-Micromass MassLynx-Openlynx data system.

Сверхпроизводительную жидкостную хроматографию (UPLC) с обращенной фазой проводили на колонке мостиковый этилсилоксан/диоксид кремния (BEH) C18 (1,7 мкм, 2,1 × 50 мм) со скоростью потока 0,8 мл/мин. Две подвижные фазы (подвижная фаза A: 0,1% муравьиная кислота в смеси H₂O/метанол 95/5; подвижная фаза B: метанол) использовали для создания условия градиента от 95% A до 5% A, 95% B за 1,3 минуты и удерживания в течение 0,2 минуты. Использовали объем впрыска 0,5 мкл.

Конусное напряжение было 10 В для режима положительной ионизации и 20 В для режима отрицательной ионизации.

A. Получение промежуточных соединений

Пример A1

a) Получение промежуточного соединения 1

К раствору 5-нитроиндолина (10,0 г, 0,061 моль) и гидрохлорида 4-хлорпиридина (11,0 г, 0,073 моль) в DMF (60 мл) в атмосфере аргона при 0°C добавляют порциями трет-бутоксид калия (17,0 г, 0,15 моль). Смесь нагревают вплоть до 100°C в течение 16 часов. Смесь выливают на лед и экстрагируют дважды EtOAc. Органический слой отделяют, сушат (MgSO₄), фильтруют и растворитель выпаривают. Остаток очищают дважды колоночной хроматографией на силикагеле (40-63 мкм) (элюент: циклогексан/EtOAc/MeOH 50/50/0 до 0/80/20). Чистые фракции собирают и растворитель выпаривают, получая 2,49 г (17%) промежуточного соединения 1 в виде коричневато-оранжевого твердого вещества.

¹H ЯМР (300 МГц, DMSO-d₆) δ 8,47 (дд, 2H, J=6,4, J=1,6), 8,06 (м, 2H), 7,41 (д, 1H, J=9,6), 7,28 (дд, 2H, J=6,4, J=1,6), 4,16 (т, 2H, J=8,6), 3,22 (т, 2H, J=8,6).

MC (ES+C m/z 242(М+1).

b) Получение промежуточного соединения 2

Смесь промежуточного соединения 1 (2,4 г, 0,010 моль) и никеля Ренея (5 мл, 50% суспензия в воде) в EtOH (45 мл) и THF (45 мл) перемешивают при комнатной температуре при 30 psi (фунт на кв. дюйм) водорода в течение 3 часов. После фильтрования через целитовую прокладку растворитель выпаривают, получая 2,01 г (96%) промежуточного соединения 2 в виде коричневого твердого вещества.

¹H ЯМР (300 МГц, CMCl₃) δ 8,32 (дд, 2H, J=6,4, J=1,5), 7,15 (д, 1H, J=8,5), 6,92 (дд, 2H, J=6,4, J=1,5), 6,63 (д, 1H, J=2,2), 6,50 (дд, 1H, J=8,3, J=2,4), 3,92 (т, 2H, J=8,3), 3,44 (уш.с, 2H), 3,08 (т, 2H, J=8,3).

с) Получение промежуточного соединения 3

К раствору промежуточного соединения 2 (1,9 г, 0,0089 моль) в DCM (20 мл) и THF (20 мл) в атмосфере аргона добавляют последовательно индол-3-уксусную кислоту (2,0 г, 0,012 моль), гидрат 1-гидроксибензотриазола (1,6 г, 0,012 моль) и гидрохлорид 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида (2,2 г, 0,012 моль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 40 часов. Чтобы завершить реакцию, добавляют индол-3-уксусную кислоту (1,6 г, 0,0089 моль) и гидрохлорид 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида (1,7 г, 0,0089 моль) и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение более 16 часов. Растворители выпаривают и остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле (40-63 мкм) (элюент: DCM/MeOH/NH₄OH 95/5/0,1 до 80/20/0,1). Собранные фракции выпаривают, полученное в результате твердое вещество промывают MeOH и сушат, получая 1,95 г (60%) промежуточного соединения 3.

¹H ЯМР (300 МГц, DMSO-d₆) δ 10,93 (уш.с, 1H), 10,08 (уш.с, 1H), 8,31 (д, 2H, J=6,3), 7,88 (д, 1H, J=8,1), 7,58 (м, 2H), 7,34 (м, 2H), 7,26 (д, 1H, J=2,1), 7,17 (д, 2H, J=6,6), 7,07 (т, 1H, J=6,9), 6,98 (т, 1H, J=7,4), 3,99 (т, 2H, J=8,3), 3,71 (с, 2H), 3,12 (т, 2H, J=8,2).

MC(ES+)Cm/z 369 (М+1).

Пример A2

a) Получение промежуточного соединения 4

К раствору 5-нитроиндолина (5,0 г, 0,030 моль) и 4-хлорхинолина (6,0 г, 0,037 моль) в DMF (30 мл) в атмосфере аргона добавляют порциями трет-бутоксид калия (8,4 г, 0,075 моль). Смесь перемешивают при 100°C в течение 16 часов, затем при комнатной температуре в течение 70 часов. Смесь выливают на лед и экстрагируют 3 раза EtOAc. Органический слой отделяют, промывают насыщенным раствором соли, сушат (MgSO₄), фильтруют и растворитель выпаривают. Остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле (40-63 мкм) (элюент: EtOAc/циклогексан 50/50 до 100/0). Чистые фракции собирают и растворитель выпаривают, получая 2,26 г (26%) промежуточного соединения 4 в виде оранжевого твердого вещества.

¹H ЯМР (300 МГц, CMCl₃) δ 8,93 (д, 1H, J=4,9), 8,11 (м, 2H), 7,92 (дд, 1H, J=8,9, J=2,5), 7,85 (д, 1H, J=7,7), 7,82 (дт, 1H, J=7,0, J=1,4), 7,60 (дт, 1H, J=6,8, J=1,2), 7,54 (д, 1H, J=4,9), 6,26 (д, 1H, J=8,9), 4,30 (т, 2H, J=8,4), 3,35 (т, 2H, J=8,2).

MC(ES+)Cm/z 292 (М+1).

b) Получение промежуточного соединения 5

Смесь промежуточного соединения 4 (2,0 г, 0,0069 моль) и никеля Ренея (3 мл, 50% суспензия в воде) в EtOH (30 мл) и THF (30 мл) перемешивают при комнатной температуре под давлением водорода 30 psi в течение 4,5 часов. После фильтрования через целитовую прокладку растворитель выпаривают, получая 1,81 г (100%) промежуточного соединения 5 в виде оранжевого твердого вещества.

¹H ЯМР (300 МГц, CMCl₃) δ 8,71 (д, 1H, J=5,1), 8,07 (д, 1H, J=8,5), 8,01 (д, 1H, J=8,5), 7,67 (т, 1H, J=7,0), 7,41 (т, 1H, J=7,1), 7,09 (д, 1H, J=5,1), 6,67 (с, 1H), 6,49 (д, 1H, J=8,3), 6,38 (дд, 1H, J=8,3, J=1,9), 4,04 (т, 2H, J=7,9), 3,39 (уш.с, 2H), 3,12 (т, 2H, J=7,8).

MC(ES+)Cm/z 262 (М+1).

с) Получение промежуточного соединения 6

К раствору промежуточного соединения 5 (1,7 г, 0,0064 моль) в DCM (15 мл) и THF (15 мл) в атмосфере аргона добавляют последовательно индол-3-уксусную кислоту (1,5 г, 0,0084 моль), гидрат 1-гидроксибензотриазола (1,1 г, 0,0084 моль) и гидрохлорид 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида (1,6 г, 0,0084 моль). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 16 часов. Растворители выпаривают и остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле (40-63 мкм) (элюент: DCM/MeOH/NH₄OH 90/10/0,1). Чистые фракции собирают и растворитель выпаривают, получая 1,15 г (43%) промежуточного соединения 6 в виде коричневой пены.

¹H ЯМР (300 МГц, CMCl₃) δ 8,74 (д, 1H, J=5,1), 8,61 (уш.с, 1H), 8,09 (д, 1H, J=8,1), 7,91 (д, 1H, J=8,4), 7,70-7,62 (м, 2H), 7,41 (м, 4H), 7,22 (м, 3H), 7,09 (д, 1H, J=5,1), 6,74 (дд, 1H, J=8,4, J=1,8), 6,38 (д, 1Н, J=8,4), 4,04 (т, 2H, J=8,0), 3,89 (c, 2H), 3,15 (т, 2H, J=7,9).

MC(ES+) m/z 419 (М+1).

Пример A3

Получение промежуточного соединения 7

Смесь индол-3-уксусной кислоты (2,0 г, 0,013 моль) и 1,1-карбонилдиимидазола (2,1 г, 0,013 моль, добавленный порциями) в DCM (28 мл) перемешивают в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение 2 часов. Гидрохлорид N,O-диметилгидроксиламина (1,3 г, 0,013 моль) добавляют, смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 16 часов и затем выливают в лед с водой. pH доводят до 10 4 н. раствором гидроксида натрия и водный слой экстрагируют дважды EtOAc. Органический слой отделяют, промывают 3 н. раствором гидрохлорида, сушат (MgSO₄), фильтруют и растворитель выпаривают, получая 2,37 г (89%) промежуточного соединения 7 в виде розового твердого вещества.

¹H ЯМР (300 МГц, CMCl₃) δ 8,09 (уш.с, 1H), 7,66 (д, 1H, J=7,5), 7,36 (д, 1H, J=7,5), 7,22-7,10 (м, 3H), 3,92 (c, 2H), 3,66 (c, 3H), 3,23 (c, 3H).

Пример A4

a) Получение промежуточного соединения 8

Смесь 5-нитроиндолина (4,0 г, 0,024 моль) и метилового сложного эфира 4-хлор-2-пиридинкарбоновой кислоты (5,0 г, 0,029 моль) в уксусной кислоте (24 мл) нагревают вплоть до 120°C в течение 25 минут в микроволновом аппарате Biotage Initiator. Реакцию гасят льдом, pH доводят до pH 9 добавлением насыщенного раствора карбоната калия. Смесь экстрагируют 3 раза DCM. Органический слой отделяют, сушат (MgSO₄), фильтруют и растворитель выпаривают. Остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле (40-63 мкм) (элюент: DCM/MeOH 100/0 до 90/10). Чистые фракции собирают и растворитель выпаривают, получая 1,37 г (19%) промежуточного соединения 8 в виде желтого твердого вещества.

¹H ЯМР (300 МГц, CMCl₃) δ 8,65 (д, 1H, J=5,6), 8,16 (дд, 1H, J=8,9, J=2,1), 8,11 (с, 1H), 7,98 (д, 1H, J=2,5), 7,35 (д, 1H, J=8,9), 7,30 (дд, 1H, J=5,7, J=2,5), 4,23 (т, 2H, J=8,5), 4,05 (c, 3H), 3,32 (т, 2H, J=8,4).

MC(ES+) m/z 300 (М+1).

b) Получение промежуточного соединения 9

Смесь промежуточного соединения 8 (1,2 г, 0,0045 моль) и никеля Ренея (4 мл, 50% суспензия в воде) в MeOH (20 мл) и THF (20 мл) перемешивают при комнатной температуре в атмосфере водорода в течение 20 часов. После фильтрования через целитовую прокладку растворитель выпаривают, получая 1,06 г (88%) промежуточного соединения 9 в виде оранжевого твердого вещества.

¹H ЯМР (300 МГц, CMCl₃) δ 8,40 (д, 1H, J=5,8), 7,77 (д, 1H, J=2,5), 7,18 (д, 1H, J=8,4), 7,05 (дд, 1H, J=5,8, J=2,6), 6,62 (д, 1H, J=2,2), 6,52 (дд, 1H, J=8,4, J=2,4), 4,00 (м, 5H), 3,09 (т, 2H, J=8,3).

MC (ES+) m/z 270 (М+1).

Пример A5

a) Получение промежуточного соединения 10

Смесь 5-аминоиндола (1,1 г, 0,0086 моль) и фталевого ангидрида (2,6 г, 0,017 моль) в DMF (20 мл) перемешивают при 100°C в течение 5 часов, затем при комнатной температуре в течение 64 часов. Реакционную смесь разбавляют в EtOAc, промывают дважды насыщенным раствором хлорида аммония, сушат (MgSO₄), фильтруют и растворитель выпаривают. Полученное в результате масло забирают в уксусную кислоту (15 мл) и перемешивают при комнатной температуре в течение 20 минут, затем нагревают вплоть до 80°C в течение 1,5 часов. Добавляют лед и pH доводят до pH 4 насыщенным раствором карбоната натрия. Смесь экстрагируют дважды EtOAc. Органический слой отделяют, сушат (MgSO₄), фильтруют и растворитель выпаривают. Остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле (40-63 мкм) (элюент: EtOAc/циклогексан 40/60). Чистые фракции собирают и растворитель выпаривают, получая 2,06 г (91%) промежуточного соединения 10.

¹H ЯМР (300 МГц, CMCl₃) δ 8,32 (уш.с, 1H), 7,97 (м, 2H), 7,79 (м, 2H), 7,66 (д, 1H, J=2,0), 7,49 (д, 1H, J=8,6), 7,27 (дд, 1H, J=5,7, J=2,8), 7,17 (дд, 1H, J=8,6, J=2,0), 6,61 (т, 1H,J=1,1).

MC (ES+C m/z 263 (М+1).

b) Получение промежуточного соединения 11

Смесь промежуточного соединения 10 (2,1 г, 0,0079 моль) и цианоборгидрида натрия (987 мг, 0,016 моль) в уксусной кислоте (30 мл) перемешивают при комнатной температуре в течение 18 часов. Добавляют лед и pH доводят до 6 насыщенным раствором карбоната натрия. Смесь экстрагируют дважды EtOAc. Органический слой отделяют, промывают насыщенным раствором соли, сушат (MgSO₄), фильтруют и растворитель выпаривают. Остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле (40-63 мкм) (элюент: EtOAc/циклогексан 30/70 до 70/30). Чистые фракции собирают и растворитель выпаривают, получая 726 мг (35%) промежуточного соединения 11 в виде желтого твердого вещества.

¹H ЯМР (300 МГц, CMCl₃) δ 7,93 (м, 2H), 7,77 (м, 2H), 7,09 (с, 1H), 7,00 (д, 1H, J=8,2), 6,70 (д, 1H, J=8,2), 3,62 (т, 2H, J=8,4), 3,09 (т, 2H, J=8,4).

MC (ES+C m/z 265 (М+1).

с) Получение промежуточного соединения 12

Смесь промежуточного соединения 11 (570 мг, 0,0022 моль), 4-бром-6,7-дигидро-5H-[1]пиридин-7-ола (554 мг, 0,0026 моль) и 5 н. раствора гидрохлорида в 2-пропаноле (0,57 мл, 0,0029 моль) в DMF (11 мл) нагревают вплоть до 120°C в течение 1 часа в микроволновом аппарате Biotage Initiator. Реакцию гасят насыщенным раствором гидрокарбоната натрия и экстрагируют 3 раза DCM. Растворители выпаривают. Остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле (40-63 мкм) (элюент: EtOAc/MeOH 100/0 до 80/20, затем DCM/MeOH 95/5 до 90/10). Чистые фракции собирают и растворитель выпаривают, получая 651 мг (76%) промежуточного соединения 12 в виде желтого твердого вещества.

¹H ЯМР (300 МГц, CMCl₃) δ 8,30 (д, 1H, J=5,6), 7,95 (м, 2H), 7,79 (м, 2H), 7,23-7,12 (м, 3H), 6,94 (д, 1H, J=8,4), 5,24 (т, 1H, J=7,0), 4,18 (м, 1H), 4,08 (м, 1H), 3,25 (м, 2H), 3,00 (м, 1H), 2,85 (м, 1H), 2,57 (м, 1H), 2,06 (м, 1H).

MC (ES+C m/z 398 (М+1).

d) Получение промежуточного соединения 13

При комнатной температуре гидразингидрат (137 мкл, 0,0028 моль) добавляют к суспензии промежуточного соединения 12 (557 мг, 0,0014 моль) в MeOH (5,5 мл) и полученную в результате смесь нагревают вплоть до 70°C в течение 40 минут. Реакцию гасят водой и экстрагируют 4 раза EtOAc. Органический слой отделяют, сушат (MgSO₄), фильтруют и растворитель выпаривают, получая 392 мг (100%) промежуточного соединения 13 в виде коричневато-оранжевого твердого вещества.

¹H ЯМР (300 МГц, CMCl₃) δ 8,18 (д, 1H, J=5,8), 7,07 (д, 1H, J=5,8), 6,49 (д, 1H, J=8,3), 6,63 (д, 1H, J=2,1), 6,48 (дд, 1H, J=8,3, J=2,4), 5,21 (м, 1H), 4,19 (уш.с, 2H), 4,03 (м, 3H), 3,05 (м, 3H), 2,84 (м, 1H), 2,50 (м, 1H), 2,03 (м, 1H).

Пример А6

а) Получение промежуточного соединения 14

Смесь 2,3-дигидро-3,3-диметил-5-нитро-1Н-индола (0,003 моль) и 4-бром-пиридина (0,003 моль) в 1-бутаноле (5 мл) нагревают в герметизированной пробирке в микроволновой печи при 140°C в течение 30 минут, затем забирают в 10% раствор карбоната калия и экстрагируют EtOAc. Органический слой промывают водой, затем NaCl и насыщенным раствором соли, сушат (MgSO₄), фильтруют и растворитель выпаривают. Остаток (0,8 г) очищают колоночной хроматографией на силикагеле (20-45 мкм) (элюент: DCM/MeOH 100/0 до 98/20. Чистые фракции собирают и растворитель выпаривают. Остаток (0,45 г, 64%) кристаллизуют из ацетонитрила. Осадок отфильтровывают и сушат, получая 0,216 г (31%) промежуточного соединения 14, температура плавления 217°C (Kofler).

¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ 1,4 (6H, с), 3,92 (2H, с), 7,3 (2H, м), 7,45 (1Н, м), 8,10 (2H, м), 8,47 (2H, м)

LCMS (ES+) m/z 270 (М+1), R_t=0,77, способ B

b) Получение промежуточного соединения 15

Смесь промежуточного соединения 14 (0,003 моль) и никеля Ренея (0,9 г) в MeOH (20 мл) гидрируют при комнатной температуре в течение 1 часа под давлением 3 бар, затем фильтруют через целит. Целит промывают MeOH. Фильтрат выпаривают, получая 0,8 г (100%) промежуточного соединения 15.

с) Получение промежуточного соединения 16

Гексафторфосфат бромтрис(пирролидино)фосфония (0,004 моль) добавляют порциями при комнатной температуре к раствору промежуточного соединения 15 (0,003 моль), 1Н-индол-3-уксусной кислоты (0,004 моль), 1-гидроксибензотриазола (0,04 моль) и диизопропилового простого эфира (0,005 моль) в DCM (15 мл). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Органический слой промывают 10% раствором карбоната калия, сушат (MgSO₄), фильтруют и растворитель выпаривают. Остаток (3,2 г) очищают колоночной хроматографией на силикагеле (15-40 мкм) (элюент: DCM/MeOH/NH₄OH 95/5/0,2). Чистые фракции собирают и растворитель выпаривают. Остаток (0,7 г, 52%) кристаллизуют из ацетонитрила. Осадок отфильтровывают и сушат, получая 0,55 г (41%) промежуточного соединения 16, температура плавления 158°C (Kofler).

¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ 1,28 (6H, с), 3,7 (2H, с), 3,73 (2H, с), 6,99 (1H, т, J=7,7 Гц), 7,07-7,11 (3H, м), 2,25 (1Н, д, J=3,6 Гц), 7,30-7,39 (3H, м), 7,55 (1Н, уш.д, J=3,6 Гц), 7,62 (1Н, д, J=7,7 Гц), 8,3 (2H, д, J=7,7 Гц), l0,03 (1Н, уш.с), 10,92 (1Н, уш.с)

LCMS (ES+) m/z 397 (М+1), R_t = 8,43, способ A

B. Получение конечных соединений

Пример B1

Получение соединения 1

Смешанный гидрид лития-алюминия (423 мг, 0,0011 моль) добавляют порциями к суспензии промежуточного соединения 3 (1,0 г, 0,0027 моль) в THF (60 мл) в атмосфере аргона. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 24 часов, гасят льдом и разбавленным раствором виннокислого калия-натрия и экстрагируют 3 раза DCM. Органический слой отделяют, сушат (MgSO₄), фильтруют и растворитель выпаривают. Остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле (40-63 мкм) (элюент: DCM/MeOH/NH₄OH 95/5/0,1). Чистые фракции собирают и растворитель выпаривают, получая 170 мг (18%) соединения 1 в виде желтой пены.

¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃) δ 8,36 (уш.с, 1H), 8,32 (д, 2H, J=6,6), 7,63 (д, 1H, J=7,8), 7,39 (д, 1H, J=7,5), 7,24-7,11 (м, 3H), 7,07 (д, 1H, J=1,8), 6,93 (д, 2H, J=6,6), 6,58 (с, 1H), 6,45 (дд, 1H, J=8,4, J=2,1), 3,93 (т, 2H, J=8,2), 3,62 (уш.с, 1H), 3,46 (т, 2H, J=7,5), 3,09 (м, 4H).

LCMS (ES+) m/z 355 (М+1), R_t=8,30, способ A

Пример B2

Получение соединения 2

В атмосфере аргона при комнатной температуре гидрид лития-алюминия (391 мг, 0,010 моль) добавляют порциями к раствору промежуточного соединения 6 (1,1 г, 0,0026 моль) в THF (55 мл). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 18 часов. Реакцию гасят MeOH при 0°C. Добавляют лед и разбавленный раствор виннокислого калия-натрия и смесь экстрагируют 3 раза DCM. Органический слой отделяют, промывают насыщенным раствором соли, сушат (MgSO₄), фильтруют и растворитель выпаривают. Остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле (40-63 мкм) (элюент: DCM/MeOH/NH₄OH 97/3/0,5). Чистые фракции собирают и растворитель выпаривают, получая 121 мг (12%) соединения 2 в виде оранжевой пены.

¹H ЯМР (300 МГц, CMCl₃) δ 8,70 (д, 1H, J=5,1), 8,18 (уш.с, 1H), 8,07 (д, 1H, J=8,7), 8,03 (д, 1H, J=8,7), 7,66 (м, 2H), 7,41 (м, 2H), 7,22 (т, 1H, J=7,7), 7,12 (м, 3H), 6,63 (с, 1H), 6,56 (д, 1H, J=8,4), 6,34 (дд, 1H, J=8,4, J=2,1), 4,06 (т, 2H, J=7,8), 3,46 (т, 2H, J=6,8), 3,12 (м, 4H).

MC (ES+C m/z 405 (М+1).

Пример B3

Получение соединения 3

При 0°C в атмосфере аргона гидрид лития-алюминия (14 мг, 0,00036 моль) добавляют к раствору промежуточного соединения 7 (74 мг, 0,00036 моль) в THF (1 мл). Смесь перемешивают при 0°C в течение 1 часа, гасят 5% раствором гидросульфата калия и экстрагируют дважды EtOAc. Органический слой отделяют, промывают насыщенным раствором соли, сушат (MgSO₄), фильтруют и растворитель выпаривают, получая индол-3-ил ацетальдегид в виде оранжевого масла.

Смесь промежуточного соединения 9 (200 мг, 0,00074 моль) и цианоборгидрида натрия (64 мг, 0,0010 моль) в MeOH (2,3 мл) и уксусную кислоту (2 капли) добавляют по каплям к раствору указанного альдегида (236 мг, 0,0015 моль) в MeOH (2 мл). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 16 часов. Реакцию гасят водой, подщелачивают насыщенным раствором гидрокарбоната натрия и экстрагируют 3 раза EtOAc. Органический слой отделяют, промывают насыщенным раствором соли, сушат (MgSO₄), фильтруют и растворитель выпаривают. Остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле (40-63 мкм) (элюент: EtOAc/MeOH 100/0 до 90/10). Чистые фракции собирают и растворитель выпаривают, получая 190 мг (44%) соединения 3 в виде оранжевой пены.

¹H ЯМР (300 МГц, CMCl₃) δ 8,42 (д, 1H, J=5,7), 8,08 (уш.c, 1H), 7,79 (д, 1H, J=2,4), 7,63 (д, 1H, J=7,8), 7,40 (д, 1H, J=8,1), 7,25-7,07 (м, 5H), 6,59 (c, 1H), 6,48 (дд, 1H, J=8,7, J=2,1), 4,00 (м, 5H), 3,48 (т, 2H, J=6,8), 3,12 (м, 4H).

MC(ES+) m/z 413 (М+1).

Пример B4

Получение соединения 4

Боргидрид натрия (92 мг, 0,0024 моль) медленно добавляют к раствору соединения 3 (100 мг, 0,00024 моль) в MeOH (3 мл). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 часа, затем при 80°C в течение 4 часов и снова при комнатной температуре в течение 85 часов. Реакцию гасят водой и смесь экстрагируют EtOAc. Органический слой отделяют, промывают насыщенным раствором соли, сушат (MgSO₄), фильтруют и растворитель выпаривают. Остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле (40-63 мкм) (элюент: DCM/MeOH 90/10 до 85/10). Чистые фракции собирают и растворитель выпаривают, получая 50 мг (54%) соединения 4 в виде желтой пены.

¹H ЯМР (300 МГц, DMSO-d₆) δ 10,83 (уш.c, 1H), 8,14 (д, 1H, J=5,7), 7,54 (д, 1H, J=7,8), 7,35 (д, 1H, J=7,8), 7,22 (м, 2H), 7,14 (д, 1H, J=2,1), 7,70 (дт, 1H, J=7,6, J=1,2), 6,98 (дт, 1H, J=7,5, J=0,9), 6,86 (дд, 1H, J=6,0, J=2,4), 6,62 (д, 1H, J=2,1), 6,45 (дд, 1H, J=8,7, J=2,2), 5,39 (уш.c, 2H), 4,49 (д, 2H, J=4,0), 3,92 (т, 2H, J=8,2), 3,30 (м, 2H), 3,06 (т, 2H, J=8,1), 2,96 (т, 2H, J=7,5).

MC (ES+) m/z 385 (М+1).

Пример B5

Получение соединения 5

При 0°C в атмосфере аргона гидрид лития-алюминия (14 мг, 0,00036 моль) добавляют к раствору промежуточного соединения 7 (74 мг, 0,00036 моль) в THF (1 мл). Смесь перемешивают при 0°C в течение 1 часа, гасят 5% раствором гидросульфата калия и экстрагируют дважды EtOAc. Органический слой отделяют, промывают насыщенным раствором соли, сушат (MgSO₄), фильтруют и растворитель выпаривают, получая индол-3-ил ацетальдегид в виде оранжевого масла.

К смеси промежуточного соединения 13 (100 мг, 0,00037 моль) и цианоборгидрида натрия (33 мг, 0,00052 моль) в MeOH (1,5 мл) и уксусную кислоту (2 капли) добавляют по каплям к раствору указанного альдегида (57 мг, 0,00036 моль) в MeOH (0,5 мл). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 18 часов. Реакцию гасят насыщенным раствором гидрокарбоната натрия и экстрагируют дважды EtOAc. Органический слой отделяют, промывают насыщенным раствором соли, сушат (MgSO₄), фильтруют и растворитель выпаривают. Остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле (40-63 мкм) (элюент: DCM/MeOH 100/0 до 90/10). Чистые фракции собирают и растворитель выпаривают, получая 79 мг (52%) соединения 5 в виде желтой пены.

¹H ЯМР (300 МГц, CMCl₃) δ 8,37 (уш.с, 1H), 8,15 (д, 1H, J=5,8), 7,63 (д, 1H, J=7,8), 7,37 (д, 1H, J=7,1), 7,21 (дт, 1H, J=7,6, J=1,2), 7,12 (дт, 1H, J=7,6, J=l,l), 7,07 (м, 2H), 6,83 (д, 1H, J=8,5), 6,56 (д, 1H, J=2,0), 6,40 (дд, 1H, J=8,5, J=2,3), 5,22 (т, 1H, J=6,7), 4,19 (уш.с, 1H), 4,04 (м, 3H), 3,44 (т, 2H, J=6,7), 3,06 (м, 5H), 2,83 (м, 1H), 2,54 (м, 1H), 2,08 (м, 1H).

MC(ES+)Cm/z 411 (М+1).

Пример B6

Получение соединения 6

Промежуточное соединение 16 (0,001 моль) добавляют порциями к раствору тетрагидрида лития-алюминия (0,002 моль) в THF (10 мл) в потоке N₂. Смесь перемешивают и кипятят с возвращением флегмы в течение 24 часов, выливают в воду со льдом и фильтруют через целит. Целит промывают EtOAc. Фильтрат экстрагируют EtOAc. Органический слой отделяют, сушат (MgSO₄), фильтруют и растворитель выпаривают. Остаток (0,45 г) очищают колоночной хроматографией на силикагеле (10 мкм) (элюент: DCM/MeOH/NR₄OH 95/5/0,5). Чистые фракции собирают и растворитель выпаривают, получая 0,042 г соединения 6.

¹H ЯМР (DMSO-d₆) δ 1,28 (6H, с), 2,95 (2H, т, J=7,7 Гц), 3,27-3,34 (2H, м), 3,65 (2H, с), 5,38 (1Н, уш.т, J=6,4 Гц), 6,45 (1Н, дд, J=4 Гц,7,7 Гц), 6,57 (1Н, д, J=4 Гц), 6,96-7,02 (3H, м), 7,07 (1Н, т, J=7,7 Гц), 7,15-7,5 (3H, м),7,35(1Н, д, J=7,7 Гц), 7,55 (1Н, д, J=7,7 Гц), 8,22 (1Н, д, J=7,7 Гц), 10,83 (1Н, уш.с).

MC (ES+C m/z 383 (М+1), R_t=9,17, способ A

В таблице F-1 перечислены соединения, которые были получены в одном из указанных примеров.

C. Фармакологический пример

Способность соединений сохранять p53 в клетках A2780 была измерена твердофазным иммуноферментным анализом р53. Анализ p53 является иммуноферментным анализом с применением иммуносэндвича из двух поликлональных антител. Поликлональное антитело, специфическое по отношению к белку р53, было иммобилизовано на поверхности пластиковых лунок. Какой-либо р53, присутствующий в анализируемом образце, будет связываться с иммобилизованным антителом. Биотинилированное идентифицирующее поликлональное антитело также распознает белок р53 и будет связываться с каким-либо р53, который удерживается иммобилизованным антителом. Идентифицирующее антитело, в свою очередь, связывается стрептавидином, конъюгированным с пероксидазой хрена. Пероксидаза хрена катализирует превращение хромогенного субстратного о-фенилендиамина, интенсивность которого пропорциональна количеству белка р53, связанного с планшетом. Цветной продукт реакции определяют количественно с помощью спектрофотометра. Количественный анализ проводят построением стандартной кривой с использованием известных концентраций очищенного рекомбинантного меченного HIS белка р53 (смотри пример С.1).

Клеточную активность соединений формулы (I) определяли на опухолевых клетках U87MG с использованием колориметрического анализа токсичности для клеток или выживания клеток (смотри пример С.2).

Клетки U87MG являются клетками глиобластомы человека с р53 дикого типа. В этой клеточной линии MDM2 строго контролирует экспрессию р53.

С.1. ELISA р53

Клетки A2780 (ATCC) культивировали в среде RPMI 1640, обогащенной 10% фетальной телячьей сывороткой (FCS), 2 мМ L-глутамином и гентамицином, при 37°C в увлажненном инкубаторе с 5% CO₂.

Клетки A2780 высевали при 20000 клеток на лунку на 96-луночный планшет, культивировали в течение 24 часов и обрабатывали соединением в течение 16 часов при 37°C в увлажненном инкубаторе. После инкубации клетки промывали один раз забуференным фосфатом физиологическим раствором и добавляли 30 мкл на лунку солевого буфера RIPA (20 мМ трис, pH 7,0, 0,5 мМ EDTA, 1% Nonidet P40, 0,5% DOC, 0,05% SDS, 1 мМ PMSF, 1 мкг/мл апротинина и 0,5 мкг/мл лейпептина). Планшеты помещали на лед на 30 минут, чтобы завершить лизис. Белок р53 определяли в лизатах с помощью анализа ELISA с использованием иммуносэндвича, который описан ниже.

96-луночные планшеты из сильно связывающего полистирола EIA/RIA (Costar 9018) покрывали иммобилизованным антителом pAb 1801 (Abcam ab28-100) при концентрации 1 мкг/мл в буфере для покрытия (0,1 M NaHCO₃ pH 8,2), 50 мкл на лунку. Антителу давали возможность прилипать в течение ночи при 4°C. Покрытые планшеты промывали один раз забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS)/0,05% Tween 20 и добавляли 300 мкл блокирующего буфера (PBS, 1% альбуминов бычьей сыворотки (BSA)), для периода инкубации в течение 2 часов при комнатной температуре. Разбавления очищенного рекомбинантного меченного HIS белка р53 в пределах 3-200 нг/мл производили в блокирующем буфере и использовали в качестве стандартов.

Планшеты промывали дважды PBS/0,05% Tween 20 и блокирующим буфером или стандарты добавляли по 80 мкл/лунка. К стандартам добавляли 20 мкл лизисного буфера. Образцы добавляли в другие лунки при 20 мкл лизата/лунка. После инкубации в течение ночи при 4°С планшеты промывали дважды PBS/0,05% Tween 20. Аликвоты по 100 мкл вторичного поликлонального антитела p53(F1-393) (Tebubio, sc-6243) при концентрации 1 мкг/мл в блокирующем буфере добавляли в каждую лунку и давали возможность прилипать в течение 2 часов при комнатной температуре. Планшеты промывали три раза PBS/0,05% Tween 20. Идентифицирующее антитело против кроличьего HRP (sc-2004, Tebubio) при 0,04 мкг/мл в PBS/1% BSA добавляли и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Планшеты промывали три раза PBS/0,05% Tween 20 и добавляли 100 мкл субстратного буфера (субстратный буфер готовили незадолго до применения добавлением 1 таблетки из 10 мг o-фенилендиамина (OPD) от Sigma и 125 мкл 3% H₂₀₂ к 25 мл буфера OPD: 35 мМ лимонная кислота, 66 мМ Na₂HPO₄, pH 5,6). Через 5-10 минут цветную реакцию останавливали добавлением 50 мкл стоп-буфера (1 M H₂SO₄) на лунку. Оптическую плотность измеряли при двух длинах волн 490/655 нм, используя ридер для микропланшетов Biorad, и результаты затем анализировали.

Для каждого эксперимента контроли (не содержащие лекарства) и пустое инкубирование (не содержащее ни клеток, ни лекарств) проводили параллельно. Величину пустой пробы вычитали из всех величин контролей и образцов. Для каждого образца величину р53 (в единицах оптической плотности) выражали как процентую долю величины для р53, присутствующего в контроле. Относительную сохранность выше, чем 140%, определяли как значительную. Здесь эффекты испытуемых соединений выражены как наименьшая доза, дающая по меньшей мере 140% от величины для р53, присутствующего в контроле (LAD) (смотри таблицу F-2).

C.2. Анализ пролиферации

Все испытуемые соединения растворяли в DMSO и дополнительные разбавления производили в культуральной среде. Конечные концентрации DMSO никогда не превышали 0,1% (об./об.) в анализах пролиферации клеток. Контроли содержали клетки U87MG и DMSO без соединения, и пустые пробы содержали DMSO, но без клеток.

Посев клеток U87MG производили в 96-луночные планшеты для клеточных культур при 3000 клеток/лунка/100 мкл. Спустя 24 часа среду заменяли и соединение и/или растворитель добавляли до конечного объема 200 мкл. После 4 суток инкубации среду заменяли 200 мкл свежей среды и рост клеток оценивали, используя анализ на основе МТТ. Поэтому 25 мкл раствора МТТ (0,5% MTT сорта для исследований от Serva в забуференном фосфатом физиологическом растворе) добавляли в каждую лунку и клетки дополнительно инкубировали в течение 2 часов при 37°C. Среду затем осторжно отсасывали и синий продукт MTT-формазан растворяли добавлением в каждую лунку 25 мкл 0,1 M глицина и 100 мкл DMSO. Планшеты встряхивали в течение следующих 10 мин на шейкере для микропланшетов перед считыванием оптической плотности при 540 нм ридером для микропланшетов Biorad.

В каждом эксперименте результатами для каждого экспериментального состояния являются средние величины из 3 повторных лунок. Для целей первоначального скрининга соединения испытывали при единой фиксированной концентрации 10^-5 M. Для активных соединений эксперименты повторяли, чтобы установить полные кривые концентрация-отклик. Для каждого эксперимента контроли (не содержащие лекарства) и пустое инкубирование (не содержащее ни клеток, ни лекарств) проводили параллельно. Величину пустой пробы вычитали из всех величин контролей и образцов. Для каждого образца среднюю величину роста клеток (в единицах оптической плотности) выражали как процентую долю средней величины для роста клеток контроля. Когда свойственно, величины IC₅₀ (концентрация лекарства, необходимая для уменьшения роста клеток до 50% контроля) вычисляли, используя пробит-анализ переменных данных (Finney, D.J., Probit Analyses, 2^nd Ed. Chapter 10, Graded Responses, Cambridge University Press, Cambridge 1962). Здесь эффекты испытуемых соединений выражены как pIC₅₀ (величина отрицательного логарифма величины IC₅₀) (смотри таблицу F-2).

В некоторых экспериментах анализ пролиферации приспосабливали и использовали в 384-луночных планшетах для культивирования (смотри таблицу F-2).

Таблица F-2 В таблице F-2 перечислены результаты соединений, которые испытывали согласно примеру С.1 и С.2

D. Композиционный пример: покрытые пленкой таблетки

Получение сердцевины таблетки

Смесь 100 г соединения формулы (I), 570 г лактозы и 200 г крахмала тщательно смешивают и затем увлажняют раствором 5 г додецилсульфата натрия и 10 г поливинилпирролидона приблизительно в 200 мл воды. Влажную порошковую смесь пропускают через сито, сушат и снова пропускают через сито. Затем добавляют 100 г микрокристаллической целлюлозы и 15 г гидрогенизированного растительного масла. Все это тщательно смешивают и прессуют в таблетки, получая 10000 таблеток, каждая из которых содержит 10 мг соединения формулы (I).

Покрытие

К раствору 10 г метилцеллюлозы в 75 мл денатурированного этанола добавляют раствор 5 г этилцеллюлозы в 150 мл дихлорметана. Затем добавляют 75 мл дихлорметана и 2,5 мл 1,2,3-пропантриола, 10 г полиэтиленгликоля расплавляют и растворяют в 75 мл дихлорметана. Последний раствор добавляют к прежнему и затем добавляют 2,5 г октадеканоата магния, 5 г поливинилпирролидона и 30 мл концентрированной цветной суспензии и все это гомогенизируют. Сердцевины таблеток покрывают полученной таким образом смесью в аппарате для покрытия.

1. Соединение формулы (I)

его N-оксидная форма, аддитивная соль или стереохимически изомерная форма, где
m равно 0, 1 и когда m равно 0, тогда подразумевается непосредственная связь;
n равно 0, 1, 2 или 3 и, когда n равно 0, тогда подразумевается непосредственная связь;
р равно 1;
t равно 0 или 1 и, когда t равно 0, тогда подразумевается непосредственная связь;
означает -CR⁸=С<, и тогда пунктирная линия представляет связь, где
R⁸ представляет водород;
R¹ и R² представляет водород;
R³ и R⁴ представляет водород;
R⁵ представляет водород;
R⁶ и R⁷, каждый независимо, выбраны из водорода или C_1-6 алкила;
Z представляет радикал, выбранный из

где R¹⁰ и R¹¹, каждый независимо, выбран из таких значений, как водород, гидрокси, C_1-6 алкилкарбонил, C_1-6 алкилкарбонилокси C_1-6 алкил, C_1-6 алкилоксикарбонил, C_1-6 алкилкарбонилокси, гидрокси C_1-6 алкил.

2. Соединение по п.1, где
n равно 0; t равно 0; R¹⁰ и R¹¹, каждый независимо, выбран из водорода, гидрокси, С_1-6 алкилоксикарбонила или гидрокси C_1-6 алкила.

3. Соединение по п.1 или 2, где
n равно 0; t равно 0; R⁶ и R⁷ представляет водород; Z представляет радикал, выбранный из (а-2) или (а-4); R¹⁰ и R¹¹, каждый независимо, выбраны из водорода, гидрокси или гидрокси C_1-6 алкила.

4. Соединение по п.1 или 2, где соединение является соединением No.1, соединением No.4 или соединением No.5.

соединение No.1	соединение No.4
соединение No.5

5. Соединение по п.1 или 2 для применения в медицине для лечения рака.

6. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая фармацевтически приемлемые носители и в качестве активного ингредиента терапевтически эффективное количество соединения по пп.1-4.

7. Способ получения фармацевтической композиции по п.6, где фармацевтически приемлемые носители и соединение по пп.1-4 тщательно смешивают.

8. Применение соединения по п.1, 2, 3 или 4 для получения лекарственного средства для лечения рака.

9. Комбинация противоракового средства и соединения по п.1, 2, 3 или 4.

10. Способ получения соединения по п.1, характеризующийся взаимодействием промежуточного соединения формулы (II) с промежуточным соединением формулы (III), где W представляет соответствующую уходящую группу, такую как, например, галоген,

где переменные имеют значения, как определено в п.1.

11. Способ получения соединения по п.1, характеризующийся превращением промежуточного соединения формулы (IV) в соединение формулы (I), где р равно 1, обозначенного как соединение формулы (1-а), в присутствии литийалюмогидрида в подходящем растворителе

где переменные имеют значения, как определено в п.1.

12. Способ получения соединения по п.1, характеризующийся взаимодействием соответствующего карбоксальдегида формулы (VI) с промежуточным соединением формулы (V) в присутствии соответствующего реагента в подходящем растворителе

где переменные имеют значения, как определено в п.1.

13. Способ получения соединения по п.1, характеризующийся взаимодействием промежуточного соединения формулы (II) с соответствующим карбоксальдегидом формулы (VII) с образованием соединения формулы (I), где t равно 1, обозначенного как соединение формулы (I-b)

где переменные имеют значения, как определено в п.1.

14. Применение по п.8, где рак выбирают из группы, включающей: легочный рак (например, аденокарцинома и, в том числе, немелкоклеточный легочный рак), панкреатические злокачественные заболевания (например, панкреатическая карцинома, такая как, например, внешнесекреторная панкреатическая карцинома), злокачественные заболевания толстой кишки (например, колоректальные карциномы, такие как, например, аденокарцинома толстой кишки и аденома толстой кишки), эзофагеальный рак, сквамозная карцинома ротовой полости, карцинома языка, желудочная карцинома, назофарингеальный рак, гематопоэтические новообразования лимфоидного происхождения (например, острый лимфоцитарный лейкоз, В-клеточная лимфома, лимфома Буркитта), неходжкинская лимфома, болезнь Ходжкина, миелоидный лейкоз, (например, острый миелогенный лейкоз (AML)), тироидный фолликулярный рак, миелодиспластический синдром (MDS), опухоли мезенхимального происхождения (например, фибросаркомы и рабдомиосаркомы), меланомы, тератокарциномы, нейробластомы, опухоли мозга, глиомы, доброкачественная опухоль кожи (например, кератоакантома), карцинома молочной железы (например, прогрессирующий рак молочной железы), почечная карцинома, карцинома яичника, цервикальная карцинома, эндометриальная карцинома, карцинома мочевого пузыря, рак простаты, в том числе прогрессирующая болезнь, тестикулярные новообразования, остеосаркома, рак головы и шеи и эпидермальная карцинома.