Биомаркеры ишемии и их применение для прогнозирования неблагоприятных неврологических последствий хирургической операции
Изобретение относится к медицине и касается способа прогнозирования появления неблагоприятных неврологических последствий хирургической операции. Изобретение обеспечивает адекватное прогнозирование риска транзиторных ишемических атак или инсульта при определении биохимического маркера до операции. 16 з.п. ф-лы, 2 ил., 5 табл.
ССЫЛКА НА ПРЕДШЕСТВУЮЩИЕ ЗАЯВКИ
По данной заявке испрашивается приоритет согласно 35 U.S.C. §119(e), в соответствии с предварительной заявкой США № 60/646,762, поданной 25 января 2005 г. Содержание вышеупомянутой заявки включено в данный документ посредством ссылки, как если бы полностью было изложено здесь.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Изобретение относится к способам прогнозирования риска неблагоприятных неврологических последствий хирургической операции. В частности, настоящее изобретение относится к способом анализа на NR2-пептиды и антитела в крови пациентов, ожидающих хирургическую операцию, и к способам использования таких результатов анализа для того, чтобы прогнозировать вероятность инсульта, транзиторной ишемической атаки (ТИА) и других приступов, вызванных ишемией, у пациентов при хирургической операции. Этот анализ, в частности, полезен для пациентов с уже имеющимися сердечно-сосудистыми нарушениями, церебрально-васкулярными нарушениями, гипертензией, диабетом или шумом над сонной артерией, кто наиболее вероятно подвергается неблагоприятным неврологическим последствиям в результате хирургической операции, но чей риск последствий хирургической операции подробно не изучен. Диагностическая и прогностическая способности этого анализа обещают уменьшить число заболеваний и смертность в операционной и усовершенствовать лечение пациентов с сердечно-сосудистыми и церебрально-васкулярными нарушениями, которым назначена хирургическая операция.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Повреждение нервной системы вследствие хирургической операции является совокупностью прямого токсического эффекта на нейроны и вторичного поражения вследствие общей гипоксии и ишемии. Инсульты бывают как окклюзионные (вследствие закупорки кровеносного сосуда), так и геморрагические (вследствие кровотечения из сосуда) и оба могут приводить в результате к недостаточному кровоснабжению мозга, приводящему к состоянию, известному как ишемия.
Фокальное повреждение головного мозга отлично от общего аноксического повреждения головного мозга, которое возникает после остановки сердца или недостаточной перфузии (Graham SH, Chen J. J Cereb Blood Flow 2001;21:99-109). При возникновении фокального повреждения головного мозга, очаг ишемии развивается так, что в основном окружается пограничной зоной выживших клеток. Эти выжившие клетки предотвращают (или по крайне мере останавливают) распространение инфаркта и величину повреждения головного мозга (Deshpande J, et al.Exp Brain Res 1992;88:91-105; Matsui T, et al.J Cereb Blood Flow Metab 2002;22:711-722). При возникновении ишемии головного мозга в целом, наиболее уязвимые зоны головного мозга находятся в теменной коре и подкорковых узлах, где наблюдаются апоптические явления (Kjos BO, Brant-Zawadzki M, Young RG.Am J Roentgenol 1983; 141:1227-1232).
В течение последнего десятилетия было предложено несколько биомаркеров для прогнозирования и диагностики повреждения головного мозга. Большой интерес к S100B в сыворотке в качестве биомаркера для неврологической и нейрокогнитивной оценки результата операции на сердце был вызван сообщениями, что S100B был взаимосвязан с повреждением головного мозга после инсульта, травматическим повреждением головного мозга и остановкой сердца (Abraha HD, et al.Ann Clin Biochem 1997; 34:366-370; Buttner T, et al. Stroke 1997; 28:1961-1965; Lynch JR, et al. Stroke 2004; 35:57-63). S100B является кальций-регулирующим белком, найденным главным образом в глиальных клетках и клетках Шванна. Другим возможным биомаркером для церебрально-васкулярных последствий в результате операции на сердце является С-реактивный белок (СРБ), острофазовый агент и индикатор лежащего в основе общего воспаления. CRP является новым плазменным маркером для атеротромботического заболевания и показателем сердечно-сосудистого заболевания.
Недавно были предложены N-метил-D-аспартат (NMDA)-рецепторные белки и их антитела в качестве биомаркеров нейротоксичности, лежащей в основе ишемии головного мозга и инсульта (Dambinova SA, et al.Stroke 2002; 33:1181-1182; Dambinova SA, et al.Clin Chem 2003; 49:1752-1762). NMDA-рецептор присущ только головному мозгу. Со смертью нейронов или ишемией пептидные фрагменты NMDA-рецептора отрываются, появляются в кровяном токе и вызывают иммунный ответ. Пептидный фрагмент и антитела могут быть обнаружены в образце крови (Dambinova SA, et al.Stroke 2002). Взрослые пациенты, страдающие от острого ишемического инсульта, имеют повышенный уровень NMDA-пептидов и/или антител в крови, что соотносится с количеством повреждений головного мозга на томограммах мозга (MRI) и нейрокогнитивным состоянием пациента (Dambinova SA, et al.Clin Chem 2003; 49:1752-1762).
Стандартное применение определенных биомаркеров с потенциальными диагностическими и прогностическими способностями могло значительно улучшить ведение и терапевтический результат у пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями и заболеваниями сосудов мозга, подвергающихся хирургической операции, особенно операции на сердце, включая сердечно-легочное шунтирование (СЛШ). Церебральные осложнения представляют собой основную причину заболеваемости и нетрудоспособности после операции на сердце с сердечно-легочным шунтированием. Частота возникновения инсульта колеблется от 1 до 5% в течение периоперационного периода (Gardner TJ, et al. Ann Thorac Surg 1985; 40:574-581; Murkin JM, et al. J Thorac Cardiovasc Surg 1995; 110:349-362; Roach GW, et al. N Engl J Med 1996; 335:1857-1863; Libman RB, et al. Arch Neurol 1997; 54:83-87; Carrascal Y, et al. Eur Neurol 1999; 41:128-134), и его встречаемость связывается с увеличенной смертностью (Roach GW, et al. N Engl J Med 1996; 335:1857-1863; Carrascal Y, et al. Eur Neurol 1999; 41:128-134). Хотя инсульт является заметным осложнением, нейрокогнитивная дисфункция и помрачнение сознания являются более трудно уловимыми осложнениями. Влияние нейрокогнитивной дисфункции на послеоперационное обслуживание и стоимость, связанную с продолжительной госпитализацией вследствие такой дисфункции, огромны.
Общая церебральная ишемия связывается с сердечно-сосудистыми нарушениями и сильно способствует ухудшению нейрокогнитивных способностей и неврологическим осложнениям. Многочисленные исследования сообщили о незначительных нейропсихологических ухудшениях, используя набор нейрокогнитивных анализов, частых после хирургической операции на сердце (Murkin JM, et al. J Thorac Cardiovasc Surg 1995; 110:349-362; Shaw PJ, et al. Q J Med 1987; 239:259-268; McKhann GM, et al. Ann Throrac Surg 1997; 63:510-515; McKhann et al. Lancet 1997; 349:1282-1284). Однако одни нейрокогнитивные анализы не способны предсказать неблагоприятные неврологические последствия в результате хирургической операции.
Определяющие детерминанты церебральной дисфункции, связанные с хирургической операцией на сердце, основанные на предоперационных факторах риска и механизмах, связанных с оперативными приемами, важны для того, чтобы уменьшить риск вследствие таких приемов и улучшить исход болезни у пациента. Церебральное повреждение вследствие хирургической операции на сердце в настоящее время оценивается ретроспективно сравнением предоперационных и послеоперационных клинических и нейропсихологических обследований, или, используя методы с воспроизведением изображения (CT или MRI) для того, чтобы обнаружить морфологические изменения. К несчастью, нейропсихологическая оценка требует времени, высококвалифицированных специалистов и контакта с больным. Кроме того, получение изображения нервной системы (особенно MRI) очень дорого и может быть напряженно и рискованно для пациента в послеоперационный период. Способность биохимических маркеров обнаруживать повреждения головного мозга и предсказывать дальнейшие повреждения головного мозга будет иметь значительное практическое значение.
ЗАДАЧИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Одной из задач настоящего изобретения является точное предсказание риска неблагоприятных неврологических последствий плановой хирургической операции, включая транзиторную ишемическую атаку (ТИА), инсульт и нейрокогнитивную дисфункцию, с использованием биомаркеров, которые могут быть обнаружены в крови человека или других биологических жидкостях до проведения хирургической операции.
Другая задача настоящего изобретения - оценить риск неблагоприятных неврологических последствий, вызываемых ишемией, вследствие планируемой хирургической операции у пациентов при индивидуальном риске таких неблагоприятных осложнений, включая пациентов с уже имеющимися сердечно-сосудистыми или церебрально-васкулярными повреждениями или хроническим ишемическим стрессом или диабетом.
Еще одна задача настоящего изобретения - сделать возможным более эффективный выбор хирургических стратегий для уменьшения риска неблагоприятных неврологических последствий хирургической операции, включая режимы мониторирования и нейрозащитную терапию против повреждений, вызванных церебральной ишемией, до, в течение или после хирургической операции.
Раскрытие изобретения
Предложены способы и наборы для оценки у пациента риска неблагоприятного неврологического последствия хирургической операции, основанные на присутствии и количестве NMDA-рецепторных пептидов и антител в кровотоке пациента. Заранее установленные клинически пределы для NMDA-рецепторных пептидов и антител позволили автору продемонстрировать хорошие характеристики и клиническую пользу этих анализов с определением пептида и антитела для оценки риска неблагоприятных неврологических последствий, включающих ТИА и инсульт у взрослых пациентов до хирургической операции. Анализы распределений NMDA-пептидов и антител до и после операции показали, что эти маркеры имеют высокую прогностическую ценность для неврологических осложнений отдельно и при комбинации с MMSE (краткая шкала оценки психического статуса) компонентной шкалой. Также разработаны диагностические и терапевтические способы для контроля и снижения такого риска, основанные на результатах этого анализа.
Уровни в крови NR2A- и NR2B-субъединиц NMDA-рецептора, особенно пептидные фрагменты из N-терминального домена NR2A- и NR2B-субъединиц особенно предпочтительны в способах по настоящему изобретению и необыкновенно точны для прогнозирования вероятности неблагоприятных неврологических последствий в результате операции. В одном проспективном, слепом многоцентровом клиническом исследовании, где определялась частота возникновения инсульта или ТИА у пациентов, перенесших операцию сердечно-легочного шунтирования, эти способы были способны выявить 96,2% пациентов, которые подвергнутся инсульту или TIA, когда в кровяной сыворотке пациента присутствовало более чем 2,0 нг/мл антител, и 95,6% пациентов, которые не подвергнутся инсульту или TIA, когда в кровяной сыворотке пациента присутствовало менее чем 2,0 нг/мл антител. Напротив, S100B - кальций-регулирующий белок, который широко исследуется в качестве потенциального биомаркера для неврологического исхода хирургической операции на сердце, имел незначительную способность обнаруживать пациентов, которые подвергнутся или не подвергнутся ТИА или инсульту. CRP (С-реактивный белок), о котором также сообщалось, как о маркере для атеротромботических заболеваний и средстве прогнозирования цереброваскулярных заболеваний, также имел незначительную способность обнаруживать пациентов, которые подвергнутся или не подвергнутся ТИА или инсульту.
Следовательно, в одном варианте осуществления изобретение включает способ вспомогательной оценки риска инсульта у внешне здорового человека до хирургической операции включая: (а) получение анализируемого образца у человека; (б) анализ тестируемого образца на присутствие и количество NR2-антигена и NR2-антитела или их комбинации; и сравнение результатов этапа (в) c соответствующими контрольными количествами NR2-антигенов и NR2-антител или их комбинации, где соответствующие контрольные количества определены для популяции внешне здоровых людей.
При выявлении недопустимого риска ТИА или инсульта, согласно изобретению далее используются режимы мониторирования и нейрозащитная терапия для контроля или снижения такого риска. Например, при наблюдении опасного уровня NMDA-рецепторных пептидов или антител, пациент мог принимать различные известные лекарственные препараты для того, чтобы оказать благоприятное воздействие на сердечно-сосудистую систему и снизить риск инсульта, включая различные антитромбоцитарные средства, антикоагулянты, гиполипидемические средства, лекарственные средства для снижения кровяного давления (если наблюдается высокое кровяное давление) и хирургическое вмешательство. С другой стороны или в дополнение, может быть введен конкретный режим мониторирования, в котором уровни NR2 контролируются дополнительно один или более раз, в частности, непосредственно перед операцией, во время операции и сразу же после операции.
Дополнительные преимущества изобретения будут установлены далее частично в описании, которое последует, и частично будут очевидны из описания, или могут быть определены посредством применения изобретения на практике. Преимущества изобретения будут реализованы и достигнуты посредством элементов и комбинаций, изложенных в прилагаемой формуле изобретения. Должно быть понятно, что и вышеизложенное общее описание и следующее за ним детальное описание являются примерными и лишь поясняющими, и не ограничивающими изобретение, как оно заявлено.
ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение может быть понято более полно с помощью ссылки на следующее детальное описание предпочтительного варианта осуществления изобретения и примеров, включенных в него.
Определения и использование терминов
Как используется в этом описании и в формуле изобретения, которая последует, единичные формы включают также множественное число, если смысл явно не предписывает другого. Следовательно, например, ссылка на «фрагмент» включает также смеси фрагментов, ссылка на «олигонуклеотид ДНК» включает более чем один олигонуклеотид и так далее.
NMDA-рецептор является одним из семейства лиганд-регулируемых ионных каналов, которые связываются предпочтительно с N-метил-D-аспартатом и которые являются посредниками огромного большинства возбуждений нейропередачи в мозге (Dingledine R. et al., Pharmacol Rev. 1999 Mar;51(1):7-61.). Рецепторы включают несколько субъединиц, описанных в литературе как NR1, NR2A, NR2B, NR2C, NR2D и NR3A, которые выполняют определенные фармакологические функции. Номера доступа GenEMBL сообщены для NR1 (X58633), NR2A (U09002) и NR2B (U28861) и описаны в WO 02/12892 (Dambinova). «Церебральный» NMDA-рецептор относится к рецептору, который находится в мозге, в отличие от NMDA-рецептора, который находится исключительно в органах человеческого тела, за исключением мозга.
NMDA-рецепторный пептид представляет собой NMDA-рецепторный белок полной длины, пептидный фрагмент встречающегося в природе NMDA-рецептора полной длины, или аналог, производное, фрагмент или рекомбинированную (а/к/а рекомбинант) совокупность их фрагментов. NR2-пептид включает NR2A-, NR2B-, NR2C-, NR2D-субъединицы полной длины в дополнение к фрагментам, аналогам, производным и их рекомбинированным фрагментам. NR2A-, NR2B-, NR2C- или NR2D-пептид обозначает NR2A-, NR2B-, NR2C- и NR2D-пептидную субъединицу полной длины, встречающуюся в природе или фрагмент, аналог, производное или их рекомбинированные фрагменты. N-терминальный домен NR2A- и NR2B-пептидов относится к аминокислотному N-терминальному доменному фрагменту NR2A- и NR2B-субъединиц полной длины или фрагменту, аналогу, производному или их рекомбинированным фрагментам, как описано в WO 02/12892 (Dambinova).
Циркулирующий NMDA-рецепторный пептид относится к NMDA-рецепторному пептиду, который проник через гематоэнцефалический барьер в общий кровоток, и его фрагментам, образованным в кровотоке. Особенно предпочтительный циркулирующий NMDA-рецепторный пептид является пептидом, который включает в себя один или более фрагментов последовательностей, которые часто встречаются в обеих NR2A- и NR2B-субъединицах. Пептид может включать одну такую последовательность или 2, или более таких последовательностей, которые дискретно локализованы в природном NR2-пептидном остове, и рекомбинируются в один непрерывный фрагмент, как in vivo, так и in vitro.
«Аналог» пептида обозначает пептид, который включает одно или более аминокислотное замещение, удаление, присоединение или перегруппировку. Например, в области биохимии белков хорошо известно, что аминокислота, принадлежащая к группе аминокислот, имеющая специфический размер и характеристики (такие, как заряд, гидрофобность и гидрофильность), зачастую может быть замещена на другую аминокислоту без изменения активности белка, в частности в участках белка, которые не связаны непосредственно с биологической активностью. Таким образом, аналог NMDA-пептида пригоден для настоящего изобретения, если он включает аминокислотное замещение, удаление, присоединение или перегруппировку на участках, так что антитела, индуцированные аналогом, являются еще и специфичными к NMDA-пептиду.
Если не утверждают обратное, аналог NMDA, как используется в этом документе, относится к последовательности, которая имеет, по меньшей мере, 80% аминокислотной идентичности с NMDA, встречающейся в природе, хотя она может также содержать, по меньшей мере, 85%, 90% или 95% идентичности. Аминокислотная идентичность определяется с помощью аналогового сравнения между аналогом и NMDA, встречающимся в природе. Две аминокислотные последовательности выравнивают таким образом, чтобы максимально увеличить число общих аминокислот по длине этих последовательностей; допустимы пробелы в одной из двух или в обеих вместе последовательностях в процессе проведения сравнения первичной структуры для того, чтобы максимально увеличить число общих аминокислот. Процент аминокислотной идентичности выше следующих двух значений: (1) число аминокислот, общих у двух пептидов при выравнивании первичной структуры, деленное на число аминокислот в аналоге NMDA, умноженное на 100, или (2) число аминокислот, общих у двух пептидов при выравнивании первичной структуры, деленное на число аминокислот в природном NMDA-пептиде, умноженное на 100.
Производные NMDA включают природные NMDA и аналоги NMDA и их фрагменты, которые химически или ферментативно модифицированы с отличием в одной или более входящей в состав аминокислоте, включая модификации в боковой цепи, модификации остова и N- и C-терминальные модификации с помощью, например, ацетилирования, гидроксилирования, метилирования, амидирования, фосфорилирования или гликозилирования. Термин также включает соли NMDA, такие как NMDA цинка и NMDA аммония.
Белок или пептид измеряется «прямо» в смысле, что белок или пептид измеряется как таковой в биологическом образце, в отличие от некоторых других косвенных измерений белка или пептида, таких как аутоантитела к белку или пептиду, другие пептидные фрагменты из того же самого белка или субъединицы или цДНК, связанная с экспрессией белка или пептида.
Термин «антитело» является синонимом «иммуноглобулина». Как используется здесь, термин антитело включает и природные антитела, моноклональные антитела, поликлональные антитела, рекомбинантные ДНК антитела и биологически активные производные антител, такие как, например, Fab', F(ab')2 или Fv, так же как однодоменные и одноцепочечные антитела. Биологически активное производное антитела включается в это определение, поскольку оно сохраняет способность связываться со специфическим антигеном. Таким образом, NR2-антитело обладает способностью связываться по меньшей мере с одним NR2-пептидом.
ОБСУЖДЕНИЕ
В одном варианте изобретение включает способ, позволяющий оценить риск инсульта у внешне здоровых людей перед хирургической операцией, включающий: (а) получение анализируемого образца у человека; (б) анализ полученного анализируемого образца на присутствие и количество NR2-антигена и NR2-антитела, или их комбинации; и сравнение результата этапа (в) c соответствующими контрольными количествами NR2-антигена и NR2-антитела, или их комбинации, где соответствующие контрольные количества получают для популяции внешне здоровых людей. В другом аспекте, изобретение включает способ прогнозирования неблагоприятных неврологических последствий хирургической операции, предусматривающий: (a) наличие пациента-человека, ожидающего хирургическую операцию; (б) измерение первоначального уровня циркулирующих церебральных NMDA-рецепторных пептидов в биологических жидкостях вышеупомянутого пациента; и (в) соотнесение упомянутого уровня с риском подвергнуться неблагоприятному неврологическому последствию хирургической операции.
Когда пациент обследуется и имеет опасные уровни NMDA-рецепторных пептидов или антител в своем кровотоке, предпочтительно обследовать пациента несколько раз до и в течение хирургической операции. Кроме того, поскольку пациенты часто не подвергаются неблагоприятным неврологическим осложнениям вскоре после хирургической операции, предпочтительно обследовать этих пациентов один или более раз дополнительно после хирургической операции, в течение одного или более последующих периодов времени: один час, три часа, шесть часов, двенадцать часов, двадцать четыре часа, три дня, семь дней или тринадцать дней. Таким образом, в один вариант осуществления изобретения, кроме того, включены: (а) измерение последующих уровней циркулирующих церебральных NMDA-рецепторных пептидов у упомянутого пациента после упомянутой хирургической операции; (б) определение того, имеются ли различия между вышеупомянутым первоначальным и последующими уровнями; и (в) соотнесение различия между вышеупомянутым первоначальным и последующими уровнями с неблагоприятным неврологическим последствием, которое либо наблюдается, либо, вероятно, будет наблюдаться в ближайшем будущем.
Способы могут быть осуществлены на взрослых или детях, которым планируется хирургическая операция, и в особенно важном варианте осуществления изобретения выполняются на неонатальных пациентах и новорожденных, для которых неврологическое осложнение представляет собой особую опасность. Способ особенно полезен при оценке пациентов, уже предрасположенных к перенесению неврологического последствия, таких как пациенты с диабетом, атеросклерозом, высоким кровяным давлением, или ранее заподозренным или подтвержденным ТИА или инсультом. Способы могут также быть использованы в сочетании с MMSA-анализом, до хирургической операции для того, чтобы предсказать риск неблагоприятного неврологического последствия. Предоперационное понижение компонентных оценок MMSA относительно ориентировки, внимания и вспоминания связываются с помрачнением сознания и цереброваскулярными последствиями вскоре после хирургической операции.
Типы неврологических осложнений, которые могут быть спрогнозированы с помощью текущего изобретения, являются в основном такими, которые вызываются церебральной ишемией, в особенности, ишемические последствия, которые вызваны недостаточным обеспечением мозга кислородом (в отличие от геморраргических последствий, которые возникают при разрыве кровеносных сосудов в мозгу). Эти последствия могут быть сфокусированы в отдельной области мозга, как наблюдается при инсульте или при ТИА, или могут быть общими, как наблюдается при делирии. Неблагоприятное неврологическое последствие, следовательно, может характеризоваться помрачнением сознания или может быть диагностировано, как ТИА или ишемический инсульт. Обеспечение кислородом может быть поставлено под угрозу из-за состояния сердца пациента (как, например, при определенных кровеносных нарушениях, таких как анемия), но более часто будут обуславливаться последствиями хирургической операции. Говорят, что неблагоприятное неврологическое осложнение является следствием хирургической операции, если осложнение наблюдается в течение хирургической операции, или в течение тридцати дней после завершения хирургической операции, хотя, при желании, результирующее неблагоприятное осложнение могло также быть идентифицировано в период в семь дней, три дня, два дня или один день.
Прогностические способы по настоящему изобретению могут предсказать риск неблагоприятных неврологических последствий любых типов хирургических операций, это наиболее ценно при травматичных операциях, при которых временно замедляется или останавливается приток кислорода к мозгу. Например, способ может быть проведен до любой кардиоваскулярной процедуры, которая останавливает или блокирует нормальную циркуляцию крови, что приводит к интраоперационным микро- или макроэмболам, ненормальному церебральному кровоснабжению, реперфузионной травме головного мозга, или воспалению или нейрогуморальной реакции. Изобретение особенно полезно при прогнозировании наличия неблагоприятных неврологических последствий при проведении сердечно-легочного шунтирования.
Способы анализа могут быть проведены, основываясь на измерениях любого циркулирующего NMDA-рецепторного пептида, и они могут быть проведены, используя любой прямой или косвенный способ измерения. Следовательно, например, уровни циркулирующих пептидов могут быть измерены с помощью косвенного измерения антител к пептидам, экспрессии кДНК, кодирующей пептиды, или с помощью измерения самих пептидов. Следовательно, в одном варианте осуществления изобретение включает способ, в котором названный уровень измеряется с помощью контакта названной биологической жидкости с иммобилизованными антителами или их фрагментами (а именно, антителами или фрагментами, которые прикреплены к носителю, такому как пластинка или шарик, или маленькая частица), и прямое измерение уровня одного или более циркулирующих церебральных NMDA-рецепторных пептидов. В другом варианте выполнения изобретение включает способ, в котором названный уровень измеряется с помощью контакта названной биологической жидкости с иммобилизованным церебральным NMDA-рецепторным пептидом и измерение уровня антител, которые связываются с упомянутым иммобилизованным пептидом.
Кроме того, различные субъединицы и фрагменты NMDA-рецептора могут быть предпочтительно измерены. Например, способ предпочтительно выполняется с помощью измерения NR2A-пептидов или NR2В-пептидов и, даже более предпочтительно выполнять измерения обоих. В одном предпочтительном варианте выполнения изобретения, способ осуществляется с помощью измерения одной или более пептидных последовательностей, которые характерны для природных NR2A- и NR2B-последовательностей, одной или более пептидных последовательностей, которые характерны для N-терминального домена природных NR2A- и NR2B-последовательностей, или антител к ним. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, циркулирующие пептиды, которые включают в себя 2, 7 и 14 кДа фрагменты N-терминального домена NR2A- и NR2B-субъединиц церебрального NMDA-рецептора, измеряются в способах по настоящему изобретению.
Способ может быть осуществлен с использованием практически любой биологической жидкости, в которой циркулирующие церебральные NMDA-рецепторы, или маркеры таких рецепторов экспрессируются или обнаруживаются, включая кровь, мочу, плазму крови, сыворотку крови, спинномозговую жидкость, слюну, пот или ткани мозга. В предпочтительном варианте осуществления изобретения биологической жидкостью является плазма или сыворотка, и в более предпочтительном варианте осуществления изобретения плазма или сыворотка разбавляются в отношении 1:50.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения, оценка риска делается, основываясь на заранее установленной границе уровней пептидов. Таким образом, например, экспериментально и клинически показано, что уровни NR2A/B N-терминальных доменных антител в плазме или сыворотке, которые являются большими чем 2,0, 1,8, 1,5 или 1,0 нг/мл, или уровни NMDA-пептидов, которые соответствуют NR2A/B N-терминальным доменам циркулирующих пептидов более чем 200, 100 или 50 пг/мл, являются необычайно прогностически ценными для предсказания неблагоприятных неврологических последствий у пациентов, подвергающихся хирургической операции. В отличие от этого, уровни NR2A/B N-терминальных доменных антител в плазме или сыворотке, которые являются меньшими чем 2,0, 1,8, 1,5 или 1,0 нг/мл, или уровни NMDA-пептидов, которые соответствуют NR2A/B N-терминальным доменам циркулирующих пептидов и являются меньшими чем 200, 100 или 50 пг/мл, являются необычайно прогностическими ценными для предсказания того, что неблагоприятные неврологические последствия не будут возникать в течение хирургической операции. Предпочтительным пределом количества антител является 2,0 нг/мл.
В проспективных клинических исследованиях, описанных в примерах, пациенты с предоперационным положительным анализом пептид/антитело (>200 пг/мл и ≥2,0 нг/мл соответственно) почти в 18 раз более вероятно испытывали послеоперационные неврологические последствия, чем пациенты с отрицательным анализом (<2,0 нг/мл). Согласно клиническим исследованиям, женщины показали более высокую степень риска неврологических осложнений, чем мужчины, и неблагоприятные неврологические последствия были более широко распространены среди пожилых людей (> 70 лет). Кроме того, повышенные показатели NIHSS в сочетании с высокими (>2 нг/мл) концентрациями NR2-антител и пептида (>200 пг/мл) свидетельствовали о том, что они могут предсказывать ТИА/инсульт у пациентов, подвергающихся хирургической операции. Однако предоперационное NIHSS в отдельности не предсказывает неблагоприятные неврологические последствия.
На основании результатов анализа, могут быть внедрены различные режимы для того, чтобы уменьшить риск неблагоприятных неврологических последствий, которые, как ожидается, будут иметь место. Например, способ может дополнительно включать, если пациент имеет риск подвергнуться неблагоприятным неврологическим последствиям в результате хирургической операции, (i) применение нейропротективной терапии к упомянутому пациенту, (ii) внедрение контрольных программ для контролирования риска или возникновения неблагоприятного неврологического последствия. Нейропротективная терапия включает прием лекарств, таких как антиагрегантные, антикоагулянтные, гиполипидемические и понижающие кровяное давление лекарственные средства. И наоборот, способ может дополнительно включать, если пациент имеет риск подвергнуться неблагоприятным неврологическим последствиям в результате хирургической операции, необязательно, анализ упомянутого пациента на предмет образования новой области инфаркта, определяемой с помощью MRI, и выполнение нейрохирургической операции или хирургической операции на сосудах у упомянутого пациента, такой как каротидная эндартерэктомия, прямая эндартерэктомия, ангиопластика с размещением стента, экстракраниально-интракраниальное шунтирование и транспозиция позвоночной артерии.
Способ может быть проведен, используя любое количество известных диагностических способов, включая иммунопреципитацию (ИП), непрямую иммунофлюоресценцию (НИФ), иммунодот и иммуноблоттинг (ИБ) (Вестерн-блоттинг), прямой или непрямой фермент-связывающий иммуносорбентный анализ (ELISA), радиоимуноанализ (РИА), противоточный иммуноэлектрофорез (ПИЭ), проточную цитометрию (ПЦ), латексную агглютинацию, растекание в радиальном направлении (lateral flow), флуоресцентный поляризационный анализ или микрочип. В одном частном варианте осуществления изобретения используется иммобилизированная твердая фаза для поглощения и измерения NMDA-пептидных маркеров. Изобретение, следовательно, включает способ прогнозирования неблагоприятных неврологических последствий в результате хирургической операции, предусматривающий: (а) наличие пациента-человека, ожидающего хирургическую операцию; (б) контакт биологического образца упомянутого пациента с иммобилизованной твердой фазой, включающей NR2-пептид или NR2-антитело в течение достаточного времени для того, чтобы образовать комплекс между упомянутым NR2-пептидом или упомянутом NR2-антителом и NR2-пептидом или NR2-антителом упомянутого биологического образца; (в) контакт упомянутого комплекса с индикаторным реагентом, присоединенным к генерирующему сигнал соединению для того, чтобы генерировать сигнал; (г) измерение сгенерированного сигнала; (д) соотнесение генерированного сигнала с уровнем упомянутого NR2-пептида или упомянутого NR2-антитела в упомянутом образце; и (е) соотнесение уровня упомянутого NR2-пептида или упомянутого NR2-антитела в упомянутом образце с упомянутым риском неблагоприятного неврологического последствия. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, индикаторный реагент включает куриный анти-человеческий или античеловеческий IgG, присоединенный к пероксидазе хрена.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения, твердой фазой является полимерная матрица. Более предпочтительно, полимерной матрицей является полиакрилат, полистирол или полипропилен. В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения твердой фазой является микропланшет. В другом предпочтительном варианте исполнения изобретения твердой фазой является нитроцеллюлозная мембрана или заряженная нейлоновая мембрана.
В другом варианте осуществления изобретения способ выполняется, используя агглютинацию. В этом варианте осуществления изобретение включает способ прогнозирования неблагоприятного неврологического последствия в результате хирургической операции, включающий: (а) наличие пациента-человека, ожидающего хирургическую операцию; (б) контакт биологического образца упомянутого пациента с агглютинирующим носителем, включая NR2-пептид или NR2-антитело, в течение достаточного времени для того, чтобы образовать агглютинационный комплекс между упомянутым NR2-пептидом или упомянутом NR2-антителом и NR2-пептидом или NR2-антителом упомянутого биологического образца; (в) генерирование сигнала агглютинации; (г) соотнесение упомянутого сигнала с упомянутыми уровнями одного или более маркеров NR2-пептида; и (д) соотнесение уровня упомянутого NR2-пептида или упомянутого NR2-антитела в упомянутом образце с упомянутым риском неблагоприятного неврологического последствия. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, «достаточное время» меньше чем 30, 20, 15 или даже 10 минут.
Латекс-агглютинационные методы анализа описаны в Beltz, G. A. et al., в Molecular Probes: Techniques and Medical Applications, A.Albertini et al., eds., Raven Press, New York, 1989, введенной здесь с помощью ссылки. В латекс-агглютинационном методе анализа, антитело к специфическим биомаркерам иммобилизуется на частицах латекса. Капля латексных частиц прибавляется к соответствующему слабому раствору сыворотки для тестирования и смешения с помощью слабого покачивания карты. С образцами, лишенными достаточных уровней биомаркеров, латексные частицы остаются в суспензии и сохраняют гладкость и опалесценцию. Однако, если биомаркеры, реагирующие с антителом, присутствуют, латексные частицы скапливаются в детектируемые визуально агрегаты.
Агглютинационный метод анализа может также быть использован для того, чтобы обнаруживать биомаркеры, где соответствующее антитело иммобилизуется на подходящей частице, помимо латексных шариков, например, на желатине, красных кровяных клетках, нейлоне, липосомах, частицах золота и т.д. Присутствие антител в методе анализа является причиной агглютинации, подобной агглютинации реакции осаждения, которая может далее быть обнаружена с помощью таких методов, как нефелометрия, определение мутности, инфракрасной спектрометрии, визуальное обследование, колориметрия и подобных.
Термин «латексная агглютинация» применяется в основном здесь для того, чтобы ссылаться на любой метод, основанный на образовании детектируемого агглютината, и не ограничивается использованием латекса в качестве иммуносорбентного субстрата. В то время как предпочтительные субстраты для агглютинации основываются на латексе, такие как полистирол и полипропилен, особенно полистирол, другие хорошо известные субстраты включают шарики, сформированные из стекла, бумаги, декстрана или нейлона. Иммобилизованные антитела могут быть ковалентно, ионно или физически присоединены к твердофазному иммуноадсорбенту, с помощью способов, таких как ковалентное связывание через амидную или сложноэфирную связь, ионного притяжения или с помощью адсорбции. Специалисты в данной области техники знают много других подходящих носителей или смогут выявить подобные, используя стандартный эксперимент.
Общепринятые методы могут быть использованы для того, чтобы подготовить антитела для использования в настоящем изобретении. Например, с помощью использования пептида NMDA белка, поликлональная иммунная сыворотка или моноклональные антитела могут быть приготовлены с использованием стандартных способов. Млекопитающее (например, мышь, хомяк или кролик) могут быть иммунизированы иммуногенной формой пептида (предпочтительно NR2A- и/или NR2B-рецептором, антигенной детерминантой NR2A- и/или NR2B-рецептора, или аналогом или их производным), который вызывает иммунный ответ у млекопитающих. Способы наделения пептида иммуногенностью включают присоединение к носителям или другие хорошо известные в технике способы. Например, пептид может применяться в присутствии вспомогательного вещества. Протекание иммунизации может отслеживаться с помощью определения титров антитела в плазме или сыворотке. Стандартный ELISA или другой иммуноанализ могут быть использованы с иммуногеном в качестве антигена для того, чтобы определить уровни антител. После иммунизации, иммунная сыворотка может быть применена и, при желании, поликлональные антитела могут быть выделены из сыворотки.
Чтобы продуцировать моноклональные антитела, плазматические клетки (лимфоциты) могут быть получены из иммунизированного животного и объединены с клетками миеломы с помощью стандартной процедуры слияния для соматических клеток, таким образом, иммортализируя эти клетки и производя гибридомные клетки. Такие способы хорошо известны в технике, (например, гибридомный способ первоначально разрабатывался Kohler и Milstein (Nature 256, 495-497 (1975)), также как другие способы, такие как способ человеческой B-клеточной гибридомы (Kozbor et al., Immunol. Today 4, 72 (1983)), ЭБВ-гибридомный способ для того, чтобы продуцировать человеческие моноклональные антитела (Cole et al. Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy (1985) Allen R. Bliss, Inc., pages 77-96), и скрининг комбинаторных библиотек антител (Huse et al., Science 246, 1275 (1989)). Гибридомные клетки могут быть тщательно проверены иммунохимически для продуцирования антител, специфически реагирующих с пептидом, и моноклональные антитела могут быть выделены. Следовательно, в изобретении также рассматриваются гибридомные клетки, секретирующие моноклональные антитела со специфичностью к NR2A- или NR2B- NMDA-белкам или их фрагментам, как описано здесь.
В одном варианте осуществления изобретения, способ применяется с использованием набора, который откалиброван на предприятии, исходя из антител и пептидов, очищенных из человеческой крови. Следовательно, в другом варианте осуществления изобретение осуществляется при следующих условиях: (а) уровни NR2-антител или пептидов в упомянутой биологической жидкости измеряются, используя диагностический набор; (б) упомянутый диагностический набор включает связывание NR2-пептидов или антител; и (в) упомянутый набор изготавливается по стандарту для антитела или пептида, включая фракцию иммуноглобулинов G или пептидов, очищенных из человеческой крови.
Кроме того, способ может быть осуществлен с использованием доступных в больших количествах хемилюминесцентных методов. Например, в способе может использоваться двухцентровый сэндвич-иммунноанализ с применением прямой хемилюминесцентной методики, в которой используются постоянные количества двух моноклональных антител. Первое антитело, в жидком реагенте, могло быть акридиновым желтым, меченым моноклональным мышиным античеловеческим NMDA-рецепторным пептидным BNP (F(ab`)2 фрагментом, специфичным к первому участку пептида. Второе антитело, в твердой фазе, могло быть биотинилированным мышиным античеловеческим антителом, специфичным к другому участку пептида, которое могло связываться с стрептавидин-функционализированными магнитными частицами. Иммунокомплекс будет образовываться с помощью смешения образца пациента и двух антител. После любые несвязанные конъюгаты антитела смываются, хемилюминесцентный сигнал иммунокомплекса далее измеряется, используя люменометр.
Иммуносорбент по настоящему изобретению для измерения уровней аутоантител может быть изготовлен, как указано далее. Фрагмент рецепторного белка фиксируется с помощью ковалентной связи или ионной связи на подходящем носителе, таком как полистирол или нитроцеллюлоза. Если используется стандартный полистироловый планшет для иммунологических исследований, он сначала подвергается нитрованию, при этом на поверхности планшета появляются свободные нитрогруппы, которые восстанавливают до аминогрупп и активируют глутаровым диальдегидом, который служит линкером. После этого, таким образом активированный планшет выдерживают с 2-50 нМ пептидом-мишенью с целью химически зафиксировать соответствующие иммуногенные фрагменты рецепторного белка на некоторое время и при температуре достаточной для того, чтобы обеспечить фиксацию (то есть в течение 16 часов при 4°С).
Также практически возможно изготовить иммуносорбент с помощью фиксации соответствующего фрагмента рецепторного белка на нитроцеллюлозных полосках с помощью силы ионного взаимодействия. Соответствующий фрагмент рецепторного белка, выделенный из мозга млекопитающего, прибавляется к нитроцеллюлозе и выдерживается в течение 15 мин при 37°С. Далее нитроцеллюлоза промывается 0,5% раствором TWEEN-20 и получающийся в результате иммуносорбент сушится при комнатной температуре и хранится в сухом месте в течение периода в один год.
ПРИМЕРЫ
Следующие примеры приведены далее для того, чтобы обеспечить специалиста в данной области полным раскрытием и описанием того, каким образом соединения, заявленные здесь, изготавливаются и оцениваются. Далее примеры предназначаются быть лишь примерами изобретения и не предназначены для того, чтобы ограничивать объем того, что изобретатели рассматривают в качестве изобретения. Приложены усилия для того, чтобы обеспечить точность с соблюдением чисел (например, количеств, температуры и т.д.), но некоторые ошибки и отклонения могут быть учтены. Если не указано иначе, часть является массовой частью, температура показана в °С или является комнатной температурой, давление атмосферное или близкое к нему.
Пример 1. Анализ на NMDA-пептид
Предпочтительным NR2-пептидным анализом является латексный агглютинационный иммуноанализ для качественного определения NR2-пептидов в крови. Образцы крови смешиваются с антителами, связанными с латексными шариками, и агглютинация визуально обнаруживается в течение 10 минут. После прибавления образца крови в отверстие для образца испытательной установки, красные кровяные клетки удаляются из плазмы с помощью фильтрации. Предопределенное количество плазмы перемещается с помощью капиллярных сил в реакционную камеру, где оно реагирует с латексным реагентом (латексными шариками, покрытыми антителами) для того, чтобы образовать комплексы, которые могут быть обнаружены визуально. В примерах, сообщенных здесь, анализ использует калибратор, установленный с 100-5000 пг/мл и стандартами с «низким» (<200 пг/мл) и «высоким» (1000 пг/мл) значениями NR2-пептида.
Пример 2. Анализ на NMDA-антитело
Быстрый способ анализа NR2-антитела (CIS-LA анализ на антитело) основывается на способе латексной агглютинации. CIS-LA анализ на антитело использует тройное предметное стекло с лункой со встроенным увеличительным устройством для того, чтобы детектировать реакцию визуально, обеспечивая немедленный ответ «да» или «нет». В этом анализе образцы сыворотки смешиваются с NR2-пептидом, связанным с окрашенными латексными частицами, и агглютинация визуально обнаруживается через встроенное увеличительное устройство в течение от 2 до 5 минут или выявляется, используя нефелометр. Концентрации IgG в образцах пациента выражаются в нг/мл, согласно калибровочной кривой из установки калибратора 0-100 нг/мл и стандартам с «низким» (<2,0 нг/мл) и «высоким» (6 нг/мл) значениями NR2-антител.
Пример 3. Определение количества NR2-антител у взрослых оперируемых пациентов
У тридцати взрослых пациентов, ожидающих операцию с использованием АИК, определялись уровни NR2-антител в сыворотке до хирургической операции, через 24 часа после операции и через 48 часов после операции и записывались неблагоприятные последствия. Результаты представлены в таблице 1.
| Таблица 1 | |||||
| № | NR2-антитело, значение±среднеквадратичное отклонение, нг/мл | Тип хирургической операции | Неблагоприятные последствия | ||
| Перед | Через 24 часа | Через 48 часов | |||
| 1 | 1,70±0,14 | 1,58±0,12 | 1,55±0,13 | клапан | 1ый постоп геморр, |
| 2 | 1,79±0,10 | 1,64±0,03 | 2,76±0,08 | АКШ | 1ый-3ий постоп, С |
| 3 | 2,25±0,02 | 1,81 | 2,14±0,03 | АКШ+клапан | 2ой постоп, С (ч) |
| 4 | 2,00±0,04 | 3,23±0,09 | 3,34±0,15 | АКШ | 3ий-5ый постоп, С |
| 5 | 3,9±0,08 | 2,32±0,06 | 2,70±0,15 | АКШ | 2ой постоп, IS |
| 6 | 5,4±0,12 | 4,65±0,09 | 4,60±0,25 | АКШ+клапан | 2ой постоп, C&D, DM |
| 7 | 2,29±0,09 | 2,05±0,02 | 2,20±0,02 | АКШ | Предоп, *С |
| 8 | 1,69±0,02 | 1,35±0,004 | 1,22±0,07 | АКШ+клапан | 3ий постоп, С (ч) |
| 9 | 1,94±0,03 | 1,69±0,005 | 1,38±0,03 | клапан | 2ой постоп, С (4 ч) |
| 10 | 1,78±0,14 | 1,89±0,04 | 1,65 | АКШ+клапан | 1ый постоп, **, DM |
| 11 | 1,70±0,03 | 2,00±0,006 | 2,35±0,24 | АКШ+клапан | 2ой постоп, C&D, DM |
| 12 | 1,40±0,03 | 1,38±0,03 | 1,39±0,06 | АКШ+клапан | - |
| 13 | 2,11±0,03 | 1,81±0,02 | 1,93±0,16 | АКШ | - |
| 14 | 1,79±0,03 | 1,40±0,07 | 1,39±0,02 | АКШ | 1ый постоп, С (24 ч) |
| 15 | 1,47±0,02 | 1,30±0,08 | 1,31±0,07 | АКШ+клапан | 25ый постоп, депресс, |
| 16 | 0,70±0,09 | 0,69±0,06 | 0,60±0,03 | АКШ | 2ой-3ий постоп, пароксизм |
| 17 | 1,16±0,09 | 1,09±0,06 | 1,14±0,06 | АКШ | 2ой постоп, D |
| 18 | 1,16±0,004 | 0,78±0,03 | 0,60±0,01 | АКШ | 1ый постоп, тревога, С |
| 19 | 1,35±0,05 | 1,10±0,015 | 1,16±0,04 | АКШ | 2ой постоп, С |
| 20 | 1,21±0,005 | 0,92±0,09 | 0,82±0,05 | АКШ | 2ой постоп, С |
| 21 | 2,5±0,08 | 1,86±0,04 | 1,73±0,03 | АКШ | Предоп, возбуждение |
| 22 | 0,99±0,01 | 0,78±0,07 | 0,80±0,06 | АКШ | 1ый постоп, возб и инсом |
| 23 | 1,00 | 0,92±0,02 | 0,82 | АКШ | 3ий постоп, С |
| 24 | 1,10±0,18 | 1,15±0,05 | 0,98±0,004 | АКШ | 1ый постоп, тревога |
| 25 | 1,04±0,02 | 0,64±0,03 | 0,61±0,02 | АКШ | 1ый постоп, тревога |
| 26 | 0,98±0,03 | 0,81±0,05 | 0,70±0,004 | АКШ | 7ый постоп, тревога |
| 27 | 0,91±0,005 | 0,82±0,08 | 0,79±0,01 | АКШ | 2ой постоп, С |
| 28 | 0,92±0,03 | 1,15±0,09 | 0,69±0,01 | АКШ | 1ый постоп, С |
| 29 | 1,04±0,03 | 0,90±0,01 | 0,79±0,03 | АКШ+клапан | предоп, возбуждение |
| 30 | 1,10±0,11 | 0,82±0,09 | нет образца | АКШ+клапан | 1ый постоп, возбуждение |
| 31 | 0,72±0,004 | 0,73±0,004 | 0,68±0,01 | АКШ+клапан | 1ый-4ый постоп, пароксизм |
| 32 | 0,73±0,04 | 0,68±0,02 | 0,70±0,04 | клапан | предоп, возбуждение, 5ый-11ый энцефало |
IS - ишемический инсульт,
С - спутанное сознание,
D - дезориентация,
DM - панкреатический диабет,
* - нарушенное глотание,
** - изменение в психическом состоянии.
Пример 4. Определение уровней NR2-пептида и антитела в течение и после хирургической операции
Более чем 32000 младенцев (один из каждых 125-150) рождаются с врожденными дефектами сердца каждый год в Соединенных Штатах. JT пациент (дата рождения 06/25/04) перенес операцию для лечения врожденного дефекта сердца, с использованием АИК 7 декабря 2004. Данные о развитии нервной системы (шкала раннего развития Мюллена, MSEL), определяющие умственную и двигательную способности, определялись предоперационно и представлены в таблице 2. Этот младенец показал низкие результаты и пониженные зрительные, языковые способности и двигательную слабость.
| Таблица 2 | ||
| Величина | Значение | Процентиль |
| Состав раннего обучения | Стандартное значение 80 | 9 |
| Величина общей моторики | t-показатель 28 | 1 |
| Визуальное восприятие | t-показатель 45 | 31 |
| Тонкая моторика | t-показатель 34 | 5 |
| Восприятие речи | t-показатель 37 | 10 |
| Экспрессия речи | t-показатель 42 | 21 |
Результаты наблюдения NR2-пептидов и антител в крови JT пациента представлены в таблице 3. Ненормально высокие уровни пептидов и антител были обнаружены после интубации и вплоть до конца АИК. Повышенные вышеуказанные нормативные предоперационные NR2-пептид/антитела данные демонстрировали хорошее соотношение с предоперационными MSEL значениями и подтверждали травму головного мозга и неблагоприятные неврологические последствия в результате АИК. Подобранная по возрасту контрольная группа (n=7) детей младшего возраста без врожденных пороков сердца имела NR2-пептид 0,2-0,4 нг/мл и NR2-антитела 0,4-0,8 нг/мл.
| Таблица 3 | ||||
| Дата | Время | Операция | NR2-пептид, нг/мл | NR2-антитело, нг/мл |
| 12/7/2004 | 7:55 | интубация | 9,5±0,07 | 1,4±0,12 |
| 12/7/2004 | 10:14 | АИК | 10,0±0,01 | 3,1±1,02 |
| 12/7/2004 | 11:53 | 1 ч в АИК | 7,0±0,33 | 1,2±0,27 |
| 12/7/2004 | 14:35 | Конец АИК | 2,7±0,09 | 1,0±0,02 |
| 12/8/2004 | 11:30 | 24 ч после | 2,5±0,15 | 1,2±0,01 |
| 12/9/2004 | 9:30 | 48 ч после | 4,6±0,05 | 1,7±0,07 |
Пример 5. Характеристики CIS-LA анализа на антитело
Таблица 4 представляет результаты исследования, предпринятого на АИК пациентах для того, чтобы оценить величину предоперационных NR2-Ab уровней для прогнозирования вероятности неблагоприятных неврологических последствий. Результаты представлены для различных границ уровней NR2-Ab в сыворотке пациента и подразделяются, основываясь на присутствии или отсутствии постоперационных неблагоприятных последствий. Пациенты считались подвергнувшимися неблагоприятному неврологическому последствию, если в течение 28 дней АИК операции пациент страдал от спутанного состояния, ТИА или инсульта были обнаружены, основываясь на NIHSS шкале, больше, чем 9. Пациентов, не подвергавшихся неврологическим последствиям, относили к группе «без неврологического последствия».
| Таблица 4 | ||
| Предоп NR2-Ab | С неврологическим последствием n/N (%) | Без неврологического последствия n/N (%) |
| <1,5 нг/мл | 7/213 (3,3%) | 206/213 (96,7%) |
| 1,5-<2,0 нг/мл | 12/159 (7,6%) | 147/159 (92,5%) |
| ≥2,0 нг/мл | 25/26 (96,2%) | 1/26 (3,9%) |
Таблица 5 отражает подробный анализ шести различных пределов концентраций NR2-Ab от 1,5 до 2,0 нг/мл и демонстрирует эффективность каждого интервала при прогнозировании неблагоприятных неврологических последствий. Хотя вероятность события увеличивается в интервале от 1,5 до 2,0 для обеих групп, это увеличение наступает быстрее в группе «неврологическое последствие». Следовательно, степень риска значительно повышается в пределах проанализированной области, с самой большой степенью риска, соответствующей 2,0 нг/мл (ClinChem, 2003). 96% (24/25) пациентов с концентрациями NR2-Ab ≥2,0 нг/мл до операции имели неврологические осложнения в течение 48 часов после АИК, в сравнении с 5,4% пациентов с концентрациями NR2-Ab <2,0 нг/мл, что приводит к 17,9-кратному увеличению (95% CI (доверительный интервал), 11,6-27,6) способности маркера прогнозировать послеоперационные неблагоприятные неврологические последствия.
| Таблица 5 | |||
| Предоп NR2-Ab | С неврологическим последствием n/N (%) | Без неврологического последствия n/N (%) | Степень риска1 (наименьшая 95% норма)2 |
| <1,5 нг/мл | 8/214 (3,7%) | 206/214 (96,3%) | 5,2 |
| ≥1,5 нг/мл | 36/184 (19,6%) | 148/184 (80,0%) | 2,8) |
| <1,6 нг/мл | 10/288 (3,5%) | 278/288 (96,5%) | 8,9 |
| ≥1,6 нг/мл | 34/110 (30,9%) | 76/110 (69,1%) | (5,1) |
| <1,7 нг/мл | 12/319 (3,8%) | 307/319 (96,2%) | 10,8 |
| ≥1,7 нг/мл | 32/79 (40,5%) | 47/79 (59,5%) | (6,4) |
| <1,8 нг/мл | 17/351 (4,8%) | 334/351 (95,2%) | 11,9 (7,6) |
| ≥1,8 нг/мл | 27/47 (57,5%) | 20/47 (42,6%) | |
| <1,9 нг/мл | 19/364 (5,2%) | 345/364 (94,8%) | 14,1 |
| ≥1,9 нг/мл | 25/34 (73,5%) | 9/34 (26,5%) | (9,4) |
| <2,0 нг/мл | 20/373 (5,4%) | 353/373 (94,6%) | 17,9 |
| ≥2,0 нг/мл | 24/25 (96,0%) | 1/25 (4,0%) | (12,4) |
|
1Отношение вероятности события среди пациентов с положительным предоперационным NR2-Ab, деленное на отношение вероятности события среди пациентов с отрицательным предоперационным NR2-Ab; 2Наименьшая односторонняя 95% граница достоверности по отношению к риску |
В настоящее время по меньшей мере 30% пациентов, перенесших операцию на сердце, имеют послеоперационное нейрокогнитивное нарушение. Основываясь на полученном коэффициенте вероятности неврологического последствия 17,9, обнаруженная предоперационно концентрация NR2-антител, являющаяся большей, чем 2,0 нг/мл, будет прогнозировать неврологические осложнения у 89% пациентов после хирургической операции.
Фиг.1 представляет три кривых нормы изменения, основанных на данных NR2-анализа. Площадь под кривой для предоперационного определения NR2-Ab свидетельствует о том, что NR2-Ab маркер имеет высокую прогностическую способность (AUC=0,814) в отношении неблагоприятных неврологических последствий после хирургической операции.
Пример 6. Анализы пред- и постоперационного распределения NR2-антител
Высокое прогностическое значение NR2-Ab маркера для ТИА/инсульта до АИК показано на фигуре 2. Концентрации NR2-Ab в образцах сыворотки пациентов без неврологических последствий (нейрокод 0) оставались в пределе 2,0 нг/мл во все моменты времени в течение исследования. Напротив, большая часть пациентов с неблагоприятными неврологическими последствиями (NIHSS значение >9) имела повышенные показатели NR2-Ab выше предела 2,0 нг/мл перед операцией и через 24 и 48 часов после исследования.
Подробные анализы распределений NR2-Ab в группе пациентов перед операцией, через 24 и 48 часов после операции показали, что NR2-Ab могут надежно обнаруживать пациентов с неврологическими осложнениями до хирургической операции у пациентов с неврологическими осложнениями, в то время как пациенты без неврологических осложнений имели показатели NR2-Ab в рамках предела. Биомаркер NR2-Ab был чувствителен к уменьшению (т.е. ухудшению) значений NIHSS через 24 часа после хирургической операции.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Во всем тексте данной заявки упоминаются различные публикации. Раскрытия этих публикаций в их полноте вводятся таким образом посредством ссылки в эту заявку для того, чтобы более полно описать состояние области техники, к которой принадлежит это изобретение. Для специалиста в данной области техники будет очевидно, что различные модификации и вариации настоящего изобретения могут быть сделаны без отклонения от объема и сущности изобретения. Другие варианты осуществления изобретения будут очевидны для специалистов в данной области техники из описания и практического осуществления изобретения, как описано здесь. Предполагается, что описание и примеры должны рассматриваться как только иллюстративные, в то время как действительный объем и сущность изобретения показаны в последующей формуле.
1. Способ облегчения оценки риска инсульта у внешне здоровых людей до хирургической операции, предусматривающий:
а) получение анализируемого образца у человека;
б) анализ полученного тестируемого образца на присутствие или начальный уровень NMDA-рецепторного пептида, или антитела, или их комбинации;
в) сравнение результата этапа (b) с соответствующим контрольным количеством NMDA-рецепторного пептида, или антитела, или их комбинации, где соответствующее контрольное количество получают от популяции внешне здоровых людей,
где анализируемым образцом является сыворотка крови; при этом первоначальный уровень NR2 антител к пептидным фрагментам из N-терминального домена субъединиц NR2A и NR2B в указанном анализируемом образце, превышающий 2,0 мг/мл, соотносится с риском неврологических последствий в результате хирургической операции; и первоначальный уровень NR2 антител к пептидным фрагментам из N-терминального домена субъединиц NR2A и NR2B в указанном анализируемом образце, являющийся более низким чем 1,0 мг/мл, не соотносится с риском неврологических последствий в результате хирургической операции.
2. Способ по п.1, дополнительно предусматривающий:
а) определение у упомянутого пациента наличия или отсутствия одного или более дополнительных факторов риска неблагоприятных неврологических последствий; и
б) соотнесение наличия или отсутствия упомянутых одного или более дополнительных факторов риска с упомянутым риском неблагоприятных неврологических последствий после хирургической операции.
3. Способ по п.1, дополнительно включающий, если пациент имеет риск перенести неблагоприятные неврологические последствия хирургической операции, (i) применение нейропротективной терапии к упомянутому пациенту или (ii) выполнение мониторинговой программы для отслеживания риска или появления неблагоприятного неврологического последствия.
4. Способ по п.1, дополнительно включающий, если пациент имеет риск неблагоприятных неврологических последствий хирургической операции, исследование упомянутого пациента на предмет новых областей инфаркта, определяемых с помощью MRI, и проведение нейрохирургической операции на упомянутом пациенте.
5. Способ по п.1, где упомянутыми неблагоприятными неврологическими последствиями являются фокальные ишемические неврологические последствия.
6. Способ по п.1, где упомянутые неблагоприятные неврологические последствия характеризуются спутанным сознанием, ТИА или ишемическим инсультом.
7. Способ по п.1, где упомянутые неблагоприятные неврологические последствия возникают во время упомянутой хирургической операции или в течение 72 ч после хирургической операции.
8. Способ по п.1, где упомянутые NMDA-рецепторные пептиды включают фрагмент NR2-субъединицы церебрального NMDA-рецептора.
9. Способ по п.1, где упомянутые NMDA-рецепторные пептиды включают фрагмент NR2А-субъединицы церебрального NMDA-рецептора, фрагмент NR2В-субъединицы церебрального NMDA-рецептора или их комбинацию.
10. Способ по п.1, где упомянутые NMDA-рецепторные пептиды включают N-терминальный домен NR2А-субъединицы церебрального NMDA-рецептора или их комбинацию, N-терминальный домен NR2В-субъединицы церебрального NMDA-рецептора или их комбинацию.
11. Способ по п.1, дополнительно включающий:
а) измерение последующего уровня NMDA-рецепторных пептидов или антител у упомянутого пациента после упомянутой хирургической операции;
б) определение того, имеется ли существенное различие между упомянутым первоначальным и последующими уровнями;
в) соотнесение существенного различия между упомянутым первоначальным и последующими уровнями с неблагоприятным неврологическим последствием; и
г) соотнесение отсутствия существенного различия между упомянутым первоначальным и последующими уровнями с отсутствием неблагоприятного неврологического последствия.
12. Способ по п.1, где упомянутая хирургическая операция включает анестезию.
13. Способ по п.1, где упомянутая хирургическая операция включает искусственное кровообращение (АИК).
14. Способ по п.1, где упомянутым пациентом является новорожденный или ребенок младшего возраста с риском неврологического осложнения.
15. Способ по п.1, где посредством данного анализа у упомянутого пациента диагностируется диабет, атеросклероз или предварительные подозрения на инсульт или ТИА.
16. Способ по п.1, где:
а) уровни NMDA-рецепторных антител в упомянутом анализируемом образце измеряются с использованием диагностического набора;
б) упомянутый диагностический набор включает связанные NMDA-рецепторные пептиды; и
в) упомянутый набор изготавливается по стандарту для антитела, включая фракцию иммуноглобулина G, очищенного из человеческой крови.
17. Способ по п.1, выполняемый посредством прямого или косвенного ELISA, RIA, иммунодота, иммуноблоттинга, латексной агглютинации, растекания в радиальном направлении (lateral flow), флюоресцентного анализа или микрочипа.
