Инактивированные химерные вакцины и связанные с ними способы применения

Группа изобретений относится к области ветеринарии и касается инактивированных химерных вакцин и связанных с ними способов применения. Сущность изобретений включает инактивированный химерный флавивирус, содержащий первый флавивирус, представляющий собой вирус желтой лихорадки, в котором нуклеотидные последовательности, кодирующие премембранный и оболочечный белки, заменены нуклеотидными последовательностями, кодирующими премембранный и оболочечный белки второго флавивируса, представляющего собой вирус лихорадки западного Нила. Изобретения также включают иммуногенную композицию и вакцину для защиты животных от флавивирусной инфекции, включающих инактивированный химерный флавивирус. Преимущество изобретений заключается в разработке усовершенствованной иммуногенной композиции и вакцины на основе инактивированного химерного флавивируса. 4 н. и 10 з.п. ф-лы, 5 табл.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА СВЯЗАННЫЕ ЗАЯВКИ

По данной заявке испрашивается приоритет по § 119 35 U.S.C. предварительной заявки США 60/693629, поданной 24 июня 2005 года, которая включена в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Это изобретение относится к новым и усовершенствованным способам профилактики и лечения флавивирусной и другой близкородственной вирусной инфекции у животных.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Флавивирусы представляют собой маленькие оболочечные вирусы с положительной цепью РНК, которые представляют интерес для многих медицинских и ветеринарных структур во всем мире. Например, вирус лихорадки западного Нила (WN или WNV), который является членом семейства флавивирусов, является этиологическим фактором энцефалита WN, инфекционного неконтагиозного переносимого членистоногими вирусного заболевания (In Virology, Fields (ed.), Raven-Lippincott, New York, 1996, pp. 961-1034). Вирус был обнаружен в Африке, Западной Азии, Среднем Востоке, Средиземноморском регионе Европы и, недавно, в США. Москиты становятся инфицированными вирусом после кормления на инфицированных диких птицах, а затем они передают вирус через укусы людям, птицам и животным, таким как лошади, овцы, крупный рогатый скот и свиньи.

Вирус лихорадки западного Нила представляет собой опасное инфекционное заболевание. Вирус лихорадки западного Нила впервые был выделен в Уганде в 1937 году. На сегодняшний день он наиболее распространен в Африке, Западной Азии, Европе и на Среднем Востоке. Однако в США его впервые выявили в 1999 году. К 2004 году вирус был выявлен у птиц и москитов в каждом штате, за исключением Аляски и Гавайев.

Другие хорошо известные заболевания, вызываемые флавивирусами, включают желтую лихорадку, японский энцефалит, денге и энцефалит Сент-Луиса. Флавивирусные инфекции обычно передаются клещами и/или комарами.

Первичными хозяевами для вируса западного Нила являются только комары и птицы. Полагают, что другие виды животных, такие как люди и животные, такие как лошади, овцы, крупный рогатый скот и свиньи и т.п. являются случайными хозяевами, которые становятся инфицированными при укусе случайного хозяина инфицированной самкой комара.

Люди, зараженные вирусом лихорадки западного Нила, обычно обладают только мягкими симптомами, включающими лихорадку, головную боль, боль в теле, кожную сыпь и увеличенные лимфатические узлы. Однако если вирус лихорадки западного Нила проникает в головной мозг, он может вызвать опасный для жизни энцефалит или менингит. Опасные для жизни случаи встречаются в основном у пожилых людей. Последние исследования показали, что вирус лихорадки западного Нила может передаваться при переливании крови и трансплантации органов. Некоторые эксперты по здоровью также полагают, что, возможно, вирус лихорадки западного Нила передается от матери ее будущему ребенку и через грудное молоко.

Существует множество исследовательских подходов по разработке вакцин на основе вируса лихорадки западного Нила, включая живые химерные вакцины (которые в одной вакцине сочетают гены более чем одного вируса), вакцины с "голой" ДНК и вакцины, содержащие смеси отдельных белков вируса западного Нила, и т.п. Однако не существует подхода, обеспечивающего применение инактивированной химерной вакцины.

Флавивирусные белки продуцируются посредством трансляции одной длинной открытой рамки считывания с образованием полибелка, который подвергается комплексной серии посттрансляционных протеолитических расщеплений сочетанием хозяйских и вирусных протеаз с образованием зрелых вирусных белков. Структурные белки вируса расположены в полибелке в порядке C-prM-E, где "C" представляет собой капсид, "prM" представляет собой предшественник вирусного связанного с оболочкой белка M (мембранного белка), и "E" представляет собой оболочечный белок. Эти белки находятся в N-концевой области полибелка, в то время как неструктурные белки (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B и NS5) расположены в C-концевой области полипептида.

В 2003 году в Acambis (Cambridge, MA) были начаты клинические испытания у людей живой аттенуированной вакцины на основе вируса западного Нила. Живая аттенуированная вакцина Acambis основана на вакцине, уже использованной для профилактики желтой лихорадки, заболевания, вызываемого другим флавивирусом.

Одна живая аттенуированная вакцина Acambis содержит гены из двух различных вирусов, вируса желтой лихорадки и вируса западного Нила, и она представляет собой пример химерного вируса. Живая аттенуированная вакцина Acambis содержит вирус желтой лихорадки с некоторыми генами, замещенными генами поверхностных белков вируса лихорадки западного Нила.

Подробное описание получения этой живой аттенуированной химерной вакцины Acambis представлено, например, в патентах США № 6962708 и 6696281 и Chambers et al., J. Virol. 73:3095-3101, 1999, все из которых включены в настоящее описание в полном объеме. Следующие способы применения и диагностики для живой аттенуированной вакцины Acambis представлены в патентах США № 6682883 и 6878372, все из которых включены в настоящее описание в полном объеме.

Результаты таких живых аттенуированных вакцин оказались успешными, и исследования продолжаются. Однако применение живой аттенуированной вирусной вакцины может сопровождаться определенным риском. Этот риск еще более выражен у субъектов с ослабленным иммунитетом, у пожилых субъектов, у беременных женщин и других субъектов с ослабленной или подавленной иммунной системой. Часто обнаруживали, что живые аттенуированные вирусные вакцины являются либо слабо аттенуированными (вызывают заболевание), либо сверхаттенуированными (не иммунизируют). Также возможно обратное превращение оптимально аттенуированной вирусной вакцины в вирулентную (вызывающую заболевание) форму посредством мутации. Однако следует отметить, что для YF-WN из Acambis не было показано возвращения вирулентности. Существуют дополнительные проблемы, касающиеся живых аттенуированных вакцин. Например, живые вирусы денге часто являются чувствительными к нагреванию, что приводит к трудности и высокой стоимости хранения вакцины в некоторых тропических и субтропических странах, где вакцина может быть наиболее необходима. Таким образом, в данной области необходима вакцина для безопасного лечения и/или профилактики флавивирусных инфекций, таких как инфекция вирусом западного Нила, у субъектов, обладающих этим или другим сходным риском, особенно у субъектов с ослабленной иммунной системой или других обладающих большим риском субъектов.

Однако уровень техники в данной области показывает, что инактивированная химерная вирусная вакцина является нежелательной и может оказаться неэффективной. В патенте США № 6432411 описано, что попытки создать убитые флавивирусные вакцины привели к ограниченному успеху. Первоначально исследования ограничивались отсутствием возможности получения достаточного выхода вируса из систем культур клеток. Выход вируса из клеток насекомых, как правило, находится в диапазоне от 10⁴ до 10⁵ БОЕ/мл, что значительно ниже уровней, необходимых для получения экономически эффективной убитой вакцины. Выход из клеток млекопитающих, включающих клетки LLC-MK2 и Vero, был выше, однако максимальный выход, приблизительно 10⁸ БОЕ/мл, из уникальной клеточной линии Vero, тем не менее, не достигает уровня, необходимого для достижения действительно экономически эффективного вакцинного продукта.

Таким образом, в данной области не рекомендовано применение инактивированных флавивирусов в качестве целесообразных вакцин-кандидатов. Более того, не существует показаний для лечения или профилактики какой-либо флавивирусной инфекции инактивированной химерной вакциной.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Различные варианты осуществления настоящего изобретения включают вакцинную или иммуногенную композицию для лечения или профилактики флавивирусной инфекций у животного.

Это изобретение также относится к способам профилактики или лечения флавивирусных инфекций у восприимчивых животных, которые включают введение субъектам инактивированных химерных флавивирусов. Это изобретение также относится к применению инактивированных химерных флавивирусов для изготовления лекарственных средств для применения в таких способах и вакцинных и/или иммуногенных композициях. В одном варианте осуществления по этому изобретению инактивированные химерные флавивирусы могут включать, например, капсидный и неструктурные белки первого флавивируса, и белок prM, и оболочечный белок второго флавивируса.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к инактивированному химерному флавивирусу, содержащему первый флавивирус, в котором нуклеотидные последовательности, кодирующие премембранный и оболочечный белки, заменены нуклеотидными последовательностями, кодирующими премембранный и оболочечный белки второго флавивируса. Первый флавивирус может представлять собой вирус желтой лихорадки, включая вирус желтой лихорадки, полученный из штамма 17D. Химерный вирус может содержать сигнальную последовательность на конце аминокислотной последовательности премембранного белка, и сигнальная последовательность может представлять собой последовательность вируса желтой лихорадки. Второй флавивирус может представлять собой вирус лихорадки западного Нила.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к иммуногенной композиции, содержащей инактивированный химерный флавивирус, содержащий первый флавивирус, в котором нуклеотидные последовательности, кодирующие премембранный и оболочечный белки, заменены нуклеотидными последовательностями, кодирующими премембранный и оболочечный белки второго флавивируса.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к вакцине, содержащей инактивированный химерный флавивирус, содержащий первый флавивирус, в котором нуклеотидные последовательности, кодирующие премембранный и оболочечный белки, заменены нуклеотидными последовательностями, кодирующими премембранный и оболочечный белки второго флавивируса. Кроме того, вакцина может содержать i) один или несколько модифицированных живых вирусов; ii) один или несколько инактивированных вирусов; или iii) один или несколько бактериальных антигенов. Кроме того, вакцина может содержать один или несколько из инактивированного вируса восточного энцефаломиелита, инактивированного вируса западного энцефаломиелита, инактивированного вируса венесуэльского энцефаломиелита, инактивированного вируса герпеса лошадей 1 типа, инактивированного вируса герпеса лошадей 4 типа, инактивированного вируса гриппа лошадей штамма Kentucky 1993/A2, инактивированного вируса гриппа лошадей штамма Kentucky 2002/A2, инактивированного вируса гриппа лошадей штамма New Market/2/93/A2 и фракции столбнячного токсоида.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу профилактики или лечения флавивирусной инфекции у животного, где способ включает введение животному инактивированного химерного флавивируса (или его иммуногенной композиции или вакцины), содержащего первый флавивирус, в котором нуклеотидные последовательности, кодирующие премембранный и оболочечный белки, заменены нуклеотидными последовательностями, кодирующими премембранный и оболочечный белки второго флавивируса. Первый флавивирус может представлять собой вирус желтой лихорадки. Вирус желтой лихорадки может быть получен из штамма 17D. Второй флавивирус может представлять собой вирус лихорадки западного Нила.

В любых вариантах осуществления настоящего изобретения инактивированный химерный вирус может быть представлен в концентрации в диапазоне между 10² и 10⁸ бляшкообразующих единиц (БОЕ). Альтернативно химерный флавивирус можно вводить в дозе в диапазоне между 10⁶ и 10⁷ БОЕ. Альтернативно химерный флавивирус можно вводить в дозе в диапазоне между 1-10 относительных антигенных единиц.

В любых вариантах осуществления настоящего изобретения инактивированный химерный вирус можно вводить посредством подкожного, внутримышечного способов, способа введения под слизистую оболочку, способа введения на слизистую оболочку или внутрикожного способов. В варианте осуществления настоящего изобретения инактивированный химерный флавивирус вводят орально.

Другие признаки и преимущества этого изобретения будут очевидны из представленного ниже описания.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Как используют в настоящем описании, термин "вакцина(ы)" означает и относится к продукту, введение которого предназначено для возникновения иммунного ответа(ов), который может предотвратить и/или уменьшить тяжесть одного или нескольких инфекционных заболеваний. Вакцины могут включать один или несколько из следующих компонентов: живой аттенуированный или инактивированный препарат бактерий, вирусов или паразитов, инактивированные (убитые) целые организмы, живые облученные клетки, неочищенные фракции или очищенные иммуногены, включая полученные посредством рекомбинантной ДНК в клетке-хозяине, конъюгаты, образованные ковалентным связыванием компонентов, синтетические антигены, полинуклеотиды (такие как вакцины на основе плазмидой ДНК), живые клетки с векторами, экспрессирующими специфичные гетерологичные иммуногены, или сенсибилизированные иммуногеном клетки.

Как используют в настоящем описании, "химерный вирус" относится к вирусу, имеющему геном, содержащий последовательности двух или более отличающихся вирусов, в том числе отличающихся вирусных штаммов. Если нет иных указаний, "химера" относится к химерному вирусу. Неограничивающим примером химерного вируса является химера YF/WN, которая представляет собой химерный флавивирус.

Как используют в настоящем описании, "химерный флавивирус" относится к вирусу, имеющему геном, содержащий последовательности из двух или более отличающихся флавивирусов, в том числе отличающихся штаммов флавивирусов. Как описано выше, неограничивающим примером химерного флавивируса является химера YF/WN.

Как используют в настоящем описании, "химерный вирус западного Нила", "химера западного Нила", "вирус YF/WN" и "химера YF/WN" относятся к химерному живому аттенуированному вирусу, содержащему вакцинный штамм 17D вируса желтой лихорадки (YFV), в котором нуклеотидные последовательности, кодирующие премембранный (prM) и оболочечный (E) белки, заменены нуклеотидными последовательностями, кодирующими белки prM и E вируса лихорадки западного Нила (WNV), так что экспрессируются белки prM и E вируса лихорадки западного Нила, и капсидный белок химерного вируса представляет собой белок вируса желтой лихорадки. Квалифицированный специалист легко поймет, что могут быть получены химерные флавивирусы, содержащие компоненты вируса желтой лихорадки и вируса лихорадки западного Нила, отличные от конкретного химерного флавивируса, описанного в этом абзаце.

Химерный вирус западного Нила (или вирус YF/WN) можно инактивировать с использованием способов, хорошо известных квалифицированному специалисту. Например, химерный вирус западного Нила (или вирус YF/WN) можно инактивировать посредством химических инактивирующих веществ или другими физическими способами, такими как нагревание. Неограничивающие примеры химических инактивирующих веществ включают бинарный этиленимин (BEI) или формалин (37% раствор формальдегида).

Живой вирус можно инактивировать с использованием BEI, сначала смешивая порошок бинарного этиленамина (BEA) с раствором гидроксида натрия. После образования BEI в щелочной среде, раствор BEI добавляют к раствору, содержащему живой вирус, до конечной концентрации BEI от 0,5 мМ до 10 мМ. Затем этот раствор можно инкубировать при 4-37°C в течение 24-96 часов. Затем после инактивации вируса для нейтрализации всего оставшегося BEI можно добавлять тиосульфат натрия.

Живой вирус также можно инактивировать формалином (37% раствор формальдегида). В этом случае формалин добавляют к раствору, содержащему живой вирус, до конечной концентрации формалина 0,05-2% об./об. (формалин/раствор живого вируса). Затем этот раствор можно инкубировать при 4-37°C в течение 24-96 часов.

Как используют в настоящем описании, термин "антиген" означает и относится к вирусу, бактериям, частям вируса или бактерий или к чужеродному белку, который действует посредством стимуляции иммунной системы у животного. Иммунную систему можно стимулировать для обеспечения атаки лейкоцитов и разрушения ими антигена, или для продукции белковой молекулы, которая связывается антигеном и либо уничтожает антиген, либо делает его неактивным. Как используют в настоящем описании, термин "антитело" означает и относится к содержащей белок молекуле, производимой иммунной системой животного, которая реагирует с антигеном и делает его неактивным.

Как используют в настоящем описании, термин "животное" означает и относится как к человеку, так и к не относящимся к человеку животным.

Как используют в настоящем описании, термин "вакцинный штамм" означает и относится к вирусному штамму, пригодному для применения в иммуногенной композиции или вакцине. "Вакцинный штамм" может включать, но не ограничиваться этим, непатогенный штамм или относительно непатогенный штамм, убитый штамм и/или аттенуированный штамм.

Как используют в настоящем описании, термин "лиофилизировать" и термины со сходным значением, означают и относятся к лиофилизации. Как используют в настоящем описании, термин "животное происхождение" означает и относится к происхождению из животных. Аналогично, термин "неживотное происхождение" означает и относится к происхождению не непосредственно из животных или непрямо из животных.

Как используют в настоящем описании, термин "стабилизировать" и термины со сходным значением, означают и относятся к получению или поддержанию в стабильном, устойчивом, неизменном состоянии и к поддержанию на приблизительно данном или по существу не изменяющемся уровне, при приблизительно данном или по существу не изменяющемся качестве и в приблизительно данном или по существу не изменяющемся количестве. Однако понятно, что может встречаться некоторое отклонение от уровня, качества и/или количества стабилизированной композиции. Подразумевают, что варианты осуществления настоящего изобретения охватывают стабилизаторы, которые допускают такие отклонения. Не ограничиваясь этим, стабилизаторы включают сухие стабилизаторы, сыпучие стабилизаторы, криопротекторы, термостабилизаторы, осмопротекторы, защищающие от потери влаги средства и т.п. Подразумевают, в частности, что такие термины относятся к стабилизаторам по настоящему изобретению.

Как используют в настоящем описании, термин "белок" означает и относится к молекулярной цепи из аминокислот. Белок не обладает конкретной длиной, и его, при необходимости, можно модифицировать in vivo или in vitro, например, посредством гликозилирования, амидации, карбоксилирования или фосфорилирования. В частности, к определению белка относятся пептиды, олигопептиды и полипептиды. Источник белка или пептида может быть биологическим и/или синтетическим.

Как используют в настоящем описании, термин "нуклеиновая кислота" означает и относится к молекулярной цепи рибонуклеиновых кислот или дезоксирибонуклеиновых кислот. Нуклеиновая кислота не обладает конкретной длиной, таким образом, к этому определению относятся полинуклеотиды, гены, открытые рамки считывания (ORF), зонды, праймеры, линкеры, спейсеры и адаптеры. Источник нуклеиновой кислоты может быть биологическим и/или синтетическим. Нуклеиновая кислота может находиться в одноцепочечной или двухцепочечной форме. Отдельная цепь может быть представлена в смысловой или антисмысловой ориентации. Также к определению относятся модифицированные РНК или ДНК. Можно проводить модификации оснований нуклеиновой кислоты, и можно встраивать основания, такие как инозин. Другие модификации могут включать, например, модификации остова.

Как используют в настоящем описании, фармацевтически приемлемый носитель понимают как соединение, которое не оказывает неблагоприятного воздействия на здоровье животного или организма, подлежащего вакцинации, по меньшей мере оно не оказывает такого неблагоприятного воздействия, чтобы неблагоприятный эффект был хуже эффектов, когда животное не вакцинируют. Неограничивающие примеры фармацевтически приемлемых носителей включают стерильную воду или стерильный физиологический солевой раствор. В более комплексной форме носитель может представлять собой буфер.

Как используют в настоящем описании, термин "углевод" означает и относится к моно-, ди-, олиго- и полисахаридам.

Как используют в настоящем описании, термин "кошачьи" означает и относится к любому животному из рода Felis, или животному, относящемуся к роду Felis, или из семейства Felidae, семейства кошачьих, таких как, не ограничиваясь ими, кошка, лев, тигр, кугуар, пума, ягуар, рыжая рысь, оцелот и т.п.

Как используют в настоящем описании, термин "собачьи" означает и относится к любому животному из рода Canis или животному, относящемуся к роду Canis, семейству собачьих, таких как, не ограничиваясь ими, собака, волк и т.п.

Как используют в настоящем описании, термин "лошадиные" означает и относится к любому животному из рода Equis, или животному, относящемуся к роду Equis, или из семейств Equidae, семейства лошадиных, таких как, не ограничиваясь ими, лошадь, мул, осел, зебра и т.п.

Настоящее изобретение, главным образом, относится к композициям и способам профилактики и лечения флавивирусной инфекции у животных. Способы по этому изобретению включают вакцинацию инактивированным химерным флавивирусом животных, обладающих риском развития флавивирусной инфекции или имеющих флавивирусную инфекцию. Другие аспекты этого изобретения относятся к способам получения вакцинной или иммуногенной композиции, содержащей инактивированный химерный флавивирус, для лечения или профилактики у животных флавивирусной инфекции.

Однако квалифицированный специалист легко поймет, что существуют другие хорошо охарактеризованные флавивирусы и вирусы, близко родственные флавивирусам, инфекцию которыми можно лечить или предотвращать с использованием инактивированных химерных вирусов, описанных в настоящем изобретении. Таким образом, это изобретение также относится к инактивированным химерным вирусам для лечения или профилактики заболеваний или расстройств, ассоциированных с вирусами семейства Flaviviridae или Togaviridae или обусловленных ими. Неограничивающие примеры родов вирусов, принадлежащих этим семействам, включают вирусы, относящиеся к родам Flavivirus, Pestivirus, Hepacivirus или Alphavirus. Неограничивающие примеры вирусов или заболеваний, вызываемых вирусами, относящимися к этим семействам или родам, включают вирусы энцефалита, вирусы восточного энцефалита лошадей, западного энцефалита лошадей, венесуэльского энцефалита лошадей, Кунжин, энцефалита долины Муррей, шотландского энцефалита овец, вирусы японского энцефалита, денге (серотипы 1-4), желтой лихорадки, энцефалита долины Муррей, энцефалита Сент-Луиса, энцефалита Росио, Вессельсброна, Ильеус; клещевые флавивирусы, такие как вирусы центрально-европейского энцефалита, сибирского энцефалита, русского весенне-летнего клещевого энцефалита, киасанурской лесной болезни, омской геморрагической лихорадки, Повассан, Негиши, Абсеттаров, Гансалова, Апои и Ипр; а также вирусы рода Hepacivirus (например, вирус гепатита C). Дополнительные вирусы, инфекцию, которыми можно лечить или предотвращать с использованием инактивированных химерных вирусов по настоящему изобретению, включают вирусы, принадлежащие роду Pestivirus (например, вирус бычьей диареи), и другие вирусы, такие как вирусы Ласса, Эбола, и вирус болезни Марбурга или другие РНК-вирусы с геномной конструкцией, встраивание в химеру которой является допустимым.

Инфекцию любым из описанных выше вирусов (или вызываемые ими заболевания) можно предотвращать или лечить с помощью инактивированных химерных вирусов, описанных в настоящем описании, в частности инактивированных химерных вирусов, которые содержат первый вирус, где один структурный белок (или несколько структурных белков) первого вируса заменен соответствующим структурным белком (или белками) второго вируса, против которого намереваются проводить профилактику или лечение.

Предпочтительный аспект этого изобретения относится к инактивированным химерным флавивирусам, способам получения инактивированных химерных флавивирусов, вакцинам, содержащим инактивированные химерные флавивирусы, и способам применения таких вакцин. Этот аспект настоящего изобретения относится к инактивированным химерным флавивирусам, которые содержат флавивирус, где один или несколько структурных белков первого флавивируса заменены одним или несколькими соответствующими структурными белками второго флавивируса, против которого требуется иммунитет. В одном варианте осуществления настоящего изобретения химеры состоят из остова первого флавивируса, в котором белки prM и E заменены белками prM и E второго флавивируса.

Инактивированные химерные вирусы, которые используют в этом изобретении, могут состоять из любого сочетания вирусов при условии, что, как упомянуто выше, вирус, против которого требуется иммунитет, является источником встраиваемого структурного белка(ов). Например, для вакцинации животного, такого как лошадь, против инфекции вирусом лихорадки западного Нила, можно использовать химерный флавивирус, состоящий из остова флавивируса, такого как остов вируса желтой лихорадки (YF), в который встроены структурные белки вируса лихорадки западного Нила, такие как белки prM и E. В этой химере белки prM и E YF заменяют белками WN. Аналогично, если требуется иммунитет против вируса японского энцефалита (JE), тогда в остов флавивируса, такого как вирус желтой лихорадки, вместо соответствующих белков остова можно встраивать белки prM и E вируса JE. Другие флавивирусы, которые вызывают заболевание у лошадей и для защиты от которых можно использовать химерные вирусы, включают вирусы Кунжин, энцефалита долины Муррей и шотландского энцефалита овец. Во всех вариантах осуществления настоящего изобретения химерный вирус далее инактивируют. Примеры животных, которых можно вакцинировать и/или лечить инактивированными химерными вирусами по настоящему изобретению, включают человека, лошадей, свиней, овец, крупный рогатый скот, домашних животных, таких как кошки и собаки, и домашних птиц. Однако, как правило, можно вакцинировать любое животное, восприимчивое к инфекции флавивирусом, от которого требуется защита.

Таким образом, неограничивающие примеры флавивирусов, которые можно использовать в этом изобретении в качестве источников вируса остова или вставок структурных белков, включают комариные флавивирусы, такие как вирусы японского энцефалита, денге (серотипы 1-4), желтой лихорадки, энцефалита долины Муррей, энцефалита Сент-Луиса, западного Нила, Кунжин, энцефалита Росио, Вессельсброна и Ильеус; клещевые флавивирусы, такие как вирусы центрально-европейского энцефалита, сибирского энцефалита, русского весенне-летнего клещевого энцефалита, киасанурской лесной болезни, омской геморрагической лихорадки, шотландского энцефалита овец, Повассан, Негиши, Абсеттаров, Гансалова, Апои и Ипр; а также вирусы рода Hepacivirus (например, вирус гепатита C). Дополнительные вирусы, которые можно использовать в качестве источника встраиваемых структурных белков, включают вирусы рода Pestivirus (например, вирус бычьей диареи), и другие вирусы, такие как вирусы Ласса, Эбола и вирус болезни Марбурга.

Как правило, как описано в патентах США № 6962708 и 6696281, в варианте осуществления для профилактики или лечения инфекции флавивирусом западного Нила, такие способы включают замену генов, кодирующих два структурных белка [prM и E] вакцинного вируса желтой лихорадки 17D соответствующими генами вируса лихорадки западного Нила, и инактивацию химерного вируса. Полученный инактивированный вирион обладает оболочкой вируса западного Нила, содержащей структуры, вовлеченные в связывание вируса с клеткой и интернализацию вируса, все антигенные детерминанты для нейтрализации и эпитоп(ы) для цитотоксических T-лимфоцитов. Нуклеокапсидный (C) белок, неструктурные белки и нетранслируемые концы, ответственные за репликацию вируса, остаются от исходного вируса желтой лихорадки 17D.

Один предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к инактивированной химерной вакцинной и/или иммуногенной композиции для лечения или профилактики инфекции вирусом западного Нила у животного, восприимчивого к инфекции вирусом западного Нила. Подробное описание получения химерных вирусов, включая химерный вирус WN/YF, которые затем можно инактивировать и использовать в различных вариантах осуществления этого изобретения, представлено, например, в патентах США № 6962708 и 6696281 и Chambers et al., J. Virol. 73:3095-3101, 1999, все из которых включены в настоящее описание в виде ссылок в полном объеме. Однако патенты США № 6962708 и 6696281 ограничиваются живыми аттенуированными химерными вирусами, вакцинами и связанными с ними способами применения. Не существует указаний или предположений о применении инактивированного химерного вируса, применении инактивированного химерного вируса в вакцине или применении инактивированного химерного вируса в любом связанном с ним способе. В противоположность этим патентам все варианты осуществления настоящего изобретения относятся к инактивированным химерным вирусам.

Вакцинные и иммуногенные композиции в соответствии с различными вариантами осуществления настоящего изобретения можно получать и/или поставлять на рынок в форме жидкости, замороженной суспензии или в лиофилизированной форме. Как правило, вакцинные и/или иммуногенные композиции, полученные в соответствии с настоящим изобретением, содержат фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, обычно используемый в таких композициях. Носители включают, но не ограничиваются ими, стабилизаторы, консерванты и буферы. Пригодные стабилизаторы представляют собой, например, композиции SPGA, Tween (такие как композиции, доступные от A.G. Scientific, Inc., San Diego, CA), углеводы (такие как сорбит, маннит, крахмал, сахароза, декстран, глутамат или глюкоза), белки (такие как сухое молоко, сывороточный альбумин или казеин) или продукты их деградации. Неограничивающие примеры пригодных буферов включают фосфаты щелочных металлов. Пригодные консерванты представляют собой тимеросал, мертиолят и гентамицин. Разбавители включают воду, водный буфер (такой как буферный физиологический раствор), спирты и полиолы (такие как глицерин).

Если желательно, инактивированные вакцины в соответствии с этим изобретением могут содержать адъювант. Пригодные для этой цели соединения или композиции включают HAVLOGEN® (адъювант на основе полимера акриловой кислоты, Intervet Inc., Millsboro, DE), полиакриловые кислоты, гидроксид, фосфат или оксид алюминия, эмульсию типа "масло-в-воде" или "вода-в-масле", например, на основе минерального масла, такого как BAYOL™ или MARCOL™ (Esso Imperial Oil Limited, Canada), или растительного масла, такого как ацетат витамина E, и сапонины. Однако компоненты с адъювантной активностью широко известны, и, в целом, можно использовать любой адъювант, который не оказывает неблагоприятного эффекта на эффективность или безопасность вакцинной и/или иммуногенной композиции.

Как правило, вакцину можно вводить подкожным, внутрикожным способом, способом под слизистую оболочку или внутримышечным способом в количестве, эффективном для предотвращения инфекции представляющим интерес флавивирусом и/или для лечения инфекции флавивирусом. Эффективное количество определяют как количество иммунизирующего инактивированного химерного материала, которое приведет к индукции иммунитета у вакцинированных животных против заражения вирулентным вирусом. В различных других вариантах осуществления эффективное количество индуцирует иммунитет у вакцинированных животных или их потомства против заражения вирулентным вирусом. В настоящем описании иммунитет определяют как индукцию значительно более высокого уровня защиты в выборке животных после вакцинации по сравнению с невакцинированной группой.

Кроме того, в различные составы инактивированных вакцинных и/или иммуногенных композиций по настоящему изобретению можно добавлять пригодные эксципиенты, стабилизаторы и т.п.

Инактивированный химерный вирус можно составлять в виде стерильного водного раствора, содержащего между 10² и 10¹² инфекционных единиц (как определяют до инактивации). В одном варианте осуществления инактивированный химерный вирус можно составлять в качестве стерильного водного раствора, содержащего между 10⁷ и 10¹⁰ инфекционных единиц (как определяют до инактивации). Инфекционные единицы включают бляшкообразующие единицы (БОЕ) или инфекционные дозы для культуры ткани (tcid). Альтернативно инактивированный химерный вирус можно составлять в виде стерильного водного раствора, содержащего между 1-10 относительных антигенных единиц дозы. Составленный инактивированный химерный вирус может быть предоставлен в объеме дозы от 0,1 до 1,0 мл для введения, например, посредством подкожного, внутримышечного способов, способа под слизистую оболочку или внутрикожного способа. Следующие варианты осуществления можно вводить способом на слизистую оболочку, таким как оральный способ. Выбор соответствующего количества химеры для введения может быть определен специалистами в данной области, и это количество может варьировать вследствие множества факторов, включающих, но не ограничивающихся ими, размер, тип и общее состояние здоровья животного, которому намереваются вводить химеру.

Для лучшего понимания этого изобретения следует обратиться к представленным ниже примерам и формуле изобретения.

Пример 1

Схема эксперимента:

Животные

Шесть (6) годовалых лошадей смешанной породы, как самцов, так и самок, являющихся серонегативными в отношении вируса лихорадки западного Нила (WNV), вакцинировали комбинированной вакциной, содержащей компоненты инактивированных вирусов вакцины PRESTIGE® V+VEE (доступной от Intervet Inc., Millsboro, DE) и инактивированную химеру вирусов желтой лихорадки - западного Нила (YF-WN), все из которых были представлены в сочетании с адъювантом полиакриловой кислотой. Вакцина PRESTIGE® V+VEE содержит инактивированный вирус восточного энцефаломиелита, инактивированный вирус западного энцефаломиелита, инактивированный вирус венесуэльского энцефаломиелита, инактивированный вирус герпеса лошадей 1 и 4 типов (ринопневмония), инактивированный вирус гриппа (штамм Kentucky 1993, штамм Kentucky 2002 и New Market-2-93) и фракции столбнячного токсоида.

Живую аттенуированную химеру YF-WN получали от Acambis в Cambridge, MA, и инактивировали бинарным этиленимином (BEI). Инактивацию проводили, первоначально смешивая порошок бинарного этиленамина (BEA) с раствором гидроксида натрия. При перемешивании BEA превращается в BEI. Этот жидкий раствор BEI добавляли к раствору живого химерного вируса до конечной концентрации BEI 2 мМ. Раствор BEI/химера инкубировали при приблизительно 18-25°C в течение приблизительно 3 суток.

Шесть (6) других годовалых лошадей смешанной породы, как самцов, так и самок, являющихся серонегативными в отношении вируса лихорадки западного Нила (WNV), вакцинировали комбинированной вакциной, содержащей компоненты инактивированных вирусов вакцины PRESTIGE® V+VEE (доступной от Intervet Inc., Millsboro, DE) и инактивированную формалином химеру вирусов желтой лихорадки - западного Нила (YF-WN).

Живую аттенуированную химеру YF-WN получали от Acambis в Cambridge, MA и инактивировали формалином (37% раствор формальдегида). Инактивацию проводили смешиванием раствора формалина с раствором живого химерного вируса до конечной концентрации формалина 0,1% об./об. относительно раствора живого химерного вируса. Раствор формалин/химера инкубировали при приблизительно 18-25°C в течение приблизительно 3 суток.

Шесть других (6) годовалых лошадей смешанной породы, как самцов, так и самок, являющихся серонегативными в отношении вируса лихорадки западного Нила (WNV), не вакцинировали и использовали в качестве контролей.

Вакцинация

Лошадям вводили дозу вакцины 2 × 1 мл, внутримышечно, вводимую с интервалом 3-4 недели.

Вирус для контрольного заражения:

Вирус лихорадки западного Нила (WNV), 5 log₁₀ БОЕ/1 мл доза, вводили каждой лошади интратекальным способом через 4 недели после второй вакцинации.

Результаты:

Серологические результаты примера 1 являются следующими:

Результаты

Серологические результаты из примера 1 иллюстрируют неожиданные результаты для инактивированной химерной вакцины против вируса западного Нила. Известно, что живые вирусы, такие как живая аттенуированная химера YF-WN Acambis, вызывают как клеточно-опосредуемый, так и гуморальный ответы (антительный ответ). Однако, главным образом, считают, что инактивированные вирусы вызывают только гуморальные ответы. В данном случае инактивированный YF-WN вызывает высокий гуморальный ответ, как видно из серологических данных. Таким образом, неожиданным является то, что инактивированный YF-WN также хорошо вызывает гуморальный ответ, как и живой YF-WN. В дополнение к описанным выше преимуществам применения инактивированной вакцины вместо живой вакцины преимущества инактивированной вакцины по настоящему изобретению являются неожиданными.

Пример 2

Схема эксперимента

Животные: Лошади

Шесть (6) годовалых лошадей смешанной породы, как самцов, так и самок, являющихся серонегативными в отношении вируса лихорадки западного Нила (WNV) вакцинировали комбинированной вакциной, содержащей компоненты инактивированных вирусов вакцины PRESTIGE® V+VEE (доступной от Intervet Inc., Millsboro, DE) и инактивированную химеру вирусов желтой лихорадки - западного Нила (YF-WN). Вакцина также содержала в качестве адъюванта полиакриловую кислоту. Вакцина PRESTIGE® V+VEE содержит инактивированный вирус восточного энцефаломиелита, инактивированный вирус западного энцефаломиелита, инактивированный вирус венесуэльского энцефаломиелита, инактивированный вирус герпеса лошадей 1 и 4 типов (ринопневмония), инактивированный вирус гриппа (штамм Kentucky 1993, штамм Kentucky 2002, и New Market-2-93), и фракции столбнячного токсоида.

Живую аттенуированную химеру YF-WN получали от Acambis в Cambridge, MA. Химерный вирус инактивировали посредством BEI и добавляли к вакцине PRESTIGE® V+VEE, как описано выше примере 1.

Шесть других (6) годовалых лошадей смешанной породы, как самцов, так и самок, являющихся серонегативными в отношении вируса лихорадки западного Нила (WNV) не вакцинировали и использовали в качестве контролей.

Вакцинация

Лошадям вводили дозу вакцины 2 × 1 мл, внутримышечно, вводимую с интервалом 3-4 недели.

Вирус для контрольного заражения

Лошадей заражали, помещая 8-17 комаров, инфицированных WNV, на каждую лошадь, и позволяя комарам кормиться в течение 10-15 минут.

Результаты:

Пример 3

I. Обзор эксперимента

Целью этого эксперимента было подтверждение иммуногенности инактивированного химерного вируса западного Нила, комбинированного с вакциной, содержащей антигенные компоненты вакцины PRESTIGE® V+VEE (доступной от Intervet Inc, Millsboro, DE; т.е., инактивированный вирус восточного энцефаломиелита, инактивированный вирус западного энцефаломиелита, инактивированный вирус венесуэльского энцефаломиелита, инактивированный вирус герпеса лошадей 1 и 4 типов (ринопневмония), инактивированный вирус гриппа (штамм Kentucky 1993, штамм Kentucky 2002 и штамм New Market-2-93), и столбнячный токсоид), где все из них находились в сочетании с адъювантом, полиакриловой кислотой.

В частности, одной целью этого эксперимента было подтверждение отсутствия подавления другими вакцинными фракциями инактивированного химерного вируса западного Нила.

Двадцать (20) самцов и самок лошадей вакцинировали два раза внутримышечным (IM) способом с интервалом от трех до четырех недель 1,0-мл дозой комбинированной вакцины, содержащей инактивированный химерный вирус западного Нила, инактивированный вирус восточного энцефаломиелита, инактивированный вирус западного энцефаломиелита, инактивированный вирус венесуэльского энцефаломиелита, инактивированный вирус герпеса лошадей 1 и 4 типов (ринопневмония), инактивированный вирус гриппа (штамм Kentucky 93, штамм Kentucky 2002 и штамм New Market-2-93), и столбнячный токсоид, все из них были представлены в сочетании с адъювантом, полиакриловой кислотой. Десять дополнительных лошадей служили в качестве невакцинированных контролей. Через 21 сутки после 2 вакцинации вакцинированных и невакцинированных контрольных лошадей заражали вирулентным WNV интратекальным (IT) способом. Две отдельных группы из 10 вакцинированных и 5 контрольных лошадей последовательно вакцинировали и заражали. Образцы крови для серологической оценки собирали до вакцинации и после заражения и тестировали на титры нейтрализующих вирус (VN) антител к WNV. После заражения собирали образцы крови для выделения WNV. Забор нервной ткани для гистологического исследования проводили во время некропсии.

Заражение лошадей вирулентным WNV интратекльным способом приводило к появлению признаков неврологического заболевания, которые соответствовали признакам, наблюдаемым у лошадей, инфицированных в природных условиях. После заражения у вакцинированных лошадей было выявлено статистически значимое снижение клинических признаков неврологического заболевания, вызванного WNV, по сравнению с невакцинированными контролями, и статистически значимое снижение выделение вируса у вакцинированных животных по сравнению с контролями. Эти результаты подтверждают отсутствие подавления другими фракциями вакцины фракции убитой флавивирусной химеры. Дополнительные данные подтвердили отсутствие подавления фракцией убитой флавивирусной химеры других фракций вакцины.

II. Материалы и способы

A. Животные

Использовали тридцать (30) лошадей разных полов и смешанной породы в возрасте от шести до девяти месяцев. Лошадей идентифицировали посредством клейма, нанесенного с помощью холода. Использовали только лошадей с титрами нейтрализующих вирус (VN) антител к WNV, равными 5, как определяют с помощью теста нейтрализации по 50% снижению количества бляшек. Вакцинированных и контрольных лошадей в ходе периода вакцинации содержали вместе в защищенных от насекомых и грызунов условиях и для заражения вирулентным WNV перемещали в другие условия.

B. Вакцины

Вакцина содержала химеру YF/WN в сочетании с вирусом восточного энцефаломиелита (EE), вирусом западного энцефаломиелита (WE), вирусом венесуэльского энцефаломиелита (VE), вирусом герпеса лошадей 1 типа (EHV-I), вирусом герпеса лошадей 4 типа (EHV-4), вирусом гриппа лошадей (EIV) штамма Kentucky 1993/A2, EIV штамма Kentucky 2002/A2, и EIV штамма New Market/2/93/A2, и фракцией столбнячного токсоида. Вакцина содержала адъювант, полиакриловую кислоту.

Для того чтобы показать отсутствие подавления, использовали две вакцины. Одна вакцина содержала минимальную иммунизирующую дозу инактивированной химеры YF/WN и стандартную высвобождающуюся дозу остальных инактивированных вирусов или фракций столбнячного токсоида. Другая вакцина содержала стандартную высвобождающуюся дозу инактивированной химеры YF/WN и минимальную иммунизирующую дозу остальных инактивированных вирусов или фракций столбнячного токсоида. В каждом случае компонент(ы), представленный в стандартной высвобождающейся дозе, не подавлял другой компонент(ы), находящийся на уровне минимальной иммунизирующей дозы.

C. Вакцинация

К моменту первой вакцинации возраст лошадей составлял от 6 до 9 месяцев. Лошадей случайным образом разделяли на группы с использованием генератора случайных чисел и проводили их акклиматизацию в течение минимум семи суток. Двадцать лошадей внутримышечно вакцинировали в шею посредством двух 1-мл доз вакцин с интервалом три недели. В качестве невакцинированных контролей использовали десять лошадей. Две группы лошадей (каждая из 10 вакцинированных животных и 5 контролей) последовательно вакцинировали.

D. Применение слепого способа

Участвующему в исследовании персоналу, наблюдавшему клинические признаки и проводившему лабораторное тестирование клинических образцов, не было известно о том, к какой группе принадлежали лошади.

F. Наблюдение и сбор образцов после вакцинации

Ректальную температуру организма измеряли, и реакции в области инъекции исследовали на сутки с -1 по 10 после вакцинации. Температуру тела ≥l02,5^oF рассматривали как повышенную температуру. Реакции в области инъекции оценивали в соответствии со способом оценки. Отмечали любые системные реакции или выявление нарушения здоровья. Кровь для исследования сыворотки собирали на 0, 7 и 21 сутки после первой вакцинации и на 21 сутки после второй вакцинации. Титры нейтрализующих антител к WNV в образцах сыворотки лошадей определяли с использованием теста нейтрализации по 50% снижению количества бляшек.

G. Заражение лошадей вирулентным WNV

На 21 сутки после второй вакцинации лошадей заражали посредством интратекального введения 1-мл дозы, содержащей вирулентный WNV штамма NY99. Результаты пяти повторных титрований зараженного материала представляли собой 5,0, 5,1, 5,1, 5,0 и 5,0 со средним значением 5,0, и 5,1, 5,1, 5,0, 5,0 и 5,1 со средним значением 5,1 log₁₀ БОЕ/мл дозы, для зараженных групп 1 и 2, соответственно. Ректальные температуры организма записывали на сутки с -1 по 21 после заражения. Заражение невакцинированных контрольных лошадей посредством WNV интратекальным способом привело к появлению клинических признаков заболевания, которые наблюдают у лошадей, естественным образом инфицированных посредством WNV в природных условиях. Лошадей наблюдали в течение 21 суток после заражения на наличие клинических признаков неврологического заболевания следующих категорий: изменение поведения, парезы, фасцикуляции и атаксия/лежачее положение. Для каждой категории клинические признаки оценивали следующим образом: 0=нет, 1=очень мягкие и могут быть незамеченными, 2=умеренные и 3=тяжелые.

При подтверждении тяжелого клинического заболевания в течение 24 часов проводили умерщвление животного. Лошадей умерщвляли из гуманных соображений вследствие непрекращающихся признаков болезни западного Нила или внезапных острых признаков, сочетающихся с лежачим положением и/или неспособностью к передвижению без помощи, согласно уведомлению Центра по ветеринарным препаратам No. 04-09, датированному 1 апреля 2004 года. Отмечали выявление любых других нарушений здоровья. Забор образцов крови для серологических исследований проводили в момент заражения и на 7, 14 и 21 сутки после заражения. Образцы крови для выделения вируса забирали на сутки с -1 по 10 после заражения. Забор крови для серологических исследований, выделения вирусов и тканей на гистопатологию проводили в момент некропсии. Гистопатологические очаги повреждения нервной ткани оценивали следующим образом: 0=нет, 1=очень мягкие/мягкие, 2=умеренные и 3=тяжелые.

III. Результаты

A. Животные и вакцинация

Температура организма ≥102,5°F была отмечена в течение одних суток после первой вакцинации у трех вакцинированных лошадей и в течение двух суток у контрольных лошадей. После второй вакцинации не было отмечено температуры организма ≥102,5^oF ни у вакцинированных, ни у контрольных лошадей. Общее состояние здоровья всех лошадей к началу исследования было хорошим. Реакции области вакцинации оценивали в соответствии со способом оценки от (0 (нет реакции) до 5 (системная реакция)). После вакцинации у трех лошадей были отмечены мягкие реакции области инъекции с показателями 2 или менее. Другая вакцинированная лошадь обладала мягкой реакцией, державшейся до 10 суток после первой вакцинации, но не вызывающей какой-либо боли или не приводившей к нарушению движений. После второй вакцинации также наблюдали мягкие реакции области инъекции с показателями 2 или менее, которые длились в течение от 1 до 6 суток после вакцинации. Было отмечено, что ни одна реакция области инъекции после первой или второй вакцинации не являлась болезненной. После первой или второй вакцинации не наблюдали системных реакций ни у одной лошади.

B. Серология после вакцинации и после заражения посредством WNV

Обобщенные серологические данные для вакцинированных и контрольных лошадей представлены в следующих таблицах.

Вакцинированная группа: Титры нейтрализующих антител к WNV для снижения количества бляшек на 50% (PRNT50%) после 1 и 2 вакцинации и после заражения.
	Титры PRNT50% к WNV на указанные сутки после вакцинации и заражения а
	После вакцинации	После заражения
Лошадь No.	Сутки 0	Сутки 7	Сутки 21 b	Сутки 42 с	Сутки 7	Сутки 14	Сутки 21
201	Отриц.	Отриц.	Отриц.	Отриц.	≥1280	≥1280	≥1280
205	Отриц.	Отриц.	Отриц.	40	640	≥1280	≥1280
209	Отриц.	Отриц.	Отриц.	5	5	NS	NS
211	Отриц.	Отриц.	Отриц.	5	80	≥1280	≥1280
212	Отриц.	Отриц.	Отриц.	10	640	≥1280	≥1280
214	Отриц.	Отриц.	Отриц.	20	640	≥1280	≥1280
217	Отриц.	Отриц.	Отриц.	10	≥1280	≥1280	≥1280
218	Отриц.	Отриц.	Отриц.	20	≥1280	≥1280	≥1280
220	Отриц.	Отриц.	Отриц.	Отриц.	20	≥1280	≥1280
223	Отриц.	Отриц.	Отриц.	Отриц.	320	≥1280	≥1280
227	Отриц.	Отриц.	Отриц.	Отриц.	640	≥1280	≥1280
229	Отриц.	Отриц.	Отриц.	Отриц.	20	≥1280	≥1280
230	Отриц.	Отриц.	Отриц.	5	160	≥1280	≥1280
232	Отриц.	Отриц.	Отриц.	20	10	≥1280	≥1280
233	Отриц.	Отриц.	20	20	20	≥1280	≥1280
234	Отриц.	Отриц.	Отриц.	10	20	≥1280	≥1280
235	Отриц.	Отриц.	Отриц.	5	80	≥1280	≥1280
238	Отриц.	Отриц.	Отриц.	10	40	≥1280	≥1280
248	Отриц.	Отриц.	Отриц.	160	160	≥1280	≥1280
254	Отриц.	Отриц.	Отриц.	Отриц.	320	≥1280	≥1280
aПоказатели титров представляют собой кратность разведения, представляющего собой наибольшее разведение сыворотки, при котором наблюдают 50% снижение количества бляшек, по сравнению с контролем. b = Сутки 21 представляют собой сутки 2 вакцинации. c = Сутки 42 представляют собой 21 сутки после 2 вакцинации и сутки заражения Отриц. = Отрицательный, NS = нет образца, умерщвление

Контрольная группа: Титры нейтрализующих антител к WNV для снижения количества бляшек на 50% (PRNT50%) после 1 и 2 вакцинации и после заражения.
	Титры PRNT50% к WNV на указанные сутки после вакцинации и заражения а
	После вакцинации	После заражения
Лошадь No.	Сутки 0	Сутки 7	Сутки 21 b	Сутки 42 c	Сутки 7	Сутки 14	Сутки 21
202	Отриц.	Отриц.	Отриц.	Отриц.	≥1280	NS	NS
204	Отриц.	Отриц.	Отриц.	Отриц.	640	≥1280	≥1280
206	Отриц.	Отриц.	Отриц.	Отриц.	40	NS	NS
208	Отриц.	Отриц.	Отриц.	Отриц.	20	640	≥1280
216	Отриц.	Отриц.	Отриц.	Отриц.	20	≥1280	≥1280
219	Отриц.	Отриц.	Отриц.	Отриц.	≥1280	NS	NS
221	Отриц.	Отриц.	Отриц.	Отриц.	320	NS	NS
225	Отриц.	Отриц.	Отриц.	Отриц.	40	≥1280	≥1280
231	Отриц.	Отриц.	Отриц.	Отриц.	40	≥1280	≥1280
239	Отриц.	Отриц.	Отриц.	Отриц.	≥1280	≥1280	≥1280
aПоказатели титров представляют собой кратность разведения, представляющего собой наибольшее разведение сыворотки, при котором наблюдают 50% снижение количества бляшек, по сравнению с контролем. b = Сутки 21 представляют собой сутки 2 вакцинации. c = Сутки 42 представляют собой 21 сутки после 2 вакцинации и сутки заражения. Отриц. = Отрицательный, NS = нет образца, умерщвление.

Все вакцинированные и контрольные лошади были серонегативными в отношении WNV к моменту вакцинации и на 7 сутки после первой вакцинации. Отсутствие анамнестического ответа на WNV у вакцинированных животных после вакцинации указывало на отсутствие предшествующего воздействия WNV. Титры нейтрализующих антител к WNV, снижающих образование бляшек, были выявлены у одного вакцинированного животного после первой вакцинации и были выявлены у 14 из 20 вакцинированных животных на 21 сутки после второй вакцинации. Все невакцинированные контрольные лошади оставались серонегативными на протяжении периода первой и второй вакцинации. Эти результаты показывают, что контрольные лошади не подвергались воздействию WNV в ходе периода вакцинации, что подтверждает приемлемость исследования. Высокие уровни нейтрализующего вирус антитела к WNV были выявлены как у вакцинированных, так и у контрольных лошадей, после заражения.

C. Ректальная температура организма и неврологические признаки у лошадей после заражения вирулентным WNV

Определяли индивидуальную температуру организма лошадей после заражения. У шести из 20 вакцинированных лошадей была выявлена температура организма ≥102,5^oF в течение одних или двух отдельных суток после заражения, и у трех из этих шести вакцинированных животных была выявлена температура организма ≥102,5^oF в течение двух или более последовательных суток. У семи из 10 невакцинированных контрольных лошадей была выявлена температура организма ≥102,5^oF на какие-либо сутки после заражения, и у всех из этих контролей была выявлена температура организма ≥102,5^oF в течение двух или более последовательных суток. Температуру после заражения сравнивали посредством анализа повторных измерений вариантности с использованием модели, которая включала эффекты лечения, сутки и взаимосвязь эффектов лечения и суток. Существовали значимые различия (P<0,05) в температурах организма среди вакцинированных и контрольных лошадей на сутки с 8 по 10 после заражения. Четырех из 10 контролей умертвили до 10 суток после заражения вследствие тяжести клинических признаков заболевания.

Заражение невакцинированных контрольных лошадей посредством WNV интратекальным (IT) способом привело к клиническим признакам заболевания, которые соответствуют признакам, наблюдаемым у лошадей, естественным образом инфицированных посредством WNV в природных условиях. Также наблюдали клинические признаки, которые включали изменения поведения, парезы, фасцикуляции и атаксию/лежачее положение. После заражения у 7 из 10 (70%) невакцинированных контрольных животных были выявлены умеренные или тяжелые признаки неврологического заболевания WNV в течение двух или более последовательных суток или было показано тяжелое общее состояние здоровья вследствие инфекции WNV, так что было оправдано умерщвление из соображений гуманности. Лошадей умерщвляли из соображений гуманности вследствие непрекращающихся признаков заболевания западного Нила или внезапных острых признаков, сочетающихся с лежачим положением и/или неспособностью к движению без помощи.

Наличие случая инфекции WNV и первичный исход для манифестации заболевания, вызванного WNV, определяли в случае лошадей, имеющих в течение двух или нескольких последовательных суток умеренные или тяжелые признаки заболевания из любой категории из: изменения поведения, парезов, фасцикуляций и атаксии/лежачего положения или в любом случае животного, для которого было необходимо умерщвление вследствие тяжелого состояния общего здоровья животного в результате инфекции WNV. Для того чтобы первичный исход было определен как неблагоприятный, необходимо было удовлетворение этим критериям; в ином случае исход для лошади рассматривали как благоприятный.

Только у 5 из 20 (25%) вакцинированных лошадей были выявлены умеренные или тяжелые признаки неврологического заболевания WNV в течение двух последовательных суток после заражения или они были умерщвлены, по сравнению с 7 из 10 (70%) контролей. Анализ первичного исхода проводили в SAS способом FREQ. Анализ соотношения лошадей, отвечающих определению случая заболевания, показал, что существовало значимое различие (P<0,02) между вакцинированными животными и контролями. Соотношение шансов показало, что вакцинированные животные обладали вероятностью быть защищенными от неврологических признаков заболевания WNV, большей в 6 раз. При сравнении с контролями доля умерщвленных вследствие признаков заболевания WNV контролей была статистически более высокой (P<0,05).

D. Выделение вируса из сыворотки после заражения вирулентным WNV

Также исследовали результаты, касающиеся WNV, выделенного из сыворотки лошадей после заражения. WNV выделили из сыворотки 6 из 20 вакцинированных и 10 из 10 контрольных лошадей на сутки с 1 по 4 после заражения. Значительно (P<0,05) большее количество контролей обладало виремией по сравнению с вакцинированными животными, и контроли обладали виремией значительно (P<0,01) большее количество суток по сравнению с вакцинированными животными.

E. Гистопатология нервной ткани у вакцинированных и контрольных животных после заражения вирулентным WNV

Во время некропсии собирали нервную ткань из моста, продолговатого мозга и гипоталамуса/таламуса и анализировали на гистопатологию вследствие вирусного энцефалита. Как правило, у вакцинированных животных по сравнению с контролями наблюдали более низкую гистопатологию, но статистически значимых различий выявлено не было.

IV. Заключение

Заражение лошадей вирулентным WNV интратекальным способом приводило к признакам неврологического заболевания, которые соответствуют признакам, наблюдаемым у лошадей в естественных условиях, и соответствуют неврологическому заболеванию, наблюдавшемуся в исследованиях одновалентной вакцины против WNV. После заражения у вакцинированных лошадей было показано статистически значимое снижение клинических признаков неврологического заболевания, вызванного WNV, по сравнению с контролями, и статистически значимое снижение выделения вируса между вакцинированными животными и контролями. Эти результаты удовлетворяют критериям для убедительной демонстрации иммуногенности фракции убитой флавивирусной химеры против вируса лихорадки западного Нила, комбинированной с вакциной, содержащей компоненты вакцины PRESTIGE® V+VEE (доступной от Intervet Inc, Millsboro, DE; т.е. вирус восточного энцефаломиелита (EE), вирус западного энцефаломиелита (WE), вирус венесуэльского энцефаломиелита (VE), вирус герпеса лошадей 1 типа (EHV-1), вирус герпеса лошадей 4 типа (EHV-4), вирус гриппа лошадей (EIV) штамма Kentucky 1993/A2, EIV штамма Kentucky 2002/A2 и EIV штамма New Market/2/93/A2, и фракции столбнячного токсоида). Эти результаты подтверждают отсутствие подавления другими фракциями вакцин фракции убитой флавивирусной химеры.

Несмотря на то, что это изобретение описано применительно к его конкретным вариантам осуществления и примерам, следует понимать, что можно проводить дальнейшие модификации, и подразумевают, что прилагаемая формула изобретения охватывает любые варианты, применения или адаптации этого изобретения, соответствующие, главным образом, принципам этого изобретения и включающие такие отклонения от настоящего описания, как относящиеся к известной или общепринятой практике в области, к которой относится это изобретение, и применимые в отношении основных признаков, указанных выше, либо существующих в настоящее время, либо тех, которые появятся в будущем. Кроме того, несмотря на то, что варианты осуществления этого изобретения описаны с помощью конкретных размерных характеристик и/или показателей и/или компонентов, будет понятно, что варианты осуществления могут обладать другими размерными характеристиками и/или показателями и/или компонентами без отклонения от принципов этого изобретения и подразумевают, что прилагаемая формула изобретения охватывает такие отличия. Более того, все патенты, печатные публикации, и т.п., упомянутые в настоящем описании, включены в настоящее описание в виде ссылок.

1. Инактивированный химерный флавивирус, содержащий первый флавивирус, представляющий собой вирус желтой лихорадки, в котором нуклеотидные последовательности, кодирующие премембранный и оболочечный белки, заменены нуклеотидными последовательностями, кодирующими премембранный и оболочечный белки второго флавивируса, представляющего собой вирус лихорадки западного Нила.

2. Инактивированный химерный флавивирус по п.1, в котором вирус желтой лихорадки получен из штамма 17D.

3. Инактивированный химерный флавивирус по п.1, в котором химерный флавивирус содержит сигнальную последовательность на аминокислотном конце премембранного белка, и сигнальная последовательность представляет собой последовательность вируса желтой лихорадки.

4. Иммуногенная композиция для защиты животных семейства лошадиных от флавивирусной инфекции, содержащая эффективное количество инактивированного химерного флавивируса по п.1.

5. Инактивированный химерный флавивирус по п.1, в котором инактивированный химерный флавивирус представлен в концентрации в диапазоне между 10² и 10⁸ бляшкообразующих единиц (БОЕ).

6. Вакцина для защиты животных семейства лошадиных от флавивирусной инфекции, содержащая эффективное количество инактивированного химерного флавивируса по п.1.

7. Вакцина по п.6, в которой инактивированный химерный флавивирус находится в концентрации в диапазоне между 10 и 10 бляшкообразующих единиц (БОЕ).

8. Способ профилактики или лечения флавивирусной инфекции у животного, где способ включает введение животному инактивированного химерного флавивируса, содержащего первый флавивирус, представляющий собой вирус желтой лихорадки, в котором нуклеотидные последовательности, кодирующие премембранный и оболочечный белки, заменены нуклеотидными последовательностями, кодирующими премембранный и оболочечный белки второго флавивируса, представляющего собой вирус лихорадки западного Нила.

9. Способ по п.8, где вирус желтой лихорадки получен из штамма 17D.

10. Способ по п.8, где химерный флавивирус вводят в дозе в диапазоне между 10 и 10 бляшкообразующих единиц (БОЕ).

11. Способ по п.10, где химерный флавивирус вводят в дозе в диапазоне между 10⁶ и 10⁷ БОЕ.

12. Способ по п.8, где инактивированный химерный флавивирус вводят подкожным, внутримышечным способом, способом введения под слизистую оболочку, способом введения на слизистую оболочку или интрадермальным способом.

13. Вакцина по п.6, дополнительно содержащая один или более из инактивированного вируса восточного энцефаломиелита, инактивированного вируса западного энцефаломиелита, инактивированного вируса венесуэльского энцефаломиелита, инактивированного вируса герпеса лошадей 1 типа, инактивированного вируса герпеса лошадей 4 типа, инактивированного вируса гриппа лошадей штамма KY93/A2, инактивированного вируса гриппа лошадей штамма KY02/A2, инактивированного вируса гриппа лошадей штамма NM/2/93/A2 и фракции столбнячного токсоида.

14. Способ по п.8, где инактивированный химерный флавивирус представлен в вакцине, которая также включает один или более из инактивированного вируса восточного энцефаломиелита, инактивированного вируса западного энцефаломиелита, инактивированного вируса венесуэльского энцефаломиелита, инактивированного вируса герпеса лошадей 1 типа, инактивированного вируса герпеса лошадей 4 типа, инактивированного вируса гриппа лошадей штамма KY93/A2, инактивированного вируса гриппа лошадей штамма KY02/A2,
инактивированного вируса гриппа лошадей штамма NM/2/93/A2 и фракции столбнячного токсоида.