Средство, обладающее антиоксидантными, гепатопротекторными и противовоспалительными свойствами

Изобретение относится к производным урсоловой кислоты формулы I:

Соединения обладают выраженной антиоксидантной активностью, а также гепатопротекторными и противовоспалительными свойствами и могут использоваться в медицине в качестве лекарственных средств. Способ получения соединений основан на превращениях урсоловой кислоты, получаемой из отходов от производства соков. 4 табл.

 

Изобретение относится к лекарственным средствам с антиоксидантной, гепатопротекторной и противовоспалительной активностью, конкретно к производным урсоловой кислоты формулы I:

2-((1S,2R,4aS,6aS,6bR,10S,12aR,12bR,14bS)-10-гидрокси-1,2,6a,6b,9,9,12а-гептаметил-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14b-эйкозагидропицен-4а-карбонилокси) уксусной кислоте (или карбоксиметиловому эфиру 3-окси-урсан-12-ен-28-овой кислоты) формулы Iа, 1S,2R,4аS,6аS,6bR,10S,12аR,12bR,14bS)-10-ацетокси-1,2,6а,6b,9,9,12а-гептаметил-1,2,3,4,4а,5,6,6а,6b,7,8,8а,9,10,11,12,12а,12b,13,14b-эйкозагидропицен-4а-карбоновой кислоте (или ацетату урсоловой кислоты) формулы Ib и 2-((1S,2R,4aS,6aS,6bR,10S,12aR,12bR,14bS)-10-гидрокси-1,2,6a,6b,9,9,12а-гептаметил-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14b-эйкозагидропицен-4а-карбоксамидо)уксусной кислоте (N-[3-гидрокси-28-оксоурсан-12-ен-28-ил]-глицину) формулы Ic, которые могут использоваться в медицине в качестве лекарственных средств, обладающих комплексной антиоксидантной, гепатопротекторной и противовоспалительной активностью.

Препараты на основе растительных соединений благодаря своему комплексному лечебному эффекту и низкой токсичности являются одними из наиболее востребованных на рынке лекарственных средств [М.Д.Машковский. Лекарственные средства (в двух томах). М.: Новая волна, 1996, Т.1, с.603; Лекарственные препараты, разрешенные к применению в СССР. Под ред. М.А.Клюева, Э.А.Бабаяна. М.: Медицина, 1979, с.61-65.]

Известно, что производные урсоловой кислоты проявляют высокую биологическую активность. Например, у бензилурсолата была обнаружена фотопротекторная активность, которая проявлялась в виде действия, препятствующего старению кожи [Патент US 6338854, Matsumoto K., Tsuruoka H., Fujiwara N., Nishimori Y., Kenjo Y. Photoaging skin-care preparation and method of treating wrinkled skin. 15.01.2002].

Важным преимуществом урсоловой кислоты можно считать доступную ресурсную базу. Урсоловую кислоту высокой чистоты можно легко получать из отходов производства соков - шротов клюквы [Патент РФ 181636, Шевцов С.А., Ралдугин В.А., Щукин Г.И. Способ получения урсоловой кислоты. Опубл. 27.09.1995] и черноплодной рябины [Патент РФ №2329048, Л.П.Козлова, Е.В.Малыхин, С.М.Обут, С.А.Попов, О.П.Шеремет. Способ получения урсоловой кислоты. Опубл. 20.07.2008.]. В ряде растительных источников встречается ацетат урсоловой кислоты, в частности, ацетаты тритерпеновых кислот содержатся в экстрактах, получаемых из отходов пищевой промышленности, однако выделение их в чистом виде является затруднительным [Л.П.Козлова, Т.П.Кукина, С.М.Обут, Л.Г.Овсянникова, Л.М.Покровский, С.А.Попов, О.И.Сальникова, О.П.Шеремет. Отходы пилотной наработки урсоловой кислоты из ягодных шротов как источник БАВ. Материалы III Всероссийской научной конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья», г.Барнаул, 23-27 апреля 2007 г., Т.2, с.314-317]. Таким образом, урсоловая кислота может являться перспективным базовым соединением для получения производных с комплексной фармакологической активностью.

Задачей настоящего изобретения является поиск лекарственных средств с комплексной антиоксидантной, гепатопротекторной и противовоспалительной активностью.

Задача решается использованием соединений общей формулы I:

в качестве лекарственных средств с антиоксидантной, гепатопротекторной и противовоспалительной активностью.

Аналогом заявляемого средства по фармакологическим свойствам является дигидрокверцетин [(2R,3R)-3,5,7,3',4'-пентагидроксифлаванон] формулы (II).

Прототипом и ближайшим структурным аналогом заявляемого средства является пентациклический тритерпеноид - урсоловая кислота III.

Соединением сравнения по противовоспалительным свойствам является нестероидный противовоспалительный препарат индометацин (субстанция "Fluka" BioChemika).

По литературным данным ацетат урсоловой кислоты оказывал синергический эффект на специфическое ингибирование куркуминоидами индуцибельной циклооксигеназы-2 в культуре мышиных клеток RAW 264.7 [US 2002/0068098, WO 03/007975 A1 (Ashini Naturaceuticals, Inc), "Curcuminoid Compositions Exhibiting Synergistic Inhibition of the Expression and/or Activity of Cyclooxigenase-2"]. Антиоксидантная, гепатопротекторная и противовоспалительная активность индивидуального соединения 1b ранее не исследовалась.

Известен N-[3-гидрокси-28-оксиурсан-12-ен-28-ил]-глицин, обладающий цитотоксической активностью [Bioorg. & Med. Chem. - 2009. V.17. N 2. P.848-854. Противовоспалительная, антиоксидантная, гепатопротекторная активность для соединения 1с не была известна.

Соединение Iа получают алкилированием урсоловой кислоты III этилхлорацетатом в диметилформамиде в присутствии карбоната калия, при этом получают этиловый эфир IV, который отделяют фильтрацией после выливания реакционной смеси в воду. Этиловый эфир IV без высушивания обрабатывают раствором спиртового раствора КОН при кипячении, при этом происходит селективный гидролиз карбоксиэтильного фрагмента, после чего подкисляют и выделяют кислоту Iа.

Соединение Ib и Iс получают способами, приведенными в работе [Bioorg. & Med. Chem. - 2009. V.17. N 2. Р.848-854].

Биологическая активность заявленного средства изучалась путем определения антиоксидантных, гепатопротекторных и противовоспалительных свойств на беспородных мышах. В качестве препаратов сравнения использовали антиоксидант дигидрокверцетин (II) (99,9% чистоты) и нестероидный противовоспалительный препарат индометацин (субстанция «Fluka» BioChemika). Структурным аналогом заявляемого средства являлась урсоловая кислота.

Для исследования антиоксидантного и гепатопротекторного эффектов была использована стандартная экспериментальная модель токсического ССl₄ гепатита у мышей. Модель воспроизводилась согласно методическим рекомендациям [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М.: ОАО «Медицина», 2005, 240 с.] Токсический гепатит моделировали путем внутрижелудочного введения мышам 25% раствора ССl₄ в растительном масле. Заявленное средство формулы I вводили в желудок в дозе 20 мг/кг в виде водно-твиновой взвеси за 1 час до гепатотоксина. Референсное соединение - дигидрокверцетин (ДКВ) - вводили аналогичным образом в дозе 50 мг/кг. Гепатопротекторный эффект определяли по снижению в сыворотке крови маркеров цитолиза - аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (ACT), антиоксидантные свойства оценивали по уменьшению концентрации продуктов перекисного окисления (ТБКРС), определяемых по реакции с тиобарбитуровой кислотой [Камышников B.C. Справочник по клинико-химической лабораторной диагностике. Минск: Беларусь, 2000, Т.2, с.207.] Пробы сыворотки крови отбирали через сутки после введения агентов. Анализ биохимических показателей проводили с использованием стандартных наборов реактивов («Ольвекс диагностикум», Германия) на биохимическом анализаторе (Фотометр 5010, Германия).

Установлено, что средство формулы I при внутрижелудочном введении в дозе 20 мг/кг обладает высокой гепатопротекторной активностью, снижая не менее чем в 2 раза выраженность цитолитических процессов по сравнению с контролем. По величине эффекта заявленное средство не уступает урсоловой кислоте и дигидрокверцетину (табл.1).

Показано, что средство формулы I оказывает выраженное антиоксидантное действие, снижая концентрацию ТБКРС в крови соответственно в 1.6, 2.0 и 1.5 раза, тогда как эталонный препарат дигидрокверцетин и урсоловая кислота уменьшают уровень показателя не более чем в 1,3 раза (табл.2).

Противовоспалительную активность заявляемого средства исследовали на стандартной модели воспаления, вызванного гистамином [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М.: ОАО «Медицина», 2005, 240 с.]. Средство формулы I и его структурный прототип вводили внутрижелудочно в дозе 20 мг/кг за 1 час до субплантарного введения флогогена. Препарат сравнения индометацин вводили тем же способом в эффективной дозе 20 мг/кг. Противовоспалительный эффект оценивали по уменьшению, по сравнению с контролем, индекса отека, который рассчитывали в процентах как отношение разности здоровой и воспаленной лапы к массе здоровой. Выявлено, что на фоне воспаления, индуцированного гистамином, заявляемое средство проявляет достоверный противовоспалительный эффект, при этом производные Iа и Iс проявляют активность, близкую к эталонному препарату индометацину, тогда как соединения Ib - к урсоловой кислоте (таблицы 3, 4).

Таким образом, заявляемое средство обладает следующими преимуществами:

- более высоким антиоксидантным эффектом по сравнению с урсоловой кислотой и дигидрокверцетином;

- наличием гепатопротекторной активности, не уступающей по величине активности урсоловой кислоты и дигидрокверцетина;

- значимым противовоспалительным действием;

- использованием в синтезе средства доступной урсоловой кислоты, получаемой из отходов пищевой промышленности, или бензилурсолата, получаемого из экстрактов шротов брусники.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами

Пример 1. Получение карбоксиметилового эфира 3-окси-урсан-12-ен-28-овой кислоты (Iа)

К суспензии урсоловой кислоты (0.92 г, 2 ммоль) в ДМФА (10 мл) добавляют измельченный K₂СО₃, (0.45 г, 3.3 ммоль) и этил 2-хлорацетат (0.25 г, 2 ммоль). Смесь перемешивают при комнатной температуре 4 час. Реакционную смесь выливают в воду 30 мл и отфильтровывают.

Сырой осадок без высушивания помещают в раствор КОН (0.4 г, 7.2 ммоль) в этаноле (10 мл). Смесь кипятят в течение 1 часа и отгоняют растворитель досуха, осадок промывают последовательно 5% соляной кислотой (20 мл), водой (3×20 мл) и сушат. Получают 0,97 г (94%) искомого соединения в виде белого порошка. Т пл. 175-178°С (разл,) α²⁵+52 (c 1.0, МеОН).

Спектр ЯМР Н¹ (Py-d₅, 300 MHz, δ м.д.): 4.95 (АВ, Δν_AB=29.4 Гц, J_AB=15.6 (2H)); 3.39 дд (J 9.3, 6.8); 5.36 дд (J 3.5, 3.5); 2.47 д (J 11.3); 1.99 уш. с; 1.13 с; 0.88 с; 0.97 с; 0.87 с; 1.18 с; 0.89 д (J 6.4); 0.87 м.

Спектр ЯМР С¹³ (Py-d₅, 75 MHz, δ_C м.д.): 174.78, 168.87, 136.47, 123.90, 76.00, 59.26, 53.67, 51.14, 46.24, 45.86, 40.25, 37.82, 37.22, 37.19, 37.02, 36.99, 35.12, 34.87, 31.33, 28.77, 26.67, 26.31, 25.92, 22.54, 21.68, 21.49, 19.16, 16.63, 15.24, 15.20, 14.44, 13.60. 15.70 к; 16.54 к; 17.30 к; 17.34 к; 18.72 т; 21.25 к; 23.59 т; 23.77 к; 24.64 т; 28.02 т; 28.40 т; 28.77 к; 30.86 т; 33.43 т; 36.96 т; 37.21 с; 39.08 т; 39.12 д; 39.29 д; 39.32 с; 39.92 с; 42.34 с; 47.96 д; 48.33 с; 53.24 д; 55.76 д; 61.35 т; 78.09 д; 126.00 д; 138.56 с; 170.97 с; 176.87 с.

Получение ацетата урсоловой кислоты 1b и N-[3-гидрокси-28-оксоурсан-12-ен-28-ил]-глицина (I с) описано в работе [Bioorg. & Med. Chem. - 2009. V.17. N 2. P.848-854].

Пример 2. Исследование гепатопротекторных свойств на модели острого токсического гепатита

Острый токсический гепатит вызывают у беспородных самцов мышей массой 20-25 г путем однократного внутрижелудочного введения 25% раствора ССl₄ в подсолнечном масле из расчета по 0,1 мл на 10 г массы тела [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М.: ОАО «Медицина»., 2005, 240 с.]. Средство формулы I и урсоловую кислоту вводят за 1 час до воспроизведения гепатита внутрижелудочно в виде взвеси в дистиллированной воде с добавлением эмульгатора Tween-80 в дозе 20 мг/кг (в объеме 0,2 мл на 10 г массы животного). Дигидрокверцетин вводят тем же способом в эффективной дозе 50 мг/кг. Контрольным животным вводят водно-твиновую взвесь в эквивалентном объеме.

Каждая группа содержит по 9-10 особей.

Через сутки животных забивают декапитацией под легким эфирным наркозом и определяют в сыворотке крови мышей активность АЛТ, ACT с помощью стандартных наборов реактивов («Ольвекс диагностикум»).

Результаты обрабатывают статистически с помощью пакета программ «STATISTIKA 6».

Установлено, что средство формулы I в условиях токсического гепатита оказывает достоверный антицитолитический эффект, снижая активность АЛТ и ACT в крови в 2,0-2,2 раза по сравнению с контролем. У агентов Iа и Ib наблюдается практически одинаковое понижение уровня обоих трансаминаз, тогда как производное Iс аналогично урсоловой кислоте и дигидрокверцетину в большей степени снижает активность АЛТ, чем ACT (соответственно в 2,8 и 1,6 раз). Однако выявленные различия между опытными и референсными не являются статистически значимыми (табл.1).

Таким образом, установлено, что средство формулы I обладает значимым гепатопротекторным действием, которое не уступает аналогичному эффекту урсоловой кислоты и дигидрокверцетина.

Пример 3. Исследование антиоксидантных свойств на модели острого токсического гепатита

Определение антиоксидантного эффекта средства формулы I проводят на модели токсического ССl₄ гепатита, описанной выше. Влияние агентов на выраженность процессов перекисного окисления липидов оценивают по уровню ТБК-реактивных соединений (ТБАРС) в сыворотке крови, которые являются вторичными продуктами перекисного окисления. Заявленное средство и агенты сравнения вводят за 1 час до воспроизведения гепатита внутрижелудочно в виде взвеси в дистиллированной воде с добавлением эмульгатора Tween-80 в дозе 20 мг/кг (в объеме 0,2 мл на 10 г массы животного). Введенные дозы составляют для урсоловой кислоты и заявляемого средства формулы I - 20 мг/кг; для дигидрокверцетина - 50 мг/кг. Контрольным животным вводят водно-твиновую взвесь в эквивалентном объеме. Каждая группа содержит по 9-10 особей. Через сутки животных забивают декапитацией под легким эфирным наркозом и определяют концентрацию ТБАРС в сыворотке крови мышей общепринятым методом [Камышников B.C. Справочник по клинико-химической лабораторной диагностике. Минск: Беларусь, 2000, Т.2, с.207.] Результаты обрабатывают статистически с помощью пакета программ «STATISTIKA 6». Различия считают достоверными с вероятностью р<0,05.

Установлено, что заявляемое средство формулы I оказывает достоверное антиоксидантное действие, снижая соответственно для Ia, Ib и Iс в 1,6, 2,0 и 1,5 раза концентрацию ТБКРС в крови, тогда как эталонный препарат дигидрокверцетин и урсоловая кислота уменьшают уровень показателя не более чем в 1,3 раза (табл.2).

Таблица 2
Влияние средства формулы I на уровень ТБК-реактивных соединений (мкмоль/л) в сыворотке крови
Группа	контроль	Iа	Ib	Iс	УК	ДКВ
ТБКРС	4,9±0,5	3,1±0,3**	2,5±0,3**	3,2±0,1*	3,8±0,3	3,7±0,3*
*Р<0,05; **Р<0,01 - различия с контролем достоверны
Р<0,05 различия с ДКВ достоверны
К - контроль, УК - урсоловая кислота, ДКВ - дигидрокверцетин, ТБКРС - ТБК-реактивные соединения.

Таким образом, заявляемое средство обладает выраженным антиоксидантным действием, при этом Iа и Iс превосходят соответствующий эффект дигидрокверцетина в 1,2 раза, а Ib - в 1,5 раза.

Пример 4. Исследование противовоспалительных свойств на модели гистаминового воспаления

Эксперименты проводят на беспородных мышах самцах массой 20-25 г. Животных делят на группы по 8 особей. Средство формулы I вводят внутрижелудочно в виде взвеси в дистиллированной воде с добавлением эмульгатора Tween-80 в дозе 20 мг/кг (в объеме 0,2 мл на 10 г массы животного). Отдельным группам мышей аналогично вводят структурный аналог урсоловую кислоту в дозе 20 мг/кг, а также эталонный противовоспалительный препарат индометацин в эффективной дозе 20 мг/кг. Контрольные животные получают эквивалентное количество водно-твиновой эмульсии. Через 1 час после введения агентов всем мышам субпланарно в заднюю лапу вводят 0,5% водный раствор гистамина по 0,05 мл/мышь. Через 5 часов после введения флогогена мышей умерщвляют путем цервикальной дислокации позвоночника, отсекают обе задние лапы, определяют массу каждой. Противовоспалительный эффект оценивают по величине индекса воспаления, который определяют как отношение разности масс воспаленной и интактной лап к массе интактной, выраженное в процентах. Результаты обрабатывают статистически с помощью пакета программ «STATISTIKA 6». Различия считают достоверными с вероятностью р<0,05.

Показано, что средство формулы Iа снижает выраженность отека лапы мышей в 1,9, а средство формулы Ib - в 1,5 раза. Урсоловая кислота и индометацин уменьшают отек в 1,8 и в 2,1 раза соответственно (табл.3). Таким образом, средство формулы Iа не уступает по противовоспалительной активности своему структурному аналогу и незначительно (в 1,1 раза) отличается от эталонного препарата индометацина. Средство формулы Ib по противовоспалительной активности незначительно (в 1,1 раза) отличается от урсоловой кислоты и в 1,4 раза уступает индометацину.

Таблица 3
Влияние агентов Iа и Ib на величину индекса гистаминового отека лапы
Группа	контроль	Iа	Ib	УК	Индометацин
Индекс отека, %	29,57±3,11	15,21±1,65**	19,3±2,56	16,82±3,00*	13,83±1,55**
*р<0,05; **р<0,01 - различия с контролем достоверны; р<0,05 различия с индометацином достоверны.

Средство формулы Iс снижает выраженность отека лапы мышей в 1,9 раза, тогда как урсоловая кислота уменьшает отек в 1,8 раза, а индометацин - в 1,7 раза (табл.4). Таким образом, в условиях данного эксперимента средство формулы Iс оказывает противовоспалительное действие, не уступающее по выраженности эталонному препарату индометацину и своему структурному аналогу.

Таблица 4
Влияние агента Iс на величину индекса гистаминового отека лапы
Группа	контроль	(I)	УК	Индометацин
Индекс отека, %	21,26±2,63	11,39±1,38**	12,09±2,16*	12,50±1,83*
*р<0,05; **р<0,01 - различия с контролем достоверны; р<0,05 различия с индометацином достоверны.

Производные урсоловой кислоты формулы I:

в качестве лекарственного средства с антиоксидантной, гепатопротекторной и противовоспалительной активностью.