Фермент ациламидаза, фрагмент днк, кодирующий ее, и биокаталитический способ синтеза n-замещенных акриламидов с использованием ациламидазы
Владельцы патента RU 2439154:
Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") (RU)
Изобретение относится к области биохимии. Представлен фермент ациламидаза АА37 из Rhodococcus erythropolis 37 ВКПМ Ac-1793, с последовательностью, приведенной в описании. Определена нуклеотидная последовательность, кодирующая этот фермент. Описан способ синтеза в водной среде N-замещенных акриламидов из акриламида и аминов в присутствии биокатализатора ациламидазы в изолированном состоянии или в составе клеток E.coli. Изобретение позволяет получить N-замещенные алифатические акриламиды из акриламида и первичных алифатических аминов в водной среде. 3 н.п. ф-лы.
Заявляемая группа изобретений относится к биотехнологии и касается фермента с ацилирующей активностью и способа синтеза N-замещенных акриламидов, в частности N-изопропилакриламида или N-диметиламинопропилакриламида, с использованием этого фермента как в изолированном состоянии, так и в составе клеток Е.coli.
N-замещенные алифатические акриламиды являются мономерами, широко используемыми для производства водорастворимых полимеров, которые применяют для создания флокулянтов, адсорбентов, и структурообразователей, находящих применение в промышленности и сельском хозяйстве (Полиакриламид. - М., 1992).
Промышленное производство N-замещенных акриламидов основано на химических способах синтеза, наиболее распространенным из которых является ацилирование алифатических аминов хлорангидридами акриловой и метакриловой кислот (Mac Williams D.S. Functional monomers. Their preparation, polymerization, and application. New York: M.Decker, 1973). Недостатком этого способа является использование крайне ядовитых хлорангидридов, а также токсичных органических растворителей.
Альтернативным подходом к синтезу N-замещенных акриламидов является биокаталитический синтез. Известен способ биокаталитического синтеза N-замещенных акриламидов в водной среде при невысокой температуре в присутствии селективного биокатализатора - клеток штамма Rhodococcus erythropolis 37 ВКПМ Ac-1793, обладающих ацилирующей активностью (RU 2399672). Рассмотрим его в качестве ближайшего аналога заявляемого способа.
Недостатком способа - ближайшего аналога является необходимость использования для выращивания штамма-биокатализатора дорогостоящего компонента среды ацетанилида, снижающего конкурентоспособность процесса.
Отсутствие сведений о ферменте, катализирующем синтез N-замещенных акриламидов, и о гене, кодирующем этот фермент, не позволяет использовать методы генетической инженерии для конструирования более совершенных биокатализаторов этого процесса.
Задачей заявляемой группы изобретений является расширение арсенала биокаталитических способов синтеза в водной среде N-замещенных акриламидов.
Задача решена путем:
- выделения нового фермента, обладающего ацилирующей активностью - ациламидазы АА37 из штамма Rhodococcus erythropolis 37 ВКПМ Ac-1793 (RU 2399672);
- клонирования фрагмента ДНК DAA37, кодирующего заявляемый фермент, и определения его нуклеотидной последовательности;
- разработки способа синтеза в водной среде N-замещенных акриламидов с использованием фермента ациламидазы АА37 в изолированном состоянии или в составе клеток Е.coli, содержащих фрагмент ДНК DAA37.
Заявляемый фермент ациламидаза АА37 обладает ацилирующей активностью с уникальной субстратной специфичностью и способен ацилировать амины в водной среде. Благодаря таким каталитическим особенностям обнаруженной ациламидазы при смешивании водных растворов акриламида и аминов в присутствии фермента ациламидазы АА37 (аминокислотная последовательность SEQ ID NO 2) происходит синтез N-замещенных акриламидов, в частности N-изопропилакриламида или N-диметиламинопропилакриламида.
Фрагмент ДНК DAA37 из Rhodococcus erythropolis 37 ВКПМ Ac-1793, кодирующий заявляемый фермент, обладает уникальной нуклеотидной последовательностью. Этот фрагмент после введения его в штаммы бактерий Е.coli в составе рекомбинантной плазмиды определяет синтез заявляемой ациламидазы клетками Е.coli. Штаммы бактерий Е.coli, в которые введена плазмида с фрагментом ДНК DAA37 из Rhodococcus erythropolis 37 ВКПМ Ac-1793, приобретают ацилирующую активность и способность синтезировать N-замещенные алифатические акриламиды.
Способ синтеза N-замещенных алифатических акриламидов в общем виде осуществляют следующим образом.
Получение биокатализатора
Клетки Е.coli, содержащие ациламидазу АА37, получают следующим образом.
Посевной материал, представляющий собой культуру бактерий Е.coli, несущих фрагмент ДНК, кодирующий ациламидазу АА37, выращивают в жидкой среде Лурия Бертани (состав в мас.%: триптон 0,5, дрожжевой экстракт 0,25, NaCl 0,5, вода - остальное) с ампициллином 100 мкг/мл при 30-37°С до достижения оптической плотности 0,5-1 единиц при 600 нм. Затем переносят культуру на 16-25°С и добавляют лактозу до концентрации 0,1-1 мас.%. После инкубации в течение 7-24 часов клетки осаждают, промывают и используют в качестве биокатализатора.
Клетки Е.coli, содержащие заявляемую ациламидазу, хранят и используют в виде водной суспензии, полученной путем отделения клеток от культуральной жидкости центрифугированием при 5-16 тыс. об/мин и последующим суспендированием в 10 мМ фосфатном буфере рН 7,0-8,0 до концентрации 20-40 г сухого веса/л.
Фермент ациламидазу АА37 используют и хранят в виде раствора электрофоретически чистого белка, получаемого после хроматографического выделения из клеток Rhodococcus erythropolis или Е.coli.
Синтез N-замещенных алифатических акриламидов
Получение водного раствора N-замещенных алифатических акриламидов, в частности N-изопропилакриламида или N-диметиламинопропилакриламида, осуществляют смешиванием водных растворов акриламида и алифатических первичных аминов, в частности изопропиламина и диметиламинопропиламина, в концентрациях 1-10% с раствором ациламидазы АА37 или с суспензией клеток Е.coli, экспрессирующих ациламидазу АА37, и последующей инкубацией при температуре 20-40°С и значении рН 9,5-11 в течение 1-48 часов. Ациламидазу используют в концентрациях 0,1-1 г белка/л, а клетки Е.coli - в концентрациях 2-16 г сухого веса/л.
Содержание конечного продукта - N-замещенного алифатического акриламида - определяют с помощью газовой хроматографии.
Изобретение поясняется следующими примерами.
Пример 1. Получение клеток Rhodococcus erythropolis 37 ВКПМ Ac-1793 и определение их ацилирующей активности
В колбу Эрленмейера (объемом 750 мл), содержащую 100 мл синтетической питательной среды М3 (состав в мас.%: Na2HPO4×12H2O - 0,7; KH2PO4 - 0,3; натрий лимоннокислый - 0,05; MgSO4×7H2O - 0,01; FeSO4×7H2O - 0,0004, ацетанилид - 0,2, NH4NO3 - 0,2, вода - остальное, среда имеет рН 7-7,2), добавляют 1 мл культуры (109 кл/мл) штамма Rhodococcus erythropolis 37 ВКПМ Ac-1793, предварительно выращенного на среде Лурия Бертани в течение 16 ч при 30°C с перемешиванием (300 об/мин). Затем колбу инкубируют с перемешиванием (200 об/мин) при 30°С в течение 36 часов. Биомассу отделяют центрифугированием при 5 тыс. об/мин, ресуспендируют в 10 мМ фосфатном буфере рН 7,0 до концентрации 20 г/л и хранят при +4°С. Полученные таким образом клетки в количестве 20 мг сухого веса обладают ацилирующей активностью 4,4 единицы/г сухого веса клеток.
Ацилирующую активность определяют по скорости синтеза N-изопропилакриламида по следующей методике.
Смешивают 300 мкл 10% водного раствора акриламида, 250 мкл 10% водного раствора изопропиламина (рН 10), 450 мкл суспензии клеток, содержащей 2,4 мг клеток. Инкубируют при 37°С 2 часа, отделяют клетки центрифугированием в течение 1 минуты при 10 тыс. об/мин и определяют содержание N-изопропилакриламида методом газовой хроматографии. Анализ реакционной смеси осуществляют на газовом хроматографе LXM-80 (Россия) с пламенно-ионизационным детектором. Продукты реакции разделяют с помощью кварцевой колонки длиной 32 м, набитой сорбентом FFAP, при постоянной температуре 180°С. В качестве газа-носителя используют гелий.
За единицу активности принимают количество фермента, необходимое для синтеза 1 мМ N-изопропилакриламида за 1 час.
Пример 2. Выделение заявляемого фермента ациламидазы АА37
Клетки штамма ВКПМ Ас-1793, полученные как в примере 1, но в количестве 200 мг сухого веса, ресуспендируют в 40 мл 10 мМ буфера Трис-HCl рН 7,5, подвергают ультразвуковому разрушению и надосадочную жидкость наносят на колонку с анионообменным сорбентом MonoQ Hitrap, уравновешенную 10 мМ Трис-HCl буфером, рН 7,5. Хроматографию ведут на хроматографе для высокоскоростной хроматографии белков («Pharmacia», Швеция) в 10 мМ буфере Трис-HCl рН 7,5 с градиентом концентрации NaCl (от 0 до 0,5 М) при скорости потока 0,4 мл/мин. Фракции, обладающие активностью гидролиза 4`-нитроацетанилида, собирают и анализируют методом электрофореза в полиакриламидном геле (ЭФ в ПААГ) по Лэммли (Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. (1970) Nature, 227, 680-685). Фракции, показавшие гомогенность на ЭФ и обладающие ацилирующей активностью, объединяют. Полученный раствор фермента ациламидазы с концентрацией 2,5 мг белка/мл, имеющей молекулярную массу субъединицы 55 кДа, замораживают и хранят при -20°С. Ацилирующая активность выделенного фермента, определенная как в примере 1, составляет 3 ед/мг белка.
Пример 3. Определение N-концевой последовательности заявляемой ациламидазы
Раствор белка (500 мкл), полученный, как в примере 2, хроматографически разделяют на колонке Aqapore RP300 (С8) 4.6×100 мм в градиенте ацетонитрила 15-60% 60 минут, 60-90% 10 минут, 1 мл/мин, AU214×0.2 (А - 0.1% ТФУ, В - 80% CH3CN в 0.1% ТФУ). Материал, выходящий в доминантном пике, используют для определения N-концевой последовательности по методу Эдмана на автоматическом секвенаторе Prosize. Ациламидаза АА37 имеет следующую N-концевую последовательность аминокислот: TEQNLHWLSATE.
Пример 4. Определение N-концевых последовательностей внутренних пептидов заявляемой ациламидазы
Раствор белка, полученный как в примере 2, разделяют электрофоретически методом ЭФ в ПААГ в присутствии 1% додецилсульфата натрия и целевой белок весом 55 кДа выделяют из геля и подвергают трипсинолизу. Хроматографическое разделение продуктов гидролиза проводят на колонке Aqapore RP300 (С8) 4.6×100 мм в градиенте ацетонитрила 0-50% 60 минут, 50-70% 30 минут, 1 мл/мин, AU214×0.2 (А - 0.1% ТФУ, В - 80% CH3CN в 0.1% ТФУ).
Хорошо отделившиеся пептиды подвергают определению N-концевой последовательности по Эдману на секвенаторе Prosize, в результате чего получают следующие последовательности аминокислот:
1. TAANFEAVRPWA
2. TNTPESGYYGGT
Пример 5. Получение хромосомной ДНК для клонирования ациламидазы АА37
Культуру штамма ВКПМ Ас-1793 инкубируют со встряхиванием 250 об/мин и 30°С в течение 24 часов в 15 мл жидкой питательной среды Лурия-Бертани. Полученную биомассу осаждают центрифугированием при 4 тыс. об/мин 10 мин и ресуспендируют в 10 мл 0,01М Tris HCl с рН 8,0. Затем выделяют хромосомную ДНК по методике, описанной в [Манниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М. Мир, 1984]. Для этого обрабатывают биомассу лизоцимом, подвергают ее щелочному лизису и экстрагируют полученную смесь последовательно фенолом, хлороформом и эфиром. ДНК, содержащуюся в полученном растворе, осаждают этанолом в присутствии ацетата натрия с рН 5,5, промывают 70% этанолом и растворяют в 200 мкл деионизованной воды.
В результате получают хромосомную ДНК в количестве 5 мг/мл.
Пример 6. Получение фрагмента ДНК, содержащего ген ациламидазы АА37
Фрагмент ДНК, содержащий ген ациламидазы, получают с помощью ПЦР-амплификации с хромосомной ДНК, полученной, как в примере 5, с использованием праймеров, созданных на основе последовательности пептидов, полученных как в примерах 3 и 4. Амплифицированный фрагмент ДНК вставляют в вектор pTZ57R/T (вектор pTZ57 (Fermentas), разрезанный по сайту Eco32I и снабженный одноцепочечными олиго-Т на обоих концах), с помощью Т4 ДНК лигазы фирмы Fermentas по методике, приведенной производителем. После трансформации лигазной смеси в штамм Е.coli XL1 Blue отбирают колонии, устойчивые к ампициллину 100 мкг/мл и содержащие плазмиду со вставкой целевого фрагмента. Секвенирование вставок из четырех независимо полученных клонов показало, что нуклеотидные последовательности фрагмента ДНК DAA37, кодирующего заявляемую ациламидазу, идентичны и имеют нуклеотидную последовательность, представленную в перечне последовательностей как SEQ ID NO 1.
Пример 7. Конструирование штамма Е.coli Tuner (DE3) pET16b-ami, способного синтезировать ациламидазу АА37
Для конструирования рекомбинантных штаммов Е.coli, способных синтезировать заявляемую ациламидазу, осуществляют клонирование структурного гена ациламидазы АА37 в вектор pET16b производства Novagen (Studier, F.W. and Moffatt, B.A. (1986) J. Mol. Biol. 189, 113-130) и трансформирование полученной конструкции в штаммы-реципиенты Е.coli.
Для этого сначала фрагмент ДНК DAA37, содержащий ген ациламидазы АА37, клонированный как в примере 6, амплифицируют с помощью ПЦР, используя праймеры с внесенными в них последовательностями эндонуклеаз рестрикции NdeI и BamHI. Амплифицированный таким образом фрагмент ДНК вставляют в плазмиду pET16b, разрезанную теми же эндонуклеазами. После трансформации лигазной смеси в штамм Е.coli XL1 Blue отбирают колонии, устойчивые к ампициллину и содержащие плазмиду pET16b-ami со вставкой целевого фрагмента ДНК.
Затем плазмиду pET16b-ami вводят в штамм-реципиент Е.coli Tuner (DE3) производства Novagen методом трансформации и получают штамм Е.coli Tuner (DE3) pET16b-ami, способный синтезировать заявляемую ациламидазу.
Пример 8. Конструирование штамма Е.coli Origami (DE3) pET16b-ami, способного синтезировать ациламидазу АА37
Плазмиду pET16b-ami, полученную как в примере 7, вводят в штамм-реципиент Е.coli Origami В (DE3) производства Novagen методом трансформации и получают штамм Е.coli Origami (DE3) pET16b-ami, способный синтезировать заявляемую ациламидазу.
Пример 9. Синтез N-изопропилакриламида из акриламида и изопропиламина с помощью изолированной ациламидазы АА37
Водные растворы акриламида и изопропиламина (рН 10) смешивают, затем к реакционной смеси добавляют раствор ациламидазы, полученный как в примере 2. Концентрации акриламида и изопропиламина в смеси эквимолярны и составляют 3% (0.42 мМ) и 2.5% (0.42 мМ) соответственно. Концентрация ациламидазы в смеси составляет 0,5 г сухого веса/л. Реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 6 часов. Затем количество конечного продукта определяют методом газовой хроматографии. Концентрация полученного раствора N-изопропилакриламида составляет 0,1 г/л.
Пример 10. Синтез N-изопропилакриламида из акриламида и изопропиламина с помощью клеток штамма Е.coli Tuner (DE3) pET16b-ami, синтезирующих ациламидазу АА37
Водные растворы акриламида и изопропиламина (рН 10) смешивают, затем к реакционной смеси добавляют суспензию клеток штамма Е.coli Tuner (DE3) pET16b-ami, полученного как в примере 7. Концентрации акриламида и изопропиламина в смеси эквимолярны и составляют 3% (0.42 мМ) и 2.5% (0.42 мМ) соответственно. Концентрация клеток в смеси составляет 8 г сухого веса/л. Реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 6 часов. Затем клетки отделяют центрифугированием (5 тыс. об/мин) и количество конечного продукта определяют методом газовой хроматографии. Концентрация полученного раствора N-изопропилакриламида составляет 1 г/л.
Пример 11. Синтез N-изопропилакриламида из акриламида и изопропиламина с помощью клеток штамма Е.coli Origami (DE3) pET16b-ami, синтезирующих ациламидазу АА37
Синтез осуществляют как в примере 10, но используют суспензию клеток штамма Е.coli Origami (DE3) pET16b-ami. Концентрация полученного раствора N-изопропилакриламида составляет 1 г/л.
Пример 12. Синтез N-диметиламинопропилакриламида из акриламида и диметиламинопропиламина с помощью ациламидазы АА37
Водные растворы акриламида и диметиламинопропиламина (рН 10) смешивают затем к реакционной смеси добавляют раствор ациламидазы, полученный как в примере 2. Концентрации акриламида и диметиламинопропиламина в смеси эквимолярны и составляют 1% (0.14 мМ) и 2.5% (0.14 мМ) соответственно. Концентрация ациламидазы в смеси составляет 0,5 г сухого веса/л. Реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 24 часов. Затем клетки отделяют центрифугированием (5 тыс. об/мин) и количество конечного продукта определяют методом газовой хроматографии.
Концентрация полученного раствора N-диметиламинопропилакриламида составляет 0,1 г/л.
Пример 13. Синтез N-диметиламинопропилакриламида из акриламида и диметиламинопропиламина с помощью клеток штамма Е.coli Tuner (DE3) pET16b-ami, синтезирующих ациламидазу АА37
Водные растворы акриламида и диметиламинопропиламина (рН 10) смешивают, затем к реакционной смеси добавляют суспензию клеток штамма Е.coli Tuner (DE3) pET16b-ami, полученную как в примере 9. Концентрации акриламида и диметиламинопропиламина в смеси эквимолярны и составляют 1% (0.14 мМ) и 2.5% (0.14 мМ) соответственно. Концентрация клеток в смеси составляет 8 г сухого веса/л. Реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 24 часов. Затем клетки отделяют центрифугированием (5 тыс. об/мин) и количество конечного продукта определяют методом газовой хроматографии. Концентрация полученного раствора N-диметиламинопропилакриламида составляет 0,5 г/л.
Пример 14. Синтез N-диметиламинопропилакриламида из акриламида и диметиламинопропиламина с помощью клеток штамма Е.coli Origami (DE3) pET16b-ami, синтезирующих ациламидазу АА37
Синтез осуществляют как в примере 13, но используют суспензию клеток штамма Е.coli Origami (DE3) pET16b-ami (пример 10). Концентрация полученного раствора N-диметиламинопропилакриламида составляет 0,5 г/л.
Таким образом,
- впервые идентифицирован фермент ациламидаза АА37, обладающий ацилирующей активностью с уникальной субстратной специфичностью, способный синтезировать N-замещенные алифатические акриламиды (N-изопропилакриламид или N-диметиламинопропилакриламид);
- выделен фрагмент ДНК DAA37 и на его основе сконструированы штаммы Е.coli, способные синтезировать ациламидазу АА37;
- разработан способ синтеза N-замещенных акриламидов с использованием ациламидазы АА37;
- осуществленная идентификация фермента ациламидазы АА37 как носителя ацилирующей активности, клонирование и секвенирование кодирующего этот фермент фрагмента ДНК открывают возможности для создания более совершенных вариантов биокатализатора.
1. Фермент ациламидаза АА37, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO 2.
2. Фрагмент ДНК DAA37, кодирующий ациламидазу по п.1 и имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO 1, либо другой фрагмент ДНК с нуклеотидной последовательностью, кодирующей ту же аминокислотную последовательность в силу вырожденности генетического кода.
3. Способ синтеза в водной среде N-замещенных алифатических акриламидов из акриламида и аминов в присутствии биокатализатора с ацилирующей активностью, отличающийся тем, что в качестве биокатализатора используют ациламидазу по п.1 в изолированном состоянии или в составе клеток E.coli, содержащих фрагмент ДНК по п.2.
