Способ изготовления модифицированных электродов, электроды, полученные указанным способом, и энзимные биосенсоры, включающие указанные электроды

Изобретение относится к области модифицированных электродов для определения анализируемых веществ в биологических жидкостях. Способ изготовления электрода, полученного методом трафаретной печати, модифицированного берлинской лазурью, включает последовательное нанесение на поверхность указанного электрода раствора, содержащего ионы железа (III) или железа (II), одно поверхностно-активное вещество в подходящем растворителе, и раствора, содержащего ионы ферроцианида (II) или феррицианида (III), и одно поверхностно-активное вещество в подходящем растворителе, с такими концентрациями указанных растворов, которые обеспечивают образование берлинской лазури непосредственно на поверхности электрода. Причем указанный электрод, полученный методом трафаретной печати, не подвергается предварительной обработке перед указанным последовательным нанесением растворов. При этом указанный раствор, содержащий ионы железа (III) или железа (II), является кислым раствором с рН 0,5-6,0 соединения, выбранного из группы, состоящей из солей железа (III) или железа (II) неорганических кислот. Указанное поверхностно-активное вещество выбрано из группы, состоящей из лаурилсульфата натрия и лаурилэтоксисульфата, хлорида бензалкония, полиоксиэтилена производных эфиров жирных кислот и сорбита и их смесей. Технический результат изобретения является высокий уровень воспроизводимости на стадии нанесения, стабильность, оперативность и возможность длительного хранения. 5 н. и 20 з.п. ф-лы, 6 ил.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области модифицированных электродов для определения анализируемых веществ в биологических жидкостях и, в частности, к новому способу изготовления электродов, модифицированных берлинской лазурью, вышеописанным модифицированным электродам, биосенсорам, включающим указанные электроды, и способу определения анализируемых веществ в биологических жидкостях с применением указанных электродов.

Уровень техники

Применение берлинской лазури для модификации энзимных электродов, применяемых в амперометрии, и является результатом открытия, произошедшего 80-е, которое сводится к тому, что берлинская лазурь может быть нанесена слоями на электроды из различных материалов, таких как платина, стеклоуглерод, SnO₂ и TiO₂ и обладает каталитическим действием при восстановлении пероксида водорода, продуцируемого при энзимном окислении анализируемого вещества.

Указанными электродами, модифицированными берлинской лазурью, может быть определена концентрация образующегося пероксида водорода, позволяя тем самым непрямое определение концентрации окисляемого анализируемого вещества, которая прямо пропорциональна количеству продуцированного пероксида водорода.

Эти электроды, модифицированные берлинской лазурью, применялись в аналитических целях, в частности амперометрических биосенсорах, для измерения содержания глюкозы в крови. В дополнение к действию в качестве электрохимического медиатора при восстановлении пероксида водорода слой берлинской лазури может быть применен в качестве подложки для иммобилизации энзима оксидазы.

Электроды, модифицированные берлинской лазурью, могут быть получены, например, посредством электрохимического осаждения растворов ферроцианида железа(III) на электроде из одного из вышеуказанных материалов. US 5876581, например, описывает способ электрохимического осаждения, в котором пара электродов погружена в раствор, содержащий ионы железа(III) и гексацианоферрата; проведение электролиза с одним или двумя электродами в качестве катода и другим в качестве анода, слой нерастворимого гексацианоферрата(III) железа, известного как берлинская лазурь, осаждается на поверхность катода.

Электроды, которые могут быть применены в способе в соответствии с US 5876581, требуют присутствие катодов, изготовленных или покрытых инертным металлом, таким как платина, родий, золото и т.д., или оксидом проводящего металла, или полупроводника. Ранее эти традиционные электроды были заменены на электроды, полученные методом трафаретной печати (SPEs), которые обладают многочисленными преимуществами: они дешевы, просты в изготовлении, универсальны и пригодны для крупномасштабного изготовления.

Как указано выше, электроды, модифицированные берлинской лазурью, применяли ранее и в настоящее время этот продукт наносят на поверхность электрода электрохимическим путем. Указанный путь, однако, непригоден для широкомасштабного изготовления модифицированных электродов исходя из электродов, полученных методом трафаретной печати по двум основным причинам:

1) электрохимические операции обычно длительные и должны выполняться электрод за электродом, с огромными затратами времени в случае изготовления большого количества электродов; и 2) плоская форма электродов, полученных методом трафаретной печати, делает применение электрохимических операций сложными и трудоемкими, поскольку последние требуют погружения электрода в раствор, содержащий ионные частицы, и это может приводить к образованию слоя берлинской лазури также на поверхности электрода сравнения, блокируя электрическую проводимость и препятствуя применению электродов, полученных методом трафаретной печати в аналитических целях.

По этим причинам, насколько известно заявителю, в настоящее время не существует электрохимических способов осаждения берлинской лазури на электроды, полученные методом трафаретной печати. Способ химического осаждения берлинской лазури на электроды, полученные методом трафаретной печати, описаны Риччи (Ricci) и др. в Biosensors and Bioelectronics 18 (2003) 165-174. Указанный способ включает предварительную электрохимическую обработку электродов в течение 3 минут при потенциале 1,7 В перед химическим осаждением берлинской лазури. В соответствии с этой статьей указанный способ достаточен для получения улучшенной воспроизводимости и отклика электрода, но с другой стороны делает изготовление модифицированных электродов очень трудоемким, требующим предварительной электрохимической обработки каждого из них и сводит к нулю преимущества химического осаждения.

Кроме того, в этом способе берлинская лазурь наносится на электрод вручную, посредством сложной операции, которая требует большой осторожности для предотвращения увеличения внутреннего сопротивления системы: смесь должна быть приготовлена на месте, добавлением раствора феррицианида калия в HCl к раствору хлорида железа(III) в HCl, после чего капля указанной смеси наносится исключительно на поверхность рабочего электрода, при этом необходимо избежать попадания смеси на электрод сравнения и вспомогательный электрод.

Таким образом даже с вышеуказанными предосторожностями модифицированные электроды ограничены в плане воспроизводимости осаждения и устойчивости слоя берлинской лазури; поэтому, даже несмотря на то, что электроды, полученные методом трафаретной печати, сами по себе характеризуются высоким уровнем воспроизводимости поверхности электрода, определяющим устойчивость и воспроизводимость электрического сигнала анализируемого вещества, низкая воспроизводимость и недостаток в единообразии приготовления слоя берлинской лазури создают серьезные проблемы при измерении количества анализируемого вещества в биологических жидкостях и, в общем, в применениях, для которых электрод предназначен.

Из сказанного выше должно быть понятно, что существует потребность в способе легко масштабируемом, посредством которого поверхность электродов, полученных методом трафаретной печати, берлинской лазурью может быть модифицирована в способе, в котором устранены недостатки известных способов, подчеркнутые выше.

Раскрытие изобретения

Заявитель разработал новый способ, в частности, дешевый и простой в осуществлении, который позволяет модифицировать электроды, полученные методом трафаретной печати, берлинской лазурью, получать электроды с высоким уровнем стабильности и воспроизводимости, применимые в изготовлении плоских биосенсеров для количественного определения анализируемых веществ в биологических жидкостях.

Целью настоящего изобретения является способ изготовления электрода, полученного методом трафаретной печати, модифицированного берлинской лазурью, характеризующийся тем, что он включает последовательное осаждение на поверхность указанного электрода, полученного методом трафаретной печати, раствора, содержащего ионы железа(III) или железа(II) и, по меньшей мере, одно поверхностно-активное вещество в подходящем растворителе и раствор, содержащий ферроцианид(II) или феррицианид(III) ионы и, по меньшей мере, одно поверхностно-активное вещество в подходящем растворителе. Указанные растворы имеют такую концентрацию, которая обеспечивает образование берлинской лазури непосредственно на поверхности электрода.

Другими объектами изобретения являются электрод, полученный методом трафаретной печати, модифицированный берлинской лазурью, полученный вышеуказанным способом, энзимный электрод и энзимный биосенсор, который включает указанный электрод, и способ определения количества анализируемого вещества в биологическом образце, включающий контакт между образцом и вышеуказанным энзиматическим биосенсором.

Характеристики и преимущества изобретения будут проиллюстрированы в деталях следующим описанием.

Краткое описание фигур

Фигура 1: Вид сбоку модифицированного электрода, полученного методом трафаретной печати, изготовленного, как описано в примере 1.

Фигура 2: Циклическая вольтамперограмма, записанная с применением модифицированного электрода, полученного методом трафаретной печати, как описано в примере 1 (кривая а), и циклическая вольтамперограмма, записанная на этом же электроде в присутствии H₂O₂ (кривая b), которая демонстрирует электрохимическую активность берлинской лазури.

Фигура 3: Циклическая вольтамперограмма, записанная с применением модифицированного электрода, полученного методом трафаретной печати, как описано в примере 3 (кривая а), и циклическая вольтамперограмма, записанная на этом же электроде в присутствии H₂O₂ (кривая b), которая демонстрирует электрохимическую активность берлинской лазури.

Фигура 4: Сравнение между циклической вольтамперограммой, записанной с применением модифицированного электрода, как описано в примере 1 (кривая а), и циклической вольтамперограммой, записанной с применением модифицированного электрода, как описано в примере 3 для сравнения (кривая b). Следует отметить большее осаждение берлинской лазури, полученной на электроде примера 1.

Фигура 5: Сравнение между рабочей стабильностью модифицированного электрода в соответствии с примером 1 (Фиг.5А) и модифицированным электродом в соответствии с примером 3 для сравнения (Фиг.5B), в которых может быть отмечена большая рабочая стабильность электрода, полученного в соответствии со способом, описанным в примере 1.

Осуществление изобретения

В способе изобретения применяют раствор, содержащий ионы железа(III) или железа(II), например, кислый раствор с рН между 0,5 и 6,0, предпочтительно кислый раствор, полученный добавлением HCl, соединения, выбранного из группы, состоящей из солей железа(III) или железа(II) неорганических кислот, например, хлорид, сульфат и нитрат железа(III); предпочтительно раствор представляет собой раствор хлорида железа(III) в водной HCl 0,01 М с рН 2,0.

Концентрация железа(III) или железа(II) в вышеуказанном растворе может быть, например, между 20 мМ и 2 М и предпочтительно 1 М. Раствор, содержащий ионы гексацианоферрата(III) в соответствии с изобретением, является, например, кислым раствором, с рН между 0,5 и 6,0, полученным предпочтительно добавлением HCl, соли, содержащей ионы ферроцианида Fe(CN)₆ ^4- или феррицианида Fe(CN)₆ ^3-, например, натрия, калия, аммония или гексацианоферрата кобальта; предпочтительно настоящий раствор является раствором феррицианида калия K₃Fe(СН)₆ в водной 0,01 М HCl с рН 2,0. Концентрация ферроцианид(II) или феррицианид(III) иона в вышеуказанном растворе может быть, например, между 20 мМ и 2 М и предпочтительно 1 М.

В соответствии с изобретением настоящий способ включает нанесение раствора, содержащего ион железа(II) или железа(III) на поверхность рабочего электрода, и сразу вслед за этим нанесение раствора, содержащего ион гексацианоферрат(III) в равном объеме и концентрации. Объем растворов с концентрацией между 20 мМ и 2 мМ составляет, например, 100 нл - 4 µл для поверхности электрода между 0,314 мм² и 3,14 см², предпочтительно 3,14 мм².

Электроды отпечатываются трафаретным способом на инертном материале, например, поликарбонате, полиэфире, поливинилхлориде (PVC) или другом пластическом материале подходящей краской с проводящими материалами, например, графитом, серебром, золотом или платиной, которые являются подходящими для применения в настоящем способе изготовления модифицированных электродов изобретения: графитовая краска является предпочтительной для рабочего электрода. После смешивания двух растворов смесь оставляют на период, например, между 2 минутами и 2 часами и предпочтительно на 10 минут; поверхность рабочего электрода затем промывают промывочным раствором, состоящим, например, из водного кислого раствора с рН между 0,5 и 6,0 и предпочтительно водного раствора 0,01 М HCl с рН 2,0. Вслед за этим рабочий электрод может быть промыт дистиллированной водой. Модифицированные таким образом электроды оставляют для высушивания в печи при температуре 50°С-200°С на 10 минут - 3 часа. Предпочтительно электрод помещают в печь при 100°С на 1 час 30 минут. Два раствора, содержащих ион железа(III) или железа(II) и ион ферроцианида(II) или феррицианида(III) в соответствии с изобретением, кроме того, содержат, по меньшей мере, одно поверхностно-активное вещество, выбранное из катионного, анионного, амфотерного поверхностно-активного вещества, в количествах для каждого раствора, например, 0,001-10 мас.% по отношению к общему объему раствора. Предпочтительно поверхностно-активное вещество выбрано из группы, состоящей из лаурил сульфата натрия и лаурилэтоксисульфата, хлорида бензалкония, соединений, принадлежащих к семейству продуктов, известных под торговой маркой Tween®, т.е. полиоксиэтиленовые производные эфиров жирных кислот с сорбитом и их смеси.

В соответствии с особо предпочтительным осуществлением изобретения поверхностно-активное вещество полиоксиэтилен (20) сорбит монолаурат, продаваемый под маркой Tween® 20, добавляют к каждому из двух растворов, содержащих соответственно ион железа(III) или железа(III) и ион ферроцианида(II) или феррицианида(III), в количестве 0,05 мас.% по отношению к общему объему раствора.

Настоящим способом нанесения может быть получен слой берлинской лазури на поверхности рабочего электрода, который является крайне воспроизводимым и активным с точки зрения электрохимии. Кроме того, циклической вольтамперометрией может быть определено количество берлинской лазури, находящейся на рабочем электроде после нанесения, включающее значения 10-200 нмоль/см² и предпочтительно 100 нмоль/см².

Настоящим способом может быть получен плотный слой берлинской лазури, никогда ранее не наблюдавшийся в химическом или электрохимическом способах; высокая поверхностная плотность берлинской лазури на поверхности электрода позволяет получить крайне высокую рабочую стабильность без влияния на каталитическую активность по отношению к восстановлению H₂O₂.

Электроды, модифицированные берлинской лазурью, изготовленные в соответствии со способом изобретения, могут быть применены в изготовлении энзимных биосенсоров с двумя или тремя электродами, которые также являются объектом настоящего изобретения. В указанных биосенсорах модифицированные электроды применяют в качестве подложки для иммобилизации подходящего энзима, выбранного на основе типа аналитического определения, для которого биосенсор предназначен, т.е. так что анализируемое вещество действует как субстрат для энзима, генерируя продукт, который может быть окислен или восстановлен электрохимически на модифицированном электроде, изменяя силу измеряемого тока пропорционально количеству анализируемого вещества, присутствующего в анализируемой жидкости.

Биосенсор по изобретению включает энзимный электрод, т.е. модифицированный электрод изобретения, описанный выше, на котором иммобилизован энзим обычно применяемыми способами, известными специалисту в данной области, и ячейку для биологической жидкости, так чтобы последняя находилась в контакте с энзимом.

В соответствии с предпочтительным осуществлением изобретения биосенсор по изобретению включает модифицированный электрод изобретения, на котором иммобилизован энзим глюкозооксидазы, применимый для определения глюкозы в биологических жидкостях, таких как кровь, сыворотка или плазма; в этом случае анализируемым веществом является глюкоза, которая окисляется энзимом, давая H₂O₂, который восстанавливается на модифицированном электроде за счет приложенного потенциала между этим электродом и электродом сравнения, генерируя ток, пропорциональный полученному H₂O₂ и следовательно количеству глюкозы, присутствующей в жидкости, содержащейся в ячейке.

Другим объектом изобретения является способ определения количества анализируемого вещества в биологической жидкости, включающий приложение подходящего потенциала на модифицированный электрод изобретения, описанного выше, и электрод сравнения, присутствующий в биосенсоре по изобретению, и регистрацию генерируемого тока. Предпочтительно способ по изобретению применяют для определения содержания глюкозы в биологических жидкостях при низком прилагаемом потенциале, например, между -250 мВ и +200 мВ, предпочтительно -50 мВ.

Способ изготовления электродов, модифицированных берлинской лазурью, как описано выше, обладает высоким уровнем воспроизводимости на стадии нанесения, что положительно влияет на воспроизводимость измерений, выполняемых с электродами, модифицированными способом по изобретению; кроме того, он обеспечивает модифицированный электрод с большей рабочей стабильностью, чем любой другой электрод, модифицированный берлинской лазурью, изготовленный известным до настоящего времени способом. Установлено, что слой берлинской лазури на электродах, модифицированных настоящим способом, остается активным и электрохимическая активность снижается только на около 35% после 150 часов непрерывной работы. В дополнение к большей рабочей стабильности электроды, модифицированные берлинской лазурью, изготовленные способом по изобретению, также обладают более высокой стабильностью при долговременном хранении.

Указанные величины стабильности, оперативность и возможность длительного хранения и воспроизводимость в случае биосенсоров с двумя и тремя электродами также достигаются способом, который не требует в отличие, например, от способа, описанного Риччи (Ricci) и др. в Biosensors and Bioelectronics 18 (2003) 165-174, предварительной электрохимической обработки электрода перед нанесением берлинской лазури, и поэтому является менее трудоемким и легче автоматизируемым и поэтому применимым в промышленном масштабе.

Другим преимуществом модифицированных электродов по изобретению в случае биосенсоров с двумя электродами, которые могут быть применены, например, при определении глюкозы является то, что они включают рабочий электрод и электрод сравнения, при этом не требуются противоэлектрода в отличие от, например, электродов, модифицированных берлинской лазурью, описанных в вышеуказанной статье Риччи (Ricci) и др.

Следующие примеры представляют не ограничивающую иллюстрацию изобретения.

Пример 1

Изготовление модифицированного электрода

Известным способом изготавливают электрод, полученный методом трафаретной печати, на полиэфирном листе, включающий круглый рабочий электрод с диаметром 2 мм, полученный с применением графитовой краски, и серебряный электрод сравнения; поверхность рабочего электрода отделяют краской из изолирующего материала. Фиг.1 представляет вид сбоку электрода, изготовленного таким образом. Готовят два следующих раствора: 1) 1 М раствор феррицианида калия K₃Fe(CN)₆ в 10 мM HCl и 2) 1 М раствор хлорида железа(III) в HCl 10 мМ. Tween® 20 добавляют к каждому из двух растворов в количестве 0,05 мас.% по отношению к общему объему раствора.

Распределительным автоматом 1 µл раствора 1) наносят на поверхность рабочего электрода и сразу за этим тем же распределительным автоматом 1 µл раствора 2) наносят на ту же поверхность рабочего электрода, получая таким образом 2 µл раствора хлорида железа(III) и гексацианоферрата калия на указанной поверхности. Через 10 минут модифицированные таким образом электроды промывают несколькими миллилитрами 10 мМ раствора HCl, затем помещают в печь при 100°С на 1 час.

Вышеописанная операция приводит к осаждению на электроде крайне компактного и стабильного слоя берлинской лазури с высокой поверхностной плотностью берлинской лазури на рабочем электроде. Последнее подтверждают результаты циклической вольтамперометрии, представленной на фиг.2, которая позволяет рассчитать количество берлинской лазури на поверхности рабочего электрода: измеренная поверхностная плотность составляет около 100 нмоль/см², гораздо больше, чем приводится в литературе до настоящего времени с применением различных способов нанесения.

Пример 2

Определение каталитической активности берлинской лазури электрода, изготовленного в примере 1.

Свойства модифицированного электрода, изготовленного в описанным выше примере 1, определяют при помощи циклической вольтамперометрии в ряду потенциалов -0,4-0,4 В. Фиг.2 представляет вольтамперограмму, полученную на электроде, полученном методом трафаретной печати, еще не модифицированном, и на том же электроде, модифицированном берлинской лазурью, изготовленном как описано выше в примере 1. Для последнего электрода можно видеть увеличение катодной волны на вольтамперограмме при около 0,05 В в присутствии пероксида водорода, демонстрирующее каталитическую активность слоя берлинской лазури, нанесенной на электрод.

Пример 3 (сравнение)

Изготовление модифицированного электрода, как описано Риччи (Ricci) и др. в Biosensors and Bioelectronics 18 (2003) 165-174

В соответствии с методикой, описанной ранее в статье Риччи (Ricci) и др. в Biosensors and Bioelectronics 18 (2003) 165-174, модифицируют электрод, полученный методом трафаретной печати, на полиэфирном листе, включающий круглый рабочий электрод с диаметром 2 мм, полученный при помощи графитовой краски, и серебряный электрод сравнения; поверхность рабочего электрода отделяют краской из изолирующего материала. Готовят следующие растворы 1) 0,1 М раствор феррицианида калия K₃Fe(CN)₆ в 10 мМ HCl и 2) 0,1 М раствор хлорида железа(III) в 10 мМ HCl.

Перед нанесением двух растворов электрохимическим способом электрод предварительно обрабатывают наложением постоянного потенциала, равного 1,7 В по отношению к Ag/AgCl в течение 3 минут, операция, не подходящая для автоматизации и гораздо более трудоемкая и длительная, чем операция в примере 1.

Распределительным автоматом на поверхность рабочего электрода наносят 20 µл раствора 1) и сразу за этим тем же распределительным автоматом наносят на ту же поверхность рабочего электрода 20 µл раствора 2), получая таким образом 40 µл смеси хлорида железа(III) и гексацианоферрата калия. Через 10 минут модифицированные таким образом электроды промывают несколькими миллилитрами 10 мМ раствора HCl, затем помещают в печь при 100°С на 1 час. Каталитическую активность слоя берлинской лазури, нанесенной таким образом, оценивают тем же способом, как описано в примере 2. Фиг.3 представляет циклические вольтамперограммы, полученные с модифицированным электродом, как описано выше.

Пример 4

Определение аналитической эффективности модифицированных электродов изобретения и известного уровня техники

Аналитическую эффективность электродов, модифицированных берлинской лазурью, изготовленных как описано в примерах 1 и 3, проверяют, определяя отклик на H₂O₂, рабочую и нерабочую стабильность и воспроизводимость. Что касается воспроизводимости, значения воспроизводимости, рассчитанные как процент относительного стандартного отклонения (обозначаемый далее как RSD%), для электрода, модифицированного как описано в примере 3, составляет около 20%, несовместимое с любым типом промышленного применения, тогда как рассчитанный RSD% для электрода, модифицированного как описано в примере 1, составляет 5%. Что касается толщины нанесенной на электроды берлинской лазури способом известного уровня техники, описанным в примере 3, поверхностная плотность слоя полученной берлинской лазури составляет 1-10 нмоль/см², что много меньше, чем эта же характеристика для электрода изобретения примера 1 (около 100 нмоль/см²), что демонстрирует сравнение циклических вольтамперограмм (фиг.4).

Это приводит к более высокой рабочей стабильности берлинской лазури, вплоть до максимума в 200 часов. Фиг.5, например, представляет непрерывный мониторинг с помощью проточного устройства, полученного с двумя электродами, изготовленными способами, описанными в примерах 1 и 3. Как явно видно при концентрации 5 мМ Н₂О₂ оба электрода обеспечивают прохождение тока восстановления благодаря каталитической активности берлинской лазури, но электрод примера 1 демонстрирует более долговременную рабочую стабильность с уменьшением начального сигнала только на 20% через 200 часов. В случае электрода известного уровня техники, изготовленного в примере 3, наблюдается более заметное уменьшение, равное около 70% после 200 часов.

Пример 5

Изготовление биосенсора

Модифицированный электрод, изготовленный как описано в примере 1, применяют в качестве носителя для иммобилизации энзима глюкозооксидазы с целью получения биосенсора, пригодного для непрерывного контроля содержания глюкозы в крови. С этой целью 200 нл раствора глутаральдегида (0,025% об./об. в H₂O) наносят на поверхность рабочего электрода, предварительно модифицированного берлинской лазурью, как описано в примере 1. Приблизительно после 25 минут 200 нл смеси, полученной растворением 10 мг энзима глюкозооксидазы в 1 мл водного раствора Nation^® (0,1%), наносят на ту же поверхность рабочего электрода. Вновь оставляют его приблизительно на 25 минут, чтобы достичь полного высыхания нанесенного раствора.

1. Способ изготовления электрода, полученного методом трафаретной печати, модифицированного берлинской лазурью, характеризующийся тем, что он включает последовательное нанесение на поверхность указанного электрода раствора, содержащего ионы железа (III) или железа (II) и, по меньшей мере, одно поверхностно-активное вещество в подходящем растворителе, и раствора, содержащего ионы ферроцианида (II) или феррицианида (III) и, по меньшей мере, одно поверхностно-активное вещество в подходящем растворителе, с такими концентрациями указанных растворов, которые обеспечивают образование берлинской лазури непосредственно на поверхности электрода.

2. Способ по п.1, в котором указанный электрод, полученный методом трафаретной печати, не подвергается предварительной обработке перед указанным последовательным нанесением растворов.

3. Способ по п.1, в котором указанный раствор, содержащий ионы железа (III) или железа (II), является кислым раствором с рН 0,5-6,0 соединения, выбранного из группы, состоящей из солей железа (III) или железа (II) неорганических кислот.

4. Способ по п.3, в котором указанные соли железа (III) или железа (II) неорганических кислот выбраны из хлорида железа (III), сульфата железа (III) и нитрата железа (III).

5. Способ по п.3, в котором указанный раствор является раствором хлорида железа (III) в водной 0,01 М HCl с рН 2,0.

6. Способ по п.1, в котором указанный раствор, содержащий ионы гексацианоферрата (III), является кислым раствором с рН 0,5-6,0 соли, содержащим ионы ферроцианида (II) или феррицианида (III).

7. Способ по п.6, в котором указанная соль выбрана из гексацианоферрата натрия, калия, аммония и кобальта.

8. Способ по п.6, в котором указанный раствор является раствором феррицианида калия K₃Fe(CN)₆ в водной 0,01 М HCl с рН 2,0.

9. Способ по п.1, в котором указанные растворы имеют одинаковые концентрации 20-2 мМ и наносятся равными объемами 100 нл - 4 мкл на электрод с поверхностью 0,314 мм² - 3,14 см², предпочтительно 3,14 мм².

10. Способ по п.1, в котором указанный электрод, полученный методом трафаретной печати, выполнен из инертного материала с трафаретной печатью графитовой краской.

11. Способ по п.1, дополнительно включающий стадии удаления растворов нанесенных на 10 мин, промывки поверхности рабочего электрода промывочным раствором, состоящим из водного раствора с рН 0,5-6,0, и при необходимости промывки дистиллированной водой и высушивания в печи с температурой 50-200°С в течение 10 мин - 3 ч.

12. Способ по п.11, в котором указный промывочный раствор является водным раствором 0,01 М HCl с рН 2,0.

13. Способ по п.12, в котором электрод высушивают в печи при температуре 100°С в течение 1 ч 30 мин.

14. Способ по п.1, в котором указанное поверхностно-активное вещество выбрано из катионных, анионных, амфотерных поверхностно-активных веществ и их смесей и добавлено в количествах для каждого раствора 0,001-10 мас.% по отношению к общему объему раствора.

15. Способ по п.12, в котором указанное поверхностно-активное вещество выбрано из группы, состоящей из лаурилсульфата натрия и лаурилэтоксисульфата, хлорида бензалкония, полиоксиэтилен производных эфиров жирных кислот и сорбита и их смесей.

16. Способ по п.12, в котором указанное поверхностно-активное вещество является полиоксиэтилен (20) монолауратом сорбита в количестве 0,05 мас.% по отношению к общему объему раствора.

17. Электрод, полученный методом трафаретной печати, модифицированный берлинской лазурью, изготовленный способом по п.1, в котором количество нанесенной берлинской лазури составляет 10-200 нмоль/см².

18. Электрод, полученный методом трафаретной печати, по п.17, в котором количество берлинской лазури составляет 100 нмоль/см².

19. Энзимный электрод, содержащий электрод, полученный методом трафаретной печати, модифицированный, по п.17 и подходящий энзим, иммобилизованный на указанном электроде, выбранный таким образом, чтобы его продукт мог быть окислен или восстановлен электрохимически на указанном модифицированном электроде.

20. Энзимный электрод по п.19, в котором указанный энзим является энзимом глюкозооксидазы.

21. Энзимный биосенсор, содержащий энзимный электрод по п.19 в качестве рабочего электрода, при необходимости противо-электрод и ячейку для анализируемой биологической жидкости, такую, чтобы последняя контактировала с иммобилизованным энзимом указанного энзимного электрода.

22. Биосенсор по п.21, включающий электрод, полученный методом трафаретной печати, и указанный электрод сравнения в качестве отдельных электродов.

23. Способ определения количества анализируемого вещества в биологической жидкости, включающий приложение соответствующего потенциала на энзимный электрод по п.19 и электрод сравнения, включенный в энзимный биосенсор по п.21, и регистрацию генерированного тока.

24. Способ по п.23, в котором указанное анализируемое вещество является глюкозой и приложенный потенциал составляет (-250)-(+200) мВ.

25. Способ по п.24, в котором указанный прилагаемый потенциал равен -50 мВ.