Кристаллизация антител или их фрагментов

Настоящее изобретение относится к способам кристаллизации и/или концентрирования антитела или фрагментов антител. Сущность способа заключается в том, что проводят контактирование антитела анти-VEGR или его фрагмента с раствором, включающим ZnCl₂ либо MgCl₂, и проводят инкубацию полученного раствора до образования кристаллов. Использование способа позволяет получать кристаллы анти-VEGR антитела или его фрагмента без добавления органических или полимерных осадителей. 16 з.п. ф-лы, 7 ил., 16 табл., 7 пр.

 

Перекрестная ссылка к родственным заявкам

По настоящей заявке испрашивается приоритет заявки США № 60/590707, поданной 23 июля 2004 г. на основании 35 U.S.C.§ 119 (e), причем заявка приведена в настоящем описании в качестве ссылки.

Предшествующий уровень техники

Моноклональные антитела становятся высокоэффективными терапевтическими агентами для лечения ряда заболеваний и состояний, включая, но не ограничиваясь ими, рак, респираторные заболевания, воспалительные заболевания и инфекционные заболевания. Как правило, для лечебных мероприятий, в которых используют антитела, требуется доставка от 100 мг до 1 г антитела на дозу. Обычно применяемым подходом для таких курсов лечения является применение внутривенных инфузий от примерно 2 до 20 мл 50 мг/мл раствора антитела. Так как желательно создание способов, отличных от внутривенного введения, таких как подкожная инъекция, более концентрированные растворы могли бы иметь некоторые преимущества. Однако применение концентрированных растворов антител может быть проблематичным из-за, включая, но не ограничиваясь ими, высоковязких растворов, белковой агрегации и трудностей со стабильностью растворов.

Например, для применения в рентгеновской кристаллографии были кристаллизованы фрагменты антител. В ранее описанных способах кристаллизации моноклональных антител обычно применяли методику на основе диффузии паром. Недостатки этой методики включают незначительное количество кристаллов, которое продуцируется, и применение агентов, которые в некоторых случаях являются неприемлемыми для применения у людей. Способы периодического процесса также могут быть использованы для получения не слишком большого количества кристаллов. Обычно используемые способы периодического процесса, как правило, используют органические или полимерные осадители. Протоколы, в которых применяют органические осадители для кристаллизации антител, были описаны. Yang с сотр., PNAS, vol. 100, No 12, pp. 6934-6939 (2003); Kuznetsov с сотр., J. Crystal Growth, vol. 232, pp. 30-39 (2001); Kuznetsov с сотр., J. Structural Biology, vol. 131, pp. 108-115 (2000); Harris с сотр., Immunological Reviews, vol. 163, pp. 35-43 (1998); Harris с сотр., J. Mol. Biol., vol. 275, pp. 861-872 (1998); и Harris с сотр., Proteins, vol. 23, pp. 285-89 (1995). Примеры обычно используемых органических или полимерных осадителей включают полиэтиленгликоль (PEG), изопропанол, Jeffamine® (Hunstman Petrochemical Corp., Salt Lake City, UT) и (+/-)-2-метил-2,4-пентандиол (MPD).

Так как многие антитела в настоящий момент обрабатывают в крупном масштабе для введения людям, желательно иметь способы образования кристаллов и/или концентрирования белковых гелей в большом масштабе, особенно тех, которые не включают органические или полимерные осадители. Кристаллы и/или гели применяют для хранения и терапевтического введения.

Сущность изобретения

Один из аспектов изобретения относится к способу получения кристаллов антитела или его фрагмента, который включает стадии контактирования антитела или его фрагмента с раствором, который включает примерно 1-500 миллимолей (мМ) соли двухвалентного катиона и примерно 1-100 мМ буфера, и инкубацию антитела или его фрагмента и раствора до образования кристаллов антитела или его фрагмента.

В некоторых вариантах осуществления способ включает контактирование антитела или его фрагмента с раствором, который содержит примерно 1-120 мМ соли цинка; и инкубацию антитела или его фрагмента и раствора до формирования кристаллов и/или белкового геля антитела или его фрагмента. В некоторых вариантах осуществления инкубацию осуществляют при температуре окружающей среды. В некоторых вариантах осуществления температура составляет от примерно 20 до 27˚C. В других вариантах осуществления инкубацию осуществляют при температуре менее чем примерно 20˚C, предпочтительно от примерно 0˚C до 20˚C, более предпочтительно от примерно 0˚C до 10˚C.

В некоторых вариантах осуществления способ включает контактирование антитела или его фрагмента с раствором, который состоит, в основном, из раствора соли цинка и буфера; и инкубацию антитела или его фрагмента и раствора до образования кристаллов и/или белкового геля антитела или его фрагмента.

Способ получения кристаллов антитела или его фрагмента включает контактирование антитела или его фрагмента с раствором, который включает соль цинка и не содержит другие осадители; и инкубацию антитела или его фрагмента и раствора до формирования кристаллов антитела или его фрагмента.

В некоторых вариантах осуществления двухвалентной солью является примерно 10-80 мМ, более предпочтительно 25 мМ-60 мМ хлорид цинка (ZnCl₂). В других вариантах осуществления буфером является примерно 1-20 мМ NaOAc, более предпочтительно примерно 25-75 мМ ацетат натрия (NaOAc). В некоторых вариантах осуществления раствор включает более чем примерно 10 мМ ZnCl₂ и более чем примерно 5 мМ NaOAc. Например, раствор включает примерно 100 мМ ZnCl₂ и примерно мМ NaOAc. В других вариантах осуществления рН буфера составляет от примерно 4 до примерно 9, более предпочтительно от примерно 4,7 до 5,7.

Изобретение также относится к кристаллам антитела или его фрагмента, полученным способом, описанным в данном описании. Антитела могут быть поликлональным антителом, моноклональным антителом, химерным антителом, биспецифичным антителом, антителом человека или гуманизированным антителом.

Изобретение также относится к композиции, включающей кристалл или белковый гель антитела, выбранного из группы, состоящей из: анти-VEGF антитела, анти-CD20, анти-CD11a, анти-CD40, анти-Apo-2, анти-HER2, анти-IgE и их фрагментов и носителя. Предпочтительно антитела являются полноразмерными гликозилированными антителами.

Изобретение также относится к составу, который включает кристалл или белковый гель антитела, выбранного из группы, состоящей из: анти-VEGF, анти-Apo-2, анти-CD20, анти-CD11a, анти-CD40, анти-HER2, анти-Apo-2, анти-IgE и их фрагментов и, по меньшей мере, одного ингредиента.

Изобретение также относится к способу лечения состояния у млекопитающего, включающему введение млекопитающему эффективного количества одной из вышеупомянутых композиций или составов. Состояния включают те, которые ассоциированы с VEGF, CD20, CD11a, CD40, Apo-2 и HER2.

Также предлагается изделие, которое включает, по меньшей мере, одну из вышеупомянутых композиций или составов и контейнер.

Изобретение относится к способам, композициям и составам, используемым, inter alia, для концентрирования, очистки, хранения и доставки антител или их фрагментов.

Краткое описание чертежей

Фигура 1 представляет собой график, на котором показана растворимость анти-VEGF при изменяющихся концентрациях ZnCl₂ и NaOAc, pH 5,7, комнатная температура. На графике показана концентрация растворимого анти-VEGF, построенная как функция концентрации ZnCl₂ и концентраций NaOAc. Различные концентрации NaOAc показаны следующим образом: × 10 мМ NaOAc; ∆ 25 мМ NaOAc (белая линия); ♦ 50 мМ NaOAc; ■ 75 мМ NaOAc; * 100 мМ NaOAc.

Фигура 2a представляет собой изображение при 200-кратном увеличении анти-VEGF кристаллов, сформированных в присутствии 5 мМ ZnCl₂ и 100 мМ NaOAc, pH 5,7 при отсутствии двойного лучепреломления света.

Фигура 2b представляет собой изображение при 200-кратном увеличении анти-VEGF кристаллов, сформированных в присутствии 5 мМ ZnCl₂ и 100 мМ NaOAc, pH 5,7 при двойном лучепреломлении света.

Фигура 2c представляет собой изображение при 200-кратном увеличении анти-VEGF кристаллов, сформированных в присутствии 25 мМ ZnCl₂ и 10 мМ NaOAc, pH 5,7 при отсутствии двойного лучепреломления света.

Фигура 2d представляет собой изображение при 200-кратном увеличении анти-VEGF кристаллов, сформированных в присутствии 25 мМ ZnCl₂ и 10 мМ NaOAc, pH 5,7 при двойном лучепреломлении света.

Фигура 2e представляет собой изображение при 200-кратном увеличении анти-VEGF кристаллов, сформированных в растворе 10 мМ ZnCl₂ и 100 мМ NaOAc, pH 5,7 при отсутствии двойного лучепреломления света.

Фигура 2f представляет собой изображение при 200-кратном увеличении анти-VEGF кристаллов, сформированных в растворе 10 мМ ZnCl₂ и 100 мМ NaOAc, pH 5,7 при двойном лучепреломлении света.

Фигура 3 показывает фазовую диаграмму статического состояния, генерированную путем построения концентрации ZnCl₂ в зависимости от концентрации NaOAc. Следующие символы идентифицируют ♦ свободные кристаллы; ■ фазовые переходы; ∆ гелевые кристаллы (белые треугольники).

Фигура 4 показывает фазовую диаграмму смешанного состояния по сравнению со статическим состоянием. Символы представляют следующее: ◊ свободное смешивание; ♦ гелевое смешивание; --♦-- переходное смешивание; --■- - переходное статическое; □ свободное статическое и ■ гелевое статическое.

Фигура 5 показывает электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) анти-VEGF кристаллов, которые были выделены и ресолюбилизированы. Линия 1 представляет собой маркеры молекулярной массы; линия 2 представляет собой 5 мкг анти-VEGF; линия 3 пустая; линия 4 представляет собой супернатант; линия 5 представляет собой промывку 1, маточный раствор; линия 6 представляет собой промывку 2, маточный раствор; линия 7 представляет собой промывку 3, маточный раствор; линия 8 пустая; линия 9 представляет собой 1 мл кристалла (растворенного в воде); линия 10 представляет собой 5 мл кристалла (растворенного в воде); линия 11 представляет собой 10 мл кристалла (растворенного в воде); линия 12 представляет собой 15 мл кристалла (растворенного в воде); линия 13 представляет собой 20 мл кристалла (растворенного в воде).

Фигура 6 показывает добавление осадителей к режиму анти-VEGF кристаллизации - 10 мМ ZnCl_2, 10 мМ NaOAc, pH 5,7. Количество растворимого анти-VEGF построили в зависимости от процентной (%) концентрации добавленного осадителя.

Фигура 7 показывает масс-спектрометрический анализ анти-VEGF исходного раствора (D), анти-VEGF кристаллических растворов (A, C) и промывного раствора от кристаллов (B). Укороченная легкая цепь анти-VEGF имеет массу примерно 23,499 Д.

Подробное описание предпочтительного варианта осуществления

Подробное описание

Определения

Термины «антитело» и «иммуноглобулин» применяют взаимозаменяемо в широком смысле и они включают моноклональные антитела (полноразмерные или интактные моноклональные антитела), поликлональные антитела, антительные композиции с полиэпитопной специфичностью, аффинно зрелые антитела, гуманизированные антитела, антитела человека, химерные антитела, гуманизированные, поливалентные антитела и мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела, поскольку они проявляют желаемую биологическую активность), а также антиген-связывающие фрагменты (например, Fab, F(ab')₂, scFv и Fv), поскольку они проявляют желаемую биологическую активность.

Полноразмерное антитело включает четыре полипептидных цепи, две идентичные тяжелые (H) цепи и две идентичные легкие (L) цепи, связанные дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь включает вариабельную область домена (V_H) тяжелой цепи и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи включает три домена, CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь включает вариабельную область домена (V_L) легкой цепи и константную область домена легкой цепи. Константная область легкой цепи включает один домен C_L. Домены V_H и V_L могут быть далее подразделены на комплементарные области (CDR) или гипервариабельные петли (HVL), вкрапленные в области, которые являются более консервативными, названные каркасными областями (FR). Каждый V_H и V_L обычно состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

В зависимости от аминокислотных последовательностей константных доменов этих тяжелых цепей антитела (иммуноглобулины) могут быть приписаны к различным классам. Существует пять главных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть далее подразделены на подклассы (изотипы), например IgG-1, IgG-2, IgA-1, IgA-2 и т.п. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, названы α, δ, ε, γ и μ соответственно. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны и, в целом, описаны, например, Abbas с сотр., Cellular and Mol. Immunology, 4^th ed. (2000). Антитело может быть частью большой слитой молекулы, сформированной путем ковалентной или нековалентной связи антитела с одним или несколькими другими белками или пептидами.

Легкие цепи антител любых видов позвоночных могут относиться к одному из двух четко различимых типов, названных каппа (κ) и лямбда (λ), основанных на аминокислотных последовательностях своих константных доменов.

Термин «полноразмерное антитело» относится к антителу в своей по существу интактной форме, включающему по меньшей мере 2 тяжелых и 2 легких цепи, неантительные фрагменты, как определено ниже. Термин на практике относится к антителу с тяжелыми цепями, которое содержит Fc область. Полноразмерное антитело может быть антителом с нативной последовательностью или рекомбинантным антителом. Полноразмерное антитело может быть человеческим, гуманизированным и/или аффинно зрелым.

Термин «моноклональное антитело», как использовано в данном описании, относится к антителу, полученному из популяции существенно гомогенных антител, то есть индивидуальных антител, включая популяции, в основном, идентичные, за исключением вариантов, которые могут возникать в процессе получения антитела.

Моноклональные антитела в данном описании специфически включают «химерные» антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична с или гомологична соответствующим последовательностям антител, полученных из определенных видов или принадлежащих к особому антительному классу или подклассу, где остаток цепи(ей) идентичен с или гомологичен соответствующим последовательностям в антителах, полученных из других видов, или принадлежащих к другому антительному классу или подклассу, а также фрагменты таких антител, поскольку они проявляют желаемую биологическую активность (Патент США № 4816567; и Morrison с сотр., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).

«Гуманизированные» формы нечеловеческих (например, мышиных) антител являются химерными антителами, которые содержат минимальную последовательность, полученную из нечеловеческого иммуноглобулина. Большей частью гуманизированные антитела являются иммуноглобулинами человека (реципиентное антитело), в которых остатки из CDR или гипервариабельной петли (HVL) реципиента замещают остатками из CDR или HVL нечеловеческих видов (донорное антитело), таких как мышь, крыса, кролик или примат, не являющийся человеком, имеющих желаемую специфичность, аффинность и активность. В некоторых примерах остатки рамочной области (FR) иммуноглобулина человека замещают соответствующими нечеловеческими остатками для улучшения антиген-связывающей аффинности. Кроме того, гуманизированные антитела могут включать остатки, которые не найдены в реципиентном антителе или донорном антителе. Эти модификации могут быть сделаны для улучшения антительной аффинности или функциональной активности. В общем, гуманизированное антитело будет включать, в значительной степени все, по меньшей мере одно и обычно два вариабельных домена, в которых все или в значительной степени все гипервариабельные области соответствуют таковым нечеловеческого иммуноглобулина и все или в значительной степени все FR являются таковыми иммуноглобулиновой последовательности человека. Гуманизированные антитела также могут быть получены как антиген-связывающие фрагменты, как описано в данном описании. Гуманизированное антитело необязательно будет также включать по меньшей мере часть иммуноглобулиновой константной области (Fc), обычно заданной или полученной из иммуноглобулина человека. Более подробную информацию можно найти из Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann с сотр., Nature 332:323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Смотри также следующие обзорные статьи и ссылки, цитированные в данном описании: Vaswani и Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle и Gross, Curr. Op. Biotech 5:428-433 (1994).

«Антитело человека» представляет собой антитело, которое обладает аминокислотной последовательностью, которая соответствует таковой антитела, продуцированного человеком, и/или было получено с использованием любой методики получения антител человека. Это определение антитела человека конкретно исключает гуманизированное антитело, включающее нечеловеческие антиген-связывающие остатки.

«Аффинно зрелое» антитело представляет собой антитело с одним или несколькими изменениями в одной или нескольких гипервариабельных областях, которые приводят к улучшению аффинности антитела для антигена по сравнению с родительским антителом, которое не обладает этим изменением(ями). Предпочтительная аффинность зрелых антител будет иметь наномолярные или даже пикомолярные аффинности для ссылочного антигена. Аффинно зрелые антитела получают с помощью методик, известных в данной области. Marks с сотр., Bio/Technology 10:779-783 (1992) описывает аффинное созревание путем перестройки VH и VL домена. Случайный мутагенез CDR и/или рамочных остатков описан: Barbas с сотр., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Scier с сотр., Gene 169:147-155 (1995); Yelton с сотр., J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson с сотр., J. Immunol 154(7):3310-9 (1995); и Hawkins с сотр., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).

«Антительные фрагменты» включают только часть интактного антитела, обычно включая антиген-связывающий сайт интактного антитела и, таким образом, сохраняя способность связывать антиген. Примеры антительных фрагментов, касающиеся настоящего определения, включают: (i) Fab-фрагмент, имеющий VL, CL, VH и CH1 домены, имеющие одну межцепочечную дисульфидную связь между тяжелой и легкой цепью; (ii) Fab'-фрагмент, который представляет собой Fab-фрагмент, имеющий один или несколько цистеиновых остатков на C-конце CH1 домена; (iii) Fd фрагмент, имеющий VH и CH1 домены; (iv) Fd'-фрагмент, имеющий VH и CH1 домены и один или несколько цистеиновых остатков на C-конце CH1 домена; (v) Fv-фрагмент, имеющий VL и VH домены одного плеча антитела; (vi) dAb-фрагмент, который состоит из VH домена; (vii) бесшарнирное антитело, включающее по меньшей мере VL, VH, CL, CH1 домены и не содержащее шарнирной области; (viii) F(ab')₂ фрагменты, бивалентный фрагмент, включающий два Fab'-фрагмента, связанных посредством дисульфидного мостика в шарнирной области; (ix) молекулы одноцепочечного антитела (например, одноцепочечный Fv; scFV); (x) «димерные антитела» с двумя антиген-связывающими сайтами, включающие вариабельный домен (VH) тяжелой цепи, соединенный с вариабельным доменом (VL) легкой цепи в одной и той же полипептидной цепи; (xi) «линейные антитела», включающие пару тандемных Fd сегментов, (VH-CH1-VH-CH1), которые вместе с комплементарными полипептидами легкой цепи формируют пару антиген-связывающих областей.

Как использовано в данном описании, «кристалл» относится к такой твердой форме вещества, при которой атомы расположены в паттерне, который повторяется периодически в трехмерном пространстве, обычно, образуя решетку.

Как использовано в данном описании, «гель» относится к концентрированной форме антитела или антительного фрагмента, который представляет собой вязкоупругий раствор, который является более твердым, чем жидкий коллоидный раствор. Необязательно, гели могут включать кристаллы. Гели, которые сформированы с использованием способов по изобретению, обычно содержат высокую концентрацию антитела или его фрагментов и могут необязательно включать кристаллы.

«Осадитель», как использовано в данном описании, относится к агенту, который делает соединение или молекулу нерастворимой. В некоторых случаях соединение или молекула формирует кристалл. Осадители также могут быть использованы для формирования кристаллов солей или молекул, являются, обычно, солями, полимерами или органическими молекулами. Органические осадители включают изопропанол, этанол, гександиол и 2-метил-2,4-пентандиол (MPD). Полимерные осадители включают полиэтиленгликоль и полиамины, такие как Jeffamine®. Применяемые соли включают сульфат аммония, цитрат натрия, ацетат натрия, хлорид аммония, хлорид натрия и формиат магния, обычно в концентрации 0,2 М или более.

«Расстройство» или «состояние» представляет собой любое состояние, на которое оказывает благоприятное воздействие лечение антителом. Оно включает хронические и острые расстройства или заболевания, включающие те патологические состояния, которые предрасполагают млекопитающее к расстройству, о котором идет речь. Неограничивающие примеры расстройств, для которых лечение по настоящему изобретению может быть эффективно, включают злокачественные и доброкачественные опухоли, нелейкозные и лимфоидные злокачественные опухоли; нейрональные, глиальные, астроцитарные, гипоталомические и другие гландулярные, макрофагальные, эпителиальные, стромальные расстройства и опухоли брюшной полости; и воспалительные, ангиогенные и иммунологические расстройства.

Как использовано в данном описании, «лечение» относится к клиническому вмешательству с целью изменить естественное течение болезни индивидуума или клетки, на которую направлено лечение. Желательные эффекты лечения включают облегчение симптомов, ослабление любых прямых или опосредованных патологических последствий заболевания, предотвращение метастазов, уменьшение скорости прогрессирования заболевания, уменьшение интенсивности или временное облегчение состояния заболевания и ремиссию или улучшенный прогноз.

Способы осуществления изобретения

Антитело и фрагменты антитела стали очень эффективны, особенно терапевтически. В настоящее время многие антитела исследуют для терапевтического применения. Терапевтическое применение часто требует крупномасштабной продукции антител или фрагментов антител. Один из аспектов изобретения включает способ концентрирования, очистки и хранения антител или их фрагментов, особенно продуцируемых в крупном масштабе. Способами по изобретению получают кристаллы, гели и гели с кристаллами. Кристаллы и/или гели антител или их фрагментов применяют, например, для характеристики 3-мерной структуры посредством дифракции рентгеновских лучей, для хранения, для концентрирования, для очистки и для доставки антитела или фрагмента антитела.

Многие белки вследствие своих размеров и своих трехмерных конфигураций с трудом могут быть кристаллизованы. Обычно несколько комбинаций осадителей, буферов и pH должны быть скринированы для того, чтобы идентифицировать комбинацию режима, который будет обеспечивать кристаллизацию. Антитела и фрагменты антител были особенно трудны для кристаллизации вследствие их размера и того факта, что шарнирная область делает молекулу более гибкой и менее жесткой. Кроме того, антитела или их фрагменты могут быть гликозилированы в зависимости от источника антитела.

В некоторых вариантах осуществления способ включает контактирование антитела или его фрагмента с раствором, включающим раствор, состоящий в основном из или состоящий из соли двухвалентного катиона. В некоторых вариантах осуществления двухвалентная катионная соль присутствует в низкой концентрации, например примерно 1-500 мМ. Раствор также может включать раствор, состоящий в основном из или состоящий из буфера, такого как ацетат натрия. В некоторых вариантах осуществления буфер имеет низкую ионную силу, например, примерно 1-100 мМ. Примеры двухвалентных катионов включают, но не ограничиваются ими, цинк, магний и кальций. При этом не подразумевая ограничение изобретения любым путем, соль двухвалентного катиона действует как осадитель и приводит к формированию белкового кристалла. В некоторых случаях раствор не содержит других осадителей, таких как органические или полимерные осадители.

В некоторых вариантах осуществления способ включает контактирование антитела или его фрагмента с раствором, включающим раствор, состоящий в основном из или состоящий из соли цинка. В некоторых вариантах осуществления соль цинка присутствует в низкой концентрации, например примерно 1-120 мМ, предпочтительно 10-80 мМ и более предпочтительно 25-60 мМ. В некоторых вариантах осуществления солью цинка является ZnCl₂. Раствор может включать раствор, состоящий в основном из или состоящий из буфера, такого как ацетат натрия. В некоторых вариантах осуществления буфер имеет низкую ионную силу, например, примерно 1-100 мМ, предпочтительно 1-20 мМ и более предпочтительно 25 мМ-75 мМ. В некоторых вариантах осуществления раствор включает примерно 100 мМ ZnCl₂ и примерно 10 мМ NaOAc. В некоторых случаях раствор не включает другие осадители, такие как органические или полимерные осадители. Способы обеспечивают образование кристаллов и/или белковых гелей. Необязательно, белковые гели могут включать кристаллы.

В некоторых вариантах осуществления раствор включает более чем примерно 10 мМ ZnCl₂ и более чем примерно 5 мМ NaOAc. В других вариантах осуществления раствор включает 100 мМ ZnCl₂ и 10 мМ NaOAc.

В некоторых вариантах осуществления способ включает контактирование антитела или его фрагмента с раствором, состоящим в основном из или состоящим из соли магния. В некоторых вариантах осуществления хлорид магния (MgCl₂) используют в низкой концентрации, например примерно 1-500 мМ, более предпочтительно примерно 200-500 мМ и наиболее предпочтительно примерно 1-100 мМ. Раствор может включать раствор, состоящий в основном из или состоящий из буфера, такого как ацетат натрия или трис. В некоторых вариантах осуществления буфер имеет низкую ионную силу, например, примерно 1-100 мМ. В некоторых случаях раствор не включает другие осадители, такие как органические или полимерные осадители. В некоторых случаях pH раствора является высоким, например от примерно 7,5 до примерно 9. Способы обеспечивают образование кристаллов и/или белковых гелей. Необязательно, белковые гели могут включать кристаллы.

В некоторых вариантах осуществления способ включает контактирование антитела или его фрагмента с раствором, состоящим в основном из или состоящим из соли цинка для формирования белкового геля. Необязательно белковые гели могут включать кристаллы. В некоторых вариантах осуществления соль цинка находится в низкой концентрации, например примерно 1-120 мМ. Раствор может включать раствор, состоящий в основном из буфера, такого как ацетат натрия, или состоящий из буфера, такого как ацетат натрия. В некоторых вариантах осуществления буфер имеет низкую ионную силу, например примерно 1-100 мМ. В некоторых случаях раствор не включает другие осадители, такие как органические или полимерные осадители.

Способы по изобретению обеспечивают малозатратный путь кристаллизации, концентрирования или очистки антитела или фрагментов антител. В некоторых случаях способы по изобретению предоставляют способы, которые не включают применение других осадителей, таких как полимеры или органические осадители, которые могут быть нежелательными в продукте. Кристаллы и/или белковые гели антитела или фрагментов антител могут быть смешаны с носителями или другими ингредиентами для хранения и/или введения.

Антитела или их фрагменты

Антитела или фрагменты антител применяют в способах по изобретению. Антитела включают, без ограничения, поликлональные, моноклональные антитела, аффинно зрелые антитела, антитела с полиэпитопной специфичностью, гуманизированные антитела, антитела человека, химерные антитела и мультиспецифичные антитела.

В некоторых случаях антитела получают как полноразмерные антитела. Полноразмерные антитела обычно включают 2 тяжелых и 2 легких цепи. Существует 5 главных классов иммуноглобулинов и они включают IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. Некоторые из них могут быть далее подразделены на подклассы, такие как IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM1, IgM2, IgA1 или IgA2. Антитела одного или нескольких этих классов могут быть использованы в способах по изобретению. В некоторых вариантах осуществления антителом является антитело IgG.

Фрагменты антител также могут быть использованы в способах по изобретению. Фрагменты антител включают антиген-связывающие фрагменты и включают Fab, Fab', Fab₂, Fab'₂, Fd, одноцепочечный Fv, scFv₂, dAb, бесшарнирные антитела, димерные антитела и линейные антитела.

В зависимости от источника антитела или его фрагмента антитела могут быть гликозилированы. Обычно рекомбинантные антитела, полученные из или продуцированные в клетках млекопитающих или насекомых, являются гликозилированными. Антитела или их фрагменты, полученные из или продуцированные в прокариотических клетках, не гликозилированы или являются агликозилированными. Гликозилирование антител также может быть модифицировано или элиминировано путем мутации последовательностей сайта гликозилирования.

Антитела или фрагменты антител являются специфичными для антигена. Антитела, применяемые в способах по изобретению, включают антитела к антигенам, включающим молекулы, такие как ренин; гормон роста, включая человеческий гормон роста и гормон роста крупного рогатого скота; фактор высвобождения гормона роста; паратиреоидный гормон; тиреоид-стимулирующий гормон; липопротеины; альфа-1-антитрипсин; A-цепь инсулина; B-цепь инсулина; проинсулин; фолликулостимулирующий гормон; кальцитонин; лютеинизирующий гормон; глюкагон; факторы коагуляции, такие как фактор VIIIC, фактор IX, тканевой фактор (TP) и фактор Виллебранда; анти-коагулирующие факторы, такие как Белок C; предсердный натрийуретический фактор; легочный сурфактант; активатор плазминогена, такой как активатор плазминогена урокиназного типа или человеческий мочевого типа, или тканевого типа (t-PA); бромбезин; тромбин; гемопоэтический фактор роста; фактор некроза опухолей-альфа и -бета; энкефалиназа; RANTES (регулируемый активацией в норме экспрессируемых и секретируемых T-клеток); макрофагальный воспалительный белок человека (MIP-1-альфа); сывороточный альбумин, такой как сывороточный альбумин человека; фактор регрессии мюллеровых протоков; A-цепь релаксина; B-цепь релаксина; прорелаксин; мышиный гонадотропин-ассоциированный пептид; микробный белок, такой как бета-лактамаза; ДНКаза; ассоциированный с цитотоксическими T-лимфоцитами антиген (CTLA), такой как CTLA-4; ингибин; активин; фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF); рецепторы гормонов или факторов роста; белок A или D; ревматоидные факторы; нейротрофный фактор, такой как полученный из кости нейротрофный фактор (BDNE); нейротрофин-3, -4, -5 или -6 (NT-3, NT-4, NT-5 или NT-6) или фактор роста нервов, такой как NGF-β; полученный из тромбоцитов фактор роста (PDGF); фактор роста фибробластов, такой как aFGF и bFGF; фактор роста эпидермиса (EGF); трансформирующий фактор роста (TGF), такой как TGF-альфа и TGF-бета, включая TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 или TGF-β5; инсулин-подобный фактор роста-I и -II (IGF-I и IGF-II); дез(1-3)-IGF-I (мозговой IGF-I), белки, связывающие инсулин-подобный фактор роста; CD белки, такие как CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 и CD40; эритропоэтин; остеоиндуктивные факторы; иммунотоксины; костный морфогенетический белок (BMP); интерферон, такой как интерферон-альфа, -бета и -гамма; колониестимулирующие факторы (CSF), например, M-CSF, GM-CSF и G-CSF; интерлейкины (IL), например, IL-1-IL-10; супероксиддисмутаза; T-клеточные рецепторы; поверхностные мембранные белки; ускоряющий распад фактор; вирусный антиген, такой как, например, часть оболочки AIDS; транспортные белки; хоминг-рецепторы; аддрессины; регуляторные белки; интегрины, такие как CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 и VCAM; опухоль-ассоциированный антиген, такой как рецептор HER2, HER3 или HER4; и фрагменты любых вышеперечисленных полипептидов.

Предпочтительные антигены для антител, касающиеся настоящего изобретения, включают CD белки, такие как CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD40, CD34 и CD46; члены рецепторного семейства ErbB, такие как рецептор EGF, рецептор HER2, HER3 или HER4; молекулы клеточной адгезии, такие как LFA-1, Mac1, p150.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, α4/β7 интегрин и αv/β3 интегрин, включая свои или α-, или β-субъединицы (например, анти-CD11a, анти-CD18 или анти-CD11b антитела); факторы роста, такие как VEGF; тканевой фактор (TF); TGF-β; альфа интерферон (α-IFN); интерлейкин, такой как IL-8; антигены группы крови; рецептор гибели Apo-2; рецептор flk2/flt3; рецептор ожирения (OB); рецептор mpl; CTLA-4; белок C и т.п. Наиболее предпочтительными мишенями в данном описании являются VEGF, TF, CD19, CD20, CD40, TGF-β, CD11a, CD18, рецептор гибели Apo-2 и C24.

В некоторых вариантах осуществления антитела или их фрагменты включают анти-VEGF, анти-Apo-2, анти-IgE, анти-HER2, анти-CD11a или анти-CD20.

Антитела или фрагменты антител могут быть получены из природных источников, синтетически или с помощью рекомбинантных способов. Способы получения антител известны специалистам в данной области и включают получение антитела или фрагментов антител с помощью фагового дисплея. Способы крупномасштабной продукции известны и включают получение антитела или его фрагментов в количестве 10 л или более.

Антитела или фрагменты антител очищают способами, известными специалистам в данной области. В некоторых случаях продуцированное антитело или фрагмент очищают для получения препаратов, которые являются существенно гомогенными для дальнейшего анализа и применения. Стандартные способы белковой очистки, известные в данной области, могут быть применены. Следующие методики иллюстрируют приемлемые методики очистки: фракционирование на иммуноаффинных или ионообменных колонках, этанольное осаждение, высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой (HPLS), хроматография на кремнеземной или на катионообменной смоле, такой как DEAE, хроматофокусирование, SDS-PAGE, осаждение сульфатом аммония и гель-фильтрация с использованием, например, Sephadex G-75. Например, в качестве первой стадии очистки антитело или его фрагмент, полученный из клеточной культуры, наносят на иммобилизованную твердую фазу с Белком A, допуская специфическое связывание антитела с Белком A. Твердую фазу затем промывают для удаления загрязнений, неспецифически связанных с твердой фазой. Наконец антитело выделяют из твердой фазы путем элюирования.

В некоторых вариантах осуществления изобретения концентрация антитела в растворе, применяемая в способах по изобретению, составляет, по меньшей мере, 1 г/л. Концентрация антитела в растворе изменяется от 1 до примерно 100 г/л. В дальнейших вариантах осуществления изобретения концентрация антитела изменяется от 20 до примерно 100 г/л. Еще в другом варианте осуществления изобретения концентрация антитела изменяется от примерно 40 до примерно 90 г/л.

Способы

Способы по изобретению включают способы кристаллизации или концентрирования антитела или фрагмента антитела из раствора. Кристаллы или белковые гели применяют, например, для характеристики структуры, для хранения, для концентрирования, для очистки и для доставки антитела или его фрагмента. В некоторых вариантах осуществления концентрирование антитела представляет собой концентрирование до, по меньшей мере, 1 г/л и более предпочтительно, по меньшей мере, 40-90 г/л. Способы по изобретению предоставляют малозатратный способ получения кристаллов антитела или его фрагментов. В одном из аспектов изобретения способ включает контактирование антитела или его фрагмента с раствором, который включает раствор, состоящий в основном из или состоящий из соли двухвалентного катиона, и инкубацию антитела или его фрагмента с раствором до формирования кристаллов антитела или его фрагмента.

В некоторых вариантах осуществления способ включает контактирование антитела или его фрагмента с раствором, который включает раствор, состоящий в основном из или состоящий из соли цинка в концентрации от примерно 1 до примерно 120 мМ, более предпочтительно от 10 до 80 мМ и наиболее предпочтительно от 25 до 60 мМ соли цинка. Соли цинка включают хлорид цинка, фосфат цинка, цитрат цинка, ацетат цинка или сульфат цинка. В некоторых вариантах осуществления раствор включает раствор, состоящий в основном из или состоящий из примерно 1 до примерно 100 мМ ZnCl₂. В специфических вариантах осуществления раствор включает более чем 10 мМ ZnCl₂ и более чем 5 мМ NaOAc и предпочтительно примерно 100 мМ ZnCl₂ и примерно 10 мМ NaOAc. В некоторых вариантах осуществления способ предлагает белковый гель, который может необязательно включать кристаллы.

В некоторых вариантах осуществления способ включает контактирование анти-VEGF антитела или его фрагмента с раствором, который включает раствор, состоящий в основном из или состоящий из соли магния в концентрации от примерно 1 до примерно 500 мМ, более предпочтительно от примерно 200 до 500 мМ и наиболее предпочтительно от примерно 10 до 100 мМ солей магния. Соли магния представляют собой соли, которые являются растворимыми и могут диассоциировать в растворителе. Соли магния включают хлорид магния, фосфат магния, цитрат магния, ацетат магния и сульфат магния. В некоторых вариантах осуществления раствор включает раствор, состоящий в основном из или состоящий из примерно 1 до примерно 100 мМ хлорида магния. В некоторых вариантах осуществления раствор имеет высокий pH, например pH от примерно 7,5 до примерно 9.

В некоторых вариантах осуществления способ включает контактирование анти-VEGF антитела или его фрагмента с раствором, который включает раствор, состоящий в основном из или состоящий из соли кальция в концентрации от примерно 1 до примерно 500 мМ, более предпочтительно от 1 до 200 мМ и наиболее предпочтительно от 10 до 100 мМ солей кальция. Соли кальция представляют собой соли, которые являются растворимыми и могут диассоциировать в растворителе. Соли кальция включают хлорид кальция, фосфат кальция, цитрат кальция, ацетат кальция и сульфат кальция. В некоторых вариантах осуществления раствор включает раствор, состоящий в основном из или состоящий из примерно 1 до примерно 100 мМ хлорида кальция. В некоторых вариантах осуществления раствор имеет высокий pH, например pH от примерно 7,5 до примерно 9.

В некоторых вариантах осуществления способ предусматривает контактирование антитела или его фрагмента с раствором, содержащим, по существу, состоящим из соли цинка, но без других осадителей. В некоторых случаях может быть желательно минимизировать применение других осадителей, таких как органические молекулы, включая 2-метил-2,4-пентандиол, изо-пропанол или полимерные соединения, включая полиэтиленгликоли или полиамины.

Эти варианты осуществления могут иметь преимущества по сравнению с предшествующими способами кристаллизации в данной области, потому что другие осадители не применяются. Одно возможное преимущество в не использовании любых органических или полимерных осадителей было бы экономическое, то есть при большом масштабе операций, например, стоимость органических осадителей могла бы иметь значение, так способ, в котором их не применяют, был бы более экономически эффективным. Другое возможное преимущество в не использовании любых органических или полимерных осадителей было бы в том, что отсутствовали любые остатки органического осадителя в конечных кристаллах. Это может быть преимуществом вследствие желания применять кристаллизованные антитела в разработанных растворах для введения млекопитающим. Некоторые из органических осадителей, которые применяют, могут быть нежелательными для введения млекопитающим, таким как человек.

Способы по изобретению также включают раствор, содержащий, состоящий в основном из или состоящий из соли двухвалентного катиона и буфера. Буферы, которые могут быть использованы в изобретении, включают любые, обычно применяемые специалистами в данной области. Примеры включают, но не ограничиваются ими, уксусную кислоту, карбонат аммония, фосфат аммония, борную кислоту, лимонную кислоту, HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтан-сульфоновая кислота), бицин, MES, какодилат натрия, имидазол, хлорид аммония, формиат магния, молочную кислоту, фосфорную кислоту, цитрат калия, метафосфат калия, моноосновной фосфат калия, ацетат натрия, цитрат натрия, лактат натрия, двухосновной фосфат натрия, моноосновной фосфат натрия, Tris (трисгидроксиметиламиноэтан). В некоторых вариантах осуществления изобретения ацетат натрия (NaOAc) применяют как буфер.

В некоторых вариантах осуществления концентрация буфера в растворе может изменяться от примерно 1 до примерно 100 мМ. В другом варианте осуществления изобретения концентрация буфера в растворе может изменяться от примерно 5 до примерно 100 мМ, более предпочтительно 1-20 мМ и наиболее предпочтительно 25-75 мМ.

В некоторых вариантах осуществления буфер комбинируют с солью двухвалентного катиона и антителом или его фрагментом в виде твердого вещества. В другом варианте осуществления изобретения буфер смешивают с солью двухвалентного катиона и антителом в виде раствора. В другом варианте осуществления изобретения твердый буфер и твердая двухвалентная соль могут быть добавлены в раствор и затем смешаны с антителом или в растворе, или в твердой форме.

Обычно pH раствора зависит по меньшей мере частично от специфического буфера, который применяют. В одном из вариантов осуществления желательный pH раствора зависит по меньшей мере частично от соли двухвалентного катиона и растворимости соли при различных pH. В некоторых вариантах осуществления pH буфера может изменяться от примерно 4,5 до примерно 9. В вариантах осуществления, когда двухвалентным катионом является Zn, pH раствора находится между примерно 4 и 6. В другом варианте осуществления изобретения, когда двухвалентным катионом является Zn, концентрация ацетата натрия в растворе находится между примерно 1 и 100 мМ, и pH раствора находится между примерно 4,7 и 5,7. В других вариантах осуществления двухвалентным катионом является Mg, буфером является Tris, и pH раствора составляет примерно 7,5-9.

В одном из вариантов осуществления pH раствора, буфера, который применяют, и двухвалентной соли, которую применяют, может зависеть по меньшей мере частично от кристаллизованного антитела. В некоторых вариантах осуществления изобретения между этими факторами может быть взаимодействие, так как антитело может быть стабильным в специфическом диапазоне pH, который может быть предписан, по меньшей мере, частично для применяемого буфера и аналогично может быть предписан, по меньшей мере, частично для двухвалентной соли (вследствие растворимости тканей, например). Специалист в данной области может определить, какая концентрация буфера и концентрация соли двухвалентного катиона определяет кривую растворимости, и идентифицировать вариации концентрации или буфера, двухвалентной соли и pH, которые приводят к фазовым изменениям.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его фрагменты кристаллизуются с по меньшей мере 25 мМ соли цинка и по меньшей мере 50 мМ буфера, такого как ацетат натрия. В других вариантах осуществления комбинация примерно 10-80 мМ соли цинка и примерно 25-75 мМ буфера, такого как ацетат натрия, является предпочтительной.

Способы по изобретению включают контактирование раствора и антитела или его фрагмента. В некоторых вариантах осуществления антитело или его фрагмент контактирует с раствором в способе диффузии паром. В диффузии паром маленький объем (то есть несколько миллилитров) антитела или его фрагмента в растворе смешивают с раствором. Эту смесь суспендируют в ячейке, содержащей небольшое количество раствора. В других вариантах осуществления в способ контактирования вовлечен диализ. Диализ включает полупроницаемую специально калиброванную мембрану, которая удерживает антитело или его фрагмент, но позволяет маленьким молекулам, таким как буферы и осадители, диффундировать в нее и из нее. Осадитель медленно диффундирует через мембрану и снижает растворимость антитела или его фрагмента. Другой вариант осуществления представляет собой способ периодического типа. В периодическом способе раствор добавляют к раствору антитела или его фрагмента.

Способы по изобретению включают инкубацию антитела или его фрагмента с раствором до формирования кристаллов или белкового геля. В некоторых вариантах осуществления раствор может быть осторожно перемешан один или два раза в день в течение инкубации. В других вариантах осуществления раствор может перемешиваться непрерывно. Если имеются большие кристаллы, желательное перемешивание должно быть минимизировано.

Инкубация может быть проведена в диапазоне температур от примерно 0˚C до примерно 27˚C, более предпочтительно от 2 до 25˚C. В некоторых вариантах осуществления температура поддерживается на уровне температуры окружающей среды (например, примерно 25˚C). В других случаях инкубацию проводят от примерно 2 до 8˚C.

Раствор и антитело или его фрагмент инкубируют до формирования кристаллов или белкового геля. Обычно время инкубации составляет от примерно 1 часа до 30 дней, более предпочтительно 1-5 дней.

Кристаллы могут быть сформированы как свободные твердые частицы или в геле. В некоторых вариантах осуществления изобретения кристаллы антител или их фрагментов являются частью геля. В общем, гель, сформированный в способах по изобретению, имеет высокую концентрацию антитела или фрагментов антител. В одном варианте осуществления гель, который сформировался с использованием способа по изобретению, имеет концентрацию от примерно 200 до примерно 250 мг антитела/мл.

Композиции или составы

Способы по изобретению включают образование кристаллов или белковых гелей антител или их фрагментов. Кристаллы имеют регулярную трехмерную структуру, обычно называемую решеткой. Она находится в контрасте с аморфным твердым веществом, которое является некристаллическим твердым веществом, которое не имеет регулярной молекулярной решетки и имеет гетерогенную или немолекулярную структуру. Гель представляет собой концентрированный белковый раствор, который может быть мягким и вязким или твердым и хрупким.

Кристаллы, образуемые в способах, описанных в данном описании, могут иметь различные формы, включая иглы, конусоподобные формы, сферические и подобные цветку. Размер кристаллов может быть порядка от мм до мкм размера. В некоторых вариантах осуществления кристаллы имеют по меньшей мере примерно 10 мкм в размере, так что они видимы невооруженным глазом. Для терапевтического введения размер кристаллов будет изменяться в зависимости от способа введения, например, для подкожного введения размер кристаллов может быть больше, чем для внутривенного введения.

В некоторых случаях может быть желательно убедиться в том, что кристаллы представляют собой кристаллы антитела или его фрагмента. Кристаллы фрагментов антител могут быть проанализированы микроскопически при двойном лучепреломлении света. Кристаллы пропускают через себя свет с двойным лучепреломлением в отличие от некристаллических материалов, которые не делают этого. Еще в одном способе кристаллы могут быть выделены, промыты, ресолюбилизированы и пропущены через SDS PAGE гель и, необязательно, окрашены анти-Fc рецепторным антителом. Необязательно ресолюбилизированное антитело или его фрагмент также может быть тестировано на связывание со своим специфическим антигеном с использованием стандартных анализов. Ресолюбилизированное антитело или его фрагмент также может быть проанализировано посредством масс-спектрометрии.

В некоторых случаях кристаллы могут быть перекрестно связаны друг с другом. Такое перекрестное связывание может усилить стабильность кристалла. Способы перекрестного связывания кристаллов известны специалистам в данной области и были описаны, например, в патенте США № 5849296. Кристаллы могут перекрестно связаны посредством бифункционального реагента, такого как глутаральдегид. Перекрестно связанные кристаллы могут быть лиофилизированы и храниться для применения, например, для диагностического или терапевтического применения.

В некоторых случаях может быть желательно высушить кристаллы или белковые гели. Кристаллы или белковые гели могут быть высушены N₂ и/или инертными газами, сушкой в вакуумной печи, лиофилизацией, выпариванием, сушкой в поддоне, сушкой в псевдоожиженном слое, распылительной сушкой, вакуумной сушкой или роликовой сушкой.

Кристаллы могут поддерживаться в растворе или они могут быть промыты и соединены с другими носителями и/или ингредиентами для формирования композиций и/или составов кристаллов. Композиции и составы могут быть использованы, например, для терапевтического или диагностического применения.

Другой аспект изобретения включает композиции и/или состав кристаллов или белковых гелей антитела или его фрагмента. Композиция включает кристалл или белковый гель антитела или его фрагмента и носитель. Состав включает кристалл или белковый гель антитела или его фрагмента и по меньшей мере один ингредиент. В некоторых вариантах осуществления антитело выбрано из группы, состоящей из: анти-VEGF, анти-Apo-2, анти-CD20, анти-CD11a, анти-HER2, анти-IgE и их фрагментов.

Составы или композиции кристалла или белкового геля антитела или антиген-связывающего фрагмента получены для хранения путем смешивания антитела, имеющего желательную степень чистоты, с физиологически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences 16^th edition, Osol, A. Ed. (1980)) в форме водных растворов, лиофилизированных или других высушенных составов. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях и включают буферы, такой как фосфат, цитрат, гистидин и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалькония; хлорид бензетония; фенол, бутил или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); низкомолекулярные (менее чем примерно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; и/или неионные сурфактанты, такие как TWEEN^TM, PLURONICS^TM или полиэтиленгликоль (PEG).

В некоторых вариантах осуществления кристаллы или белковые гели могут быть соединены с полимерным носителем для обеспечения стабильности и непрерывного высвобождения. Такие полимеры включают биосовместимые и биорасщепляемые полимеры. Полимерный носитель может быть отдельного полимерного типа или может быть составлен из смеси полимерных типов. Неограничивающие примеры полимерных носителей включают, например, поли(акриловую кислоту), поли(цианоакрилаты), поли(аминокислоты), поли(ангидриды), поли(депсипептиды), сложные полиэфиры, такие как поли(молочная кислота) или PLA, поли(молочная-ко-гликолевая кислота) или PLGA, поли(β-гидроксибутират), поли(капролактон) и поли(диоксанон); поли(этиленгликоль), поли(гидроксипропил)метакриламид, поли[(органо)фосфазен], сложные полиортоэфиры, поли(виниловый спирт), поли(винилпирролидон), сополимеры малеинового ангидрида и простого алкилвинилового эфира, плурониевые полиолы, альбумин, природные и синтетические полипептиды, альгинат, целлюлозу и целлюлозные производные, коллаген, фибрин, желатин, гиалуроновую кислоту, олигосахариды, глюкаминогликаны, сульфатированные полисахариды, модифицированные крахмалы, такие как амилоза крахмала, амилопектин крахмала, гидроксиэтил крахмала, метакрилат крахмала и другие крахмалы, и любой стандартный материал, который будет инкапсулировать белковые кристаллы.

Составы кристаллов антител или их фрагментов включают по меньшей мере один ингредиент или эксципиент. Ингредиент или эксципиенты известны специалистам в данной области и включают: подкисляющие агенты, аэрозольные газы-вытеснители, алкогольные денатурирующие средства, подщелачивающие агенты, предотвращающие слеживание агенты, противовспенивающие агенты, микробные консерванты, антиоксиданты, забуферивающие агенты, смазывающие вещества, красители, дессиканты, эмульгирующие агенты, ускорители фильтрования, ароматизаторы и отдушки, увлажнители, мази, пластификаторы, растворители (например, масла или органические), сорбенты, углероддиоксидные сорбенты, загущающие агенты, суппозиторные основы, суспендирующие или увеличивающие вязкость агенты, подслащивающие агенты, таблеточные связующие вещества, разбавители таблеток или капсул, таблеточные дезинтеграторы, таблеточные или капсульные смазывающие вещества, тонизирующий агент, ароматизирующие или подслащивающие переносчики, маслянистые переносчики, переносчики твердого носителя, водоотталкивающий агент и смачивающие или растворяющие агенты.

В некоторых вариантах осуществления ингредиент усиливает стабильность хранения. В других вариантах осуществления ингредиент или эксципиент предпочтительно выбирают из группы, состоящей из: альбумина, сахарозы, трегалозы, лактитола, желатина и гидроксипропил-β-циклодекстрина.

Композиции и составы, описанные в данном описании, также включают эффективное количество кристаллического антитела или его фрагмента. Дозы могут быть легко определены с использованием стандартной методологии. Антитело приемлемо вводить пациенту один раз или сериями в течение курсов лечения.

В зависимости от типа и тяжести заболевания, примерно 1 мкг/кг до примерно 50 мг/кг (например, 0,1-20 мг/кг) антитела является начальной вероятной дозировкой для введения пациенту, или, например, путем одного или нескольких отдельных введений или путем непрерывной инфузии. Обычная ежедневная или недельная дозировка может изменяться от примерно 1 мкг/кг до примерно 20 мг/кг или более в зависимости от состояния, лечение повторяют до желаемого подавления наблюдаемых симптомов заболевания. Однако могут быть использованы другие схемы приема лекарственного средства.

В некоторых случаях композиции или составы включают концентрацию антитела или его фрагмента по меньшей мере примерно 1 г/л или более, если оно ресолюбилизировано. В других вариантах осуществления концентрация антитела составляет по меньшей мере от примерно 1 г/л до примерно 100 г/л, если оно ресолюбилизировано.

Кристаллы и/или белковые гели антитела или фрагменты антитела или составы, или композиции, включающие такие кристаллы или белковые гели, могут быть введены отдельно как часть фармацевтического препарата, средства ухода за собой, ветеринарного препарата или как часть профилактического препарата с или без адъюванта. Они могут быть введены путем парентерального, перорального или топического способов применения. Например, они могут быть введены путем перорального, легочного, носового, ушного, анального, дермального, глазного, внутривенного, внутримышечного, внутриартериального, внутрибюшинного, мукозального, подъязычного, подкожного, трансдермального, топического или внутричерепного способов применения или в щечную полость. При применении фармацевтического препарата, средства ухода за собой или ветеринарных аппликаций кристаллы антитела или его фрагментов или кристаллические составы или композиции могут быть топически введены в любую эпителиальную поверхность. Такие эпителиальные поверхности включают оральную, глазную, ушную, анальную и носовую поверхности, которые могут быть пролечены, защищены, восстановлены или детоксифицированы путем аппликации кристаллов антитела или его фрагмента или их кристаллических составов или композиций.

Другой аспект изобретения включает изделия. Изделия включают композицию или состав, включающий кристалл или белковый гель антитела или его фрагмента, и контейнер. Антитела или их фрагменты представляют собой предпочтительно анти-VEGF, анти-CD20, анти-Apo-2, анти-CD11a, анти-HER2, анти-IgE или их фрагменты. Необязательно изделие может включать инструкции по введению человеку для терапевтического применения.

Изделия могут также включать композицию или состав кристалла или белкового геля антитела или его фрагментов и ряд диагностических реагентов для детекции связывания антитела или его фрагмента со специфическим антигеном. Агенты для детекции связывания антитела со своим специфическим антигеном включают антитела к антигену, которые мечены детектируемым агентом. Детектируемый агент может включать флуоресцентную часть, радиоактивную часть и ферментативную часть. В некоторых вариантах осуществления изделие включает композицию или состав кристалла или белкового геля антитела или его фрагмента и контейнер. Изделие может далее включать инструкции по применению композиции или состава для человека. В других вариантах осуществления изделие далее включает агент для детекции связывания антитела или его фрагмента со своим специфическим антигеном.

Применение композиций или составов

Композиции или составы по изобретению, включающие кристаллы или белковый гель антитела или его фрагментов, могут быть использованы для любой цели, для которой применяются стандартные антительные препараты. Например, композиции или составы могут быть использованы, например, для очистки, концентрирования, визуализации, диагностического и/или терапевтического применения. В некоторых вариантах осуществления белковые гели или кристаллы, которые присутствуют в гелях, могут быть использованы для топического введения в качестве раствора, в котором далее происходит кристаллизация или очистка, или в качестве раствора для хранения кристаллов.

В некоторых вариантах осуществления композиции или составы включают кристалл, кристаллический или белковый гель анти-VEGF антитела или его фрагмента. Эти композиции или составы применяют в диагностических способах и способах лечения VEGF-ассоциированных расстройств или состояний. VEGF-ассоциированные расстройства или состояния и диагностические анализы были описаны, например, в WO 98/45331. Анти-VEGF антитела применяют для лечения различных неопластических и не-неопластических заболеваний и расстройств. Неоплазмы и родственные состояния, которые поддаются лечению, включают карциномы молочной железы, карциномы легкого, карциномы желудка, карциномы пищевода, карциномы ободочной и прямой кишки, карциномы печени, карциномы яичника, текомы, арренобластомы, карциномы шейки матки, эндометриальную карциному, эндометриальную гиперплазию, эндометриоз, фибросаркомы, хориокарциному, карциному головы и шеи, носоглоточную карциному, карциномы гортани, гепатобластому, саркому Капоши, меланому, карциномы кожи, гемангиому, кавернозную гемангиому, гемангиобластому, карциномы поджелудочной железы, ретинобластому, астроцитому, глиобластому, шванному, олигодендроглиому, медуллобластому, нейробластомы, рабдомиосаркому, остеогенную саркому, лейомиосаркомы, карциномы мочевого тракта, тиреоидные карциномы, опухоль Вильмса, почечноклеточную карциному, карциному предстательной железы, аномальную сосудистую пролиферацию, ассоциированную с факоматозом, отек (такой как отек, ассоциированный с опухолями мозга) и синдром Мейгса.

Не-неопластические состояния, для которых лечение может быть эффективно, включают ревматоидный артрит, псориаз, атеросклероз, диабет и другие пролиферативные ретинопатии, включая преждевременную ретинопатию, ретролентальную фиброплазию, неоваскулярную глаукому, ассоциированную со старением дегенерацию желтого пятна, тиреоидные гиперплазии (включая болезнь Грейвса), роговичную и другую тканевую трансплантацию, хроническое воспаление, воспаление легких, нефритный синдром, преэклампсию, асциты, выпот в полость перикарда (такой как ассоциированный с перикардитом) и экссудативный плеврит.

Связанная с агентом дегенерация желтого пятна (AMD) вызывает тяжелую утрату зрения в популяции преклонного возраста. Экссудативная форма AMD характеризуется хориоидальной неоваскуляризацией и отслойкой эпителиальных клеток пигмента сетчатки. Так как хориоидальная неоваскуляризация ассоциирована с драматическим ухудшением прогноза, предполагается, что VEGF антитела по настоящему изобретению будут особенно полезны для снижения тяжести AMD.

В некоторых вариантах осуществления композиции или составы по изобретению включают кристалл, кристаллический или белковый гель анти-CD11a. Эти композиции или составы применяют в диагностических способах и способах лечения CD11a-ассоциированных расстройств или состояний. CD11a-ассоциированные расстройства или состояния и диагностические анализы описаны в патенте США № 6037454, который включен в данное описание посредством ссылки.

Анти-CD11a (α-субъединица LFA-1) антитело может быть использовано для лечения различных, LFA-1-опосредованных расстройств. Ассоциированный с функций лимфоцитов антиген 1 (LFA-1; CD11a/CD18) вовлечен в адгезию лейкоцитов во время клеточных взаимодействий, существенных для иммунологических ответов и воспаления. Термин «LFA-1-опосредованное расстройство» относится к патологическому состоянию, вызванному взаимодействиями клеточного сцепления с участием рецептора LFA-1 на лимфоцитах. Примеры таких расстройств включают T-клеточные воспалительные ответы, такие как воспалительные кожные заболевания, включая псориаз; ответы, ассоциированные с воспалительным заболеванием кишки (такие как болезнь Крона и неспецифический язвенный колит); респираторный дистресс-синдром взрослых; дерматиты; менингиты; энцефалиты; увеиты; аллергические состояния, такие как экзема и астма; состояния, вовлекающие инфильтрацию T-клеток и хронические воспалительные ответы; кожные гиперчувствительные реакции (включая отравление плющом обыкновенным и отравление дубом); атеросклероз; недостаточность лейкоцитарной адгезии; аутоиммунные заболевания, такие как ревматоидный артрит, системная красная волчанка (SLE), сахарный диабет; множественный склероз; синдром Рейно; аутоиммунный тиреоидит, экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит, синдром Шегрена, ювенильные диабеты с ранним началом и иммунные ответы, ассоциированные с аллергической реакцией замедленного типа, опосредованной цитокинами и T-лимфоцитами, обычно выявляемые при туберкулезе, саркоидозе, полимиозите, грануломатозе и васкулите; пернициозная анемия; хроническое обструктивное заболевание легких (COPD); бронхит; инсулинит; ринит; крапивница; гломерулонефрит; заболевание с вовлечением лейкоцитарного диапедеза; воспалительное расстройство центральной нервной системы (CNS); синдром множественного повреждения органов, вторичный по отношению к септицемии или травме; аутоиммунная гемолитическая анемия; тяжелая миастения; опосредованные комплексом антиген-антитело заболевания; нефротический синдром; злокачественные опухоли (например, B-клеточные злокачественные опухоли, такие как хронический лимфоидный лейкоз или лейкозный ретикулоэндотелиоз); все типы трансплантации, включая заболевание трансплантат против хозяина или хозяин против трансплантата; HIV и риновирусная инфекция; фиброз легких; инвазия опухолевых клеток во вторичные органы и т.п.

В некоторых вариантах осуществления композиции или составы по изобретению включают кристалл, кристаллический или белковый гель анти-HER2. Эти композиции или составы применяют в диагностических способах и способах лечения HER2-ассоциированных расстройств или состояний. HER2-ассоциированные расстройства или состояния и диагностические анализы описаны в патенте США № 6387371, который включен в данное описание посредством ссылки.

Введение пациенту терапевтически эффективного количества анти-HER2 рецепторных антител ингибирует рост опухолевых клеток путем ингибирования функции рецептора HER2. Трастузумаб (Genentech, Inc.) представляет собой рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело, направленное на внеклеточный домен HER2 для лечения рака с избыточно экспрессированным HER2/амплифицированным геном HER2, особенно метастазирующего рака молочной железы (MBC). Ген HER2 также может быть амплифицирован в аденокарциноме слюнных желез, почечной аденокарциноме, карциноме молочной железы и клеточной линии рака желудка. Антитело также может быть введено пациенту в комбинации с другими лекарственными средствами, например паклитакселем или Tarceva®.

В некоторых вариантах осуществления композиции или составы по изобретению включают кристалл, кристаллический или белковый гель анти-CD20. Эти композиции или составы применяют в диагностических способах и способах лечения CD20-ассоциированных расстройств или состояний. CD20-ассоциированные расстройства или состояния и диагностические анализы описаны в патентах США № 6171586 и 5736137, которые включены в данное описание посредством ссылки. CD20 (также известный как Bp35) представляет собой желательный антиген для адресного заболевания, связанного с B-клеточными неоплазмами, вследствие его экспрессии на очень высоком уровне. CD20 представляет собой B-клеточный маркер человека, который экспрессируется в течение раннего развития пре-B-клеток и сохраняется до дифференцировки клеток плазмы. Молекула CD20 может регулировать стадию в активационном процессе, которая требуется для инициации клеточного цикла и дифференцировки. Таким образом, поверхностный антиген CD20 может быть нацелен на лечение B-клеточной лимфомы.

C2B8 представляет собой специфическое, иммунологически активное химерное анти-CD20 антитело. Терапевтическое вмешательство C2B8 антителом удаляет или истощает B-клетки периферической крови и лимфатической ткани в качестве средства удаления B-клеточных лимфом, так как системы млекопитающих легко и эффективно восстанавливают B-клетки периферической крови. Когда иммунная система имеет недостаточно B-клеток периферической крови, потребность в «экстраординарных» предупредительных мерах (то есть изоляция пациента и т.п.) отсутствует, так как основной иммунный ответ приматов является T-клеточно опосредованным. C2B8 также может быть мечено радиоактивными метками для разрушения адресных опухолевых клеток.

В некоторых вариантах осуществления композиции или составы по изобретению включают кристалл, кристаллический или белковый гель анти-Apo-2 антитела. Эти композиции или составы применяют для лечения расстройств, таких как рак. Терапевтическое применение анти-Apo-2 антитела описано в патенте США № 6252050, которое включено в данное описание посредством ссылки. Таким образом, изобретение предлагает способы лечения рака с использованием антител, таких как перекрестно реактивные Apo-2L рецепторные антитела. Агонистические Apo-2 антитела, например, могут быть применены для активации или стимуляции апоптоза в раковых клетках. Это, конечно, предполагает, что способы по изобретению могут быть применены в комбинации еще с другими терапевтическими методиками, такими как хирургия.

В некоторых вариантах осуществления композиции или составы по изобретению включают кристалл, кристаллический или белковый гель анти-IgE антитела. (Эти композиции или составы применяют для лечения IgE-опосредованных расстройств, например аллергических расстройств и воспаления.) Терапевтическое применение анти-IgE антитела описано в патентах США № 6329509 и 5994511, которые включены в данное описание посредством ссылки.

Антитела или меченые антитела могут быть использованы в ряде методик иммуновизуализации или иммуноанализа для обнаружения рака у пациента или мониторинга статуса данного рака у пациента, уже ранее диагностированного на наличие рака. При применении для мониторинга статуса рака должна быть использована методика количественного иммуноанализа. Если такой анализ посредством мониторинга выполнять периодически и сравнивать результаты, можно установить, увеличивается или уменьшается опухолевая нагрузка у пациента. Обычные аналитические методики, которые могут быть использованы, включают прямой и косвенный анализы. Если образец включает раковые клетки, меченое антитело будет связываться с этими клетками. После промывки тканей или клеток для удаления несвязанного меченого антитела с образца ткани снимают показания о присутствии меченых иммунных комплексов. В косвенном анализе ткани или клетки образца инкубируют с немеченым моноклональным антителом. Образец затем обрабатывают меченым антителом против моноклонального антитела (например, меченым антимышиным антителом), промывают и снимают показания о присутствии трехкомпонентных комплексов.

Хотя вышеприведенное относится к специфическим вариантам осуществления, необходимо понимать, что настоящее изобретение ими не ограничено. Специалист в данной области сможет сделать различные модификации раскрытых вариантов осуществления без изменения общей идеи изобретения. Все такие модификации входят в объем изобретения. Все ссылки, цитированные в данном описании, приведены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.

Пример 1

Растворимость анти-VEGF антитела в различных концентрациях хлорида цинка и ацетата натрия

Кристаллизация полноразмерных и/или гликозилированных антител может быть затруднена. Размер, форма и присутствие сахарных частей приводит к затруднению получения кристаллов антитела. Много разных комбинаций органических и неорганических осадителей, буферов и корастворенных веществ может потребоваться для исследования с целью нахождения условий, приемлемых для кристаллизации антител. Растворимость полноразмерного гликозилированного антитела VEGF в растворах различных концентраций ZnCl₂ и NaOAc исследовали для определения возможности формирования антительных белковых кристаллов в этих условиях.

Материалы и способы

Получение и очистка анти-VEGF антитела

Анти-VEGF антитело (бевасизумаб) может быть получено, в общем, как описано в WO 98/45331 и у Presta с сотр., Can. Res., 57:4593-4599, описание которых включено в данное описание в качестве ссылки. Способ также, в целом, описан ниже.

Антитело мыши, специфичное для VEGF, обозначенное A4.6.1 (Kunkel с сотр., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488-492), клонировали и секвенировали. Синтетическую консенсусную последовательность вариабельных доменов легкой и тяжелой цепи человека применяли для создания компьютерной графической модели, в которой CDR мыши могут быть импортированы с использованием программы Insight^TM (Accelrys, Inc. San Diego CA). Компьютерные модели V_H и V_L областей антитела A4.5.1 мыши были также созданы для подтверждения CDR.

Плазмиды, кодирующие все F(ab) гуманизированные варианты A4.6.1, сконструировали из плазмидной матрицы F(ab)-1. Плазмида pEMX1 (Kunkel с сотр., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488-492) содержит фрагмент ДНК, кодирующий консенсусную V_LP подгруппу I и V_H подгруппу III человека. Гуманизированное анти-VEGF сконструировали путем сайт-направленного мутагенеза pEMX1 (Kunkel с сотр., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488-492). Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих анти-VEGF антитела, предлагаются в WO 98/45331.

Один пример способа получения анти-VEGF описан в данном описании. Для экспрессии стабильно гуманизированного IgG1 варианта (rhuMAb VEGF) клетки яичников китайского хомячка (CHO) трансфицировали двуцистронными векторами, сконструированными для коэкспрессии как тяжелой, так и легкой цепей (Lucas с сотр., 1996 Nucleic Acids Res., 24:1774-1779). Плазмиды ввели в клетки DP12, запатентованное производное клеточной линии CHO-K1 DUX B11, разработанной L. Chasin (Колумбийский университет, NY) посредством липофектина, и отобрали по росту в не содержащей глицин/гипоксантин/тимидин (GHT) среде (Chisolm с сотр., 1996 DNA Cloning 4. Mammalian systems, pp. 1-41, Oxford: Oxford University Press).

Двадцать неамплифицированных клонов были случайным образом отобраны и повторно высеяны в 96-луночный планшет. Осуществляли мониторинг относительной специфической продуктивности каждой колонии с использованием иммуноферментного твердофазного анализа (ELISA) для количественного определения полноразмерного IgG человека, аккумулированного в каждой ячейке через три дня. Флуоресцентный краситель Кальцеин AM использовали в качестве суррогатного маркера числа жизнеспособных клеток в ячейке. На основании этих данных несколько неамплифицированных клонов были выбраны для дальнейшей амплификации в присутствии увеличивающихся концентраций метотрексата. Индивидуальные клоны, выжившие при 10, 50 и 100 нМ метотрексата, были отобраны и перенесены в планшеты на 96 ячеек для продуктивного скрининга.

Один клон, который воспроизводимо проявлял высокую специфическую продуктивность, был выращен в T-образных флаконах и использован для инокуляции культуры при постоянном перемешивании (спин-культуры). После нескольких пассажей адаптированные к суспензии клетки использовали для инокуляции продуктивных культур в GHT-содержащую бессывороточную среду с добавлением различных гормонов и белковых гидролизатов. Собранную клеточную культуральную жидкость, содержащую rhuMAb (рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело) VEGF, очищали с использованием белка A-Sepharose® CL-4B. Чистота после данной стадии составила ~99%. Последующую очистку до гомогенности выполняли с использованием стадии ионообменной хроматографии с использованием Q Sepharose®, за которой следовала CM Sepharose®. Содержание эндотоксина в конечном очищенном антителе было <0,10 eu/мг. Очищенное антитело концентрировали и далее очищали с использованием ультрафильтрации и диафильтрации. Альтернативные способы очистки и/или концентрирования включают тангенциальную фильтрацию потока.

Условия кристаллизации

Анти-VEGF, полученное, как описано выше, диализировали в Milli-Q® воде и концентрировали до 84,4 г/л. pH 1М NaOAc исходного раствора устанавливали до pH 5,7 6н HCl. Буферы готовили по следующей схеме последовательного разведения и pH устанавливали до pH 5,7 1н NaOH. Концентрации ZnCl₂ варьировали от 5 до 100 мМ и концентрация NaOAc варьировала от 10 до 100 мМ.

В диализном способе кристаллизации использовали полупроницаемую специально калиброванную мембрану, которая удерживает белки, но позволяет маленьким молекулам (то есть буферам и осадителям) диффундировать свободно через мембрану. Диализный способ включал применение одного (1) мл анти-VEGF исходного раствора, инъецированного в Slide-a-Lyzer® диализную кассету (Pierce, Rockford, II), и диализ каждого исходного раствора в течение ночи при 5˚C. Диализные буферы меняли целых три раза за трехдневный период. Диализные устройства непрерывно перемешивали каждый исходный раствор и полученный материал выделяли через три дня. Материал выделяли путем осторожного срезания мембраны диализной кассеты и переноса гелевого раствора в пробирку с использованием стерильного шпателя. Кривые растворимости получили путем измерения белковой концентрации материала, выделенного из диализной кассеты. График концентрации белка построили в зависимости от концентрации ZnCl₂.

Результаты

Кривая растворимости анти-VEGF в ZnCl₂ и NaOAc, pH 5,7 показана на Фигуре 1.

При увеличении концентрации ZnCl₂ наблюдается снижение растворимости анти-VEGF. Во время диализа анти-VEGF при различных концентрациях ZnCl₂ в NaOAc буфере наблюдали формирование гелей в диализных кассетах. Гель вначале стартовал мутным. Гель с кристаллами формировался в течение 25 минут диализа из буфера, содержащего до 2 мМ ZnCl₂ при комнатной температуре и при 4˚C. Гели далее анализировали с помощью микроскопа и кристаллический материал наблюдали в гелях. Кристаллы в геле были очень маленькими и однородными. При наблюдении в микроскоп кристаллы в геле проявляли двойное лучепреломление, когда рассматривались через перекрестные поляризаторы, указывая на то, что это был кристаллический материал.

Многие режимы, включающие органические и неорганические осадители с различными буферами и корастворенными веществами, были предварительно исследованы на способность кристаллизовать полноразмерное гликозилированное антитело. Многие исследованные режимы не привели к формированию кристаллов антитела (данные не показаны). Было желательно создать способ кристаллизации, в котором избегалось применение органических осадителей, особенно для антител, которые должны применяться терапевтически.

Исследование, проведенное авторами, показало, что комбинация двухвалентного катиона, как, например, в форме соли, как, например, ZnCl₂ в NaOAc буфере может быть использована для формирования кристаллов полноразмерных антител без любого органического осадителя. Растворимость анти-VEGF антитела в различных концентрациях ZnCl₂ в NaOAc буфере позволяет определить концентрацию ZnCl₂ в NaOAc, при которой анти-VEGF становится нерастворимым в результате формирования кристаллов. При низких концентрациях ZnCl₂ наблюдают свободные кристаллы. Увеличение концентраций ZnCl₂ приводит к формированию гель-содержащих кристаллов. Результаты исследования растворимости определили диапазон концентраций, использованный для исследования периодической кристаллизации в следующем примере.

Пример 2

Кристаллизация анти-VEGF с хлоридом цинка и ацетатом натрия

Как описано в Примере 1, анти-VEGF растворы, диализированные растворами различных концентраций ZnCl₂ и NaOAc, стали нерастворимыми при определенных концентрациях, что приводило к формированию кристаллов и/или гелей. Кристаллизацию анти-VEGF с растворами ZnCl₂ и NaOAc без органических осадителей исследовали как в условиях диализа, так и в условиях периодического процесса. Полученные кристаллы были далее охарактеризованы. Кристаллизация в периодическом режиме желательна, потому что масштаб такого режима может быть увеличен вплоть до крупномасштабного продуцирования.

Материалы и способы

Способы кристаллизации и анализа

Анти-VEGF получили путем концентрирования анти-VEGF от 36 г/л до 84,4 г/л посредством ультрафильтрующего центрифугирования и диализировали в Milli-Q® воде. Полученная концентрация анти-VEGF составила 84,4 г/л, и анти-VEGF инкубировали при различных концентрациях ZnCl₂ и NaOAc или путем диализа или в порции. Концентрацию анти-VEGF определяли путем измерения абсорбции при 280 нм.

Четыре кристаллизующих исходных раствора ZnCl₂ и NaOAc также получили следующим образом:

1. 10 мМ ZnCl₂, 100 мМ NaOAc, pH 5,7

2. 50 мМ ZnCl₂, 100 мМ NaOAc, pH 5,7

3. 50 мМ ZnCl₂, 10 мМ NaOAc, pH 5,7

4. 50 мМ ZnCl₂, pH, отрегулированный до 5,7 гидроксидом натрия.

Комбинации концентрации ZnCl₂ и NaOAc показаны в Таблице 1a.

Диализный способ выполняли с использованием одного (1) мл анти-VEGF исходного раствора, помещенного в Slide-a-Lyzer® диализное устройство (Pierce, Rockford, II), и диализировали каждый исходный раствор. Диализные устройства непрерывно перемешивали каждый исходный раствор, и полученный материал соскребали с устройства и помещали в эппендорфовскую пробирку через пять дней.

Эксперимент также выполняли с использованием «периодического» способа. Периодический способ начинали путем добавления 0,75 мл анти-VEGF исходного раствора в отношении 1:1 (то есть 0,75 мл) к каждому кристаллизующему исходному раствору в эппендорфовские пробирки. Каждую пробирку встряхивали дважды в день для обеспечения осторожного перемешивания. Пробирки держали при температуре окружающей среды и встряхивали дважды в течение пяти дней.

Таблица 1a
Режим#	ZnCl2 (мМ)	NaOAc pH 5,7 (мМ)	Способ	Анти-VEGF (г/л)	Масштаб (мл)
1	10	100	Диализный	84,4	1
2	50	100	Диализный	84,4	1
3	50	10	Диализный	84,4	1
4	50	0	Диализный	84,4	1
5	5	50	Периодический	42,2	1,5
6	25	50	Периодический	42,2	1,5
7	25	5	Периодический	42,2	1,5
8	25	0	Периодический	42,2	1,5

Микроскопический анализ Кристаллов

После выделения материала кристаллы анализировали микроскопически на морфологию в присутствии или в отсутствие двойного лучепреломления света. Применение двойного лучепреломления света проводит различие между кристаллическими твердыми частицами и твердым осадком. Анализ выполняли путем пропускания света между двумя поляризационными светофильтрами. Один фильтр помещали ниже образца, и другой фильтр помещали выше образца. Если образец не является кристаллическим, два поляризационных светофильтра будут препятствовать попаданию света к наблюдателю. Если образец является кристаллическим, он будет поворачивать вектор поляризации света, позволяя ему проходить через второй светофильтр и в глаза наблюдателю. Кристаллы анализировали микроскопически путем помещения образца на предметное стекло и рассматривали кристаллы при различном увеличении.

Другие способы применяли для тестирования твердого материала, включая окрашивание Izit красителем и испытание на раздавливание/растрескивание. Испытание на раздавливание/растрескивание не позволило сделать окончательный вывод, потому что большинство кристаллического материала было слишком малого размера, чтобы позволить определение степени раздавливания в зависимости от степени растрескивания. Результаты окрашивания по Izit также были несовместимы, так как наблюдали много ложноположительных и ложноотрицательных фактов.

Результаты

Результаты показаны в Таблицах 1b и 1c.

Таблица 1b показывает визуальные наблюдения, сделанные в день 1, 2 и 5, образца в различных режимах, как представлено в Таблице 1a.

Таблица 1b
Режим#	День 1	День 2	День 5
1	Опалесцентный	Опалесцентный	Пушистые твердые частицы
2	Жидкий белый	Жидкий белый	Пушистые/ гелеобразные твердые частицы
3	Жидкий белый	Жидкий белый	Гель
4	Опалесцентный, белые твердые частицы	Опалесцентный, белые твердые частицы	Опалесцентный, белые твердые частицы
5	Немного белого твердого тела	Прозрачный	Прозрачный
6	Полностью из белых твердых частиц	Гель на дне	Гель
7	Прозрачное твердое тело	Прозрачный	Прозрачный
8	Белое твердое тело	Гель на дне	Гель на дне

Таблица 1c показывает аналитические измерения, которые были выполнены на выделенном материале из образцов при различных режимах, как представлено в Таблице 1a. Сформированные твердые частицы проявляли двойное лучепреломление, когда рассматривались через перекрестные поляризаторы, но в большинстве случаев были слишком малы, чтобы распознать регулярную форму или морфологию.

Таблица 1c
Режим#	Двойное лучепреломление	Кристаллическая морфология
1	Да	Нет
2	Да	Нет
3	Да	Нет
4	Нет	Нет
5	Да	Редкие конусы
6	Да	Цветы
7	Да	Серии конусов
8	Нет	Нет

Эти результаты показывают, что анти-VEGF кристаллизовался при использовании комбинаций ZnCl₂ и NaOAc как в диализном, так и в периодическом способах. Каждый исследованный режим вызывал изменение фазы анти-VEGF немедленно после его контакта с раствором осадителя. Твердые частицы, проявляющие двойное лучепреломление, наблюдали при каждом режиме, содержащем ZnCl₂ и NaOAc, указывая, что кристаллы сформировались при каждом из этих режимов. В некоторых случаях кристаллы, которые наблюдали, были внутри гель-подобной фазы анти-VEGF. В некоторых случаях кристаллы не могли быть выделены из геля, поэтому не могло быть окончательно показано, что они представляли собой анти-VEGF кристаллы. Кристаллы формировали конусоподобные и цветкового типа структуры. Этот пример показал, что анти-VEGF кристаллы могут быть продуцированы либо диализным либо периодическим способом с использованием ZnCl₂ и NaOAc без применения органических осадителей.

Репрезентативные изображения при двойном лучепреломлении и в отсутствие двойного лучепреломления показаны на Фигуре 2a-2f. Фигура 2a представляет собой изображение при 200-кратном увеличении анти-VEGF кристаллов, сформированных в присутствии 5 мМ ZnCl₂ и 100 мМ NaOAc, pH 5,7 в отсутствие двойного лучепреломления. Фигура 2b представляет собой изображение при 200-кратном увеличении анти-VEGF кристаллов, сформированных в присутствии 5 мМ ZnCl₂ и 100 мМ NaOAc, pH 5,7 при двойном лучепреломлении. Фигура 2c представляет собой изображение при 200-кратном увеличении анти-VEGF кристаллов, сформированных в присутствии 25 мМ ZnCl₂ и 10 мМ NaOAc, pH 5,7 в отсутствие двойного лучепреломления. Фигура 2d представляет собой изображение при 200-кратном увеличении анти-VEGF кристаллов, сформированных в присутствии 25 мМ ZnCl₂ и 10 мМ NaOAc, pH 5,7 при двойном лучепреломлении. Фигура 2e представляет собой изображение при 200-кратном увеличении анти-VEGF кристаллов, сформированных в растворе 10 мМ ZnCl₂, 100 мМ NaOAc, pH 5,7 в отсутствие двойного лучепреломления. Фигура 2f представляет собой изображение при 200-кратном увеличении анти-VEGF кристаллов, сформированных в растворе 10 мМ ZnCl₂, 100 мМ NaOAc, pH 5,7 при двойном лучепреломлении.

Пример 3

Варьирование режима кристаллизации

Как описано ранее, анти-VEGF антитело кристаллизовали при различных концентрациях ZnCl₂ и NaOAc. Другие условия кристаллизации могут влиять на способность к кристаллизации анти-VEGF или на выход анти-VEGF кристаллов. Исследовали влияние изменения pH, температуры и идентичности двухвалентного катиона на кристаллизацию анти-VEGF.

Материалы и способы

Исходный раствор анти-VEGF 87 г/л в Milli-Q® воде получили путем ультрафильтрации и диафильтрации на 10 кД регенерированной целлюлозной мембране. Каждый образец включал отношение 1:1 белка к буферному раствору, приводя к конечной анти-VEGF концентрации 43,5 г/л. Исходные растворы 1М ZnCl₂, хлорида кальция (CaCl₂), MgCl₂, получили путем растворения соответствующего количества твердых частиц в Milli-Q® воде и фильтрования растворов через стерильно чистый фильтр. 1 молярные исходные растворы NaOAc, pH 4,7 и NaOAc, pH 5,7 получили путем добавления соответствующего количества тригидрата ацетата натрия и ледяной уксусной кислоты к Milli-Q® воде и фильтрования через стерильно чистый фильтр.

Режим растворения получили путем добавления соответствующего количества воды, исходного раствора двухвалентного иона, исходного раствора буфера и исходного раствора белка. Белковый исходный раствор всегда добавляли последним.

Комбинации концентраций ZnCl₂, MgCl₂, CaCl₂ и NaOAc исследовали при двух различных pH и температурах. Концентрации ZnCl₂ варьировали от 5 до 100 мМ и NaOAc варьировали от 10 до 100 мМ. Концентрация MgCl₂ варьировала от 5 до 100 мМ в 10 мМ NaOAc. Концентрация CaCl₂ варьировала от 5 до 100 мМ в 10 мМ NaOAc.

Кристаллизацию с использованием периодического способа проводили, как описано в Примере 2, за исключением того, что каждая порция имела объем образца 1 мл.

Результаты

Результаты показаны в Таблице 2. Комбинации ZnCl₂ и NaOAc были эффективными для формирования кристаллов и/или гелей с кристаллами полноразмерного анти-VEGF антитела. Твердый материал содержал кристаллический материал, как определено путем рефракции света при двойном лучепреломлении. Концентрацию анти-VEGF в супернатанте определяли путем измерения абсорбции при 280 нм.

Таблица 2
ZnCl2 (мМ)	NaOAc (мМ)	pH	Температура (˚С)	Наблюдения	Анти-VEGF конц. (г/л)	Кристаллы с двойным лучепре-ломлением
5	10	4,7	4	Пленка	43	Да
10	10	4,7	4	Пленка	44	Да
100	10	4,7	4	20% гель	16	Да
5	10	4,7	Комнатная	Пленка + твердые частицы	44	Да
10	10	4,7	Комнатная	Партии твердых частиц	43	Да
100	10	4,7	Комнатная	17% гель	18	Да
5	10	5,7	4	Пленка + твердые частицы	44	Да
10	10	5,7	4	Пленка + твердые частицы	42	Да
100	10	5,7	4	20% гель	4,3	Да
5	10	5,7	Комнатная	Пленка	43	Да
10	10	5,7	Комнатная	Пленка и замутнение	47	Да
100	10	5,7	Комнатная	17% гель	3,8	Да

Все ZnCl₂/NaOAc комбинации продуцировали кристаллы анти-VEGF в геле или свободными в растворе. Растворы хлорида магния и ацетата натрия не показали какого-либо влияния на анти-VEGF в этих условиях (данные не показаны). Хлорид кальция и раствор ацетата натрия продуцировали кристаллы с анти-VEGF, когда CaCl₂ составлял 100 мМ и 10 мМ NaOAc при pH 4,7 и инкубации при 4˚C (данные не показаны).

Кристаллический материал выделяли из раствора, сформированного из 100 мМ ZnCl₂ и 10 мМ NaOAc при pH 5,7, инкубированного при комнатной температуре. Кристаллы промывали три раза 20 мМ NaOAc и 20 мМ ZnCl₂, pH 5,7 и кристаллы растворяли в воде. Различное количество ресолюбилизиованных кристаллов в воде прогоняли через SDS PAGE и сравнивали с анти-VEGF до кристаллизации. Промывной раствор кристаллов также тестировали на присутствие анти-VEGF. Результаты показаны на Фигуре 5. Результаты показали, что промывной раствор не содержал никаких анти-VEGF, в то время как ресолюбилизированные кристаллы состояли из анти-VEGF. Увеличенное количество кристаллов приводило к увеличению детектируемого анти-VEGF.

Ресолюбилизированное анти-VEGF также анализировали путем масс-спектрометрии и сравнивали с контрольным анти-VEGF. MALDI-TOF масс-спектр интактных антител обычно дает широкий пик 150 кДа, и не легко различить одно антитело от других антител. Однако масс-спектр восстановленных антител проявляет высокую чувствительность к легкой цепи. Так как масса легкой цепи является уникальной для каждого антительного продукта, образцы восстанавливали посредством TCEP и анализировали в линейной положительной моде. Для объяснения концентрационных различий первые два образца разбавляли в 50 раз и следующие два образца разбавляли в 10 раз маточным раствором синапиновой кислоты и восстанавливали посредством TCEP при комнатной температуре (2 ч). Образцы наносили на чашку, сушили воздухом, промывали холодным 0,1% TFA и получили масс-спектр.

Молекулярная масса легкой цепи анти-VEGF составляет 23433 Да и MALDI-TOF масс-спектр обычно показывает точность определения массы +/- 0,05% в данном диапазоне массы. Спектр исходного раствора и супернатанта показывает сходные паттерны, которые представляют собой резко выраженный пик от единично и дважды протонированной легких цепей и слабый от дважды заряженной тяжелой цепи (Фигуры 7 D, A и C). Промывной раствор (в анализируемом режиме) не показывает присутствия легкой цепи (Фигура 7B), тогда как кристаллический раствор показывает пики легкой цепи.

Анализ нативного Lys-C гидролизата кристаллов посредством MALDI-TOFMS показал много анти-VEGF родственных пиков (а также продуктов автогидролиза Lys-C). Однако гидролизат первого промывного раствора также показал некоторое количество анти-VEGF родственных пиков (данные не показаны). Обычно наблюдается более высокая чувствительность гидролизатов посредством MALDI-TOFMS по сравнению с интактным белком.

Суммируя, анти-VEGF отчетливо виден в кристаллах, но первая промывка может также содержать небольшое количество анти-VEGF. Результаты показывают, что ресолюбилизированное анти-VEGF из кристаллов имеет такой же масс-спектроскопический профиль, как и контрольное анти-VEGF.

Пример 4

Исследование гель-жидких фаз анти-VEGF растворов

Две фазы были идентифицированы в растворах, содержащих анти-VEGF кристаллы. Они включают кристаллы, свободные в растворе, и гели, которые могут содержать кристаллы. Концентрация анти-VEGF супернатанта прямо связана с наличием кристаллической фазы. Когда гель присутствует, концентрации растворимого анти-VEGF обычно меньше чем примерно 10 г/л. Когда гель отсутствует, концентрации растворимого анти-VEGF обычно увеличиваются выше 40 г/л.

Анти-VEGF фазовое пространство режима кристаллизации исследовали путем варьирования концентраций NaOAc и концентраций ZnCl₂ при pH 5,7. Путем изучения фазового пространства может быть возможно определить, когда раствор переходит из геля в жидкую фазу. Это может содействовать нахождению оптимального режима кристаллизации для улучшенного выхода кристаллов.

Материалы и способы

Исходный раствор анти-VEGF 84,4 г/л в Milli-Q® воде применяли с 1 М исходными растворами ZnCl₂ и NaOAc, pH 5,7 как ингредиентами для данных 1 мл периодических экспериментов. Получили двадцать две (22) порции, каждая с концентрацией анти-VEGF 42,2 г/л и концентрациями ZnCl₂ и NaOAc, варьирующими от 5 до 100 мМ и от 10 до 100 мМ соответственно (см. Таблицу 3).

Растворы сделали в полипропиленовых пробирках, которые хранили при температуре окружающей среды. Выполнили два различных набора по 22, один набор не перемешивали и один набор встряхивали дважды в день для обеспечения осторожного перемешивания. Пробирки наблюдали в течение трех недель. Сформированный процентный гель визуально определяли в неперемешанном наборе в начале и в конце трех недель. Спустя 21 день пробирки центрифугировали и концентрацию анти-VEGF в супернатанте анализировали посредством A280.

Результаты

Таблица 3 показывает неперемешанный или статический набор из 22 образцов.

Таблица 3
ZnCl2 концентрация (мМ)	NaOAc, pH 5,7 концентрация (мМ)	% Геля начальный	% Геля конечный	Анти-VEGF концентрация в супернатанте (г/л)
5	10	0	0	43
5	100	20	0	43
10	10	0	0	47
10	50	0	0	48
10	75	0	0	47
10	100	25	0	44
25	10	0	0	42
25	25	15	0	43
25	50	45	0	44
25	75	25	20	7,1
25	100	25	20	4,3
40	10	0	0	49
40	25	0	15	47
40	50	20	40	6,0
40	75	20	20	2,5
60	10	15	20	18
60	25	30	40	6,8
60	50	35	40	2,9
60	75	40	20	1,3
80	10	40	40	9,4
80	25	45	40	3,0
100	10	65	20	3,8
100	100	35	20	0,7

В перемешанном наборе пробирок % геля не мог быть количественно определен, потому что гелевая фаза была распространена вдоль стороны пробирок. Однако визуальной индикацией определяли состояние раствора - прозрачный, гель, свободные твердые частицы или гель + свободные твердые частицы, в начале и по прошествии 21 дня. После 21 дня пробирки центрифугировали и концентрацию анти-VEGF в супернатанте анализировали посредством A280. Таблица 4 показывает результаты встряхивания дважды в день (перемешивания) набора из 22 образцов.

Таблица 4
ZnCl2 концентрация (мМ)	NaOAc, pH 5,7 концентрация (мМ)	Наблюдения начальные	Наблюдения конечные	Анти-VEGF концентрация в супернатанте (г/л)
10	50	Прозрачный	Свободные твердые частицы	49
10	75	Прозрачный	Свободные твердые частицы	48
10	100	Свободные твердые частицы	Свободные твердые частицы	47
15	50	Прозрачный	Свободные твердые частицы	45
20	50	Прозрачный	Свободные твердые частицы	47
25	25	Прозрачный	Свободные твердые частицы	45
25	50	Прозрачный	Свободные твердые частицы	42
25	75	Гель	Гель + твердые частицы	8,1
40	10	Прозрачный	Свободные твердые частицы	44
40	25	Гель	Гель	20
40	50	Гель	Гель	6,5
40	75	Гель	Гель	3,2
50	10	Прозрачный	Прозрачный	43
50	25	Гель	Гель	11
60	5	Прозрачный	Гель	27
60	10	Гель	Гель + твердые частицы	22
60	25	Гель	Гель	8,2
60	50	Гель	Гель	2,2
60	75	Гель	Гель	1,4
80	10	Гель	Гель	8,8
80	25	Гель	Гель	3,8
100	1	Гель + твердые частицы	Гель + твердые частицы	10
100	5	Гель + твердые частицы	Гель + твердые частицы	9,2
100	10	Гель	Гель	4,8

Кристаллы были сформированы во всех пробирках. Некоторые кристаллы были свободными в растворе и некоторые были в геле.

Фазовую диаграмму для неперемешанных образцов получили путем построения концентрации ZnCl₂ как функции концентрации NaOAc. График этой функции можно увидеть на Фигуре 3. Фигура 4 сравнивает фазовые диаграммы перемешанного и неперемешанного экспериментов.

Взятые вместе, Фигуры 1 (из Примера 1), 3 и 4 показывают, что как система вблизи точки фазового перехода растворимый анти-VEGF уменьшается до примерно 10-22 г/л, когда ZnCl₂ превышает 40 мМ и пробирки перемешивают. Когда пробирки неподвижны и концентрациями ZnCl₂ являются примерно 40 мМ или менее, отсутствует или существует небольшое уменьшение концентраций растворимого анти-VEGF. Это могло привести к предположению, что ZnCl₂ является доминантным фактором утраты растворимости анти-VEGF. Когда концентрация ZnCl₂ менее чем 10 мМ или более чем 80 мМ, влияние NaOAc уменьшается. При приближении концентраций ZnCl₂ к точкам перехода (25-60 мМ) концентрации NaOAc имеют большее влияние на концентрацию растворимого анти-VEGF.

Пример 5

Кристаллизация других антител

Ранее в данной области для режима кристаллизации полноразмерных антител обычно использовали органический осадитель, такой как PEG, MPD или пропанол. Мы обнаружили (см. предыдущие примеры), что полноразмерные антитела, такие как анти-VEGF, могут быть кристаллизованы в отсутствие этих органических осадителей. Мы исследовали, могут ли другие полноразмерные антитела быть кристаллизованы с двухвалентным катионом в присутствии NaOAc (pH 4,7; pH 5,7), HEPES (pH 7,5) или Tris (pH 9,0).

Материалы и способы

Моноклональные антитела, которые тестировали, представляют собой анти-HER2, анти-CD11a, анти-CD20 (C2B8) и анти-VEGF (Genentech, South San Francisco, CA). Получение и характеристика антитела с этими специфичностями были описаны в патентах США № 5736137, 6387371, 6037454 и WO 98/45331. Антитела очищали с использованием трех типов хроматографии, за которыми следует ультрафильтрация и диафильтрация, подобная стадиям очистки, описанным в Примере 1.

Моноклональные антитела диализировали в Milli-Q® воде, получая конечные концентрации между примерно 80-100 мг/мл. Эксперименты выполняли периодическим образом путем смешивания 1 части антительного раствора с 1 частью каждого соответствующего раствора. Конечные объемы образцов были от 1 до 2 мл. Образцы хранили в полипропиленовых пробирках на 6 мл.

Двухвалентными солями, которые использовали, являлись ZnCl₂, CaCl₂ и MgCl₂. Буферы, которые использовали, имели конечные концентрации и pH соответственно: 10 мМ NaOAc, pH 4,7; 10 мМ NaOAc, pH 5,7; 10 мМ HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтан-сульфоновая кислота), pH 7,5 и 10 мМ Tris (трис гидроксиметиламиноэтан), pH 9,0. Образцы, содержащие Tris буферный раствор, хранили при температуре окружающей среды и образцы с другими буферными растворами хранили при температурах 2-8˚C.

Образцы подвергали ежедневно визуальному обследованию. Если отсутствие твердого материала наблюдали через 3 дня хранения, температуру резко изменяли: образцы переносили в условия, обеспечивающие 2-8˚C или комнатную температуру в зависимости от начальных условий хранения. Если отсутствие твердого материала наблюдали через 3 дополнительных дня, образцы хранили при 2-8˚C и мониторировали еженедельно. Образцы с твердым материалом подвергали просмотру через перекрестные поляризаторы для определения двойного лучепреломления.

Результаты

Отсутствие кристаллов наблюдали в режиме, тестированном для анти-CD40 молекулы (данные не показаны).

Результаты для анти-CD20 (C2B8) молекулы с ZnCl₂ показаны в Таблице 5. Любые наблюдаемые твердые частицы не были кристаллизованы на основании двойного лучепреломления. Однако в некоторых случаях белковые гели были сформированы. Отсутствие кристаллов наблюдали в режимах, тестированных для анти-CD20 (C2B8) молекулы с CaCl₂ и MgCl₂ (данные не показаны). N/A в таблицах указывает, что абсорбцию супернатанта при 280 нм не тестировали.

Таблица 5
ZnCl2 (мМ)	NaOAc (мМ)	pH	Температура (˚С)	Наблюдения	Анти-CD20 (C2B8) в супернатанте при A280 (г/л)
5	10	4,7	2-8	Прозрачный	42
10	10	4,7	2-8	Прозрачный	42
100	10	4,7	2-8	25% гель	13
5	10	4,7	Комнатная	Прозрачный	N/a
10	10	4,7	Комнатная	Прозрачный	N/a
100	10	4,7	Комнатная	Опалесцентный + 20% гель	N/a
5	10	5,7	2-8	Прозрачный	42
10	10	5,7	2-8	Прозрачный	43
100	10	5,7	2-8	75% белое твердое тело	2,1
5	10	5,7	Комнатная	Прозрачный	N/a
10	10	5,7	Комнатная	Прозрачный	N/a
100	10	5,7	Комнатная	33% твердые частицы	N/a

Результаты для анти-HER2 молекулы с ZnCl₂ показаны в Таблице 6 ниже. Любые твердые частицы, сформированные при режимах, показанных ниже, не были кристаллизованными, как определили путем двойного лучепреломления. Отсутствие кристаллов наблюдали в режимах, тестированных для анти-HER2 молекулы с CaCl₂ или MgCl₂ (данные не показаны).

Таблица 6
ZnCl2 (мМ)	NaOAc (мМ)	pH	Температура (˚С)	Наблюдения	Анти-HER2 в супернатанте при A280 (г/л)
5	10	4,7	2-8	Прозрачный	51
10	10	4,7	2-8	Прозрачный	46
100	10	4,7	2-8	25% гель	18
5	10	4,7	Комнатная	Прозрачный	N/a
10	10	4,7	Комнатная	Прозрачный	N/a
100	10	4,7	Комнатная	Опалесцентный	N/a
5	10	5,7	2-8	Прозрачный	46
10	10	5,7	2-8	Прозрачный	47
100	10	5,7	2-8	60% твердые частицы	41
5	10	5,7	Комнатная	Прозрачный	N/a
10	10	5,7	Комнатная	Прозрачный	N/a
100	10	5,7	Комнатная	Гель + твердые частицы	N/a

Результаты для анти-CD11a молекулы с ZnCl₂ показаны в Таблице 7 ниже. Любые твердые частицы, сформированные при этих режимах, не формировали кристаллы, как определили путем двойного лучепреломления. Отсутствие кристаллов наблюдали при режимах, тестированных для анти-CD11a молекулы с CaCl₂ или MgCl₂ (данные не показаны).

Таблица 7
ZnCl2 (мМ)	NaOAc (мМ)	pH	Температура (˚С)	Наблюдения	Анти-CD11a в супернатанте при A280 (г/л)
5	10	4,7	2-8	Прозрачный	59
10	10	4,7	2-8	Прозрачный	N/a
100	10	4,7	2-8	40% гель	13
5	10	4,7	Комнатная	Прозрачный	N/a
10	10	4,7	Комнатная	Прозрачный	N/a
100	10	4,7	Комнатная	25% гель	N/a
5	10	5,7	2-8	Прозрачный	47
10	10	5,7	2-8	Прозрачный	56
100	10	5,7	2-8	75% белое твердое тело	2,3
5	10	5,7	Комнатная	Прозрачный	N/a
10	10	5,7	Комнатная	Прозрачный	N/a
100	10	5,7	Комнатная	25% гель + твердые частицы	N/a

Результаты для анти-VEGF молекулы с ZnCl₂ показаны в Таблице 8 и для MgCl₂ в Таблице 9. Кристаллы или гели были сформированы при этих режимах. Не все осадки содержали кристаллизованный материал, как определили путем двойного лучепреломления. Отсутствие кристаллов наблюдали при режимах, тестированных для анти-VEGF молекулы с CaCl₂ (данные не показаны).

Таблица 8
ZnCl2 (мМ)	NaOAc (мМ)	pH	Температура (˚С)	Наблюдения	Анти-VEGF в супернатанте при A280 (г/л)	Кристаллы с двойным лучепре-ломлением
5	10	4,7	2-8	Пленка	42,8	Да
10	10	4,7	2-8	Пленка	43,5	Да
100	10	4,7	2-8	20% гель	16,0	Да
5	10	4,7	Комнатная	Пленка + твердые частицы	44,2	Да
10	10	4,7	Комнатная	Партии твердых частиц	42,6	Да
100	10	4,7	Комнатная	17% гель	18,4	Да
5	10	5,7	2-8	Пленка + твердые частицы	43,9	Да
10	10	5,7	2-8	Пленка + твердые частицы	41,8	Да
100	10	5,7	2-8	20% гель	4,3	Да
5	10	5,7	Комнатная	Пленка	43,1	Да
10	10	5,7	Комнатная	Пленка + замутнение	46,6	Да
100	10	5,7	Комнатная	17% гель	3,8	Да

Таблица 9
MgCl2 (мМ)	10 мМ Буфер	pH	Температура (˚С)	Наблюдения	Анти-VEGF в супер-натанте при A280 (г/л)
5	NaOAc	4,7	2-8	Прозрачный	51
10	NaOAc	4,7	2-8	Прозрачный	N/a
100	NaOAc	4,7	2-8	Прозрачный	52
5	NaOAc	4,7	Комнатная	Прозрачный	N/a
10	NaOAc	4,7	Комнатная	Прозрачный	N/a
100	NaOAc	4,7	Комнатная	Прозрачный	N/a
5	NaOAc	5,7	2-8	Прозрачный	51
10	NaOAc	5,7	2-8	Прозрачный	N/a
100	NaOAc	5,7	2-8	Прозрачный	50
5	NaOAc	5,7	Комнатная	Прозрачный	N/a
10	NaOAc	5,7	Комнатная	Прозрачный	N/a
100	NaOAc	5,7	Комнатная	Прозрачный	N/a
5	HEPES	7,5	2-8	Мелкие частицы	44
50	HEPES	7,5	2-8	Несколько wht ppt	42
100	HEPES	7,5	2-8	Белые частицы	42
5	HEPES	7,5	Окружающей среды	Мелкие частицы	44
50	HEPES	7,5	Окружающей среды	Мелкие частицы	43
100	HEPES	7,5	Окружающей среды	Мелкие частицы	43
5	Tris	9,0	2-8	Мелкие частицы	44
50	Tris	9,0	2-8	Мелкие частицы	44
100	Tris	9,0	2-8	Мелкие частицы/ кристаллы со слабым двойным лучепреломлением, похожие на морского ежа	51
5	Tris	9,0	Окружающей среды	Мелкие частицы	41
50	Tris	9,0	Окружающей среды	Мелкие частицы/ кристаллы со слабым двойным лучепреломлением, похожие на морского ежа	44
100	Tris	9,0	Окружающей среды	Мелкие частицы/ кристаллы со слабым двойным лучепреломлением, похожие на морского ежа	42

Из вышеуказанных результатов следует, что как будто комбинация более высоких концентраций ZnCl₂ и NaOAc и pH 4,7 и 5,7 вызывает изменения в фазе анти-HER2, анти-CD20 (C2B8), анти-CD11a из растворимого антитела в антительный гели. Все комбинации ZnCl₂/NaOAc продуцировали кристаллы, когда их добавляли к анти-VEGF.

Только MgCl₂ и CaCl₂ исследовали при pH 7,5 и pH 9,0 (результаты для CaCl₂ не показаны). На основании вышеуказанных результатов кристаллизацию анти-VEGF наблюдали в 10 мМ Tris, 50 мМ MgCl₂, pH 9,0 при комнатной температуре и в 10 мМ Tris, 100 мМ MgCl₂, pH 9,0 при комнатной температуре и при 2-8˚C.

Пример 6

Применение осадителей в режиме кристаллизации

Мы исследовали возможность введения добавок в режим кристаллизации анти-VEGF. Применяли режим кристаллизации с 10 мМ ZnCl₂ и 10 мМ NaOAc при pH 5,7.

Кристаллизация с использованием 10 мМ ZnCl₂ и 10 мМ NaOAc при pH 5,7 уже была показана для продуцирования анти-VEGF кристаллов. В попытке увеличить выход три наиболее эффективных органических осадителя (определенные посредством скрининга) добавляли к кристаллизующим буферам. Тестированными осадителями были (+/-)-2-метил-2,4-пентандиол (MPD), приобретенный у Hampton Research, полиэтиленгликоль (PEG) 3350, приобретенный у Hampton Research, и пропанол, приобретенный у Hampton Research.

Каждый осадитель добавляли в полипропиленовую пробирку, содержащую раствор анти-VEGF (Genentech, South San Francisco, CA) в Milli-Q® воде, для получения конечной концентрации 42,4 г/л анти-VEGF, 10 мМ ZnCl₂, 10 мМ NaOAc при pH 5,7, и проценты осадителей даны в Таблице 10 ниже.

Полипропиленовые пробирки помещали при температуре окружающей среды и встряхивали дважды в день для обеспечения осторожного перемешивания. Через две недели образцы супернатанта собирали и концентрацию анти-VEGF анализировали посредством A280.

Результаты

Результаты показаны в Таблице 10.

Таблица 10
Осадитель	%	Кристаллы	Концентрация анти-VEGF в супернатанте (г/л)
PEG 3350	0,5	Да	52
PEG 3350	1	Да	48
PEG 3350	5	Да	49
Пропанол	0,5	Да	41
Пропанол	1	Да	47
Пропанол	5	Да	46
MРD	0,5	Да	53
MРD	1	Да	48
MРD	5	Да	45

Кристаллы визуально наблюдали во всех порционных пробирках. Измеренные концентрации супернатанта были между 41 и 53 г/л во всех полипропиленовых пробирках. Кристаллизация происходила, но, по-видимому, не увеличивалась путем добавления этих осадителей. Фигура 6 показывает концентрацию супернатанта как функцию концентрации осадителя для трех различных осадителей. Было установлено, что добавление MPD, PEG 3350 или пропанола, по-видимому, недостоверно улучшало выход по сравнению с выходом с использованием 10 мМ ZnCl₂, 10 мМ NaOAc при pH 5,7.

Пример 7

Кристаллизация других моноклональных антител

Авторы исследовали, могут ли смеси ZnCl₂ и NaOAc быть использованы в качестве общего режима кристаллизации моноклональных антител.

Режим кристаллизации, который был определен в данном описании для анти-VEGF, не содержит полиэтиленгликоля. Во всех других режимах, сообщенных в литературе, применяли полиэтиленгликоль в способе кристаллизации. В последних экспериментах другие антитела были изменены с помощью этих режимов путем гелеобразования или осаждения в растворе. В данном эксперименте более высокие концентрации ZnCl₂ были исследованы для того, чтобы изучить антительное фазовое пространство и определить режим кристаллизации.

Материалы и способы

Антитела, которые сравнивали, представляли собой анти-HER2, анти-CD11a, анти-2C4, анти-CD20 (2H7), анти-CD20 (C2B8) и анти-VEGF. Все антитела подвергали диафильтрации в Milli-Q® воде и концентрировали до ~100 мг/мл. Эксперименты выполняли периодическим способом, соединяя 1 часть антительного раствора с 1 частью раствора. Конечный объем образца составлял от примерно 3-5 мл и образцы хранили в пропиленовых пробирках на 6 мл без какого-либо контроля белка. Образцы хранили при температуре окружающей среды и при примерно 2-8˚C. Образцы осматривали ежедневно. Если отсутствие кристаллов или осадка наблюдали через 3 дня хранения, температуру радикально меняли: образцы переносили в условия 2-8˚C или в условия комнатной температуры в зависимости от начальных условий хранения. Если ничего не наблюдали через 3 дополнительных дня, образцы хранили при 2-8˚C и мониторировали еженедельно.

Растворы имели варьирующие концентрации ZnCl₂, CaCl₂ и MgCl₂ и все имели 0,01 М NaOAc и имели pH или 4,7, или 5,7.

Результаты

Результаты для анти-VEGF молекулы в ZnCl₂ показаны в Таблице 11. Кристаллы не наблюдали при использовании MgCl₂ или CaCl₂ при этих режимах (данные не показаны).

Таблица 11
ZnCl2 (мМ)	NaOAc (мМ)	pH	Температура (˚С)	Наблюдения	Кристаллы с двойным лучепреломлением
75	10	4,7	Окружающей среды	Гель	Нет
90	10	4,7	Окружающей среды	Гель	1 или 2 возможных кристалла
120	10	4,7	Окружающей среды	Густой гель	Гель
75	10	4,7	2-8	Твердый гель	Маленький кристалл
90	10	4,7	2-8	Твердый гель	Маленький кристалл
120	10	4,7	2-8	Густой гель	Кристалл
25	10	5,7	Окружающей среды	Густой гель	Нет
50	10	5,7	Окружающей среды	Густой гель	Маленькие капли геля
75	10	5,7	Окружающей среды	Свободный гель	Гель
25	10	5,7	2-8	Твердый гель	Кристалл
50	10	5,7	2-8	Твердый гель	Много маленьких кристаллов
75	10	5,7	2-8	Гель	Много маленьких кристаллов

Результаты для анти-CD20 (C2B8) и анти-2C4 молекул не показали формирования кристаллов или гелей при любых тестированных режимах (данные не показаны).

Результаты для анти-CD20 (2H7) молекулы показаны в Таблице 12 (ZnCl₂), Таблице 13 (CaCl₂) и Таблице 14 (MgCl₂) ниже. Во многих случаях были сформированы белковые гели. Осажденный материал не являлся кристаллизованным, как определили посредством двойного лучепреломления.

Таблица 12
ZnCl2 (мМ)	NaOAc (мМ)	pH	Температура (˚С)	Наблюдения	Кристаллы с двойным лучепреломлением
75	10	4,7	Окружающей среды	Прозрачный	Нет
90	10	4,7	Окружающей среды	Жидкий гель	Нет
120	10	4,7	Окружающей среды	Гель	Нет
75	10	4,7	2-8	Ppt	Нет
90	10	4,7	2-8	Ppt	Нет
120	10	4,7	2-8	Ppt	Нет
25	10	5,7	Окружающей среды	Гранулированный ppt	Нет
50	10	5,7	Окружающей среды	Ppt	Нет
75	10	5,7	Окружающей среды	Ppt	Нет
25	10	5,7	2-8	Гель	Нет
50	10	5,7	2-8	Густой гель	Нет
75	10	5,7	2-8	Густой гель	Нет

Таблица 13
СaCl2 (мМ)	NaOAc (мМ)	pH	Температура (˚С)	Наблюдения	Кристаллы с двойным лучепреломлением
200	10	4,7	Окружающей среды	Опалесцентный, белые твердые частицы	Нет
500	10	4,7	Окружающей среды	Гель	Нет
200	10	4,7	2-8	Опалесцентный густой гель	Нет
500	10	4,7	2-8	Опалесцентный густой гель	Нет
200	10	5,7	Окружающей среды	Густой гель	Нет
500	10	5,7	Окружающей среды	Опалесцентный густой гель	Нет
200	10	5,7	2-8	Густой гель	Нет
500	10	5,7	2-8	Густой гель	Нет

Таблица 14
MgCl2 (мМ)	NaOAc (мМ)	pH	Температура (˚С)	Наблюдения	Кристаллы с двойным лучепреломлением
200	10	4,7	Окружающей среды	Обычный гель	Нет
500	10	4,7	Окружающей среды	Густой гель	Нет
200	10	4,7	2-8	Густой гель	Нет
500	10	4,7	2-8	Густой гель	Нет
200	10	4,7	Окружающей среды	Обычный гель	Нет
500	10	4,7	Окружающей среды	Густой гель	Нет
200	10	5,7	2-8	Густой гель	Нет
500	10	5,7	2-8	Густой гель	Нет

Результаты для анти-HER2 молекулы показаны в Таблице 15 (ZnCl₂) ниже. Кристаллы не наблюдали при использовании MgCl₂ или CaCl₂ при этих режимах (данные не показаны).

Таблица 15
ZnCl2 (мМ)	NaOAc (мМ)	pH	Температура (˚С)	Наблюдения	Кристаллы с двойным лучепреломлением
75	10	4,7	Окружающей среды	Светломолочный	Нет
90	10	4,7	Окружающей среды	Светломолочный	Нет
120	10	4,7	Окружающей среды	Опалесцентный	Нет
75	10	4,7	2-8	Прозрачный	Нет
90	10	4,7	2-8	Опалесцентный	Нет
120	10	4,7	2-8	Маленькие твердые частицы	Слабое двойное лучепрелом-ление
25	10	5,7	Окружающей среды	Светломолочный	Нет
50	10	5,7	Окружающей среды	Светломолочный	Нет
75	10	5,7	Окружающей среды	Гель	Нет
25	10	5,7	2-8	Прозрачный	Нет
50	10	5,7	2-8	Гель	Нет
75	10	5,7	2-8	Мягкий гель	Нет

Результаты для анти-CD11a молекулы показаны в Таблице 16 (ZnCl₂) ниже. Кристаллы не наблюдали при использовании MgCl₂ или CaCl₂ при этих режимах (данные не показаны).

Таблица 16
ZnCl2 (мМ)	NaOAc (мМ)	pH	Температура (˚С)	Наблюдения	Кристаллы с двойным лучепреломлением
75	10	4,7	Окружающей среды	Прозрачный	Нет
90	10	4,7	Окружающей среды	Прозрачный	Нет
120	10	4,7	Окружающей среды	Опалесцентный	Нет
75	10	4,7	2-8	Прозрачный	Нет
90	10	4,7	2-8	Прозрачный	Нет
120	10	4,7	2-8	Ppt	Нет
25	10	5,7	Окружающей среды	Прозрачный	Нет
50	10	5,7	Окружающей среды	Прозрачный	Нет
75	10	5,7	Окружающей среды	Гель/твердое тело	Нет
25	10	5,7	2-8	Прозрачный	Нет
50	10	5,7	2-8	Опалесцентный	Нет
75	10	5,7	2-8	Ppt	Нет

Эти результаты показывают, что различные антитела могут формировать или кристаллы, или гели, когда контактируют с ZnCl₂ или с NaOAc.

1. Способ получения кристаллов антитела или его фрагмента, включающий:
а) приведение в контакт анти-VEGF антитела или его фрагмента с раствором, содержащим приблизительно 1-500 мМ либо ZnCl₂, либо MgCl₂ и приблизительно 1-100 мМ буфера; и
б) инкубирование антитела или его фрагмента и раствора до образования кристаллов антитела или его фрагмента.

2. Способ по п.1, где количество ZnCl₂ составляет приблизительно 10 мМ - 80 мМ.

3. Способ по п.2, где количество ZnCl₂ составляет приблизительно 25 мМ - 60 мМ ZnCl₂.

4. Способ по п.1, где буфер содержит ацетат натрия (NaOAc).

5. Способ по п.4, где буфер содержит приблизительно 1 мМ - 20 мМ NaOAc.

6. Способ по п.5, где буфер содержит приблизительно 25 мМ - 75 мМ NaOAc.

7. Способ по п.1, где раствор содержит более чем приблизительно 10 мМ ZnCl₂ и более чем приблизительно 5 мМ NaOAc.

8. Способ по п.7, где раствор содержит приблизительно 100 мМ ZnCl₂ и приблизительно 10 мМ NaOAc.

9. Способ по п.1, где контактирование происходит при температуре окружающей среды.

10. Способ по п.1, где буфер имеет рН по меньшей мере 4,7.

11. Способ по п.10, где буфер имеет рН приблизительно 4,7-5,7.

12. Способ по п.1, где количество MgCl₂ составляет приблизительно 50-100 мМ.

13. Способ по п.1, где антителом является поликлональное антитело, моноклональное антитело, химерное антитело, аффинно зрелые антитела, биспецифичное антитело, мультиспецифичные антитела, антитело человека или гуманизированное антитело.

14. Способ по п.1, где антителом является полноразмерное анти-VEGF антитело.

15. Способ по п.1, где контактирование происходит при 2-8°С.

16. Способ по п.1, где антителом является фрагмент антитела, выбранный из группы, состоящей из Fab, Fab′, Fabz, Fab′2, Fd, Fd′, scFv, scFv2, dAb, бесшарнирное антитело, линейное антитело и димерное антитело.

17. Способ по п.1, где антителом является IgGI, IgG2, IgG3, IgG4, IgM1, IgM2, IgA или IgA2.