Средство, обладающее антирадикальными, церебропротекторными и противоишемическими свойствами
Владельцы патента RU 2445090:
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Южный федеральный университет" (RU)
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Волгоградский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (RU)
Заявленное изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается сульфата 2-фенил-3-(3,4-диметоксифенил)-4-(2-морфолиноэтил)пирроло[1,2-а]бензимидазола формулы (I), обладающего антирадикальной активностью, церебропротекторными и противоишемическими свойствами, который может быть использован в качестве действующего начала лекарственных препаратов для профилактики и терапии ишемических повреждений мозга. Заявленное средство обладает повышенной эффективностью при лечении острого ишемического поражения головного мозга. 4 пр., 11 табл.
Изобретение относится к фармакологии, конкретно к биологически активным веществам, обладающим антирадикальной активностью, церебропротекторными и противоишемическими свойствами, которые могут быть использованы в качестве действующего начала лекарственных препаратов для профилактики и терапии ишемических повреждений мозга.
Свободнорадикальное окисление является необходимым процессом для нормального функционирования клеток, но вместе с тем это и один из универсальных механизмов их повреждения [Ю.А.Владимиров. Биологические мембраны и незапрограммированная смерть клетки. Соровск. Образовательный журн., 2000, т.6, №9, с.2-9; Е.Б.Меньщикова, В.З.Ланкин и др. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. М.: Фирма «Слово», 2006, 556 с.; Е.Б.Меньщикова, Н.К.Зенков и др. Окислительный стресс: патологические состояния и заболевания. Новосибирск: АРТА, 2008, 284 с.].
Действие свободных радикалов в организме контролируется эндогенными и экзогенными антиоксидантами, а также ферментными антиоксидантными системами. Нарушение систем регуляции свободнорадикальных процессов может приводить к развитию различных патологических состояний (лучевое поражение, злокачественный рост, гипоксия, ишемия, атеросклероз, стресс и другие) [Е.И.Гусев, В.И.Скворцова. Ишемия головного мозга. М.: Медицина, 2001, 327 с.; М.И.Балаболкин, Е.М.Клебанова, В.М.Креминская. Лечение сахарного диабета и его осложнений: руководство для врачей. М.: Медицина, 2005, 511 с.; Дедов И.И. Свободнорадикальное окисление и антиоксидантная защита при сахарном диабете. М.: Эндокрин. науч. центр РАМН, 2003. 40 с.; Л.Д.Лукьянова. Сигнальная функция митохондрий при гипоксии и адаптации. Патогенез, 2008, №3, с.4-12; D.Harman. Free radical theory of aging: an update: increasing the functional life span. Ann N.Y. Acad. Sci., 2006, vol.1067, p.10-21; E.Atahan. Ischemia-Reperfusion Injury in Rat Skeletal Muscle is Attenuated by Zinc Aspartate, J.Surg. Res., 2007, vol.137, №1, p.109-116).
В связи с этим актуальное значение приобретает проблема фармакологической коррекции свободнорадикальных процессов с помощью экзогенных препаратов, оказывающих антиоксидантное и антирадикальное действие (В.В.Абрамченко. Антиоксиданты и антигипоксанты в акушерстве (оксидативный стресс в акушерстве и его терапия антиоксидантами и антигипоксантами). СПб.: Деан, 2001, 400 с.; Н.Е.Арзамасцева. Окислительный стресс при хронической сердечной недостаточности и сахарном диабете типа 2. Автореф. дис… канд. мед. наук: М., 2006, 25 с.). Антирадикальные препараты применяются как для профилактики, так и для лечения свободнорадикальных патологий (W.A.Pryor, Vitamin E and heart disease: basic science to clinical intervention trials. Free Radio. Biol. Med., 2000, vol.28, p.141-164).
Однако, несмотря на широкий спектр веществ с антиоксидантным и антирадикальным действием в эксперименте, эффективных лекарственных средств, внедренных в клиническую практику, - незначительное количество. Кроме того, существующие препараты имеют ряд недостатков, связанных с особенностями биологического эффекта и его величиной либо с токсичностью (Ю.Н.Шанин, В.А. Шанин, Е.В.Зиновьев. Антиоксидантная терапия в клинической практике. СПб.: ЭЛБИ, 2003, 128 с.; Е.Б.Бурлакова. Блеск и нищета антиоксидантов. Наука и жизнь, 2006, №2, с.3-6). Поэтому поиск новых высокоэффективных антиоксидантных средств остается актуальным.
Одними из наиболее значимых патологий, которые могут привести к необратимым последствиям и гибели организма, являются различные ишемические повреждения центральной нервной системы. Неуправляемая и некомпенсированная активация процессов перекисного окисления липидов, истощение эндогенных антиоксидантов и нарушение регуляторных механизмов антирадикальной защиты рассматриваются как ключевые звенья повреждения нейронов. Быстрое и полное устранение этих факторов является наиболее актуальной проблемой современной неврологии. Однако восстановление снабжения тканей кислородом может спровоцировать неуправляемый рост активных форм кислорода, и в этих условиях возникает опасность окислительного стресса. В связи с этим важно найти пути избирательного воздействия на повреждающее действие свободных радикалов и цитотоксинов. Выходом из этой ситуации может стать использование антирадикальных соединений, способных понижать уровень свободных радикалов в тканях (Н.В.Верещагин и др. Антиоксиданты в ангионеврологии. Нервные болезни, 2004, №3, с.8-12). Проблема восстановления функций нервных клеток после гипоксического или ишемического повреждения остается актуальной для современной экспериментальной и клинической нейрофизиологии.
В настоящее время наиболее часто используемыми препаратами с антиоксидантными эффектами являются производные оксипиридинов: эмоксипин(2-этил-6-метил-3-оксипиридин) и мексидол(2-этил-6-метил-3-оксипиридина сукцинат) (Е.И.Гусев, В.И.Скворцова. Нейропротективная терапия ишемического инсульта. Журн. неврологии и психиатрии. Инсульт: прилож. к журн., 2002, №5, с.3-16; Н.В.Верещагин и др. 2004; Т.А.Воронина, Л.Д.Смирнов, И.И.Горяйнова. Механизм действия и обоснование применения препарата мексидол в неврологии. М., 2002, 14 с.). Механизм их антиоксидантного и антирадикального действия связан со взаимодействием с образующимися в ходе перекисных процессов перокси- и алкоксирадикалами за счет легкоподвижного атома водорода, связанного с азотом в составе ароматического гетероцикла (И.В.Чечет, О.Ю.Чечет, В.Б.Кузин. Реакции свободнорадикального окисления, их участие в патогенезе некоторых заболеваний и возможности ингибирования производными 3-оксипиридина. Нижегородский мед. журнал, 2006, №7, с.93-99).
Эмоксипин обладает широким спектром биологического действия. Он ингибирует свободнорадикальное окисление, активно взаимодействует с перекисными радикалами липидов, роксильными радикалами пептидов, стабилизирует клеточные мембраны. Кроме того, препарат снижает агрегацию тромбоцитов и нейтрофилов, уменьшает полимеризацию фибрина, тормозит переход фибрина-мономера в фибрин-полимер, ингибирует ФДЭ циклических нуклеотидов, увеличивает содержание цАМФ и цГМФ в клетках. Первоначально был предложен для применения в офтальмологической практике, однако впоследствии с успехом стал применяться в лечении других заболеваний, сопровождающихся усилением перекисного окисления липидов и гипоксией (инфаркт миокарда, реперфузионный синдром, нестабильная стенокардия, ишемические и геморрагические нарушения мозгового кровообращения различного генеза) (Н.В.Верещагин и др., 2004).
Мексидол является ингибитором свободнорадикальных процессов, перекисного окисления липидов, он активирует супероксиддисмутазу, оказывает влияние на физико-химические свойства мембраны, повышает содержание полярных фракций липидов (фосфотидилсерина и фосфотидилинозита и др.) в мембране, уменьшает отношение холестерол/фосфолипиды, уменьшает вязкость липидного слоя и увеличивает текучесть мембраны, активирует энергосинтезирующие функции митохондрий и улучшает энергетический обмен в клетке и, таким образом, защищает аппарат клеток и структуру их мембран (Т.А.Девяткина, Р.В.Луценко, Е.М.Важничая. Фармакологическая активность мексидола при стрессорных повреждениях печени. Экспериментальная и клиническая фармакология, 2003, №3, с.56-58). Для него характерно противогипоксическое, противоишемическое действие, ноотропная и антистрессорная активность, эффективен при острых и хронических нарушениях мозгового кровообращения (Т.А.Воронина, Л.Д.Смирнов, И.И.Горяйнова. Механизм действия и обоснование применения препарата мексидол в неврологии. М., 2002, 14 с.). Мексидол оказывает отчетливое антигипоксическое и противоишемическое действие, что выражается в его способности увеличивать продолжительность жизни и число выживших животных при различных гипоксических стояниях, а также в условиях глобальной ишемии (Е.И.Гусев, В.И.Скворцова. Нейропротективная терапия ишемического инсульта. Журн. неврологии и психиатрии. Инсульт: прилож. к журн., 2002, №5, с.3-16). Применение препарата (в дозе 200-300 мг в сутки на протяжении 2-3 дней внутривенно капельно с последующим переходом на внутримышечное введение в дозе 100-200 мг в сутки в течение 10 дней) в комплексной терапии больных с ишемическими нарушениями мозгового кровообращения позволяет снизить летальность, добиться более быстрой активации состояния сознания и регресса очагового неврологического дефицита (А.И.Федин. Оксидантный стресс и применение антиоксидантов в неврологии. Нервные болезни, 2002, №1, с.15-18).
Однако антиоксидантная, антирадикальная и церебропротективная активность препарата все же остается недостаточно высокой.
Техническим результатом изобретения является повышение эффективности антирадикальных, антиишемических и церебропротективных свойств.
Технический результат достигается сульфатом 2-фенил-3-(3,4-диметоксифенил)-4-(2-морфолиноэтил)пирроло[1,2-а]бензимидазола формулы I:
проявляющим антирадикальные, антиишемические и церебропротективные свойства.
Ранее для сульфата 2-фенил-3-(3,4-диметоксифенил)-4-(2-морфолиноэтил)пирроло[1,2-а]бензимидазола (I) была установлена высокая антиоксидантная активность (В.А.Анисимова, А.А.Спасов, И.А.Бочарова и др. Синтез и фармакологическая активность солей 4-(2-диалкиламиноэтил)-пирроло[1,2-а]бензимидазолов. Хим.-фарм. журн., 1996, т.30, №1, с.22-25).
Синтез его описан в занной статье (В.А.Анисимова и др. 1996). Заключается он во взаимодействии 2-(3,4-диметоксибензил)-1-морфолиноэтилбензимидазола с фенацилбромидом в ацетоне, последующей циклизации полученного бромида 2-(3,4-диметоксибензил)-1-морфолиноэтил-3-фенацилбензимидазолия кипячением в воде в присутствии карбоната или бикарбоната натрия в атмосфере инертного газа, а затем в переводе образующегося трициклического основания в водорастворимый сульфат формулы I.
Ниже приведены результаты исследований биологической активности и токсичности предлагаемого соединения I in vitro и in vivo.
Пример 1. Изучение антирадикальной активности соединения I на модели in vitro.
Антирадикальные свойства изучали по методу D.Glavind (Antioxidants in animal tissue. Acta chemica scand., 1963, vol.17, №6, p.1635-1640). Использовали спиртовой раствор стабильного радикала 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила (ДФПГ•) с максимум поглощения при длине волны 517 нм, исчезающий при добавлении антиоксиданта. Антирадикальную активность определяли по падению оптической плотности спектрофотометрически на спектрофотометре «Apel PD-303UV» (Япония) в кюветах с длиной оптического пути 1 см. Измерения проводили через 5 мин после начала реакции.
Вещества изучали в диапазоне концентраций от 0,1 до 10 мкмоль/л. Препаратом сравнения служил мексидол (НИИ фармакологии РАМН, Россия), вводимый в пробы в аналогичных концентрациях.
Расчет процента ингибирования проводили по формуле:
% ингибирования=100-(D1/D2*100),
где D1 - изменение оптической плотности при добавлении веществ в исследуемой концентрации; D2 - изменение оптической плотности при добавлении пирогаллола.
Для соединения I и мексидола были экспериментально определены величины ИК50 (ингибирующая концентрация, подавляющая процесс пероксидации на 50%) с использованием метода регрессионного анализа в программе Microsoft Excel (пакет Office XP, Microsoft, США).
В ходе исследования было выявлено, что в концентрации 1 мкмоль/л соединение I проявляло активность на уровне 12,9%, превосходя мексидол (% ингибирования реакции 4,3%). При повышении концентрации до 10 мкмоль/л активность вещества в отношении радикала ДФПГ• значительно повышалась - 62,2%, в этих же условиях эффективность мексидола была ниже 13,3%.
По сравнительной расчетной величине константы ингибирования реакции ИК50 вещество I превосходило мексидол: 8,93 мкмоль/л и 2094,22 мкмоль/л, соответственно.
Пример 2. Изучение острой токсичности соединения I.
Для исследуемого веществ и препарата сравнения ранее были установлены показатели LD50, которые равнялись 794 мг/кг (Хим. - фарм. журнал, 1996, т.30, с.24) и 500 мг/кг (Т.А.Воронина. Отечественный препарат нового поколения Мексидол (основные эффекты, механизм действия, применение), 2005, М., 20 с.), соответственно.
Для соединений был рассчитан сравнительный показатель условной широты терапевтического действия (УТИ). При этом использовались показатели ИК50 антирадикальной активности in vitro, а также величина острой токсичности LD50. УТИ соединения I составил 153,34, мексидола - 59,4.
По результатам изучения антирадикальных свойств соединений in vitro рассчитывали величины ИК50 в мкмоль/л (доза, в которой вещество ингибирует реакцию ПОЛ на 50%). Эти дозы, так называемые изоантиоксидантные, рассчитывали в мг/кг и в дальнейшем использовали при исследовании фармакодинамической активности веществ на патологических моделях на животных. Для соединения I данная доза составила 8,2 мг/кг, для мексидола - 122,4 мг/кг.
Пример 3. Изучение противоишемической активности соединения I на модели билатеральной окклюзии сонных артерий.
Опыты были выполнены на 38 белых неинбредных крысах-самцах массой 200-400 грамм. Животных содержали на стандартном пищевом рационе в условиях вивария (температура 22-24°С, относительная влажность воздуха 40-50%) на стандартной диете с соблюдением всех правил и Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997). На момент проведения экспериментов животные были здоровыми, изменений поведения, аппетита, режима сна и бодрствования обнаружено не было. Забой животных производили согласно требованиям, изложенным в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1997).
Ишемию создавали лигированием общих сонных артерий (Р.С.Мирзоян. Методические указания по экспериментальному изучению препаратов для лечения нарушений мозгового кровообращения и мигрени: методические рекомендации: руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М., Медицина, 2000, 398 с.) под кетаминовым наркозом, который вводили внутрибрюшинно в дозе 80 мг/кг.
Вещество I и мексидол вводили крысам внутрибрюшинно за 30 минут до оперативного вмешательства в изоантиоксидантных дозах 8,2 и 122,4 мг/кг, соответственно. Группам контрольных животных - контроль-ишемия и ложнооперированный контроль - вводили в эквивалентном объеме физиологический раствор.
В ходе эксперимента регистрировали выживаемость животных на 1, 2 и 3 сутки после проведения билатеральной окклюзии, изучали уровень двигательной активности и неврологический статус, а также исследовали характер поведения крыс в тесте «открытое поле».
Неврологический статус животных оценивали по суммарной 12-ти бальной системе. Каждую реакцию оценивали, исходя из возможного максимального количества баллов, равного 2-м - нормальные (2 балла), сниженные (1 балл) или отсутствующие (0 баллов) рефлексы. Рассматривали следующие рефлексы - реакция отдергивания хвоста и лапки, реакция вздрагивания на звуковой раздражитель, хватания передними лапами, переворачивания, роговичный рефлекс (Я.Буреш, О.Бурешова, Д.П.Хьюстон. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения, пер. с англ. Е.Н.Живописцевой, М., Высшая школа, 1991, 399 с.).
Показатели локомоторной активности регистрировали с помощью актометра («Ugo Basile», Италия). Крысу помещали в камеру размером 37×27×27 см с прозрачным верхом и полом из 30 стальных перекладин, расположенных на равном расстоянии и изолированных друг от друга. Регистрацию результатов проводили с помощью прилагаемого принтера. Двигательную активность регистрировали в течение 5 мин и оценивали в условных единицах.
Также исследовали реакцию свободного поведения крыс в тесте «открытое поле». Для этого животных помещали на 3 мин в равномерно освещенный ринг диаметром 1 м и высотой 80 см, размеченный на квадраты 15×15 см с отверстиями на пересечении квадратов - «норками». Регистрировали латентное время выхода из центрального квадрата, горизонтальную активность - число пересеченных периферических квадратов, вертикальную активность - число «стоек», поисковую активность - число заглядываний в «норки», «груминг» - уход за кожей и шерстью и количество болюсов.
После забоя животных методом декапитации через 3 суток после операции проводили забор тканей мозга и крови. Ткани взвешивали и гомогенизировали на холоде в 10 объемах физиологического раствора. Для удаления крупных частиц, создающих мутность, гомогенат центрифугировали при 1500 об/мин на центрифуге ОПН-3 (Россия) в течение 10 мин. Последующие определения проводили в супернатанте.
В крови и тканях мозга крыс определяли содержание малонового диальдегида (МДА) и диеновых конъюгатов (ДК), а также активность антиоксидантного фермента глутатионпероксидазы (ГП).
Диеновые конъюгаты (ДК) определяли в липидном экстракте, получаемом с помощью гептан-изопропиловой смеси (1:1), по интенсивности поглощения в области 232 нм после высаливания воды (В.С.Камышников. Клинико-биохимическая лабораторная диагностика. Минск, 2003, 2-е изд., т.2, 495 с.). Уровень ДК выражался в условных единицах/мг ткани.
Малоновый диальдегид (МДА) определяли по реакции с тиобарбитуровой кислотой (Л.И.Андреева, Л.А.Кожемякин. Модификация метода определения перекисей липидов в тесте с тиобарбитуровой кислотой. Лабораторное дело, 1988, №11, с.41-46; В.Б.Гаврилов, А.Р.Гаврилова, Л.М.Мажуль. Анализ методов определения продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови по тесту с тиобарбитуровой кислотой. Вопросы медицинской химии, 1987, №1, с.118-122). Для этого к исследуемому образцу добавляли 6% фосфорную кислоту и 0.8% раствор 2-тиобарбитуровой кислоты. Пробирки 30 мин кипятили на водяной бане, затем охлаждали на льду. Для повышения специфичности реакции хромогенный продукт экстрагировали н-бутиловым спиртом и калориметрировали при 532 нм. Концентрацию МДА вычисляли по коэффициенту молярной экстинкции К=1,56×105 М-1 см-1 для оптического показателя E535-580 и выражали в в плазме нмоль/мл плазмы, а в органах - в нмоль/г ткани.
При определении активности глутатионпероксидазы (ГП) за основу был взят метод, основанный на окислении глутатиона в присутствии гидроперекиси третичного бутила (ГПТБ) и образования в реакции с реактивом Эллмана (5,5'-дитиобис(2-нитробензойной кислотой) (ДТНБК)) окрашенного комплекса, количество которого прямо пропорционально количеству SH-групп, прореагировавших с ДТНБК (Е.М.Моин. Простой и специфический метод определения активности глутатионпероксидазы в эритроцитах. Лабораторное дело, 1986, №12, с.724-727). В ходе эксперимента к 0,02 мл супернатанта прибавляли 1 мл 4,8 мМ раствора восстановленного глутатиона и 0,1 мл 20 мМ раствора ГПТБ, инкубировали смесь 5 минут при t 37°С. После осаждения белка 0,1 мл 50% раствором трихлоруксусной кислоты смесь центрифугировали 10 минут 3000 об/мин на центрифуге ОПН-3 (Россия). К 0,1 мл образовавшегося супернатанта добавляли 5 мл 0,1 М трис-хлоридного буфера рН 8,5 и 0,1 мл 0,01 М метанольного раствора реактива Эллмана. Полученную окраску измеряли при 412 нм. Активность фермента выражали мкМоль/мин на г ткани.
В ходе эксперимента установлено, что в группе контроль-ишемия статистически значимо снижался уровень выживаемости относительно контрольной группы животных на 50% к третьим суткам опыта. Наибольшую смертность животных отмечали в первые 12 ч и на первые сутки после перевязки сонных артерий. Однако в группах животных, получавших вещество I и мексидол, количество выживших животных к третьим суткам наблюдений достоверно увеличивалось - на 33,3 и 7,1% соответственно относительно контроля-ишемии (Табл.1).
Одним из показателей нарушений функций головного мозга является характер и уровень двигательной активности. У ишемизированных крыс в течение трех суток статистически значимо на 80,8% снижалась двигательная активность в актометре (Табл. 2). Соль I практически нормализовала двигательную активность животных к третьим суткам полностью, не уступая контрольной группе и даже превосходя ее на 11,4%. Мексидол увеличивал двигательную активность крыс в актометре на 47,9% относительно группы ишемизированных крыс в первый день после оперативного вмешательства, далее этот показатель возрастал в 2,5 раза (Табл.2).
| Таблица 1 | ||||||
| Влияние изучаемого соединения I и мексидола в изоантиоксидантных дозах 8,2 и 122,4 мг/кг при 2-х сосудистой ишемии головного мозга на выживаемость животных (%) | ||||||
| Группа животных | Количество животных в группе (n) | Доза вещества, мг/кг | Временные интервалы | |||
| 12 часов | 24 часа | 48 часов | 72 часа | |||
| Контроль | 9 | - | 100 | 100 | 100 | 100 |
| Ишемия | 16 | - | 75 | 62,5 | 59,4 | 50* |
| Ишемия + сульфат I | 6 | 8,2 | 100 | 83,3 | 83,3 | 83,3# |
| Ишемия + мексидол | 7 | 122,4 | 100 | 71,4 | 57,1* | 57,1* |
| Примечание: * - данные статистически значимы относительно группы контрольных животных, p<0,05; # - данные статистически значимы относительно группы контрольных ишемизированных животных, p<0,05. |
| Таблица 2 | ||||
| Влияние соединения I и мексидола в изоантиоксидантных дозах 8,2 и 122,4 мг/кг на двигательную активность в актометре при 2-х сосудистой ишемии головного мозга (у.е.) (M±m) | ||||
| Группа животных | Доза вещества, мг/кг | Временные интервалы | ||
| 24 часа | 48 часов | 72 часа | ||
| Контроль | - | 86,5±17,3 | 70,0±10,4 | 68,8±14,6 |
| Ишемия | - | 18,6±7,0* | 11,2±4,1* | 13,2±3,3* |
| Ишемия + I | 8,2 | 63,8±26,7 | 58,8±13,6# | 76,7±6,0# |
| Ишемия + мексидол | 122,4 | 27,5±2,8* | 50,8±18,9 | 32,8±17,9 |
| Примечание: * - данные статистически значимы (t) относительно группы контрольных животных, p<0,05; # - данные статистически значимы (t) относительно группы контрольных ишемизированных животных, p<0,05. |
В группе животных с ишемией отмечались выраженные неврологические нарушения, прогрессирующие с течением времени, с 6,2 до 5,2 балла по сравнению с группой контрольных животных (10,8 баллов) (Табл.3). Вещество I практически полностью восстанавливало неврологические повреждения у животных с ишемией до 10,5 баллов на третьи сутки после операции (p<0,05), в то время как препарат мексидол проявлял это в меньшей степени, неврологический дефицит был более выраженным и нарастал во времени - 6,5 баллов на третьи сутки наблюдений (Табл.3).
| Таблица 3 | ||||
| Влияние изучаемого вещества I и мексидола в изоантиоксидантных дозах 8,2 и 122,4 мг/кг на неврологический статус крыс (в баллах) на модели 2-х сосудистой ишемии головного мозга (M±m) | ||||
| Группа животных | Доза вещества, мг/кг | Временные интервалы | ||
| 24 часа | 48 часов | 72 часа | ||
| Контроль | - | 9,5±0,6 | 10,7±0,6 | 10,8±0,7 |
| Ишемия | - | 6,2±0,7* | 6,2±0,8* | 5,2±0,7* |
| Ишемия + I | 8,2 | 8,8±0,6 | 10,5±0,9 | 10,5±0,3# |
| Ишемия + мексидол | 122,4 | 8,3±0,5# | 7,3±0,5* | 6,5±0,6* |
| Примечание: * - данные статистически значимы (t) относительно группы контрольных животных, p<0,05; # - данные статистически значимы (t) относительно группы контрольных ишемизированных животных, p<0,05. |
В тесте «открытое поле» отмечалось статистически значимое снижение у ишемизированных крыс относительно контрольной группы животных в течение 3-х суток после операции как горизонтальной (локомоторной) и вертикальной (ориентировочно-исследовательской), так и поисковой активности (норковый рефлекс) на 85, 73 и 68%, соответственно. Время нахождения в центральном квадрате статистически значимо увеличилось на 82% (Табл.4-7). Следует отметить, что данные параметры только усугублялись с течением времени.
Вещество I проявлял высокую эффективность, горизонтальная активность у крыс достоверно повышалась сравнительно группы животных с ишемией в 3,6 и 3,9 раза, соответственно, уровни вертикальной активности и норкового рефлекса увеличились по сравнению с контрольной ишемизированной группой в 3,8 и 4,1 раза; и в 3,5 и 3,9 раза, соответственно (p≤0,05). Длительность нахождения в центральном квадрате достоверно снизилась на 95 и 90% соответственно. Мексидол достоверно увеличивали у животных с экспериментальной ишемией относительно группы контроль-ишемия локомоторную (в 2,8 раза), вертикальную и поисковую активности (в 2,1 и 1,2 раза соответственно), время нахождения в центральном квадрате уменьшилось практически на 85% (Табл.4-7).
| Таблица 4 | |||
| Влияние вещества I и мексидола в изоантиоксидантных дозах 8,2 и 122,4 мг/кг на поведенческую активность крыс (горизонтальная активность) в тесте «открытое поле» на модели 2-х сосудистой ишемии головного мозга (M±m) | |||
| Группа животных | Временные интервалы | ||
| 24 часа | 48 часов | 72 часа | |
| Горизонтальная активность, количество пересеченных квадратов | |||
| Контроль | 48,8±8,7 | 67,5±4,4 | 62,3±5,9 |
| Ишемия | 22,5±5,8* | 11,7±2,7* | 9,3±2,2* |
| Ишемия + I | 44,4±7,4# | 43,2±8,5*# | 36,2±6,2*# |
| Ишемия + мексидол | 36,8±6,8 | 33,3±7,6* | 26,5±9,6* |
| Примечание: * - данные статистически значимы (t) относительно группы контрольных животных, p<0,05; # - данные статистически значимы (t) относительно группы контрольных ишемизированных животных, p<0,05. |
| Таблица 5 | |||
| Влияние вещества I и мексидола в изоантиоксидантных дозах 8,2 и 122,4 мг/кг на поведенческую активность крыс (вертикальная активность) в тесте «открытое поле» на модели 2-х сосудистой ишемии головного мозга (M±m) | |||
| Группа животных | Временные интервалы | ||
| 24 часа | 48 часов | 72 часа | |
| Вертикальная активность, количество стоек | |||
| Контроль | 14,4±3,9 | 17,4±1,9 | 17,2±1,8 |
| Ишемия | 5,8±2,1 | 4,5±1,1* | 4,5±0,7* |
| Ишемия + I | 13,0±1,2# | 16,5±2,1# | 16,5±2,7# |
| Ишемия + мексидол | 14,7±2,2# | 17,2±2,0# | 18,4±2,9# |
| Примечание: * - данные статистически значимы (t) относительно группы контрольных животных, p<0,05; # - данные статистически значимы (t) относительно группы контрольных ишемизированных животных, p<0,05. |
| Таблица 6 | |||
| Влияние вещества I и мексидола в изоантиоксидантных дозах 8,2 и 122,4 мг/кг на поведенческую активность крыс (норковый рефлекс) в тесте «открытое поле» на модели 2-х сосудистой ишемии головного мозга (M±m) | |||
| Группа животных | Временные интервалы | ||
| 24 часа | 48 часов | 72 часа | |
| Поисковая активность, количество заглядываний в норки | |||
| Контроль | 3,8±0,5 | 5,5±0,7 | 5,7±0,7 |
| Ишемия | 3,0±0,9 | 2,5±0,8* | 1,8±0,8* |
| Ишемия + I | 2,3±0,9*# | 5,3±0,3# | 6,3±0,8# |
| Ишемия + мексидол | 1,3±0,6 | 1,0±0,6* | 2,3±0,9* |
| Примечание: * - данные статистически значимы (t) относительно группы контрольных животных, p<0,05; # - данные статистически значимы (t) относительно группы контрольных ишемизированных животных, p<0,05. |
| Таблица 7 | |||
| Влияние вещества I и мексидола в изоантиоксидантных дозах 8,2 и 122,4 мг/кг на поведенческую активность крыс (латентное время выхода из центрального квадрата) в тесте «открытое поле» на модели 2-х сосудистой ишемии головного мозга (M±m) | |||
| Группа животных | Временные интервалы | ||
| 24 часа | 48 часов | 72 часа | |
| Латентное время выхода из центрального квадрата, сек | |||
| Контроль | 3,3±0,7 | 2,8±0,4 | 2,8±0,4 |
| Ишемия | 10,0±3,9 | 14,2±4,3* | 13,8±4,2* |
| Ишемия + I | 4,4±1,5 | 3,6±0,5 | 2,4±0,2# |
| Ишемия + мексидол | 2,3±0,3 | 2,3±0,5# | 2,5±0,3# |
| Примечание: * - данные статистически значимы (t) относительно группы контрольных животных, p<0,05; # - данные статистически значимы (t) относительно группы контрольных ишемизированных животных, p<0,05. |
О состоянии процессов липопероксидации судили по содержанию в крови и гомогенатах тканей головного мозга малонового диальдегида, а также диеновых конъюгатов. У крыс с экспериментальной ишемией наблюдалась выраженная активация перекисного окисления липидов (Табл.8). В головном мозге отмечалось повышенное образование первичных продуктов перекисного окисления липидов - диеновых конъюгатов на 46,2% (p<0,05) и статистически значимое накопление конечного продукта - малонового диальдегида - как в мозге на 66,1%, так и в сыворотке крови на 50,9%.
| Таблица 8 | |||
| Влияние веществ I и мексидола в изоантиоксидантных дозах 8,2 и 122,4 мг/кг на содержание малонового диальдегида и диеновых конъюгатов в сыворотке крови и гомогенате мозга при 2-х сосудистой ишемии головного мозга через 72 ч (M±m) | |||
| Группа животных | МДА, сыворотка крови, нмоль/мл | МДА, мозг, нмоль/г ткани | ДК, мозг, усл. ед./мг ткани |
| Контроль | 2,29±0,38 | 82,30±8,67 | 0,65±0,06 |
| Ишемия | 3,45±0,22* | 136,70±11,18* | 0,95±0,03* |
| Ишемия + I | 2,07±0,22# | 112,59±16,73# | 0,54±0,13# |
| Ишемия + мексидол | 3,45±0,37 | 132,92±22,68 | 0,66±0,00 |
| Примечание: * - данные статистически значимы (t) относительно группы контрольных животных, p<0,05; # - данные статистически значимы (t) относительно группы контрольных ишемизированных животных, p<0,05. |
Вещество I проявило выраженные антирадикальные свойства, подавляя образование малонового диальдегида и тем самым уменьшая перекисные процессы у крыс с экспериментальной ишемией головного мозга, в сыворотке - на 36,8% (p<0,05) и мозге - на 39,9%, концентрация диеновых конъюгатов уменьшилась на 43,6% (p<0,05). Препарат сравнения мексидол у ишемизированных крыс приводил к незначительному уменьшению в сыворотке малонового диальдегида - лишь на 0,15% и в тканях мозга - на 2,8%, однако, уровень диеновых конъюгатов снизился по сравнению с группой контроль-ишемия на 30,5% (Табл.8).
Нарастание перекисного окисления липидов при ишемии головного мозга у крыс сопровождалось также статистически значимым подавлением активности одного из антиоксидантных ферментов - глутатионпероксидазы - в сыворотке крови на 76,7% (Табл.9).
Изучаемое вещество I имело тенденцию к увеличению активности фермента в сыворотке крови по сравнению с группой ишемизированных животных в 4 раз, препарат сравнения действовал менее эффективно - активность фермента возрастала в 1,96 раза (Табл.9).
| Таблица 9 | |
| Влияние веществ I и мексидола в изоантиоксидантных дозах 8,2 и 122,4 мг/кг на активность глутатионпероксидазы в сыворотке крови у крыс при 2-х сосудистой ишемии головного мозга (ммоль/мин/мл) (M±m) | |
| Группа животных | Глутатионпероксидаза, ммоль/мин/мл |
| Контроль | 105,86±17,53 |
| Ишемия | 24,74±11,86* |
| Ишемия + I | 71,18±18,33 |
| Ишемия + мексидол | 48,37±11,94* |
| Примечание: * - данные статистически значимы (t) относительно группы контрольных животных, p<0,05; # - данные статистически значимы (t) относительно группы животных с ишемией, p<0,05. |
Пример 4. Исследование активности соединения I на модели тотального ишемического повреждения головного мозга.
Опыты были выполнены на 62 белых неинбредных крысах обоего пола массой 250-350 г. Животных содержали на стандартном пищевом рационе в условиях вивария и на момент проведения экспериментов они были здоровыми, изменений поведения, аппетита, режима сна и бодрствования обнаружено не было.
Забой животных проводили согласно требованиям, изложенным в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1997).
Соединение I и мексидол вводили внутрибрюшинно за 30 мин до оперативного вмешательства в изоантиоксидантных дозах 8,2 и 122,4 мг/кг, соответственно. Ишемию создавали путем наложения лигатур (окклюзоров) на общие сонные артерии под наркозом хлоралгидратом (внутрибрюшинно в дозе 400 мг/кг массы животного) в течение 30 мин. Предварительно у животных проводили забор крови из яремной вены из расчета 1 мл крови на 200 г веса животного для создания артериального давления 80/60 мм рт.ст. Затем проводили 30-минутная реперфузия путем удаления окклюзоров (Р.С.Мирзоян, Т.С.Ганьшина и др. Изыскание и изучение новых цереброваскулярных и противомигренозных средств. Бюллетень Сибирской медицины, 2006, т.5, Приложение 2, с.55-57). Забой проводили через 30 мин и 24 ч после начала реперфузии.
После забоя животных методом декапитации проводили забор органов и крови. Ткани взвешивали и гомогенизировали при охлаждении в 10 объемах физиологического раствора. Для удаления крупных частиц, создающих мутность, гомогенат центрифугировали при 3000 об/мин на центрифуге ОПН-3 (Россия) в течение 10 мин. Все последующие определения проводили в супернатанте.
В крови и тканях мозга животных определяли активность антиоксидантного фермента глутатионпероксидазы (Е.М.Моин, 1986).
В ходе работы было отмечено повышение уровня выживаемости животных в группах крыс с изучаемыми веществами по отношению к группе контроль-ишемия при 30-минутной и 24-часовой реперфузии (Табл.10). Соединение I приводило к увеличению выживаемости крыс при 30-минутной реперфузии на 66,7%, при 24-часовой данный показатель был чуть ниже - 60%. Мексидол немного уступал по влиянию на выживаемость животных изучаемому соединению - при получасовой реперфузии - 57,14%, при суточной реперфузии - 50%.
| Таблица 10 | ||||
| Влияние вещества I и мексидола в изоантиоксидантных дозах 8,2 и 122,4 мг/кг при тотальной ишемии головного мозга на выживаемость животных в разные сроки реперфузии (%) | ||||
| Группа животных | Количество животных в группе, n | Доза вещества, мг/кг | Временные интервалы, выживаемость, % | |
| 0,5 часа | 24 часа | |||
| Контроль | 14 | - | 100,0 | 100,0 |
| Ишемия | 17 | - | 42,9* | 40,0* |
| Ишемия + I | 16 | 8,2 | 66,7 | 60,0 |
| Ишемия + мексидол | 15 | 122,4 | 57,1 | 50,0* |
| Примечание: * - данные статистически значимы относительно группы контрольных животных, p<0,05. |
У животных с экспериментальной патологией наблюдалось значительное повышение перекисных процессов как в сыворотке крови, так и в головном мозге.
При исследовании активности фермента глутатионпероксидазы в крови и мозге у крыс с экспериментальной патологией было установлено достоверное снижение этого показателя на 43,6% и 55,0% в сыворотке при 30 минутах и при 24 часах и на 28,8% и 41,2% в мозге в те же временные интервалы соответственно (Табл.11). У крыс с ишемией, которым вводили соединение I, активность фермента повышалась по сравнению с ишемизированным контролем как в сыворотке на 144,0 и 85,7%, так и в мозге на 169,7 и 41,1% соответственно при получасовой и 24-часовой реперфузии (p<0,05). Тогда как мексидол действовал лишь на глутатионпероксидазу в мозге крыс, увеличивая ее активность при 30-минутной реперфузии на 59,3% и через сутки после реперфузии - на 28,2% (Табл.11).
| Таблица 11 | |||
| Влияние вещества I и мексидола в изоантиоксидантных дозах 8,2 и 122,4 мг/кг на активность глутатионпероксидазы в сыворотке крове и мозге (ммоль/мин/г ткани или мл сыворотки) (M±m) | |||
| Группа животных | Доза вещества, мг/кг | Временные интервалы | |
| 0,5 часа | 24 часа | ||
| Сыворотка крови, ммоль/мин/мл | |||
| Контроль | - | 248,67±9,82 | 218,80±29,85 |
| Ишемия | - | 140,21±23,74* | 98,57±34,87* |
| Ишемия + I | 8,2 | 342,17±9,26*# | 183,08±14,80# |
| Ишемия + мексидол | 122,4 | 141,23±11,04* | 122,43±20,70* |
| Мозг, ммоль/мин/г | |||
| Контроль | - | 156,88±22,43 | 141,13±5,55 |
| Ишемия | - | 111,65±39,09 | 83,03±21,94* |
| Ишемия + I | 8,2 | 301,13±4,76*# | 117,16±6,90* |
| Ишемия + мексидол | 122,4 | 177,82±34,66 | 106,41±19,87 |
| Примечание: * - данные статистически значимы (t) относительно группы контрольных животных, p<0,05; # - данные статистически значимы (t) относительно группы контрольных ишемизированных животных, p<0,05. |
В результате проведенных исследований установлено, что соединение I оказывает выраженное антирадикальное действие in vitro, превосходящее по эффектам препараты сравнения тролокс и мексидол. Также данное вещество проявило в условиях 2-х сосудистой ишемии более выраженную противоишемическую активность относительно препарата сравнения мексидола; соединение I способствовало повышению уровня выживаемость крыс, улучшало их двигательную, поведенческую активности и восстанавливало неврологический дефицит, также в достаточной степени влияло на антиоксидантный статус животного и процессы перекисного окисления липидов. Исследование противоишемических эффектов вещества I при ишемически-реперфузионных повреждения головного мозга показало, что соединение способствовало увеличению выживаемости животных как при ранних, так при более поздних нарушениях функции головного мозга. Оно увеличивало активность фермента глутатионпероксидазы как в крови, так и тканях мозга при ранних и более отдаленных реперфузионных поражениях мозга.
Таким образом, изучаемое антирадикальное вещество I и препарат сравнения мексидол при профилактическом введении оказывали положительное действие на показатели перекисного окисления липидов и антиоксидантный статус организма на экспериментальных моделях ишемического поражения головного мозга у крыс, но более активным оказалось вещество I.
Исходя из вышеизложенного, можно заключить, что данное вещество является перспективным для дальнейшего изучения его антирадикальной активности, так и противоишемической и церебропротекторной, что в дальнейшем позволит судить о перспективах создания нового отечественного лекарственного препарата на основе этого вещества.
Применение сульфата 2-фенил-3-(3,4-диметоксифенил)-4-(2-морфолиноэтил)пирроло[1,2-а]бензимидазола формулы I
в качестве соединения, проявляющего антирадикальные, антиишемические и церебропротективные свойства.
