Способ концентрирования нативного о-антигена vidrio cholerae

Изобретение относится к технологии производства медицинских иммунобиологических препаратов и касается способа концентрирования нативного O-антигена Vibrio cholerae. Сущность изобретения включает концентрирование нативного O-антигена V.cholerae с применением мембраны с номинальной отсечкой по молекулярной массе 500 кДа в режиме проточной (тангенциальной) фильтрации с давлением 0,24-0,26 МПа, средней удельной скоростью фильтрации (79±2) дм³/м²/ч. Преимущество изобретения заключается в увеличении производительности процесса и снижении потери O-антигена на 40%, с сохранением показателей качества препарата. 3 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к технологии производства медицинских иммунобиологических препаратов, в частности к способам концентрирования нативного O-антигена Vibrio cholerae, и может быть использовано в практике производства вакцины оральной холерной бивалентной химической таблетированной.

O-антиген V. cholerae 01 классического биовара штамма М-41 серовара Огава, наряду с холерогеном-анатоксином и O-антигеном V. cholerae O1 классического биовара штамма 569 В серовара Инаба являются основными компонентами вакцины оральной холерной бивалентной химической таблетированной.

Данная вакцина в 2001 году Приказом Минздрава России (№229 от 27.06.2001 г.) включена в Национальный календарь профилактических прививок по эпидемическим показаниям, предусматривающим проведение вакцинации лиц, выезжающих в неблагополучные по холере страны, и населения приграничных районов России в случае возникновения неблагоприятной по холере обстановке на сопредельной территории.

Известен способ получения пероральной химической вакцины (патент России №2076734, 1997 г.). В данном изобретении разработан промышленный способ изготовления химической оральной вакцины, содержащей анатоксин-холероген и O-антиген, таблетированной с ацидорезистентным покрытием. Сущность данного способа заключается в раздельном получении анатоксина-холерогена и соматического O-антигена, что достигается последовательным фракционным выделением сульфатом аммония из обеззараженной формальдегидом культуральной жидкости гипертоксигенных полученных методом генной инженерии штаммов холерного вибриона соматического O-антигена между 0,2-0,35 насыщения и анатоксина-холерогена между 0,35-0,80 насыщения.

Известен способ производственного получения O-антигена Огава (патент России №2080121, 1997 г.), при котором проводят глубинное культивирование вибрионов в реакторе, обезвреживание, сепарирование микробных тел, выделение и очистку O-антигена из культуральной жидкости, диализ, лиофильное высушивание, добавление к компонентам оральной вакцины, таблетирование и покрытие ацидорезистентной оболочкой. O-антиген Огава получают из культуральной жидкости, выдержанной в течение 20-30 дней при 10-12°C с 0,2-0,3% формалина, путем осаждения сульфатом аммония при 0,5 насыщении при рН 7,0±0,3 и фракционированием между 0,3-0,4 насыщения при рН 6,8±0,1 и концентрации белка 1,0±0,2% с последующей лиофилизацией и обогащением полученным антигеном Огава препарата.

Известен способ получения О-антигена штамма возбудителя холеры 0139 серовара (Джапаридзе М.Н., Наумов А.В., Громова О.В. и др. Использование нового штамма Vibrio cholerae 0139 в качестве продуцента энтеральной химической вакцины. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии, 1996; 2:52-55), в котором выделение антигена из культуральной жидкости проводится фракционированием сульфатом аммония в интервале 0,2-0,8 насыщения при рН 7,0±0,3, с последующим диализом и лиофилизацией.

Недостатком описанных способов является применение значительного количества сульфата аммония, затрачиваемого на выделение O-антигенов из большого объема культуральной жидкости.

Известен способ получения O-антигена холерного очищенного для специфической индикации и диагностики холеры (патент России №2143280, 1999 г.), сущность которого заключается в том, что из нативного O-антигена удаляют балластные белки осаждением их при рН 4,4±0,2 с последующим центрифугированием, далее концентрируют и отделяют неспецифические примеси с молекулярной массой менее 100 кДа ультрафильтрацией, а неспецифические примеси с молекулярной массой менее 300 кДа отделяют колоночной хроматографией. Недостатком данного способа является то, что концентрирование и очистка O-антигена осуществляется в две стадии (ультрафильтрация с последующим хроматографированием).

Известным и наиболее близким к заявляемому решению является способ получения O-антигена (Дятлов И.А., Нижегородцев С.А., Громова О.В. и др. Разработка ультрафильтрационной технологии получения O-антигена холерного вибриона для производства вакцин. Пробл. особо опасных инф. 2001; 2(82):133-139), реализованный в технологии производства вакцины холерной бивалентной химической таблетированной, сущность которого заключается в том, что нативный О-антиген, полученный при глубинном культивировании V.cholerae O1 классического биовара штамма М-41 серовара Огава и отделенный от биомассы центрифугированием, концентрируют ультрафильтрацией в тупиковом режиме на установке с модулями из полых волокон с номинальной отсечкой по молекулярной массе 17 кДа при давлении фильтруемого материала на входе в установку с модулями из полых волокон, равном 0,02-0,03 МПа, со средней удельной скоростью фильтрации 8-12 дм³/м²/ч. При данном способе концентрирования O-антиген, имеющий молекулярную массу 800-1000 кДа, остается внутри пор полых волокон, а балластные вещества с молекулярной массой менее 17 кДа отводятся в линию фильтрата. Сконцентрированный в порах полых волокон O-антиген смывают стерильной дистиллированной водой через линию отвода фильтрата. Недостатками данного способа являются следующие: большие потери при получении концентрированного O-антигена вследствие того, что значительная часть O-антигена остается в порах полых волокон после его смыва; низкая средняя удельная скорость фильтрации, обусловленная тем, что процесс фильтрации происходит при маленьком давлении фильтруемого материала на входе в установку с модулями из полых волокон и применением ультрафильтрационных модулей с малым значением номинальной отсечки по молекулярной массе.

Технический результат заключается в увеличении выхода получаемого продукта - O-антигена с сохранением показателей качества препарата и повышении средней удельной скорости фильтрации.

Технический результат достигается тем, что концентрирование O-антигена осуществляют путем проточной фильтрации через мембранные модули с номинальной отсечкой по молекулярной массе 500 кДа под давлением 0,24-0,26 МПа.

Сравнение существенных признаков заявляемого способа получения концентрированного О-антигена и наиболее близкого к нему способа показывает, что общим для них является процесс концентрирования О-антигена V.cholerae.

Существенными отличительными признаками заявляемого способа являются: концентрирование осуществляют в режиме проточной (тангенциальной) фильтрации через мембранные фильтры с номинальной отсечкой по молекулярной массе 500 кДа под давлением 0,24-0,26 МПа, что позволяет увеличить среднюю удельную скорость фильтрации. Осуществление процесса ультрафильтрации в режиме проточной фильтрации с отводом сконцентрированного O-антигена в отдельную емкость, что исключает операцию смыва O-антигена и приводит к уменьшению его потерь.

Фильтрация в проточном (тангенциальном) потоке является разделительным методом, в котором поток жидкости направляется вдоль мембраны, омывая ее поверхность. Такой смывающий эффект позволяет постоянно удалять отложения, предотвращая их скапливание и образование слоя на поверхности фильтра, которое известно под названием концентрационной поляризации, уменьшающей скорость фильтрации. Материал мельче номинального порога отсечения по молекулярной массе проходит через ультрафильтрационную мембрану в линию фильтрата. Материал, превышающей номинальный порог отсечения по молекулярной массе, "отбрасывается" мембраной и концентрируется в отдельную емкость. Потери продукта за счет незначительного "мертвого" объема мембраны минимальны и сводятся к нулю путем промывки мембранного модуля дистиллированной водой в количестве, соответствующем "мертвому" объему мембраны.

Подобранные заявителем режимы, параметры ведения технологического процесса концентрирования O-антигена на пористых мембранах и их характеристики обеспечивают снижение потерь и увеличение средней удельной скорости фильтрации.

Возможность осуществления заявляемого изобретения подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Выбор мембран с номинальной отсечкой по молекулярной массе для концентрирования O-антигена холерного вибриона.

Для работы использовали нативные O-антигены V.cholerae O1 классического биовара штамма М-41 серовара Огава, полученные способом глубинного культивирования и отделенные от биомассы центрифугированием согласно регламенту производства №ПР 01898109-05-06. Для концентрирования нативного О-антигена применяли мембранные модули с номинальной отсечкой по молекулярной массе 20, 30, 50, 100, 300 и 500 кДа.

Концентрированный O-антиген получали путем рециркуляции нативного O-антигена через систему (установка с кассетным модулем) с отводом фильтрата в отдельную емкость под давлением 0,14-0,18 МПа. Коэффициент кратности концентрирования фильтруемого материала по объему равен 10 раз, что соответствует способу-прототипу. Среднюю удельную скорость фильтрации определяли по объему фильтрата, удаленному за промежуток времени от начала до окончания процесса концентрирования, отнесенную к площади фильтрующей поверхности мембран. Результаты исследований представлены в таблице 1, в которой отражены показатели, полученные при концентрировании с использованием мембранных модулей с различными номинальными отсечками по молекулярной массе.

Анализ данных, представленных в таблице 1, показывает, что при использовании всех мембранных модулей для концентрирования безмикробных центрифугатов содержание О-антигена в концентрате увеличивается, при этом в фильтрате он не обнаруживается. Наибольшая средняя удельная скорость фильтрации определена при использовании мембранного модуля с номинальной отсечкой по молекулярной массе 500 кДа.

Пример 2. Выбор параметров ведения технологического процесса концентрирования O-антигена

Для работы использовали нативные O-антигены V.cholerae O1 классического биовара штамма М-41 серовара Огава, полученные способом глубинного культивирования и отделенные от биомассы центрифугированием согласно регламенту производства №ПР 01898109-05-06. Для концентрирования нативного О-антигена использовали мембранный модуль с номинальной отсечкой по молекулярной массе 500 кДа. Устанавливали значения давлений на входе в установку с мембранным модулем, указанные в таблице 2. Содержание O-антигена в безмикробных центрифугатах в реакции иммунной диффузии с O1-сывороткой составляло 1:8. Концентрирование заканчивали при уменьшении объема безмикробного центрифугата в 10 раз. Среднюю удельную скорость фильтрации определяли по объему фильтрата, удаленному за промежуток времени от начала до окончания процесса концентрирования, отнесенную к площади фильтрующей поверхности мембран. Результаты исследований по обоснованию оптимальных параметров давления при проведении процесса концентрирования О-антигена штамма V.cholerae M41 серовара Огава при использовании мембранного модуля с НОММ 500 кДа представлены в таблице 2.

Как следует из данных таблицы 2, оптимальным параметром давления при проведении процесса концентрирования является 0,24-0,26 МПа, при котором наблюдается максимальная средняя удельная скорость фильтрации.

Пример 3. Получение концентрированного O-антигена V.cholerae О1 классического биовара штамма М-41 серовара Огава мембранным способом в режиме проточной фильтрации с уменьшением потерь и увеличением средней удельной скорости фильтрации.

Для работы использовали нативные O-антигены V. cholerae O1 классического биовара штамма М-41 серовара Огава, полученные способом глубинного культивирования и отделенные от биомассы центрифугированием согласно регламенту производства №ПР 01898109-05-06. Для концентрирования нативного O-антигена использовали мембранные модули с номинальной отсечкой по молекулярной массе 500 кДа.

Концентрированный О-антиген получали путем рециркуляции нативного O-антигена через систему (установка с кассетным модулем) с отводом фильтрата в отдельную емкость под давлением 0,24-0,26 МПа. Коэффициент кратности концентрирования фильтруемого материала по объему равен 10 раз, что соответствует способу-прототипу. Средняя удельная скорость фильтрации концентрирования O-антигена составила: при использовании способа-прототипа (10±2) дм³/м²/ч, по заявляемому способу (79±2) дм³/м²/ч. Таким образом, производительность процесса в заявляемом способе увеличивается почти в 4 раза.

Характеристики лиофильно высушенных О-антигенов, полученных по способу-прототипу и заявляемому способам, приведены в таблице 3.

Данные таблицы свидетельствуют о том, что значения показателя качества препарата соответствуют требованиям регламента производства вакцины холерной бивалентной химической таблетированной, при этом исходя из объемов безмикробных центрифугатов, подвергнутых концентрированию по способу-прототипу и заявляемому способу, и количества полученного сухого препарата O-антигена, его потери снижаются на 40%.

Таблица 1
Способ концентрирования нативного O-антигена V.cholerae
	Значение показателя, полученного при использовании мембранного модуля с номинальной отсечкой по молекулярной массе, кДа
Наименование показателя
	20	30	50	100	300	500
Ц	Ф	К	Ц	Ф	К	Ц	Ф	К	Ц	Ф	К	Ц	Ф	К	Ц	Ф	К
Активность O-антигена в реакции иммунной диффузии с O1-сывороткой, обратный титр	8	0	64	8	0	64	8	0	64	8	0	64	8	0	64	8	0	64
Средняя удельная скорость фильтрации, дм3/м2/час	18	21	23	29	35	51
Примечание. Ц - безмикробный центрифугат, Ф - фильтрат, К - концентрат
Таблица 2
Значения давления на входе в установку, МПа	Содержание O-антигена в реакции иммунной диффузии с O1-сывороткой, обратный титр	Средняя удельная скорость фильтрации, дм3/м2/час
0,15±0,01	64	51±2
0,20±0,01	64	64±2
0,25±0,01	64	79±2
0,30±0,01	64	69±2

Таблица 3
Способ концентрирования нативного O-антигена V.Cholerae
Наименование показателя	Значение показателя качества препарата O-антигена
полученного по способу-прототипу	полученного по заявляемому способу	требования нормативной документации
Содержание O-антигена, обратный показатель титра в реакции непрямой агллютинации с O1-сывороткой	224	256	≥100
Объем безмикробного центрифугата, дм3	200	10	отсутствует
Вес сухого препарата, г	100	7	отсутствует
Средняя удельная скорость фильтрации, дм3/м2/час	10±2	79±2	отсутствует

Способ концентрирования нативного O-антигена V.cholerae, отличающийся тем, что концентрирование осуществляют через мембраны с номинальной отсечкой по молекулярной массе 500 кДа в режиме проточной (тангенциальной) фильтрации с давлением 0,24-0,26 МПа, средней удельной скоростью фильтрации (79±2) дм³/м²/ч.