Антитело против глипикана-3 с улучшенными кинетическими показателями в плазме

Изобретение относится к биохимии и предоставляет собой антитело против глипикана-3, противораковую композицию, противораковое средство, содержащие антитело против глипикана-3. Раскрыты нуклеиновая кислота, клетка-хозяин и способ получения антитела против глипикана-3. Антитело обладает улучшенным временем полужизни в плазме. 6 н. и 5 з.п. ф-лы, 15 ил., 1 табл., 14 пр.

 

Родственные заявки

По настоящей заявке испрашивается приоритет японской патентной заявки No. 2007-256063, поданной 28 сентября 2007, содержание которой включено в описание с помощью ссылки.

Область изобретения

Изобретение относится к способу улучшения кинетических показателей антител против глипикана-3 в плазме (крови), к фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента антитело против глипикана-3, которое обладает улучшенными кинетическими показателями в плазме, и к способу его получения.

Уровень техники

Антитела стабильны в плазме и проявляют незначительные побочные эффекты, поэтому их использование в качестве лекарственных средств привлекает внимание исследователей. Среди нескольких изотипов антител в продаже имеется большое количество терапевтических антител изотипа IgG, и в настоящее время в разработке находится также большое количество терапевтических антител (Janice M. Reichert, Clark J. Rosensweig, Laura B. Faden and Matthew C. Dewitz, Monoclonal antibody successes in the clinic, Nature Biotechnology (2005) 23, 1073-8; Pavlou A.K. and Belsey M.J., The therapeutic antibodies market to 2008, Eur. J. Pharm. Biopharm. (2005) 59(3), 389-96; and Janice M. Reichert and Viia E. Valge-Archer, Development trends for monoclonal antibody cancer therapeutics, Nat. Rev. Drug Disc. (2007) 6, 349-356). Известно, что антитела против глипикана-3 проявляют противоопухолевую активность, оказывая цитотоксическое действие, например, на опухолевые клетки печени и опухолевые клетки легкого (WO 2003/000883). Известно, что конъюгаты антитело-лекарственное средство, содержащие антитело против глипикана-3, связанное с цитотоксическим веществом, также проявляют противоопухолевую активность по отношению к опухоли печени, опухоли яичника, меланоме и т.п. (Albina Nesterova, Paul J. Carter and Leia M. Smith, Glypican 3 as a Novel Target for an Antibody-Drug Conjugate, AACR Abstract No. 656 (2007), Los Angeles, CA, April, 4-18).

Кроме того, для получения терапевтических антител второго поколения разрабатываются способы, которые направлены на усиление эффекторных функций. Например, известно, что антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC) и комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC) усиливаются при аминокислотной замене, когда аминокислоты, составляющие Fc-фрагмент антител изотипа IgG (называемых IgG-антителами), заменяют различными аминокислотами (Kim S.J., Park Y. and Hong H.J., Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies, Mol. Cells (2005) 20(1), 17-29). При получении антитела против глипикана-3 в клетках СНО, лишенных транспортера фукозы, фукоза не присоединяется к разветвленным цепям сахара, соединенным с антителом против глипикана-3. Такое антитело против глипикана-3 обладает значительно более высокой ADCC-активностью, чем антитело против глипикана-3, содержащее фукозу в разветвленной цепи сахара, и существует предположение, что в качестве терапевтического антитела оно имеет большую противоопухолевую активность (WO 2006/067913).

Кроме указанных выше способов, направленных на усиление эффекторных функций, также известны и другие способы, с помощью которых увеличивают или уменьшают время полужизни антитела в плазме крови благодаря аминокислотной замене в аминокислотах, составляющих Fc-фрагмент антитела (Hinton P.R., Xiong J.M., Johlfs M.G., Tang M.T., Keller S. and Tsurushita N., An engineered human IgG1 antibody with longer serum half-life, J. Immunol. (2006) 176(1), 346-56; and Ghetie V., Popov S., Borvak J., Radu C., Matesoi D., Medesan C., Ober R.J. and Ward E.S., Increasing the serum persistence of a IgG fragment by random mutagenesis, Nat. Biotechnol. (1997) 15(7), 637-40). В случае использования способов, которые увеличивают время полужизни антител в плазме крови, для терапевтических антител следует ожидать уменьшения дозы вводимого терапевтического антитела и увеличения интервала между введениями, что позволит обеспечить менее дорогостоящие терапевтические антитела, более удобные в применении.

Говоря научным языком, время полужизни в плазме может быть увеличено путем замены аминокислоты Fc-фрагмента IgG-антитела другой аминокислотой, что приводит к улучшению сродства IgG-антитела в отношении неонатального Fc-рецептора, который, как известно, является рецептором спасения IgG-антител. Кроме того, известно, что время полужизни в плазме крови увеличивается при “перетасовке” отдельных доменов (СН1, СН2, СН3), составляющих константную область антитела (Zuckier L.S., Chang C.J., Scharff M.D. and Morrison S.L., Chimeric human-mouse IgG antibodies with shuffled constant region exons demonstrate that multiple domains contribute to in vivo half-life, Cancer Res. (1998) 58(17), 3905-8). Однако поскольку аминокислотная последовательность константной области IgG-антитела человека является консервативной, то антитело с искусственной аминокислотной заменой, как описано выше, в аминокислотах, составляющих константную область, может вызывать побочные эффекты в результате иммуногенности в организме человека. Поэтому предпочтительна замена только небольшого количества аминокислот.

Известные на сегодняшний день методы аминокислотной замены в вариабельной области (также называемой V-областью) IgG-антител включают методы создания гуманизированных антител (Tsurushita N., Hinton P.R. and Kumar S., Design of humanized antibodies: from anti-Tac to Zenapax, Methods (2005) 36(1), 69-83), “созревания” аффинности, где для усиления связывающей активности проводят аминокислотную замену в гипервариабельном участке (CDR) (Rajpal A., Beyaz N., Haber L., Cappuccilli G., Yee H., Bhatt R.R., Takeuchi T., Lerner R.A. and Crea R., A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2005) 102(24), 8466-71), и аминокислотной замены в аминокислотах, составляющих каркасный участок (FR), для улучшения физико-химической стабильности (Ewert S., Honegger A. and Pluckthun A., Stability improvement of antibodies for extracellular and intracellular applications: CDR grafting to stable frameworks and structure-based framework engineering, Methods (2004) 34(2), 184-99). В отличие от аминокислотной замены в константной области (также называемой С-областью), аминокислотную замену в вариабельном участке обычно используют для улучшения характеристик (например, стабильности) и усиления функции (например, антигенсвязывающей активности) антител. Поскольку аминокислотную последовательность, составляющую CDR гуманизированных антител, получают из аминокислотной последовательности отличных от человека животных, то предполагается, что риск появления иммуногенности в результате осуществления искусственной аминокислотной замены в этой последовательности будет меньше, чем в случае аминокислотной замены в других областях. Кроме того, что касается искусственной аминокислотной замены в аминокислотной последовательности, составляющей FR-участок гуманизированных антител, предполагается, что такая замена вызовет незначительный риск появления иммуногенности, если аминокислотная последовательность FR, полученная в результате замены, будет такой же, как любая из множества аминокислотных последовательностей FR антител человека, которые опубликованы, например, в базе данных Кабата (http://ftp.ebi.ac.uk/pub/database/kabat/), базе данных IMGT (https://imgt.cines.fr/) и т.п. Кроме того, иммуногенность можно уменьшить путем повторного отбора последовательности антитела человека, которая в значительной степени аналогична аминокислотной последовательности FR, полученной в результате замены, из множества аминокислотных последовательностей FR антител человека, которые опубликованы в базе данных Кабата, базе данных IMGT и т.п. (WO 1999/018212).

В отличие от этого, единственными известными способами, позволяющими увеличить время полужизни IgG-антител в плазме, являются, как описано выше, аминокислотные замены аминокислот, составляющих Fc-фрагмент, который является частью константной области, и до настоящего времени не описан ни один способ, который приводил бы к увеличению времени полужизни IgG-антител в плазме крови благодаря аминокислотной замене аминокислот, составляющих вариабельную область, что, предполагается, связано с незначительным риском появления иммуногенности. Предполагается, что причиной этого отчасти является то, что время полужизни IgG-антител в плазме в значительной степени зависит от антигензависимой элиминации и связывания с неонатальным Fc-рецептором, рецептором “спасения” IgG-антител (Lobo E.D., Hansen R.J. and Balthasar J.P., Antibody pharmacokinetics and pharmacodynamics, J. Pharm. Sci. (2004) 93(11), 2645-68) и что функции и свойства вариабельной области не могут оказывать значительного влияния на время полужизни в плазме.

Также было описано, что изоэлектрическая точка (pI) IgG-антитела снижается при анионизации IgG-антитела путем сукцинилирования (Yamasaki Y., Sumimoto K., Nishikawa M., Yamashita F., Yamaoka K., Hashida M. and Takakura Y., Pharmacokinetic analysis of in vivo disposition of succinylated proteins targeted to liver nonparenchymal cells via scavenger receptors: importance of molecular size and negative charge density for in vivo recognition by receptors, Pharmacol. Exp. Ther. (2002) 301(2), 467-77) и что pI IgG-антитела повышается при катионизации IgG-антитела путем модификации с использованием полиамина (Poduslo J.F. and Curran G.L., Polyamine modification increases the permeability of proteins at the blood-nerve and blood-brain barriers, Neurochem. (1996) 66(4), 1599-609). Однако в обоих случаях не происходило повышения времени полужизни модифицированного IgG-антитела в плазме, при этом время полужизни скорее снижалось. Таким образом, повышение времени полужизни IgG-антител в плазме не может быть достигнуто путем модификации pI IgG-антитела в случае использования вышеописанной химической модификации IgG-антитела.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение было выполнено с учетом приведенных выше данных. Целью настоящего изобретения является способ модуляции времени полужизни антитела против глипикана-3 в плазме (крови), антитела против глипикана-3 с модулированным временем полужизни в плазме и фармацевтической композиции, содержащей антитело в качестве активного ингредиента, а также способа получения антитела против глипикана-3 и фармацевтической композиции. Другой целью настоящего изобретения является способ модуляции цитотоксичности антитела путем модуляции времени полужизни проявляющего цитотоксичность антитела в плазме, антитела с модулированной цитотоксичностью и фармацевтической композиции, содержащей это антитело, а также способа получения такого антитела и фармацевтической композиции.

Авторы настоящего изобретения провели целенаправленные исследования способов модуляции времени полужизни антитела (например, антитела против глипикана-3) в плазме. В результате, авторы настоящего изобретения обнаружили, что время полужизни антитела (например, антитела против глипикана-3) в плазме можно модулировать путем модификации - наряду с аминокислотными остатками, составляющими вариабельную область и константную область антитела (например, антитела против глипикана-3), - аминокислотных остатков, находящихся на поверхности молекулы антитела, и, таким образом, путем контроля поверхностного заряда молекулы антитела. А именно, наряду с аминокислотными остатками в аминокислотной последовательности, составляющей вариабельную и константную область антитела (например, антитела против глипикана-3), были идентифицированы конкретные аминокислотные остатки, которые могут изменять время полужизни антитела (например, антитела против глипикана-3) в плазме благодаря модификации поверхностного заряда молекулы антитела, при этом не влияя на структуру или функцию этого антитела, например на антигенсвязывающую активность. Авторы настоящего изобретения также подтвердили, что антитело (например, антитело против глипикана-3), имеющее модулированное таким образом время полужизни, действительно сохраняет свою антигенсвязывающую активность. Авторы настоящего изобретения также обнаружили, что модуляция времени полужизни антитела (например, антитела против глипикана-3) в плазме повышает проявляемую цитотоксическими антителами (такими как антитело против глипикана-3) активность ингибирования пролиферации опухолевых клеток на примере раковых клеток.

Настоящее изобретение относится к способу модуляции времени полужизни антитела (например, антитела против глипикана-3) в плазме путем модификации находящегося на поверхности антитела аминокислотного остатка; антителу (например, антителу против глипикана-3), которое имеет модулированное время полужизни в плазме в результате модификации аминокислотного остатка; к фармацевтической композиции, содержащей антитело в качестве активного ингредиента; и к способу получения такой фармацевтической композиции. Более конкретно, настоящее изобретение относится к следующим объектам:

1. Способ получения антитела против глипикана-3 с модулированными кинетическими показателями в плазме, который включает следующие стадии:

(а) культивирование клетки-хозяина, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело против глипикана-3, в условиях, при которых возможна экспрессия нуклеиновой кислоты, причем антитело против глипикана-3 имеет аминокислотную последовательность, которая изменена так, что модифицирован заряд по меньшей мере одного аминокислотного остатка, который может находиться на поверхности антитела; и

(b) выделения антитела против глипикана-3 из культуры клеток-хозяев;

2. Способ по п.1, где модуляция кинетических показателей в плазме представляет собой увеличение или уменьшение параметра, выбранного из: времени полужизни в плазме, среднего времени пребывания в плазме и плазменного клиренса.

3. Способ по п.1, где модификация заряда аминокислотного остатка происходит путем аминокислотной замены.

4. Способ по п.1, где аминокислотный остаток, который может находиться на поверхности антитела против глипикана-3, расположен на участке антитела против глипикана-3, который не является FcRn-связывающим фрагментом.

5. Способ по п.4, где FcRn-связывающий фрагмент содержит Fc-фрагмент.

6. Способ по п.4, где FcRn-связывающий фрагмент содержит аминокислотные остатки с EU-номерами 250, 253, 310, 311, 314, 428, 435, 436 согласно нумерации Кабата.

7. Способ по п.1, где антитело против глипикана-3 представляет собой IgG-антитело.

8. Способ по п.п.1-7, где аминокислотный остаток, заряд которого модифицирован, представляет собой аминокислотный остаток, расположенный в вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи.

9. Способ по п.8, где антитело против глипикана-3 содержит гипервариабельный участок (CDR), происходящий от отличного от человека животного, каркасный участок (FR), происходящий от человека, и константную область, происходящую от человека, и где модификация заряда аминокислотного остатка происходит путем замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка, который может находиться на поверхности антитела в CDR или FR антитела, на аминокислотный остаток, имеющий заряд, отличающийся от заряда указанного аминокислотного остатка.

10. Способ по п.9, где модификация заряда аминокислотного остатка происходит путем:

(1) по меньшей мере одной замены в вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:1, выбранной из:

(а) замены Q, который является 43-м аминокислотным остатком, на K,

(b) замены D, который является 52-м аминокислотным остатком, на N и

(с) замены Q, который является 107-м аминокислотным остатком, на R;

и/или

(2) по меньшей мере одной замены в вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO:7, выбранной из:

(d) замены Е, который является 17-м аминокислотным остатком, на Q,

(e) замены Q, который является 27-м аминокислотным остатком, на R и

(f) замены Q, который является 105-м аминокислотным остатком, на R;

11. Способ по п.9, где модификация заряда аминокислотного остатка происходит путем:

(1) по меньшей мере одной замены в вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:1, выбранной из:

(а) замены K, который является 19-м аминокислотным остатком, на Т,

(b) замены Q, который является 43-м аминокислотным остатком, на Е,

(с) замены Q, который является 62-м аминокислотным остатком, на Е,

(d) замены K, который является 63-м аминокислотным остатком, на S,

(e) замены K, который является 65-м аминокислотным остатком, на Q и

(f) замены G, который является 66-м аминокислотным остатком, на D;

и/или

(2) по меньшей мере одной замены в вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO:7, выбранной из:

(g) замены R, который является 24-м аминокислотным остатком, на Q;

(h) замены Q, который является 27-м аминокислотным остатком, на E;

(i) замены K, который является 79-м аминокислотным остатком, на T,

(j) замены R, который является 82-м аминокислотным остатком, на S и

(k) замены K, который является 112-м аминокислотным остатком, на E;

12. Способ по п.11, дополнительно включающий по меньшей мере одну модификацию в константной области тяжелой цепи SEQ ID NO:31, выбранную из:

(а) замены Н, который является 151-м аминокислотным остатком, на Q,

(b) замены K, который является 157-м аминокислотным остатком, на Q,

(с) замены R, который является 238-м аминокислотным остатком, на Q,

(d) замены D, который является 239-м аминокислотным остатком, на E,

(e) замены L, который является 241-м аминокислотным остатком, на M и

(f) замены Q, который является 302-м аминокислотным остатком, на E;

13. Способ по любому из п.п.9-12, где антитело против глипикана-3 имеет пониженное содержание фукозы, соединенной с Fc-фрагментом антитела;

14. Антитело против глипикана-3, полученное способом по любому из п.п.1-13.

15. Способ получения антитела с модулированными кинетическими показателями в плазме, который включает следующие стадии:

(а) культивирование клетки-хозяина, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, в условиях, при которых возможна экспрессия нуклеиновой кислоты, причем антитело имеет аминокислотную последовательность, которая изменена так, что модифицируется заряд по меньшей мере одного аминокислотного остатка в константной области антитела, которая не является FcRn-связывающим фрагментом; и

(b) выделения антитела из культуры клеток-хозяев;

16. Способ по п.15, где модуляция кинетических показателей в плазме представляет собой увеличение или уменьшение параметра, выбранного из: времени полужизни в плазме, среднего времени пребывания в плазме и плазменного клиренса.

17. Способ по п.15, где модификация заряда аминокислотного остатка происходит путем аминокислотной замены.

18. Способ по п.17, где антитело представляет собой IgG-антитело.

19. Способ по п.18, где антитело представляет собой IgG1-антитело.

20. Способ по п.17, где модификация заряда аминокислотного остатка происходит путем замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка IgG1-антитела на соответствующий аминокислотный остаток IgG4-антитела.

21. Способ по любому из п.п.15-20, где FcRn-связывающий фрагмент содержит аминокислотные остатки c EU-номерами 250, 253, 310, 311, 314, 428, 435 и 436 согласно нумерации Кабата.

22. Способ по п.20, где модификация заряда аминокислотного остатка происходит путем по меньшей мере одной замены в константной области тяжелой цепи SEQ ID NO:31, выбранной из:

(а) замены H, который является 151-м аминокислотным остатком, на Q,

(b) замены K, который является 157-м аминокислотным остатком, на Q,

(с) замены R, который является 238-м аминокислотным остатком, на Q,

(d) замены D, который является 239-м аминокислотным остатком, на E,

(e) замены L, который является 241-м аминокислотным остатком, на M и

(f) замены Q, который является 302-м аминокислотным остатком, на E;

23. Способ по любому из п.п.15-22, где антитело представляет собой антитело против глипикана-3.

24. Способ стабилизации антитела против глипикана-3, которое содержит гипервариабельный участок (CDR), происходящий от отличного от человека животного, каркасный участок (FR), происходящий от человека, и константную область, происходящую от человека, который включает следующие стадии:

(а) культивирование клетки-хозяина, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело против глипикана-3, в условиях, при которых возможна экспрессия нуклеиновой кислоты, причем антитело против глипикана-3 имеет аминокислотную последовательность, которая изменена для увеличения значения T_m антитела путем модификации по меньшей мере одного аминокислотного остатка; и

(b) выделения антитела из культуры клеток-хозяев;

25. Способ по п.24, где аминокислотный остаток расположен в FR1-участке и/или FR2-участке тяжелой цепи или легкой цепи.

26. Способ по п.25, где аминокислотный остаток в FR2-участке тяжелой цепи заменен на аминокислотный остаток FR2-участка подкласса VH4.

27. Способ по п.25, где аминокислотный остаток в FR2-участке легкой цепи заменен на аминокислотный остаток FR2-участка подкласса VK3.

28. Способ по любому из п.п.24-27, где замена аминокислотного остатка происходит путем:

(1) по меньшей мере одной замены в вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:1, выбранной из:

(а) замены V, который является 37-м аминокислотным остатком, на I,

(b) замены A, который является 40-м аминокислотным остатком, на P,

(с) замены M, который является 48-м аминокислотным остатком, на I и

(d) замены L, который является 51-м аминокислотным остатком, на I;

и/или

(2) по меньшей мере одной замены в вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO:7, выбранной из:

(e) замены L, который является 42-м аминокислотным остатком, на Q,

(f) замены S, который является 48-м аминокислотным остатком, на A и

(g) замены Q, который является 50-м аминокислотным остатком, на R;

29. Способ получения антитела с модулированной цитотоксичностью, включающий следующие стадии:

(а) культивирование клетки-хозяина, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, в условиях, при которых возможна экспрессия нуклеиновой кислоты, где антитело имеет аминокислотную последовательность, которая изменена так, что модифицируется заряд по меньшей мере одного аминокислотного остатка, который может находиться на поверхности цитотоксического антитела; и

(b) выделение антитела из культуры клеток-хозяев;

30. Способ по п.29, где модификация заряда аминокислотного остатка происходит путем аминокислотной замены.

31. Способ по п.29, где аминокислотный остаток, который может находиться на поверхности антитела, расположен на участке антитела, который не является FcRn-связывающим фрагментом.

32. Способ по п.31, где FcRn-связывающий фрагмент содержит Fc-фрагмент.

33. Способ по п.31, где FcRn-связывающий фрагмент содержит аминокислотные остатки c EU-номерами 250, 253, 310, 311, 314, 428, 435, 436 согласно нумерации Кабата.

34. Способ по п.29, где антитело представляет собой IgG-антитело.

35. Способ по любому из п.п.29-34, где аминокислотным остатком, заряд которого модифицирован, является аминокислотный остаток, находящийся в константной области антитела.

36. Способ по любому из п.п.29-34, где аминокислотным остатком, заряд которого модифицирован, является аминокислотный остаток, находящийся в вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи антитела.

37. Способ по п.36, где антитело представляет собой антитело, которое содержит гипервариабельный участок (CDR), происходящий от отличного от человека животного, каркасный участок (FR), происходящий от человека, и константную область, происходящую от человека, и где модификация заряда аминокислотного остатка происходит путем замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка, который может находиться на поверхности антитела в CDR или FR антитела, на аминокислотный остаток, который имеет заряд, отличающийся от заряда указанного аминокислотного остатка.

38. Способ по п.37, где модификация заряда аминокислотного остатка происходит путем:

(1) по меньшей мере одной замены в вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:1, выбранной из:

(а) замены K, который является 19-м аминокислотным остатком, на Т,

(b) замены Q, который является 43-м аминокислотным остатком, на Е,

(с) замены Q, который является 62-м аминокислотным остатком, на E,

(d) замены K, который является 63-м аминокислотным остатком, на S,

(e) замены K, который является 65-м аминокислотным остатком, на Q и

(f) замены G, который является 66-м аминокислотным остатком, на D;

и/или

(2) по меньшей мере одной замены в вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO:7, выбранной из:

(g) замены R, который является 24-м аминокислотным остатком, на Q,

(h) замены Q, который является 27-м аминокислотным остатком, на Е,

(i) замены K, который является 79-м аминокислотным остатком, на T,

(j) замены R, который является 82-м аминокислотным остатком, на S и

(k) замены K, который является 112-м аминокислотным остатком, на E;

39. Способ по п.38, дополнительно включающий по меньшей мере одну замену в константной области тяжелой цепи SEQ ID NO:31, выбранной из:

(а) замены Н, который является 151-м аминокислотным остатком, на Q,

(b) замены K, который является 157-м аминокислотным остатком, на Q,

(с) замены R, который является 238-м аминокислотным остатком, на Q,

(d) замены D, который является 239-м аминокислотным остатком, на E,

(e) замены L, который является 241-м аминокислотным остатком, на M и

(f) замены Q, который является 302-м аминокислотным остатком, на E;

40. Способ по п.36, где антитело содержит гипервариабельный участок (CDR), происходящий от отличного от человека животного, каркасный участок (FR), происходящий от человека, и константную область, происходящую от человека, и где модификация заряда аминокислотного остатка происходит путем замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка, который может находиться на поверхности антитела в константной области антитела, на аминокислотный остаток, который имеет заряд, отличающийся от заряда указанного аминокислотного остатка.

41. Способ по п.40, где заменой является по меньшей мере одна замена в константной области тяжелой цепи SEQ ID NO:31, выбранной из:

(а) замены Н, который является 151-м аминокислотным остатком, на Q,

(b) замены K, который является 157-м аминокислотным остатком, на Q,

(с) замены R, который является 238-м аминокислотным остатком, на Q,

(d) замены D, который является 239-м аминокислотным остатком, на E,

(e) замены L, который является 241-м аминокислотным остатком, на M и

(f) замены Q, который является 302-м аминокислотным остатком, на E;

42. Способ по любому из п.п.37-41, где антитело имеет пониженное содержание фукозы, связанной с Fc-фрагментом антитела.

43. Антитело, полученное способом по любому из п.п.29-42.

44. Антитело по п.43, где антитело представляет собой антитело против глипикана-3.

45. Антитело, содержащее:

(1) вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:1, в которой аминокислотная последовательность содержит по меньшей мере одну замену, выбранную из:

(а) замены K, который является 19-м аминокислотным остатком, на Т,

(b) замены Q, который является 43-м аминокислотным остатком, на E,

(с) замены Q, который является 62-м аминокислотным остатком, на E,

(d) замены K, который является 63-м аминокислотным остатком, на S,

(e) замены K, который является 65-м аминокислотным остатком, на Q и

(f) замены G, который является 66-м аминокислотным остатком, на D;

и/или

(2) вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:7, в которой аминокислотная последовательность содержит по меньшей мере одну замену, выбранную из:

(g) замены R, который является 24-м аминокислотным остатком, на Q,

(h) замены Q, который является 27-м аминокислотным остатком, на Е,

(i) замены K, который является 79-м аминокислотным остатком, на T,

(j) замены R, который является 82-м аминокислотным остатком, на S и

(k) замены K, который является 112-м аминокислотным остатком, на E;

46. Антитело по п.45, содержащее тяжелую цепь SEQ ID NO:3 и легкую цепь SEQ ID NO:9.

47. Антитело по п.45, содержащее тяжелую цепь SEQ ID NO:5 и легкую цепь SEQ ID NO:11.

48. Антитело по п.45, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:27 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:28.

49. Антитело по п.45, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:27 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:29.

50. Антитело по любому из п.п.45-49, содержащее константную область антитела человека.

51. Антитело по п.50, где константная область содержит последовательность SEQ ID NO:32 или SEQ ID NO:33.

52. Антитело, содержащее:

(1) вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:1, в которой аминокислотная последовательность содержит по меньшей мере одну замену, выбранную из:

(а) замены Q, который является 43-м аминокислотным остатком, на K,

(b) замены D, который является 52-м аминокислотным остатком, на N,

(с) замены Q, который является 107-м аминокислотным остатком, на R;

и

(2) вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:7, в которой аминокислотная последовательность содержит по меньшей мере одну замену, выбранную из:

(d) замены Е, который является 17-м аминокислотным остатком, на Q,

(e) замены Q, который является 27-м аминокислотным остатком, на R и

(f) замены Q, который является 105-м аминокислотным остатком, на R;

53. Антитело по п.52, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:4 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:10.

54. Антитело по п.52, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:6 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:12.

55. Антитело по любому из п.п.52-54, содержащее константную область антитела человека.

56. Антитело, содержащее по меньшей мере одну замену в аминокислотной последовательности константной области тяжелой цепи SEQ ID NO:31, выбранную из:

(а) замены Н, который является 151-м аминокислотным остатком, на Q,

(b) замены K, который является 157-м аминокислотным остатком, на Q,

(с) замены R, который является 238-м аминокислотным остатком, на Q,

(d) замены D, который является 239-м аминокислотным остатком, на Е,

(e) замены L, который является 241-м аминокислотным остатком, на M и

(f) замены Q, который является 302-м аминокислотным остатком, на E;

57. Антитело, содержащее константную область тяжелой цепи SEQ ID NO:33.

58. Антитело по любому из п.п.45-57, где антитело имеет пониженное содержание фукозы, соединенной с Fc-фрагментом указанного антитела.

59. Композиция, содержащая антитело по любому из п.п.45-58 и фармацевтически приемлемый носитель.

60. Средство против рака, содержащее в качестве активного ингредиента антитело по любому из п.п.45-58.

61. Средство против рака по п.60, где рак представляет собой рак печени.

62. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид антитела по любому из п.п.45-58.

63. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.62.

64. Клетка-хозяин по п.63, где клетка-хозяин представляет собой клетку животного, лишенную транспортера фукозы, клетку животного с удаленной фукозилтрансферазой или клетку животного с модифицированной сложной разветвленной цепью сахара.

65. Способ получения антитела, включающий культивирование клетки-хозяина по п.63 или п.64 и выделение полипептида из клеточной культуры.

Краткое описание рисунков

На Фиг.1 представлен график, полученный в результате измерения с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии антитела Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2).

На Фиг.2 представлена электрофореграмма антитела H0L0 и антитела Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2), полученная в результате изоэлектрического фокусирования в области высоких значений pI, где дорожки 1 и 4 соответствуют маркерам pI, дорожка 2 соответствует антителу H0L0 и дорожка 3 соответствует антителу Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2), где цифровые значения соответствуют значениям pI-маркерных молекул и стрелки указывают на электрофоретические подвижности соответствующих pI-маркерных молекул.

На Фиг.3 представлена электрофореграмма антитела H0L0 и антитела Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6), полученная в результате изоэлектрического фокусирования в области низких значений pI, где дорожки 1 и 4 соответствуют маркерам pI, дорожка 2 соответствует антителу H0L0 и дорожка 3 соответствует антителу Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6), где цифровые значения соответствуют значениям pI-маркерных молекул и стрелки указывают на электрофоретические подвижности соответствующих pI-маркерных молекул.

Фиг.4 представляет собой диаграмму, демонстрирующую степень сродства к связыванию антитела H15L4 и антитела H0L0 с антигеном против глипикана-3 в конкурентном методе ELISA, где черный ромб обозначает сродство к связыванию антитела H0L0, а серый квадрат обозначает сродство к связыванию антитела H15L4.

Фиг.5 представляет собой диаграмму, демонстрирующую степень сродства к связыванию антитела Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) и антитела H0L0 с антигеном против глипикана-3 в конкурентном методе ELISA, где черный ромб означает сродство к связыванию антитела H0L0, а серый квадрат означает сродство к связыванию антитела Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2).

Фиг.6 представляет собой диаграмму, демонстрирующую степень сродства к связыванию антитела Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6) и антитела H0L0 с антигеном против глипикана-3 в конкурентном методе ELISA, где черный ромб означает сродство к связыванию антитела H0L0, а серый квадрат означает сродство к связыванию антитела Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6).

На Фиг.7 показана противоопухолевая активность в мышиной модели с трансплантированной опухолью печени человека антитела H0L0, антитела Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) и антитела Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6).

На Фиг.7А показана противоопухолевая активность в мышиной модели с трансплантированной опухолью печени человека антитела H0L0, антитела Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) и антитела Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6), причем каждое тестируемое антитело вводили модели дозой 5 мг/кг, где черный ромб означает активность при введении носителя, черный треугольник означает активность при введении антитела Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6), белый кружок означает активность при введении антитела Hspu2.2Lspu2.2 и черный квадрат означает активность при введении антитела H0L0.

На Фиг.7В показана противоопухолевая активность антитела H0L0, антитела Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) и антитела Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6) в мышиной модели с трансплантированной опухолью печени человека, причем каждое тестируемое антитело вводили модели дозой 1 мг/кг, где черный ромб означает активность при введении носителя, черный треугольник означает активность при введения антитела Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6), белый кружок означает активность при введении антитела Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) и черный квадрат означает активность при введении антитела H0L0.

На Фиг.8 на мышиной модели с трансплантированной опухолью печени человека показана концентрация антитела H0L0, антитела Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) и антитела Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6) в плазме.

На Фиг.8А на мышиной модели с трансплантированной опухолью печени человека показаны концентрации в плазме антитела H0L0, антитела Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) и антитела Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6), которые вводили, причем каждое тестируемое антитело вводили модели при дозе 5 мг/кг, где черный треугольник означает концентрацию в плазме антитела Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6), белый кружок означает концентрацию в плазме антитела Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) и черный квадрат означает концентрацию в плазме антитела H0L0.

На Фигуре 8В на мышиной модели с трансплантированной опухолью печени человека показаны концентрации в плазме антитела H0L0, антитела Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) и антитела Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6), которые вводили, причем каждое тестируемое антитело вводили модели при дозе 1 мг/кг, где черный треугольник означает концентрацию в плазме антитела Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6), белый кружок означает концентрацию в плазме антитела Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) и черный квадрат означает концентрацию в плазме антитела H0L0.

На Фиг.9 показана ADCC-активность тестируемых антител против клеток HepG2, линии опухолевых клеток печени человека, где черный треугольник означает ADCC-активность антитела Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6), белый кружок означает ADCC-активность антитела Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) и черный квадрат означает ADCC-активность антитела H0L0.

На Фиг.10 показано измеренное с помощью конкурентного метода ELISA сродство к связыванию с антигеном против глипикана-3 антитела H0L0, антитела Hd1.8Ld1.6, антитела pH7pL14 и антитела pH7pL16, где черный кружок означает связывающую активность антитела H0L0, белый кружок означает связывающую активность антитела Hd1.8Ld1.6, черный квадрат означает связывающую активность антитела pH7pL14, а белый квадрат означает связывающую активность антитела pH7pL16.

На Фиг.11 показана противоопухолевая активность антитела H0L0, антитела pH7pL14 и антитела pH7pL16 в мышиной модели с трансплантированной опухолью печени человека, где * означает противоопухолевую активность антитела H0L0, белый кружок означает противоопухолевую активность антитела Hd1.8Ld1.6, черный квадрат означает противоопухолевую активность антитела pH7pL14, а белый квадрат означает противоопухолевую активность антитела pH7pL16.

На Фиг.12 показана концентрация в плазме мыши антитела H0L0, антитела Hd1.8Ld1.6, антитела pH7pL14, антитела pH7pL16 и pH7M85pL16, где * означает концентрацию в плазме антитела H0L0, белый кружок означает концентрацию в плазме антитела Hd1.8Ld1.6, черный квадрат означает концентрацию в плазме антитела pH7pL14, белый квадрат означает концентрацию в плазме антитела pH7pL16, черный треугольник означает концентрацию в плазме мыши pH7M85pL16.

На Фиг.13 показана ADCC-активность антитела H0L0, антитела Hd1.8Ld1.6, антитела pH7pL14 и антитела pH7pL16 против клеток HepG2, клеточной линии опухоли печени человека, где черный кружок означает ADCC-активность антитела H0L0, белый кружок означает ADCC-активность антитела Hd1.8Ld1.6, черный квадрат означает ADCC-активность антитела pH7pL14 и белый квадрат означает ADCC-активность антитела pH7pL16.

На Фиг.14 показано измеренное конкурентным методом ELISA сродство к связыванию с антигеном против глипикана-3 антитела H0L0, антитела H0M85L0, антитела pH7pL16 и антитела pH7M85pL16, где черный треугольник означает связывающую активность антитела H0L0, черный квадрат означает связывающую активность антитела H0M85L0, * означает связывающую активность антитела pH7pL16, а белый ромб означает связывающую активность антитела pH7M85pL16.

На Фиг.15 показана ADCC-активность антитела pH7pL16 и антитела pH7M85pL16 против клеток HepG2, клеточной линии опухоли печени человека, где белый квадрат означает ADCC-активность антитела pH7pL16, а черный треугольник означает ADCC-активность антитела pH7M85pL16.

Описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения

Настоящее изобретение относится к способу модуляции кинетических показателей антитела (например, антитела против глипикана-3) в плазме. В предпочтительном варианте осуществления изобретения способ включает модификацию заряда по меньшей мере одного аминокислотного остатка, который может находиться на поверхности антитела (например, антитела против глипикана-3). То есть кинетические показатели антитела (например, антитела против глипикана-3) в плазме можно модулировать путем модификации заряда аминокислотного остатка в антителе с целью изменения его изоэлектрической точки (pI). Антитело (например, антитело против глипикана-3) с модулированными кинетическими показателями в плазме способно проявлять противоопухолевую активность в отношении раковых клеток, превышающую активность немодулированного антитела.

Среди нескольких изотипов антитела, основные пути метаболизма IgG-антитела не проходят через почечную экскрецию из-за достаточно высокой молекулярной массы IgG-антитела. Известно, что IgG-антитело, содержащее Fc-фрагмент как часть молекулы, имеет продолжительное in vivo время полужизни благодаря рециклингу, происходящему “реутилизационным” путем, опосредованным неонатальным Fc-рецептором (FcRn), который экспрессируется эндотелиальными клетками, например, в сосудистой системе. Полагают, что метаболизм IgG-антитела происходит, главным образом, путем метаболических преобразований в эндотелиальных клетках (He X.Y., Xu Z., Melrose J., Mullowney A., Vasquez M., Queen C., Vexler V., Klingbeil C., Co M.S. and Berg E.L., Humanization and pharmacokinetics of a monoclonal antibody with specificity for both E- and P-selectin, J. Immunol. (1998), 160(2), 1029-35). То есть существует предположение, что рециркуляция IgG-антитела происходит через связывание неспецифически поглощаемого эндотелиальной клеткой IgG-антитела с FcRn, при этом IgG-антитело, которое не может быть связанным, подвергается процессам метаболизма. Содержащее Fc-фрагмент IgG-антитело, модифицированное таким образом, чтобы оно обладало более низкой связывающей активностью с FcRn, имеет более короткое время полужизни в плазме. И наоборот, время полужизни IgG-антитела в плазме может быть повышено путем повышающей связывающую активность с FcRn модификации аминокислотных остатков, содержащихся в Fc-фрагменте IgG-антитела (He X.Y., Xu Z., Melrose J., Mullowney A., Vasquez M., Queen C., Vexler V., Klingbeil C., Co M.S. and Berg E.L., Humanization and pharmacokinetics of a monoclonal antibody with specificity for both E- and P-selectin, J. Immunol. (1998), 160(2), 1029-35; и LinksOber R.J., Radu C.G., Ghetie V., Ward E.S. Differences in promiscuity for antibody-FcRn interactions across species: implications for therapeutic antibodies. Int. Immunol. (2001) 13(12), 1551-9). Как описано выше, известные способы модуляции кинетических показателей IgG-антитела в плазме включают модификацию связывающей активности с FcRn путем модификации аминокислотных остатков, составляющих Fc-фрагмент. Отдельные примеры указанных выше аминокислотных остатков включают аминокислотные остатки Н250, Н253, Н310, Н311, Н314, Н428, Н435 и Н436, согласно нумерации Кабата. Кроме того, предполагается, что аминокислотные остатки Н254, Н255, Н257, Н288, Н296, Н307, Н309, Н315, Н415, Н433, которые опосредованно вовлечены во взаимодействие IgG-антител с FcRn, могут быть мишенью для модификации. Эти аминокислотные остатки соответствуют, например, аминокислотным остаткам под номерами 130, 133, 190, 191, 194, 308, 315 и 316 и аминокислотным остаткам под номерами 134, 135, 137, 168, 176, 187, 189, 195, 295 и 313 в SEQ ID NO:30, а также аминокислотным остаткам под номерами 133, 136, 193, 194, 197, 311, 318 и 319 и аминокислотным остаткам под номерами 137, 138, 140, 171, 179, 190, 192, 198, 298 и 316 в SEQ ID NO:31, соответственно. Однако, как показано в приведенных ниже примерах, авторами настоящего изобретения было обнаружено, что время полужизни антитела (например, антитела против глипикана-3) в плазме в значительной степени зависит от pI. Таким образом, в данной работе показано, что время полужизни антитела (например, антитела против глипикана-3) в плазме можно модулировать, не модифицируя аминокислотные остатки, составляющие FcRn-связывающий фрагмент, модификация которых приводила бы к иммуногенности, в частности, аминокислотных остатков Н250, Н253, Н310, Н311, Н314, Н428, Н435 и Н436, а также Н254, Н255, Н257, Н288, Н296, Н307, Н309, Н315, Н415 и Н433, согласно нумерации Кабата. Также неожиданным результатом было то, что модификация аминокислотных остатков, отличающихся от Н250, Н253, Н310, Н311, Н314, Н428, Н435 и Н436, а также Н254, Н255, Н257, Н288, Н296, Н307, Н309, Н315, Н415 и Н433, приводила к снижению значения pI и изменению связывающей активности с FcRn.

Не желая вдаваться в теоретические подробности, авторы настоящего изобретения придерживаются следующей точки зрения. Предполагается, что скорость неспецифического поглощения IgG-антитела эндотелиальными клетками зависит от физико-химического кулоновского взаимодействия между IgG-антителом и отрицательно заряженной клеточной поверхностью. Поэтому, как предполагается, уменьшение (увеличение) кулоновского взаимодействия путем уменьшения (повышения) pI IgG-антитела может приводить к уменьшению (увеличению) неспецифического поглощения эндотелиальной клеткой, что, в свою очередь, вызывает снижение (повышение) скорости метаболизма эндотелиальной клетки, приводящее к модуляции кинетических показателей в плазме. Как используют в описании, “уменьшение кулоновского взаимодействия” означает увеличение кулоновской силы, выраженной силой отталкивания. Поскольку кулоновское взаимодействие между антителом и отрицательно заряженной клеточной поверхностью эндотелиальной клетки представляет собой физико-химическое взаимодействие, предполагается, что это взаимодействие, как правило, не зависит от составляющей антитело аминокислотной последовательности как таковой. Поэтому способ модуляции кинетических показателей в плазме, описанный в настоящем изобретении, можно широко использовать для любых антител или антител против глипикана-3, а не ограничивать применением только к специфическому антителу или антителу против глипикана-3.

Если в качестве антитела (антитела против глипикана-3) по настоящему изобретению используется IgG-антитело, то можно использовать любой подтип при условии, что он является молекулой антитела IgG-типа. Также может быть использовано биспецифическое антитело. В случае когда антитело (например, антитело против глипикана-3) по настоящему изобретению представляет собой биспецифическое антитело, оно также может специфически связываться как с соответствующим антигеном (молекулой глипикана-3 в случае антитела против глипикана-3), так и эпитопом, который отличается от такого антигена. Например, чтобы восполнить NK-клетки, цитотоксические Т-клетки, LAK-клетки и т.п., в качестве другого антигена можно использовать соответствующим образом поверхностный антиген, который специфически связывается с указанными клетками. Было показано, что цитотоксичность LAK-клеток направлена против опухоли желчных путей при использовании биспецифического антитела, полученного из антитела MUSE11, распознающего MUC1 (антиген аденокарциномы), и антитела ОКТ3, распознающего поверхностный антиген LAK-клетки (Katayose Y., Kudo T., Suzuki M., Shinode M., Saijyo S., Sakurai N., Saeki H., Fukuhara K., Imai K. and Matsuno S., MUC1-specific targeting immunotherapy with bispecific antibodies: inhibition of xenografted human bile duct carcinoma growth, Cancer Res. (1996) 56(18), 4205-12). Антитело (например, антитело против глипикана-3) с улучшенными кинетическими показателями в плазме по настоящему изобретению можно соответствующим образом использовать вместо антитела MUSE11, распознающего MUC1. Кроме того, антитело, распознающее различные эпитопы антигена, с которым антитело связывается (молекула глипикана-3 в случае антитела против глипикана-3), также можно соответствующим образом использовать в качестве биспецифического антитела (например, антитела против глипикана-3) по настоящему изобретению. Что касается антител с низкой молекулярной массой, для которых почечная экскреция является основным путем метаболизма, таких как scFv и Fab, то кинетические показатели таких антител в плазме нельзя модулировать посредством pI, как описано выше. Однако настоящее изобретение можно применять к любому типу молекулы антитела, если она представляет собой Fc-связанный белок, для которого почечная экскреция не является основным путем метаболизма. Примеры таких молекул включают scFv-Fc, dAb-Fc и Fc-слитые белки. Поскольку основной путь метаболизма указанных молекул не осуществляется через почечную экскрецию, кинетические показатели указанных молекул в плазме можно модулировать путем изменения pI согласно способу по настоящему изобретению. Антителоподобные молекулы включены в группу молекул антител, охваченных объемом настоящего изобретения. Антителоподобные молекулы представляют собой молекулы, которые функционируют посредством связывания с молекулой-мишенью (Binz H.K., Amstutz P. and Pluckthun A., Engineering novel binding proteins from nonimmunoglobulin domains, Nat. Biotechnol. (2005) 23(10), 1257-68), и примеры включают DARPins, Affibody и Avimer.

Используемый в настоящем описании термин “модулированные кинетические показатели в плазме” означает, что кинетические показатели в плазме модифицированы в нужном направлении в случае сравнения кинетических показателей антитела в плазме после модификации аминокислот, составляющих это антитело (например, антитело против глипикана-3), с кинетическими показателями этого антитела в плазме до модификации. Таким образом, если нужно увеличить время полужизни антитела (например, антитела против глипикана-3) в плазме, то “модуляция кинетических показателей в плазме” относится к увеличению времени полужизни этого антитела в плазме. Если нужно уменьшить время полужизни антитела в плазме (например, антитела против глипикана-3), то “модуляция кинетических показателей в плазме” относится к уменьшению времени полужизни этого антитела в плазме.

Модифицированы ли в плазме кинетические показатели антитела (например, антитела против глипикана-3) по настоящему изобретению в нужном направлении, т.е. модулированы ли кинетические показатели в плазме нужным образом, можно оценить соответствующим образом с помощью фармакокинетических тестов, например, на мышах, кроликах, собаках, обезьянах и т.п. Кроме того, используемый в описании термин “увеличение времени полужизни в плазме” или “уменьшение времени полужизни в плазме” также может включать параметры, которые отличаются от параметра “время полужизни”, например, такие как среднее время пребывания в плазме и плазменный клиренс (Pharmacokinetics Analysis by Practice, (Nanzando). Например, “модуляцию кинетических показателей в плазме” по настоящему изобретению можно оценить подходящим образом, используя указанные параметры, с помощью некомпартментного анализа, проводимого согласно инструкциям, прилагаемым к программному обеспечению для in vivo фармакокинетического анализа WinNonlin (Pharsight).

Используемая в описании фраза “аминокислотный остаток, который может находиться на поверхности” обычно означает аминокислотный остаток, который расположен на поверхности полипептида, содержащегося в молекуле антитела (например, антитела против глипикана-3). Фраза “аминокислотный остаток, расположенный на поверхности полипептида” относится к аминокислотному остатку, боковая цепь которого может входить в контакт с молекулами растворителя (обычно молекулами воды). Нет необходимости в том, чтобы боковая цепь аминокислотного остатка полностью входила в контакт с молекулами растворителя. Если даже часть боковой цепи аминокислотного остатка входит в контакт с молекулами растворителя, такой аминокислотный остаток рассматривают как расположенный на поверхности аминокислотный остаток. Специалисты в данной области могут сконструировать гомологичную модель полипептида или антитела, используя коммерчески доступное программное обеспечение по гомологичному моделированию. В качестве “аминокислотного остатка, расположенного на поверхности полипептида” можно соответствующим образом, основываясь на указанной гомологичной модели, выбрать аминокислотные остатки на поверхности полипептида, входящего в состав антитела (например, антитела против глипикана-3).

“Аминокислотный остаток, который может находиться на поверхности” не ограничен особым образом в настоящем изобретении, но предпочтительно представляет собой аминокислотный остаток, находящийся вне FcRn-связывающего фрагмента антитела (например, антитела против глипикана-3). FcRn-связывающий фрагмент предпочтительно представляет собой Fc-фрагмент, но также включает, например, участок, состоящий из одного или нескольких аминокислотных остатков Н250, Н253, Н310, Н311, Н314, Н428, Н435 и Н436 согласно нумерации Кабата. Кроме того, аминокислотные остатки Н254, Н255, Н257, Н288, Н296, Н307, Н309, Н315, Н415, Н433, которые не принимают непосредственного участия во взаимодействии IgG-антител с FcRn, рассматриваются в качестве мишени для модификации. Указанные аминокислотные остатки соответствуют, например, аминокислотным остаткам под номерами 130, 133, 190, 191, 194, 308, 315 и 316 и аминокислотным остаткам под номерами 134, 135, 137, 168, 176, 187, 189, 195, 295 и 313 в SEQ ID NO:30, а также аминокислотным остаткам под номерами 133, 136, 193, 194, 197, 311, 318 и 319 и аминокислотным остаткам под номерами 137, 138, 140, 171, 179, 190, 192, 198, 298 и 316 в SEQ ID NO:31, соответственно.

Аминокислотный остаток, модифицируемый с целью изменения заряда антитела (например, антитела против глипикана-3) по настоящему изобретению, предпочтительно представляет собой аминокислотный остаток, входящий в состав вариабельной области тяжелой цепи (Н-цепи) или вариабельной области легкой цепи (L-цепи) антитела. Предпочтительными специфическими примерами указанных вариабельных областей являются гипервариабельный участок (CDR) и каркасный участок (FR).

Специалисты в данной области смогут подходящим образом выбрать поверхностный аминокислотный остаток в вариабельной области антитела на основании гомологичной модели, построенной с помощью гомологичного моделирования. Таким образом, поверхностный аминокислотный остаток в вариабельной области антитела может быть соответственно выбран из Н1, H3, H5, H8, H10, H12, H13, H15, H16, H19, H23, H25, H26, H39, H42, H43, H44, H46, H68, H71, H72, H73, H75, H76, H81, H82b, H83, H85, H86, H105, H108, H110 и H112, которые представляют собой аминокислотные остатки согласно нумерации Кабата. Например, в FR тяжелой цепи гуманизированного антитела против глипикана-3, представленной в SEQ ID NO:1, поверхностные аминокислотные остатки могут включать, но не ограничиваются ими, аминокислотные остатки в положениях 1, 3, 5, 8, 10, 12, 13, 15, 16, 19, 23, 25, 26, 39, 42, 43, 44, 46, 69, 72, 73, 74, 76, 77, 82, 85, 87, 89, 90, 107, 110, 112 и 114. Поверхностный аминокислотный остаток в CDR тяжелой цепи также может быть выбран с помощью такой же гомологичной модели. Таким образом, Н97, аминокислотный остаток согласно нумерации Кабата, находится на поверхности почти всех антител. Например, серин в положении 101 в CDR тяжелой цепи гуманизированного антитела против глипикана-3, представленной в SEQ ID NO:1, соответствует такому аминокислотному остатку. Подходящими примерами других аминокислотных остатков в CDR тяжелой цепи гуманизированного антитела против глипикана-3, представленной в SEQ ID NO:1, являются аминокислотные остатки в положениях 52, 54, 62, 63, 65 и 66.

Что касается FR легкой цепи, поверхностные аминокислотные остатки в вариабельной области антитела могут быть выбраны соответствующим образом из аминокислотных остатков под номерами согласно нумерации Кабата L1, L3, L7, L8, L9, L11, L12, L16, L17, L18, L20, L22, L38, L39, L41, L42, L43, L45, L46, L49, L57, L60, L63, L65, L66, L68, L69, L70, L74, L76, L77, L79, L80, L81, L85, L100, L103, L105, L106 и L107. Например, поверхностные аминокислоты могут включать, но не ограничиваются ими, аминокислоты под номерами 1, 3, 7, 8, 9, 11, 12, 16, 17, 18, 20, 22, 43, 44, 45, 46, 48, 49, 50, 54, 62, 65, 68, 70, 71, 73, 74, 75, 79, 81, 82, 84, 85, 86, 90, 105, 108, 110, 111 и 112 гуманизированного антитела против глипикана-3, представленного в SEQ ID NO:7. Поверхностные аминокислотные остатки в CDR легкой цепи могут быть выбраны с помощью такой же гомологичной модели, что и гомологичная модель, с помощью которой были определены поверхностные аминокислотные остатки в CDR тяжелой цепи. Подходящими примерами аминокислотных остатков в CDR легкой цепи гуманизированного антитела против глипикана-3, представленной в SEQ ID NO:7, являются аминокислотные остатки в положениях 24, 27, 33, 55 и 59.

Термин “модификация” аминокислотного остатка в способе по настоящему изобретению, в частности, означает, помимо прочего, замену исходного аминокислотного остатка на другой аминокислотный остаток, делецию исходного аминокислотного остатка и добавление нового аминокислотного остатка и предпочтительно указывает на замену исходного аминокислотного остатка на другой аминокислотный остаток. Таким образом, “модификация заряда аминокислотного остатка” в настоящем изобретении предпочтительно представляет собой аминокислотную замену.

Для осуществления “модификации заряда аминокислотного остатка” у антитела против глипикана-3 по настоящему изобретению, например, предпочтительно модифицируют заряд по меньшей мере одного аминокислотного остатка, выбранного из аминокислотных остатков в положениях 19, 43, 52, 54, 62, 63, 65, 66 и 107, находящихся в вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела против глипикана-3, SEQ ID NO:1. Кроме того, предпочтительно модифицируют заряд, например, по меньшей мере одного аминокислотного остатка, выбранного из аминокислотных остатков в положениях 17, 24, 27, 33, 55, 59, 79, 82, 105 и 112 в вариабельной области легкой цепи, входящей в состав гуманизированного антитела против глипикана-3, SEQ ID NO:7. Помимо перечисленных выше аминокислотных остатков, аминокислотные остатки, которые отличаются от остатков с модификацированным зарядом, не должны быть модифицированы при условии получения нужного модулирующего эффекта на кинетические показатели в плазме; однако такие аминокислотные остатки могут быть модифицированы обычным способом так, чтобы они не имели заряда или чтобы они имели заряд такого же типа, что и модифицированный аминокислотный остаток (остатки).

Известно, что имеются аминокислоты, несущие заряд. Как правило, лизин (K), аргинин (R) и гистидин (H) известны как положительно заряженные аминокислоты. Аспарагиновая кислота (D) и глутаминовая кислота (Е) известны как отрицательно заряженные аминокислоты. Аминокислоты, которые отличаются от этих, известны как незаряженные аминокислоты.

Описанный выше “модифицированный аминокислотный остаток” предпочтительно выбирают, но без ограничения, из аминокислотных остатков, находящихся в любой из следующих групп (a) и (b):

(а) глутаминовой кислоты (Е), аспарагиновой кислоты (D);

(b) лизина (K), аргинина (R) и гистидина (Н).

Если исходный (до модификации) аминокислотный остаток уже несет заряд, то предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения будет модификация, в результате которой образуется незаряженный аминокислотный остаток. Таким образом, модификация в настоящем изобретении охватывает: (1) замену заряженной аминокислоты на незаряженную аминокислоту, (2) замену заряженной аминокислоты на аминокислоту, несущую противоположный заряд и (3) замену незаряженной аминокислоты на заряженную аминокислоту.

Модификация аминокислотного остатка, входящего в состав молекулы антитела (например, молекулы антитела против глипикана-3), с целью изменения изоэлектрической точки (pI) антитела является предпочтительной для настоящего изобретения. Кроме того, в тех примерах, где должно быть модифицировано множество аминокислотных остатков, модифицируемые аминокислотные остатки могут включать небольшое количество незаряженных аминокислотных остатков.

Подходящими примерами “модификации заряда аминокислотного остатка” антитела против глипикана-3 по настоящему изобретению являются следующие примеры. Относительно модификации, направленной на увеличение значения pI, можно осуществить, например, по меньшей мере одну замену, выбранную из Q43K, D52N и Q107R в вариабельной области тяжелой цепи, составляющей гуманизированное антитело против глипикана-3, SEQ ID NO:1, при этом особенно предпочтительной является модификация в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:4 или 6. Кроме того, можно осуществить, например, по меньшей мере одну замену, выбранную из E170Q, Q27R и Q105R в вариабельной области легкой цепи, составляющей гуманизированное антитело против глипикана-3, SEQ ID NO:7, при этом особенно предпочтительной является модификация в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:10 или 12. С другой стороны, что касается модификации, направленной на уменьшение значения pI, можно осуществить по меньшей мере одну замену, выбранную из K19T, Q43E, Q62E, K63S, K65Q и G66D в вариабельной области тяжелой цепи, составляющей гуманизированное антитело против глипикана-3, представленной в SEQ ID NO:1, при этом особенно предпочтительной является модификация в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3, 5 или 27. Кроме того, можно осуществить, например, по меньшей мере одну замену, выбранную из R24Q, Q27E, K79T, R82S и K112E в вариабельной области легкой цепи, входящей в состав гуманизированного антитела против глипикана-3, представленной в SEQ ID NO:7, при этом особенно предпочтительной является модификация в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:9, 11, 28 или 29. Кроме того, модификация, которая приводит к уменьшению величины pI, также включает замену одного или нескольких аминокислотных остатков в константной области тяжелой цепи, обозначенных как Н268, Н274, Н355, Н356, Н358 и Н419 согласно нумерации Кабата. Предпочтительным примером замены является по меньшей мере одна модификация в константной области тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO:31, она включает, например, замену Н, который является 151-м аминокислотным остатком, на Q, замену K, который является 157-м аминокислотным остатком, на Q, замену R, который является 238-м аминокислотным остатком, на Q, замену D, который является 239-м аминокислотным остатком, на Е, замену L, который является 241-м аминокислотным остатком, на М и замену Q, который является 302-м аминокислотным остатком, на Е. Описанная выше замена приводит к образованию химеры константной области IgG1 и константной области IgG4 антитела человека. Таким образом, такая замена позволяет получить модифицированное антитело с нужным значением pI, не влияя при этом на иммуногенность антитела.

На количество модифицируемых аминокислотных остатков в настоящем изобретении отсутствуют какие-либо ограничения; например, при модификации вариабельной области антитела предпочтительно модифицировать наименьшее количество аминокислотных остатков, необходимых для достижения нужных модулированных кинетических показателей в плазме, с тем, чтобы избежать уменьшения связывающей активности с антигеном, и с тем, чтобы избежать увеличения иммуногенности. Подходящей также может быть соответствующая комбинация с модификацией аминокислотных остатков, которая приведет к снижению иммуногенности, и/или с модификацией аминокислотных остатков, приводящей к увеличению связывающей активности с антигеном.

Для измерения антигенсвязывающей активности антитела могут быть использованы известные способы. Например, могут быть использованы твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), иммуноферментный анализ с аффинной хроматографией (EIA), радиоизотопный иммунный анализ (RIA) или иммунофлуоресцентный анализ. Указанные способы описаны в общеизвестном руководстве Antibodies: A Laboratory Manual, Ed. Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.

Способы, описанные на страницах от 359 до 420 руководства Antibodies: A Laboratory Manual (Ed. Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), являются примерами способов, которые можно использовать для измерения связывающей активности антитела с клетками. Связывающую активность можно оценить методом FACS (сортировкой активированных флуоресценцией клеток) или методом ELISA, используя клетки в качестве антигена. В формате ELISA, выполняют количественную оценку связывающей активности антитела с клетками путем сравнения уровней сигналов, генерируемых в результате ферментативной реакции. Таким образом, тестируемое антитело вносят в ELISA-планшет, на котором иммобилизованы клетки с избыточной экспрессией, и связанное с клетками антитело детектируют с помощью меченного ферментом антитела, которое распознает тестируемое антитело. В случае метода FACS, связывающая активность с клетками может быть оценена путем получения серии разведений тестируемого антитела и сравнения титров связывания антитела с клетками, имеющими избыточную экспрессию.

Связывание антигена, экспрессируемого на поверхности клеток, суспендированных в буфере и не зафиксированных на носителе (таком как ELISA-планшет), с антителом указанного антигена может быть измерено с помощью FACS. Проточный цитометр, используемый в таких измерениях, может включать FACSCanto^TM II, FACSAria^TM, FACSArray^TM, FACSVantage^TM SE и FACSCalibur^TM (все из BD Bioscience) и EPICS ALTRA HyPerSort, Cytomics FC 500, EPICS XL-MCL ADC, EPICS XL ADC и Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC (все из Beckman Coulter).

В примере подходящего способа измерения связывающей активности тестируемого антитела против глипикана-3 с антигеном выполняют реакцию тестируемого антитела с клеткой, экспрессирующей глипикан-3; клетки окрашивают FITC-меченным вторичным антителом, которое распознает тестируемое антитело; интенсивность флуоресценции измеряют с помощью FACSCalibur (BD) и данные анализируют, используя программное обеспечение CELL QUEST (BD). Согласно данному способу, тестируемое антитело, связанное с глипиканом-3 на поверхности клеток, экспрессирующих глипикан-3, окрашивают FITC-меченным вторичным антителом, которое специфически распознает тестируемое антитело, и интенсивность флуоресценции измеряют с помощью цитометра FACSCalibur, затем с помощью программного обеспечения CELL QUEST сравнивают среднегеометрическое значение (тестируемое geo-mean значение), полученное при анализе полученной интенсивности флуоресценции, с контрольным geo-mean значением, полученным от контрольного антитела. Формулы для вычислений, с помощью которых получают geo-mean значение (среднее геометрическое), описаны в руководстве пользователя программы CELL QUEST (BD Biosciences).

Для того чтобы избежать увеличения in vivo иммуногенности для человека, получающего антитело, модифицированная аминокислотная последовательность является предпочтительно, но не ограничивается ею, последовательностью человека (последовательностью, встречаемой в природном антителе человеческого происхождения). Кроме того, можно вводить соответствующим образом мутации в положения, которые отличаются от положений модификаций, введенных для изменения изоэлектрической точки, с тем, чтобы модифицировать каждый участок из множества FR (FR1, FR2, FR3, FR4) в последовательность человека. Способ, с помощью которого каждый из FR превращается, таким образом, в последовательность человека, описан у Ono K., Ohtomo T., Yoshida K., Yoshimura Y., Kawai S., Koishihara Y., Ozaki S., Kosaka M. and Tsuchiya M., The humanized anti-HM1.24 antibody effectively kills multiple myeloma cells by human effector cell-mediated cytotoxicity, Mol. Immunol. (1999) 36(6), 387-395. Кроме того, для изменения изоэлектрической точки антитела, каждая из FR-последовательностей может быть превращена в другую FR-последовательность человека для изменения заряда конкретной FR-последовательности (например, FR3 может быть заменен другим FR человека для уменьшения изоэлектрической точки антитела). Такой метод получения гуманизированных антител описан у Dall'Acqua W.F., Damschroder M.M., Zhang J., Woods R.M., Widjaja L., Yu J. and Wu H., Antibody humanization by framework shuffling, Methods (2005) 36(1), 43-60.

В тех примерах, в которых требуемые модулированные кинетические показатели в плазме не достигаются путем умеренной модификации поверхностного заряда, антитело (например, антитело против глипикана-3), проявляющее нужные модулированные кинетические показатели в плазме, может быть получено соответствующим образом путем повторной модификации поверхностного заряда и оценки кинетических показателей в плазме.

Кинетические показатели в плазме химерного EP5C7.g4, химерного антитела к Е- и Р-селектину (IgG4), сравнивали с кинетическими показателями HuEp5C7.g4, гуманизированного антитела (IgG4), и сравнения показали, что оба антитела имеют одинаковые кинетические показатели в плазме макаки-резус (He X.Y., Xu Z., Melrose J., Mullowney A., Vasquez M., Queen C., Vexler V., Klingbeil C., Co M.S. and Berg E.L., Humanization and pharmacokinetics of a monoclonal antibody with specificity for both E- and P-selectin, J. Immunol. (1998), 160(2), 1029-35). Кроме того, кинетические показатели в плазме ch5d8, химерного анти-CD154 антитела, сравнивали с кинетическими показателями гуманизированного антитела Hu5c8 у макак-крабоедов, и сравнения показали, что оба антитела имеют одинаковые кинетические показатели в плазме (Gobburu J.V., Tenhoor C., Rogge M.C., Frazier D.E. Jr., Thomas D., Benjamin C., Hess D.M. and Jusko W.J., Pharmacokinetics/dynamics of 5c8, a monoclonal antibody to CD154 (CD40 ligand) suppression of an immune response in monkeys, J. Pharmacol. Exp. Ther. (1998) 286(2), 925-30). Было показано, что у мыши кинетические показатели химерного антитела сСС49 в плазме являются такими же, как и кинетические показатели гуманизированного антитела HuCC49 (Kashmiri S.V., Shu L., Padlan E.A., Milenic D.E., Schlom J. and Hand P.K., Generation, characterization, and in vivo studies of humanized anticarcinoma antibody CC49, Hybridoma (1995) 14(5), 461-73). При проведении исследований на мышах было показано, что кинетические показатели и распределение в плазме антитела мыши и гуманизированного антитела являются одинаковыми (Graves S.S., Goshorn S.C., Stone D.M., Axworthy D.B., Reno J.M., Bottino B., Searle S., Henry A., Pedersen J., Rees A.R. and Libby R.T., Molecular modeling and preclinical evaluation of the humanized NR-LU-13 antibody, Clin. Cancer Res. (1999) 5(4), 899-908; Couto J.R., Blank E.W., Peterson J.A. and Ceriani R.L., Anti-BA46 monoclonal antibody Mc3: humanization using a novel positional consensus and in vivo and in vitro characterization, cancer Res. (1995) 55(8), 1717-22). Существует предположение, что кинетические показатели и распределение в плазме химерных антител и гуманизированных антител являются одинаковыми вследствие того, что Fc-фрагмент мыши и Fc-фрагмент человека являются оба перекрестнореагирующими с FcRn-рецептором мыши. Как показано с помощью этих примеров, кинетические показатели в плазме у химерных антител и гуманизированных антител с одинаковыми CDR-областями являются одинаковыми. Это означает, что гуманизация антител известными методами, описанными у Ghetie V., Popov S., Borvak J., Radu C., Matesoi D., Medesan C., Ober R.J. and Ward E.S., Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis, Nat. Biotechnol. (1997) 15(7), 637-40) и т.д., может обеспечить такие же кинетические показатели в плазме, как и у химерного антитела, и, следовательно, гуманизированное антитело с модулированными кинетическими показателями в плазме не может быть получено известными методами.

Напротив, если химерное антитело (например, антитело против глипикана-3) гуманизируют способом по настоящему изобретению, то pI антитела модифицируют с помощью модификации аминокислотного остатка, который может находиться на поверхности химерного антитела, с целью создания гуманизированного антитела (например, гуманизированного антитела против глипикана-3), которое по сравнению с исходным химерным антителом проявляет модулированные кинетические показатели в плазме (т.е. увеличение или уменьшение времени полужизни в плазме). Для модуляции кинетических показателей в плазме, можно осуществить модификацию аминокислоты, которая может находиться на поверхности гуманизированного антитела (например, гуманизированного антитела против глипикана-3), совместно с гуманизацией антитела, либо можно модифицировать pI гуманизированного антитела путем модификации находящейся на поверхности аминокислоты, происходящей от гуманизированного антитела (например, гуманизированного антитела против глипикана-3).

Было показано, что трастузумаб, бевацизумаб и пертузумаб, которые являются тремя гуманизированными антителами, гуманизированными с использованием одной и той же FR-последовательности антитела человека, имели практически одинаковые кинетические показатели в плазме (Adams C.W., Allison D.E., Flagella K., Presta L., Clarke J., Dybdal N., McKeever K. and Sliwkowski M.X., Humanization of a recombinant monoclonal antibody to produce a therapeutic HER dimerization inhibitor, pertuzumab, Cancer Immunol. Immunother. (2006) 55(6), 717-27). Таким образом, в случае гуманизации антител с использованием одинаковой FR-последовательности кинетические показатели в плазме являются практически одними и теми же. Согласно способу по настоящему изобретению кинетические показатели антитела (например, антитела против глипикана-3) могут быть изменены на стадии гуманизирования, когда pI антитела (например, антитела против глипикана-3) модулируют путем модификации аминокислотного остатка, который может находиться на поверхности антитела.

Способ по настоящему изобретению также можно применять к антителам человека. Антитело человека (например, антитело человека против глипикана-3) с модулированными кинетическими показателями в плазме по сравнению с кинетическими показателями в плазме исходно полученного антитела человека (т.е. увеличение или уменьшение времени полужизни исходного антитела в плазме) можно сконструировать путем модификации pI антитела человека (например, антитела человека против глипикана-3), вводя модификацию в аминокислотный остаток, который может находиться на поверхности антитела человека, сконструированного на основе библиотеки антител человека, мыши, продуцирующей антитела человека, и т.п.

Время полужизни антитела в плазме увеличивается при снижении значения pI антитела. И наоборот, известно, что время полужизни в плазме уменьшается, а характеристики транслокации антитела в тканях улучшаются при увеличении значения pI антитела (Vaisitti T., Deaglio S. and Malavasi F., Cationization of monoclonal antibodies: another step towards the “magic bullet”?, J. Biol. Regul. Homoest. Agents (2005) 19(3-4), 105-12: Pardridge W.M., Buciak J., Yang J. and Wu D., Enhanced endocytosis in cultired human breast carcinoma cells and in vivo biodistribution in rats of a humanized monoclonal antibody after cationization of the protein, J. Pharmacol. Exp. Ther. (1998) 286(1), 548-54). Однако вследствие повышенной иммуногенности и увеличенной интернализации такого антитела в клетку требуется его дополнительное улучшение для использования в качестве антитела, проявляющего противоопухолевую активность посредством такого механизма, как цитотоксическая активность, поскольку интернализация в клетку препятствует проявлению его цитотоксической активности, такой как ADCC-активность, CDC-активность и т.п. Таким образом, что касается антитела, которое проявляет противоопухолевый эффект посредством такого механизма, как цитотоксическая активность, при котором интернализация в клетку является препятствием для проявления его цитотоксической активности, такой как ADCC-активность, CDC-активность и т.п., не было определено, вызывает ли увеличение или уменьшение значения pI антитела усиление эффекта подавления развития опухоли. В настоящем изобретении, были созданы модифицированное гуманизированное антитело против глипикана-3 со сниженным значением pI и модифицированное гуманизированное антитело против глипикана-3 с повышенным значением pI, затем проверяли, какая из модификаций имела более высокую активность подавления развития опухоли путем сравнения противоопухолевого эффекта обоих антител. В результате, неожиданно было обнаружено, что гуманизированное антитело против глипикана-3 со сниженным значением pI показало лучший эффект против рака печени.

Используемый в описании термин “антитело против глипикана-3” охватывает антитело против глипикана-3, полученное путем дополнительной модификации аминокислотного остатка антитела против глипикана-3, которое уже было подвергнуто модификации аминокислотного остатка, как описано выше, например, путем замены, делеции, добавления и/или инсерции аминокислотного остатка, входящего в состав указанного антитела против глипикана-3. Кроме того, используемый в описании термин “антитело против глипикана-3” также охватывает антитело против глипикана-3, полученное из антитела против глипикана-3, в котором уже произвели замену, делецию, добавление и/или инсерцию аминокислотного остатка, или модификацию аминокислотной последовательности, например, путем химеризации, гуманизации и т.п., и дополнительно модифицированное с целью изменения заряда аминокислотных остатков, составляющих указанное антитело.

Предпочтительным примером модификации с целью улучшения характеристик антитела (например, антитела против глипикана-3) по настоящему изобретению является модификация с целью повышения стабильности антитела (называемая далее модификацией стабильности). В водном растворе, антитело находится в равновесии между двумя состояниями, его нативным состоянием и неактивным денатурированным состоянием. Стабильность нативного состояния, согласно второму закону термодинамики (∆G=∆H-T∆S), зависит от изменения свободной энергии Гиббса ∆G системы и баланса между компонентами ∆G, т.е. изменения энтальпии ∆Н (обусловленного изменениями, например, в гидрофобных взаимодействиях и водородной связи в полипептидной цепи) и изменения энтропии ∆S (обусловленного изменениями в сольватации и степенях свободы в трехмерной структуре). Положительное значение ∆G указывает на то, что нативное состояние белка является более стабильным, чем денатурированное состояние белка, и стабильность нативного состояния белка повышается, поскольку ∆G допускает более высокие положительные значения. С тем чтобы произошла денатурация белка необходимо разрушить силы, способствующие поддержанию стабильности. Например, выдерживание раствора белка при высоких температурах приводит к повышению степени свободы в трехмерной структуре и ослаблению факторов, способствующих стабилизации белка, что приводит к тепловой денатурации белка. В этом случае параметр -T∆S определяет денатурацию. ∆Н разворачивания в результате тепловой денатурации белка можно непосредственно измерить с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC), как, в частности, описано в представленных в описании примерах. Кривая DSC процесса тепловой денатурации белка принимает форму эндотермического пика, который выражает температуру, известную как средняя температура денатурации (Tm), представляющая собой характеристику тестируемого белка. Изменение энтальпии денатурации получают путем интегрирования этого пика. Значение Tm обычно является показателем тепловой стабильности. С помощью DSC во время тепловой денатурации белка также можно измерить изменение теплоемкости (∆Ср). Изменение теплоемкости, происходящее в процессе денатурации, вызвано гидратацией, которая происходит, когда в процессе денатурации белка аминокислотные остатки, которые в нативном состоянии белка не находятся на поверхности его молекулы, становятся подверженными воздействию молекул растворителя.

Как описано выше, “модификация” аминокислотного остатка в способе по настоящему изобретению, в частности, охватывает, помимо прочего, замену исходного аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком, делецию исходного аминокислотного остатка и добавление нового аминокислотного остатка. Замена исходного аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком является предпочтительной. Таким образом, в настоящем изобретении предпочтительно используется модификация путем замены аминокислотного остатка, когда предполагается модификация стабильности антитела. Значение Tm антитела (например, антитела против глипикана-3) увеличивается в результате осуществления модификации стабильности путем модификации аминокислотных остатков, составляющих антитело. Таким образом, значение Tm используется соответствующим образом в качестве показателя модификации стабильности антитела (например, антитела против глипикана-3).

Для осуществления вышеуказанной “модификации стабильности” антитела против глипикана-3 по настоящему изобретению, предпочтительно выполняют модификацию, например, по меньшей мере одного аминокислотного остатка, выбранного из аминокислотных остатков в положениях 37, 40, 48 и 51 вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела против глипикана-3, представленной в SEQ ID NO:1. Кроме того, модификацию предпочтительно осуществляют по меньшей мере одного аминокислотного остатка, выбранного из аминокислотных остатков в положениях 2, 25, 42, 48, 50, 83 и 84 вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела против глипикана-3, представленной в SEQ ID NO:7. Аминокислотные остатки, которые отличаются от описанных выше предпочтительных для модификации стабильности аминокислотных остатков, не нужно модифицировать для получения нужного значения Tm. Однако может потребоваться соответствующая модификация этих остатков для достижения значения Tm, которое является почти таким же или выше значения Tm модифицированного гуманизированного антитела против глипикана-3.

Модификация стабильности может быть осуществлена путем произвольной модификации аминокислотных остатков, входящих в состав антитела (например, гуманизированного антитела против глипикана-3), предназначенного для модификации. Кроме того, модификация стабильности также может быть осуществлена путем замены части аминокислотной последовательности, составляющей предназначенное для модификации гуманизированное антитело (например, антитело против глипикана-3), на аминокислотную последовательность, обнаруженную в антителе, которое уже имеет высокое значение Tm и которое соответствует - с точки зрения корреляции трехмерной структуры антитела - указанной выше части аминокислотной последовательности, составляющей гуманизированное антитело (например, гуманизированное антитело против глипикана-3), предназначенное для модификации. Отсутствуют какие-либо ограничения на положение аминокислотного остатка или остатков, предназначенных для замены; однако предпочтительно модифицировать аминокислотный остаток или остатки в FR. При необходимости может быть осуществлена модификация аминокислотного остатка даже в CDR-области при условии, что при этом не происходит уменьшение связывающей активности с антигеном. Кроме того, отсутствуют какие-либо особые ограничения на количество аминокислотных остатков, предназначенных для модификации, также возможна модификация путем замены конкретного участка в FR на нужный участок. К таким участкам, которые могут быть модифицированы, относятся все участки в FR (FR1, FR2, FR3, FR4), при этом один или несколько из этих участков модификации могут быть объединены.

В случаях модифицикации FR-участка FR2 тяжелой цепи или легкой цепи является предпочтительным примером. Предпочтительным специфическим примером в этом отношении является модификация аминокислотного остатка, при которой FR2 тяжелой цепи гуманизированного антитела против глипикана-3 в подклассе VH1b (SEQ ID NO:1) модифицируют в подкласс VH4, т.е. модификация V37I (валин в положении 37 заменяют изолейцином), а также модификации A40P, M48I и L51I. Другими предпочтительными специфическими примерами являются модификация FR2-участка легкой цепи гуманизированного антитела против глипикана-3 в подклассе VK2 (SEQ ID NO:7) в подкласс VK3, т.е. модификации L42Q, S48A и Q50R. Также предпочтительной является модификация V2I, которая соответствует модификации в последовательности зародышевой линии для FR1.

Замену, делецию, добавление и/или инсерцию аминокислотных остатков, входящих в состав антитела (например, антитела против глипикана-3), и модификацию аминокислотной последовательности путем, например, химеризации и гуманизации можно осуществить подходящим образом, используя любой метод, известный специалистам в данной области. При необходимости, в процессе конструирования антитела (например, антитела против глипикана-3) по настоящему изобретению в виде рекомбинантного антитела аналогичным образом можно осуществить замену, делецию, добавление и/или инсерцию аминокислотных остатков, входящих в состав вариабельной области и константной области антитела.

В качестве антитела (например, антитела против глипикана-3) по настоящему изобретению могут быть использованы любые антитела животного происхождения, например антитело мыши, антитело человека, антитело крысы, антитело кролика, антитело козы, верблюжье антитело предпочтительно. Также предпочтительным для использования является модифицированное антитело (например, антитело против глипикана-3), полученное путем замены в аминокислотной последовательности химерного антитела и гуманизированного антитела. Предпочтительными для использования также являются модификации антитела с присоединением любых различных молекул.

“Химерное антитело” относится к антителу, сконструированному путем комбинации последовательностей, происходящих от различных животных. Подходящими для этого примерами являются антитела, сконструированные из вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи антитела мыши и константных областей тяжелой цепи и легкой цепи антитела человека. Методы конструирования химерных антител известны. Например, рекомбинантную ДНК создают путем лигирования ДНК, кодирующей вариабельную область антитела мыши, с сохранением рамки считывания с ДНК, кодирующей константную область антитела человека, при этом данная рекомбинантная ДНК может быть встроена в обычный вектор экспрессии. Клетку-хозяин, трансфицированную или трансформированную таким вектором, культивируют, при этом химерное антитело может быть получено или выделено из культуральной среды соответствующими способами.

Гуманизированные антитела также известны как реконструированные антитела человека. Они представляют собой антитела, в которых гипервариабельный участок (CDR) антитела, выделенного из отличного от человека млекопитающего, такого как мышь, лигирован с каркасным участком (FR) антитела человека. Последовательность ДНК, кодирующая гуманизированное антитело, может быть синтезирована с помощью перекрывающейся ПЦР с использованием в качестве праймеров множества олигонуклеотидов. Исходные материалы и процедуры проведения перекрывающейся ПЦР описаны, например, в международной патентной заявке WO 98/13388, а также в других источниках. ДНК, кодирующую вариабельную область гуманизированного антитела по настоящему изобретению, получают с помощью перекрывающейся ПЦР из множества олигонуклеотидов, сконструированных таким образом, чтобы получить нуклеотидные последовательности, которые перекрывают друг друга, которую, в свою очередь, лигируют с ДНК, кодирующей константную область антитела человека, для создания последовательности кодонов в пределах рамки считывания. Затем ДНК, лигированную таким образом, встраивают необходимым для функционирования образом в вектор экспрессии, который затем трансфицируют в хозяина.

Методы идентификации CDR известны (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md.; Chothis et al., Nature (1989) 342, 877). Следовательно, также известны методы общей генетической рекомбинации (см. ссылки в патенте ЕР 125023 А и международной патентной заявке WO 96/02576). После определения CDR, полученного из антитела отличного от человека животного, например антитела мыши, указанные известные методы можно использовать для конструирования ДНК, кодирующей рекомбинантное антитело, в котором лигированы CDR и FR из антитела человека. FR из антитела человека, лигированные с CDR, выбирают таким образом, чтобы CDR-участок формировал высококачественный антигенсвязывающий сайт. При необходимости, аминокислотный остаток или остатки в FR-участках вариабельных областей антитела можно модифицировать таким образом, чтобы CDR реконструированного антитела человека мог образовать соответствующий антигенсвязывающий сайт (Sato et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-6). Аминокислотные остатки в FR, предназначенных для модификации, могут включать остатки, которые связываются непосредственно с антигеном нековалентными связями (Amit et al., Science (1986) 233, 747-53), остатки, которые влияют или оказывают воздействие на структуру CDR (Chothia et al., J. Mol. Biol. (1987) 196, 901-17), и остатки, относящиеся к взаимодействиям типа VH-VL (вариабельная область тяжелой цепи- вариабельная область легкой цепи) (патент ЕР 239400 В).

Кодируемое ДНК гуманизированное антитело продуцируется клеткой-хозяином, которая была трансформирована или трансфицирована обычно используемым вектором экспрессии, в который встроена данная ДНК, затем антитело выделяют из культуральной среды, генерируемой культурой клетки-хозяина.

Если антитело по настоящему изобретению представляет собой химерное антитело, гуманизированное антитело или антитело человека, то в качестве константной области этого антитела используют константную область антитела человеческого происхождения. Например, если антитело против глипикана-3 по настоящему изобретению представляет собой химерное антитело против глипикана-3, гуманизированное антитело против глипикана-3 или антитело человека против глипикана-3, то в качестве константной области антитела против глипикана-3 предпочтительно используют константную область антитела человеческого происхождения. Например, каждый из Сγ1, Сγ2, Сγ3 и Сγ4 является подходящим для использования в качестве константной области тяжелой цепи, в то время как каждый из Сκ и Сλ является подходящим для использования в качестве константной области легкой цепи. Кроме того, константная область антитела человека при необходимости может быть модифицирована для улучшения антитела (например, антитела к глипикану-3) или для улучшения стабильности его продуцирования. Химерное антитело (например, химерное антитело против глипикана-3) по настоящему изобретению содержит соответствующую вариабельную область антитела отличного от человека млекопитающего и константную область антитела человека. С другой стороны, гуманизированное антитело предпочтительно содержит CDR антитела отличного от человека млекопитающего и константную область и FR антитела человека. Например, гуманизированное антитело против глипикана-3 предпочтительно содержит CDR антитела против глипикана-3 отличного от человека млекопитающего и константную область и FR антитела человека. Антитело человека содержит соответствующие CDR антитела человеческого происхождения и константную область и FR антитела человека. Например, антитело человека против глипикана-3 содержит соответствующие CDR антитела против глипикана-3 человеческого происхождения и константную область и FR антитела человека. Константная область антитела человека состоит из аминокислотной последовательности, которая является характерной для конкретного изотипа, т.е. IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD и IgE. Константную область антитела, принадлежащего любому из этих изотипов, используют подходящим образом в качестве константной области гуманизированного антитела (например, антитела против глипикана-3) по настоящему изобретению. Использование константной области IgG человека является предпочтительным, но не ограничивающим. Также отсутствуют какие-либо особые ограничения на FR антитела человека, используемый в качестве FR гуманизированного антитела (например, гуманизированного антитела против глипикана-3) или антитела человека (например, антитела человека против глипикана-3), при этом подходящим образом используется FR антитела, принадлежащего любому изотипу.

С целью снижения иммуногенности также могут быть заменены все или часть аминокислотных остатков, составляющих FR, последовательностями зародышевой линии с помощью метода, описанного у Ono K. et al., Loc. Cit., или аналогичного метода. Основываясь на рациональном прогнозе о том, что последовательности зародышевой линии имеют низкую иммуногенность, аминокислотную последовательность, составляющую FR гуманизированного антитела, можно сравнить путем выравнивания с аминокислотными последовательностями зародышевой линии (Abhinandan K.R. and Martin C.R., J. Mol. Biol. (2007) 369, 852-862). Отличающиеся при таком сравнении аминокислотные остатки FR гуманизированного антитела могут быть заменены, в пределах не ухудшающей антигенсвязывающие характеристики области, на аминокислотные остатки из последовательности зародышевой линии. Далее приведены специфические примеры аминокислотных остатков, составляющих вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:1, к которым относятся: модификация, которая заменяет L в положении 70 на I; модификация, которая заменяет Т в положении 87 на R; и модификация, которая заменяет Т в положении 97 на А. Кроме того, модификация, которая заменяет S в положении 25 на А, является примером для аминокислотных остатков, составляющих вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:7.

Что касается вариабельной области и константной области модифицированного химерного антитела, гуманизированного антитела и антитела человека по настоящему изобретению, то при необходимости можно осуществить делецию, замену, инсерцию и/или добавление одной или нескольких аминокислот, составляющих вариабельную область и/или константную область модифицируемого антитела, с тем, чтобы проявилась специфичность связывания с антигеном. В частности, в вариабельной области и константной области модифицированного химерного антитела против глипикана-3, гуманизированного антитела против глипикана-3 и антитела человека против глипикана-3 согласно настоящему изобретению при необходимости осуществляют делецию, замену, инсерцию и/или добавление одной или нескольких аминокислот, составляющих вариабельную область и/или константную область модифицируемого антитела против глипикана-3, таким образом, чтобы проявилась специфичность связывания с молекулой антигена, глипиканом-3.

Поскольку химерные антитела против глипикана-3 с последовательностями, происходящими от человека, гуманизированные антитела против глипикана-3 и антитела человека против глипикана-3 имеют сниженную иммуногенность в организме человека, предполагается, что они пригодны для использования в качестве терапевтических антител, которые вводят человеку, например, с терапевтической целью.

В способе по настоящему изобретению в качестве последовательностей, кодирующих тяжелую цепь и легкую цепь антитела, для введения мутации можно использовать известные последовательности. Кроме того, новые последовательности гена антитела могут быть получены способами, известными специалистам в данной области. Например, гены могут быть получены подходящим способом из библиотек антител. Кроме того, гены также могут быть получены путем клонирования с помощью известных процедур, например ПЦР в реальном времени, используя в качестве матрицы мРНК гибридому, продуцирующую моноклональные антитела.

Что касается библиотек антител, то уже известны многочисленные библиотеки. Кроме того, поскольку способы создания библиотек антител также известны, специалисты в данной области могут получить или создать соответствующие библиотеки антител. Примерами подходящих библиотек антител являются библиотеки фаговых антител, раскрытые в литературе, например Clackson et al., Nature (1991) 352, 624-8; Marks et al., J. Mol. Biol. (1991) 222, 581-97; Waterhouses et al., Nucleic Acids Res. (1993) 21, 2265-6; Griffiths et al., EMBO J (1994) 13, 3245-60; Vaughan et al., Nature Biotechnology (1996) 14, 309-14; и заявка на патент Японии, доступная под № 2008-504970. Подходящими для использования также являются способ создания библиотеки в эукариотических клетках (WO 95/15393) и такие известные способы, как рибосомный дисплей и т.д. Специалисты в данной области также знакомы со способом получения антител человека с помощью метода пеннинга с использованием в качестве исходного материала библиотеки антител человека. Таким образом, используя методы фагового дисплея, на поверхности фага экспрессируют одноцепочечное антитело (scFv), содержащее слитые внутри рамки считывания вариабельные области тяжелой и легкой цепей антитела человека. Гены, кодирующие антиген-связывающий scFv, выделяют из этого фага путем отбора фага, который связывается с этим антигеном. Идентификация последовательности таких генов позволяет определить последовательность ДНК, которая кодирует вариабельные области тяжелой и легкой цепей антитела человека против глипикана-3, которое связывается с антигеном, глипиканом-3. Антитело человека против глипикана-3 получают соответствующим образом путем вставки гена антитела, имеющего эту последовательность, в подходящий вектор экспрессии, который обеспечивает экспрессию в подходящей клетке-хозяине, как описано ниже. Такие способы хорошо известны в данной области и включают способы, раскрытые в WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438 и WO 95/15388.

Известные методы можно использовать и для получения гена, кодирующего антитело, из гибридомы, которая продуцирует антитело, в частности для получения гена, кодирующего антитело против глипикана-3, из гибридомы, которая продуцирует моноклональное антитело против глипикана-3. Если говорить кратко, животных иммунизируют, используя глипикан-3 (необходимый сенсибилизирующий антиген), с помощью стандартных способов иммунизации, и с помощью стандартных методов слияния клеток, которые подробно описаны ниже, выполняют клеточное слияние полученных из животного иммуноцитов с известными родительскими клетками. Стандартными методами скрининга проводят скрининг продуцирующих моноклональные антитела клеток (гибридом), и с помощью обратной транскриптазы можно синтезировать кДНК вариабельной области (V области) антитела против глипикана-3 с использованием в качестве матрицы мРНК, выделенную из отобранной гибридомы. Ген антитела против глипикана-3 получают соответствующим образом путем слияния внутри рамки считывания этой кДНК с ДНК, кодирующей константную область (C область) нужного антитела.

Специфические примеры приведены ниже, но настоящее изобретение не ограничено этими примерами. Сенсибилизирующий антиген, используемый для генерации антитела по настоящему изобретению, может представлять собой полный иммуногенный антиген или может быть неполным антигеном, включая, например, неиммуногенный гаптен. Например, соответствующим образом можно использовать белок глипикана-3 полной длины или его неполный полипептид или пептид. Предпочтительным примером является растворимый коровый полипептид GPC3, приведенный в SEQ ID NO:13. В ином случае, также известно использование в качестве антигена веществ, содержащих полисахарид, нуклеиновую кислоту, липид и т.д. Антиген, с которым связывается антитело против глипикана-3 по настоящему изобретению, по существу не ограничен описанными выше вариантами осуществления. Получение антигена осуществляют соответствующим образом с помощью известных специалистам в данной области способов. Например, соответствующим образом можно применить способ, использующий бакуловирус (например, WO 98/46777 и т.д.). Если антиген обладает низкой иммуногенностью, животное можно соответствующим образом иммунизировать с помощью такого антигена, связанного с очень большой иммуногенной молекулой, такой как альбумин. Если сенсибилизирующий антиген представляет собой молекулу, которая связана с клеточной мембраной, такой как глипикан-3, то, при необходимости, в качестве сенсибилизирующего антигена используется соответствующим образом фрагмент полипептида из внеклеточного домена молекулы. Либо в качестве сенсибилизирующего антигена соответствующим образом используется клетка, экспрессирующая такую молекулу на клеточной поверхности. Кроме того, если сенсибилизирующий антиген представляет собой нерастворимую молекулу, можно добиться растворения путем прикрепления этой молекулы к другой растворимой в воде молекуле и затем можно соответствующим образом использовать эту растворенную молекулу в качестве сенсибилизирующего антигена.

Продуцирующие антитело клетки (например, клетки, продуцирующие антитело против глипикана-3) получают соответствующим образом путем иммунизации животного, используя подходящий сенсибилизирующий антиген, как описано выше. Либо продуцирующие антитело клетки (например, клетки, продуцирующие антитело против глипикана-3) могут быть получены in vitro путем иммунизации лимфоцитов, которые способны продуцировать антитело. В качестве предназначенного для иммунизации животного можно использовать различных позвоночных животных и млекопитающих. В частности, в качестве предназначенного для иммунизации животного можно использовать грызунов, зайцеобразных и приматов. Грызуны могут включать мышей, крыс и хомяков; зайцеобразные могут включать кроликов; а приматы могут включать обезьян, таких как яванская макака, макака-резус, гамадрил и шимпанзе. Кроме того, также известны трансгенные животные, которые поддерживают в своем геноме набор генов антител человека, и, используя соответствующим образом таких животных, можно получить антитело человека (WO 96/34096; Mendez et al., Nat. Genet. (1997) 15, 146-56). Вместо использования таких трансгенных животных, нужное антитело человека, проявляющее связывающую активность по отношению к нужному антигену, можно получить соответствующим образом, например путем сенсибилизации лимфоцитов человека in vitro нужным антигеном или клетками, которые экспрессируют нужный антиген, с последующим клеточным слиянием с клетками миеломы человека, например U266 (японская патентная заявка № Hei 1-59878). Кроме того, нужное антитело человека (например, антитело человека против глипикана-3) может быть получено соответствующим образом путем иммунизации нужным антигеном трансгенного животного, которое поддерживает в своем геноме весь набор генов антител человека (WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 96/34096 и WO 96/33735).

Иммунизацию животного проводят, например, путем подходящего разведения и суспендирования сенсибилизирующего антигена в забуференном фосфатом солевом растворе (PBS), физиологическом растворе и т.д., при необходимости, эмульгирования с использованием смеси адъюванта и затем внутрибрюшинного или подкожного введения сенсибилизирующего антигена животному. Предпочтительно выполняют несколько введений сенсибилизирующего антигена, смешанного с неполным адъювантом Фрейнда (Freund) с 4-21-дневным интервалом. Продуцирование антитела к сенсибилизирующему антигену в иммунизированном животном может быть измерено с помощью известных аналитических методов, например методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) и методом проточной цитометрии (FACS).

Гибридому можно получить слиянием клетки, продуцирующей антитело против глипикана-3, полученной из животного или лимфоцита, иммунизированного представляющим интерес сенсибилизирующим антигеном, с клетками миеломы с использованием агента слияния, обычно используемого для слияния клеток, например полиэтиленгликоля (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986) 59-103). Гибридому можно создавать соответствующим образом, например способом, предложенным Milstein et al. (G. Kohler and С. Milstein, Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46). Клеточная культура и пролиферация клеток гибридомы, полученных таким способом, дают моноклональное антитело, которое продуцируется гибридомой и специфически связывается с глипиканом-3. Специфичность связывания, проявляемая этим моноклональным антителом по отношению к глипикану-3, может быть соответствующим образом измерена известными аналитическими методами, такими как иммунопреципитация, радиоиммуноанализ (RIA), твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), проточная цитометрия (FACS) и т.д. При необходимости, гибридому, продуцирующую антитело против глипикана-3 с требуемой специфичностью, сродством или активностью, можно затем субклонировать соответствующим образом, например предельным разбавлением, и можно выделить моноклональное антитело, продуцированное этой гибридомой.

Затем из вышеупомянутой гибридомы или продуцирующей антитело клетки (например, сенсибилизированного лимфоцита) можно клонировать ген, кодирующий отобранное антитело, используя зонд, способный специфически связываться с геном (например, олигонуклеотидом, комплементарным последовательности, кодирующей константную область этого антитела). Клонирование также можно выполнять методом ПЦР в реальном времени, используя в качестве матрицы мРНК, изолированную из гибридомы или продуцирующей антитело клетки (например, сенсибилизированного лимфоцита). Иммуноглобулины подразделяют на 5 различных классов, т.е. IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, исходя из различий в их структуре и функциях. Кроме того, отдельные классы подразделяют на несколько подклассов (изотипов) (например, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4; IgA1 и IgA2 и т.д.). Антитело по настоящему изобретению может происходить из антитела, принадлежащего любому из этих классов и подклассов, и, по существу, не ограничено никаким классом или подклассом; однако антитело, принадлежащее классу IgG, особенно предпочтительно.

Гены, кодирующие аминокислотные последовательности, составляющие тяжелую цепь и легкую цепь антитела (например, антитела против глипикана-3), могут быть модифицированы соответствующим образом с помощью методов генной инженерии. Например, рекомбинантное антитело, которое было подвергнуто искусственной модификации с целью, например, уменьшения ксено-иммуногенности (гетеро-иммуногенности) в отношении людей (например, химерное антитело, такое как химерное антитело против глипикана-3, гуманизированное антитело, такое как гуманизированное антитело против глипикана-3, и т.д.), можно получить с помощью соответствующей модификации остатков нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную последовательность, составляющую это антитело, например антитело мыши, антитело крысы, антитело кролика, антитело хомяка, антитело овцы, антитело верблюда и т.д. Химерное антитело представляет собой антитело, составленное из вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи антитела, полученного из не относящегося к человеку млекопитающего, такого как мышь, и константных областей тяжелой цепи и легкой цепи антитела человека. Химерное антитело может быть получено следующим образом: ДНК, кодирующую вариабельную область антитела мыши, лигируют с ДНК, кодирующей константную область антитела человека, встраивают в вектор экспрессии и полученный рекомбинантный вектор вводят хозяину и обеспечивают экспрессию. Гуманизированное антитело также известно как реконструированное антитело человека и является антителом, в котором гипервариабельный участок (CDR) антитела (например, антитела против глипикана-3), выделенный из не относящегося к человеку млекопитающего, такого как мышь, лигируют с каркасным участком антитела человека для создания последовательности кодонов в пределах рамки считывания. Последовательность ДНК, кодирующая гуманизированное антитело, может быть синтезирована с помощью реакции перекрывающихся праймеров ПЦР с использованием в качестве матриц множества олигонуклеотидов. Исходные материалы и процедуры для реакции перекрывающихся праймеров ПЦР описаны, например, в WO 98/13388 или в других источниках.

ДНК, кодирующая вариабельную область рекомбинантного антитела (например, рекомбинантного антитела против глипикана-3) по настоящему изобретению, получают с помощью перекрывающейся ПЦР из множества олигонуклеотидов, сконструированных таким образом, чтобы получить нуклеотидные последовательности, которые перекрывают друг друга, которую, в свою очередь, лигируют с ДНК, кодирующей константную область антитела человека, для создания последовательности кодонов в пределах рамки считывания. Затем лигированную таким образом ДНК встраивают необходимым для функционирования образом в вектор экспрессии и вводят хозяину. Антитело (например, антитело против глипикана-3), кодируемое ДНК, экспрессируют путем культивирования хозяина. Экспрессированное антитело (например, антитело против глипикана-3) выделяют с помощью очистки из среды для культивирования хозяина (EP 239400, WO 96/02576 и т.д.). FR гуманизированного антитела (например, антитела против глипикана-3), лигированные с CDR, отбирают таким образом, чтобы гипервариабельный участок формировал высококачественный антиген-связывающий сайт для данного антигена. При необходимости, аминокислотная последовательность может быть модифицирована с помощью подходящей замены аминокислотных остатков, составляющих FR вариабельной области антитела, таким образом, чтобы гипервариабельный участок реконструированного антитела мог формировать подходящий антиген-связывающий сайт для данного антигена (K. Sato et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).

Дополнительно к относящейся к гуманизации модификации, как описано выше, могут быть введены дополнительные модификации, например, для улучшения биохимических характеристик антитела, например связывающей активности с антигеном, узнаваемым этим антителом (например, антителом против глипикана-3). Модификации в контексте настоящего изобретения могут быть выполнены соответствующим образом известными способами, такими как сайт-специфический мутагенез (см., например, Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488), ПЦР-мутация, мутация кассеты и т.д. Аминокислотная последовательность модифицированного антитела с улучшенными биохимическими характеристиками обычно имеет по меньшей мере 70%, более предпочтительно, по меньшей мере 80% и, еще более предпочтительно, по меньшей мере 90% (например, по меньшей мере 95%, 97%, 98%, 99% и т.д.) идентичность и/или подобие с аминокислотной последовательностью, составляющей предназначенное для модификации антитело (т.е. антитело, являющееся основой для модифицированного антитела). Как используется в настоящем описании, идентичность и/или подобие последовательностей относится к доле аминокислотных остатков, которые идентичны (идентичные остатки) или подобны (аминокислотные остатки, классифицируемые в пределах той же самой группы на основе общих характеристик аминокислотной боковой цепи) после выравнивания последовательностей и, при необходимости, вставки пропусков таким образом, чтобы идентичность последовательностей была максимальной. Встречающиеся в природе аминокислотные остатки, как правило, можно классифицировать на следующие группы исходя из свойств боковой цепи: (1) гидрофобные: аланин, изолейцин, валин, метионин и лейцин; (2) нейтральные гидрофильные: аспарагин, глутамин, цистеин, треонин и серин; (3) кислые: аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; (4) основные: аргинин, гистидин и лизин; (5) остатки, влияющие на ориентацию цепи: глицин и пролин; и (6) ароматические: тирозин, триптофан и фенилаланин.

Специфический соответствующий вариант осуществления модификации для усиления функции антитела включает усиление проявляемой антителом цитотоксичности, таким как гуманизированное антитело против глипикана-3. Предпочтительными примерами цитотоксичности являются антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC) и комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC). В настоящем изобретении CDC-активность означает цитотоксичность, проявляемую благодаря системе комплемента, в то время как ADCC относится к активности, повреждающей клетку-мишень, когда специфическое антитело прикрепляется к антигену клеточной поверхности на клетке-мишени и клетка, несущая Fcγ-рецептор (например, иммуноцит), связывается с Fc-фрагментом антитела посредством Fcγ-рецептора. Обладает ли тестируемое антитело ADCC-активностью либо CDC-активностью, можно определить известными способами (например, Current Protocols in Immunology, Chapter 7, Immunologic studies in humans. Editor, John E. Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc., (1993)).

Сначала в специальных условиях готовят эффекторные клетки, раствор комплемента и клетки-мишени.

(1) Получение эффекторных клеток

Извлекают селезенку, например, из мыши CBA/N и клетки селезенки разделяют в среде RPMI1640 (Invitrogen). После промывки той же средой, содержащей 10%-ную эмбриональную бычью сыворотку (FBS, HyClone), концентрацию клеток доводят до 5×10⁶ клеток/мл для получения эффекторных клеток.

(2) Получение раствора комплемента

Раствор комплемента можно приготовить 10-кратным разведением средой (Invitrogen) комплемента Baby Rabbit (CEDARLANE) с 10% FBS-содержащей средой (Invitrogen).

(3) Получение клеток-мишеней

Клетки, экспрессирующие белок антигена, с которым связывается тестируемое антитело, культивируют с 0,2 mCi ⁵¹Cr хромата натрия (GE Healthcare Bioscience) в среде DMEM, содержащей 10%-ный FBS, в течение 1 часа при температуре 37°C для введения в клетки-мишени радиоактивной метки. В качестве клеток, экспрессирующих белок антигена, с которым связывается тестируемое антитело, среди прочих, можно использовать нижеследующие клетки: клетки, трансформированные геном, кодирующим белок антигена, с которым связывается тестируемое антитело, клетки рака яичников, клетки рака простаты, клетки рака молочной железы, клетки рака матки, клетки рака печени, клетки рака легкого, клетки рака поджелудочной железы, клетки рака почек, клетки рака мочевого пузыря и клетки рака толстой кишки. После введения радиоактивной метки, клетки промывают три раза средой RPMI1640, содержащей 10%-ный FBS, и концентрацию клеток доводят до 2×10⁵ клеток/мл для получения клеток-мишеней.

ADCC-активность и CDC-активность можно измерить следующими способами. Для измерения ADCC-активности вносят 50 мкл клеток-мишеней и 50 мкл тестируемого антитела в 96-луночный планшет с U-дном (Becton Dickinson) и выдерживают в течение 15 минут на льду для прохождения реакции. К реакционной смеси добавляют 100 мкл эффекторных клеток и инкубируют в течение 4 часов в инкубаторе с углекислым газом. Конечная концентрация тестируемого антитела предпочтительно находится в пределах от 0 до 10 мкг/мл. После инкубации извлекают 100 мкл супернатанта и измеряют радиоактивность супернатанта с помощью гамма-счетчика (COBRA II AUTO-GAMMA, MODEL D5005, Packard Instrument Company). Цитотоксичность можно вычислять, используя радиоактивность, согласно следующему уравнению:

(А-C)/(B-C)×100,

где A представляет собой радиоактивность (cpm) образца с конкретным тестируемым антителом; В представляет собой радиоактивность (cpm) образца, к которому был добавлен 1%-ный NP-40 (Nacalai Tesque); и С представляет собой радиоактивность (cpm) образца, содержащего только клетки-мишени.

Для измерения CDC-активности 50 мкл клеток-мишеней и 50 мкл тестируемого антитела вносят в 96-луночный планшет с плоским дном (Becton Dickinson) и выдерживают в течение 15 минут на льду для прохождения реакции. В реакционную смесь добавляют 100 мкл раствора комплемента и инкубируют в течение 4 часов в инкубаторе с углекислым газом. Конечная концентрация тестируемого антитела предпочтительно находится в пределах от 0 до 3 мкг/мл. После культивирования извлекают 100 мкл супернатанта и измеряют радиоактивность супернатанта с помощью гамма-счетчика. Цитотоксичность можно вычислять таким же способом, как и ADCC-активность.

После измерения цитотоксичности, обусловленной конъюгатом антител, в 96-луночный планшет с плоским дном (Becton Dickinson) вносят по 50 мкл клеток-мишеней и 50 мкл конъюгата тестируемого антитела и выдерживают в течение 15 минут на льду для прохождения реакции. Затем планшет инкубируют в течение 1-4 часов в инкубаторе с углекислым газом. Конечная концентрация тестируемых антител предпочтительно находится в пределах от 0 до 3 мкг/мл. После инкубации извлекают 100 мкл супернатанта и измеряют радиоактивность супернатанта с помощью гамма-счетчика. Цитотоксичность можно вычислять таким же способом, как и ADCC-активность.

Вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи антитела (например, антитела против глипикана-3), как описано выше, как правило, состоят из 3-х CDR- и 4-х FR-участков. Аминокислотные остатки, предназначенные для "модификации" в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, можно выбирать соответствующим образом, например, из аминокислотных остатков, составляющих CDR- или FR-участки. Модификация аминокислотных остатков, составляющих CDR-участки, в некоторых случаях может привести к снижению антиген-связывающей активности модифицируемого антитела (например, антитела против глипикана-3). По этой причине аминокислотные остатки антитела (например, антитела против глипикана-3), предназначенного для "модификации" в настоящем изобретении, предпочтительно выбирают из аминокислотных остатков, составляющих FR-участки, но без ограничения. Если подтверждено, что модификация аминокислотных остатков, локализованных в CDR-участках, не приводит к снижению антиген-связывающей активности модифицируемого антитела (например, антитела против глипикана-3), то такие аминокислотные остатки могут быть выбраны для модификации.

Специалисты в данной области могут легко найти в общедоступной базе данных, такой как база данных Кабата, аминокислотные последовательности, составляющие FR вариабельной области антитела, которые действительно встречаются в организме, например, у мыши или человека.

Предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения предоставляет гуманизированное антитело (например, антитело против глипикана-3), имеющее кинетические показатели в плазме, модулированные способом по настоящему изобретению. Например, гуманизированное антитело (например, антитело против глипикана-3) представляет собой гуманизированное антитело, содержащее гипервариабельный участок (CDR), происходящий от не относящегося к человеку животного, каркасный участок (FR), происходящий от человека, и константную область, происходящую от человека, где по меньшей мере один аминокислотный остаток, который может находиться на поверхности антитела в CDR или FR, имеет заряд, который отличается от заряда аминокислотного остатка, находящегося в соответствующем положении в CDR или FR исходного антитела и где гуманизированное антитело имеет модулированные кинетические показатели в плазме по сравнению с химерным антителом, имеющим такую же константную область.

Другой предпочтительный вариант настоящего изобретения относится к антителу человека (например, антитело человека против глипикана-3), имеющему кинетические показатели в плазме, модулированные способом по настоящему изобретению. Антитело человека, например, представляет собой антитело человека, содержащее гипервариабельный участок (CDR), происходящий от человека, каркасный участок (FR), происходящий от человека, и константную область, происходящую от человека, где по меньшей мере один аминокислотный остаток, который может находиться на поверхности антитела в CDR или FR, имеет заряд, который отличается от заряда аминокислотного остатка, находящегося в соответствующем положении в CDR или FR исходного антитела, и где антитело человека имеет модулированные кинетические показатели в плазме по сравнению с химерным антителом, имеющим такую же константную область.

Вышеуказанная константная область человека предпочтительно означает область, содержащую Fc-фрагмент человека дикого типа, но также соответствующим образом можно использовать модифицированный Fc. Такой "модифицированный Fc" может включать модифицированный Fc, полученный путем модификации аминокислотного остатка, составляющего Fc, а также модифицированный Fc, полученного путем модификации уже выполненной в Fc-фрагменте модификации. Предпочтительным примером такой модификации некоторой модификации является модификация характера модификации цепи сахара, связанного с Fc-фрагментом. Одним из предпочтительных специфических примеров является "антитело, имеющее пониженное содержание фукозы, связанной с Fc-фрагментом", который по существу раскрыт в настоящем описании как ссылочный пример.

Термин "антитело, имеющее пониженное содержание фукозы, связанной с Fc-фрагментом", означает антитело, у которого количество связанной фукозы значительно меньше по сравнению с контрольным антителом, и фукоза предпочтительно не детектируется. Как правило, фукоза связана с N-гликозид-связанными сахарными цепями, которые связаны с двумя полисахарид-связывающими сайтами, расположенными в Fc-фрагменте двух молекул тяжелых цепей, которые формируют одну молекулу антитела. Термин "антитело, имеющее пониженное содержание фукозы, связанной с Fc-фрагментом", означает антитело, у которого по сравнению с обычным используемым в качестве контроля антителом содержание фукозы составляет не более 50%, предпочтительно не более 25%, более предпочтительно не более 10% и особенно предпочтительно не более 0% от общего содержания сахарной цепи контрольного антитела. Содержание фукозы можно измерить с помощью аналитической процедуры, приведенной ниже в примерах в виде ссылки. Способ получения такого лишенного фукозы антитела может включать способ, описанный в ссылочных примерах настоящего изобретения, а также способ получения антител с использованием животных клеток с дефицитом фукозилтрансферазы (Biotechnol. Bioeng. (2004) 87 (5), 614-22) и способ получения антител с использованием животных клеток с модифицированной модификацией сложной разветвленной цепи сахара (Biotechnol. Bioeng. (2006) 93 (5), 851-61). Кроме того, подходящие примеры способов получения, в которых в качестве клеток-хозяев используются клетки неживотного происхождения, могут включать способ получения антител с использованием растительных клеток (Nature Biotechnology (2006) 24, 1591-7) и дрожжевых клеток (Nature Biotechnology (2006) 24, 210-5).

Предпочтительный вариант осуществления способа получения по настоящему изобретению представляет собой способ получения антитела (например, антитела против глипикана-3), имеющего модулированные кинетические показатели в плазме, включающий (a) модификацию нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, содержащий по меньшей мере один аминокислотный остаток, который может находиться на поверхности антитела (например, антитела против глипикана-3), которая изменяет заряд аминокислотного остатка(ов); (b) культивирование клетки-хозяина таким образом, чтобы экспрессировалась нуклеиновая кислота, модифицированная на стадии (a); и (c) выделение антитела (например, антитела против глипикана-3) из культуры клетки-хозяина.

В способе по настоящему изобретению термин "модификация нуклеиновой кислоты" относится к модификации последовательности нуклеиновой кислоты с тем, чтобы обеспечить кодон, который соответствует аминокислотному остатку, который вводят с помощью "модификации" по настоящему изобретению. Более конкретно, этот термин относится к модификации нуклеиновой кислоты, которая содержит подвергаемый модификации кодон, где указанная модификация изменяет кодон, соответствующий аминокислотному остатку до модификации, на кодон аминокислотного остатка, который вводится с помощью модификации. Вообще этот термин означает осуществление генетического процесса или мутагенной обработки с тем, чтобы произвести замену по меньшей мере одного основания нуклеиновой кислоты, содержащей кодоны, для обеспечения кодона, кодирующего целевой аминокислотный остаток. Таким образом, кодон, кодирующий аминокислотный остаток, предназначенный для модификации, заменяют кодоном, кодирующим аминокислотный остаток, который вводят с помощью модификации. Модификация нуклеиновой кислоты может быть выполнена соответствующим образом специалистами в данной области с помощью известного метода, например сайт-специфическим мутагенезом, ПЦР мутагенезом и т.д.

Нуклеиновую кислоту, полученную в настоящем изобретении, обычно помещают (встраивают) в подходящий вектор и вводят в клетку-хозяина. Отсутствуют какие-либо особые ограничения на вектор при условии, что он обладает способностью стабильно поддержать встроенную нуклеиновую кислоту. Например, относительно использования в качестве хозяина E. coli, предпочтительным является вектор pBluescript (Stratagene) в качестве клонирующего вектора, хотя можно использовать различные коммерчески доступные векторы. В частности, вектор экспрессии пригоден в тех случаях, где для получения полипептида по настоящему изобретению используется вектор. На вектор экспрессии отсутствуют какие-либо конкретные ограничения при условии, что он может in vitro экспрессировать полипептид в E. coli, в клеточной культуре или внутри организма. Предпочтительные примеры включают вектор pBEST (Promega) для экспрессии in vitro, вектор pET (Invitrogen) для E. coli, вектор pME18S-FL3 (GenBank Accession No. AB009864) для клеточной культуры и вектор pME18S (Mol. Cell Biol. (1988) 8, 466-472) для организма. ДНК по настоящему изобретению может быть встроена в вектор стандартными способами, например лигазной реакцией, в которой используются сайты ферментативной рестрикции (Current Protocols in Molecular Biology, edited by Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons, sections 11.4-11.11).

На указанную выше клетку хозяина отсутствуют какие-либо конкретные ограничения, и в зависимости от поставленной цели можно использовать различные клетки-хозяева. Примеры клеток для экспрессии полипептида включают бактериальные клетки (например, Streptococcus, Staphylococcus, E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilus), клетки грибов (например, дрожжи, Aspergillus), клетки насекомых (например, Drosophila S2, Spodoptera Sf9), животные клетки (например, CHO, COS, HeLa, C127, 3Т3, ВНК, НЕК293, клетки меланомы Bowes) и клетки растений. Вектор может быть введен в клетку-хозяина с помощью известных способов, например преципитацией фосфатом кальция, электропорацией (Current Protocols in Molecular Biology, edited by Ausubel et al. (1987) John Wiley & Sons, sections 9.1-9.9), липофекцией и микроинъекцией.

В антитело (например, антитело против глипикана-3) соответствующим образом может быть встроен подходящий секреторный сигнал для вызова секреции антитела, экспрессируемого в клетке-хозяине в полости эндоплазматического ретикулума, периплазматическом пространстве или внеклеточной среде. Такой сигнал может соответствовать характеристике нативной последовательности сигнала антитела (например, антитела против глипикана-3) или может быть гетерологичной последовательностью сигнала.

Антитело (например, антитело против глипикана-3), полученное как описано выше, может быть выделено путем сбора культуральной среды в тех случаях, когда антитело по настоящему изобретению секретировалось в культуральную среду. В тех случаях, когда антитело (например, антитело против глипикана-3) по настоящему изобретению продуцировалось внутри клетки, клетку сначала подвергают лизису, а затем выделяют антитело.

Для очистки антитела (например, антитела против глипикана-3) по изобретению можно соответствующим образом применять известные способы для выделения из рекомбинантной клеточной культуры, например, преципитацией сульфатом аммония и этанолом, экстракцией кислотой, анион- или катион-обменной хроматографией, хроматографией на фосфоцеллюлозной бумаге, хроматографией гидрофобного взаимодействия, аффинной хроматографией, хроматографией на гидроксиапатите и хроматографией с использованием лектина.

Настоящее изобретение также относится к композиции (лекарственному средству), содержащему фармацевтически приемлемый носитель и антитело (например, антитело против глипикана-3) (например, антитело IgG), имеющее кинетические показатели в плазме, модулированные способом по изобретению.

Фармацевтическая композиция в контексте настоящего изобретения в общем случае относится к агенту для лечения или профилактики заболевания или для детектирования или диагностирования заболевания.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть составлена способом, известным специалистам в данной области. Например, лекарственный состав можно использовать для неперорального введения в подходящем для инъекции виде, т.е. суспензии или стерильного раствора с водой или другой фармацевтически приемлемой жидкостью. Например, лекарственный состав можно приготовить путем комбинации антитела с фармакологически приемлемым носителем или средой, в частности со стерильной водой или физиологическим раствором, растительным маслом, эмульгирующим агентом, суспендирующим агентом, сурфактантом, стабилизатором, ароматизатором, разбавителем, носителем, консервантом, связующим агентом и т.д., и путем смешивания в виде единичной дозы согласно общим требованиям, установленным в фармацевтической практике. Количество активного ингредиента в лекарственном составе выбирают таким образом, чтобы была получена подходящая доза в указанном диапазоне.

Стерильная композиция для инъекции может быть составлена соответствующим образом согласно стандартной фармацевтической практике с использованием носителя, такого как дистиллированная вода для инъекции.

Водный раствор для инъекции может представлять собой, например, изотонический раствор, содержащий физиологический раствор, декстрозу и другие адъюванты (например, D-сорбитол, D-маннозу, D-маннит, поваренную соль). Соответствующим образом также можно использовать подходящие солюбилизирующие агенты (например, спирт, такой как этанол, или полиалкоголь, такой как пропиленгликоль или полиэтиленгликоль) и неионный сурфактант (например, полисорбат 80™, HCO-50).

Масляные жидкости включают кунжутное масло и соевое масло. В качестве солюбилизирующих агентов соответствующим образом также можно использовать бензила бензоат и/или бензиловый спирт. В качестве подходящих веществ также могут быть включены буфер (например, раствор фосфатного буфера, раствор натрий ацетатного буфера), успокаивающее средство (например, прокаина гидрохлорид), стабилизатор (например, бензиловый спирт и фенол) и ингибитор окисления. Раствор для инъекции, приготовленный описанным выше способом, обычно наливают в подходящие ампулы.

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить предпочтительно непероральным способом введения. Например, она может быть составлена в виде инъецируемой композиции, трансназальной композиции, композиции для введения с помощью ингаляции или трансдермальной композиции. Ее можно вводить соответствующим образом системно или локально, например, путем внутривенной инъекции, внутримышечной инъекции, интраперитонеальной инъекции или подкожной инъекции.

Способ введения может быть выбран соответствующим образом в зависимости от возраста пациента и симптомов. Дозировка фармацевтической композиции, содержащей антитело или кодирующий антитело полинуклеотид, может быть выбрана, например, в диапазоне от 0,0001 мг до 1000 мг на 1 килограмм массы тела на единичную дозу. Либо дозировка может быть составлена или установлена при норме дозирования от 0,001 до 100000 мг на пациента; однако настоящее изобретение не ограничено этими количественными значениями в обязательном порядке. Дозировка и способ введения могут меняться в зависимости от массы тела, возраста и симптомов пациента, и, учитывая эти факторы, специалист в данной области может выбрать подходящую дозировку и способ введения.

Настоящее изобретение также предоставляет нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело (например, антитело против глипикана-3) (например, гуманизированное антитело против глипикана-3), имеющее кинетические показатели в плазме, модулированные способом по настоящему изобретению. В объем настоящего изобретения также входит вектор, несущий такую нуклеиновую кислоту.

Настоящее изобретение также предоставляет клетку-хозяина, которая содержит вышеуказанную нуклеиновую кислоту. Тип клетки хозяина не ограничен особым образом, и клетка может быть, например, бактериальной клеткой, такой как E. coli, или любой клеткой, полученной из разных животных. Клетку-хозяина можно использовать соответствующим образом в системе продуцирования для продуцирования или экспрессии антитела (например, антитела против глипикана-3) по настоящему изобретению. Таким образом, настоящее изобретение также предоставляет систему продуцирования, которую можно использовать для продуцирования антитела (например, антитела против глипикана-3), используя вышеуказанную клетку-хозяина. Систему in vitro или in vivo продуцирования можно использовать соответствующим образом в качестве системы продуцирования. Эукариотические клетки и прокариотические клетки используются соответствующим образом в качестве клеток-хозяев, используемых в системе in vitro продуцирования.

Эукариотические клетки, используемые в качестве клетки-хозяина, могут включать животные клетки, растительные клетки и клетки грибов. Животные клетки могут включать клетки млекопитающих, такие как CHO (J. Exp. Med. (1995) 108, 945), COS, HEK293, 3T3, миеломы, BHK (почки детеныша хомячка), HeLa, Vero и т.д.; клетки амфибий, такие как ооциты Xenopus laevis (Valle et al., Nature (1981) 291, 338-340); и клетки насекомых, такие как Sf9, Sf21 и Tn5. Например, клетки CHO-DG44, CHO-DX11B, COS7, HEK293 и клетки BHK используются соответствующим образом для экспрессии антитела против глипикана-3 по настоящему изобретению. Использование клеток CHO в качестве клетки хозяина особенно предпочтительно, если требуются высокие уровни экспрессии в животных клетках. Трансфекцию рекомбинантного вектора в клетку хозяина выполняют соответствующим образом с помощью кальций фосфатного метода, способа с использованием DEAE-декстрана, способа с применением DOTAP-катионоактивных липосом (Boehringer Mannheim), электропорации, липофекции и т.д.

Что касается растительных клеток, то в качестве системы продуцирования белка известны клетки Lemna minor и клетки, полученные из Nicotiana tabacum, и антитело против глипикана-3 по настоящему изобретению может быть продуцировано с помощью методов каллюсной культуры, использующих такие клетки. Что же касается клеток грибов, то для продуцирования антитела против глипикана-3 по настоящему изобретению в качестве клетки-хозяина можно использовать известные системы экспрессии белков, использующие дрожжевые клетки, например Saccharomyces (например, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe), и системы экспрессии белков, использующие мицелиальные грибы, например Aspergillus (например, Aspergillus niger), и их клетки.

Что касается использования прокариотических клеток, то соответствующим образом можно применять любые системы продуцирования, использующие бактериальные клетки. Системы продуцирования, использующие E. Coli, как описано выше, или B. subtilus, известны как бактериальные клетки, и любая из этих бактериальных клеток может использоваться соответствующим образом для продуцирования антитела (например, антитела против глипикана-3) по настоящему изобретению.

Для продуцирования антитела (например, антитела против глипикана-3) с помощью клетки-хозяина по настоящему изобретению, клетку-хозяин, трансформированную вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, кодирующий антитело по настоящему изобретению, культивируют для экспрессии полинуклеотида, кодирующего антитело (например, антитело против глипикана-3). Клетку-хозяин можно культивировать согласно известным способам. Если в качестве хозяина используется клетка животного, то в качестве культуральной среды соответствующим образом используется, например, DMEM, МЕМ, RPMI1640 или IMDM. Может быть добавлена вспомогательная сыворотка, например FBS, эмбриональная телячья сыворотка (FCS) и т.д. Клетки также могут быть культивированы в среде без сыворотки. Клетки можно культивировать при pH, равной примерно 6-8, в зависимости от клетки-хозяина. Обычно культуру выдерживают в течение примерно 15-200 часов при температуре примерно 30-40°C со сменой среды, аэрацией и взбалтыванием, при необходимости.

С другой стороны, для продуцирования антитела (например, антитела против глипикана-3) по настоящему изобретению в качестве систем in vivo доступны системы продуцирования, основанные на животных или растениях. Полинуклеотид, кодирующий антитело (например, антитело против глипикана-3) по настоящему изобретению, вводят в животное или растение, и внутри этого животного или растения продуцируется антитело, которое затем выделяют. Термин "хозяин", как используется в настоящем описании, охватывает таких животных и растения.

Если в качестве хозяина используется животное, то доступны системы продуцирования на основе млекопитающих и насекомых. В качестве млекопитающего соответствующим образом используется коза, свинья, овца, мышь, корова и т.д. (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications (1993)). Также можно использовать трансгенное животное.

Например, полинуклеотид, кодирующий антитело (например, антитело против глипикана-3) по настоящему изобретению, может быть продуцирован в виде гена, слитого с геном, кодирующим полипептид, который определенным образом продуцируется в молоке, таким как β-казеин козы. Затем фрагмент полинуклеотида, содержащий слитый ген, вводят в эмбрион козы и переносят в женскую особь. Представляющее интерес антитело (например, антитело против глипикана-3) получают из молока, даваемого трансгенной козой, рожденной от козы, получившей эмбрион, или из молока, даваемого потомством трансгенной козы. Соответствующим образом трансгенной козе можно вводить подходящие гормоны для увеличения количества антител (например, антител против глипикана-3), т.е. количества молока, получаемого от трансгенной козы (Ebert et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).

Тутовый шелкопряд представляет собой пример насекомого, которое можно использовать для продуцирования антитела (например, антитела против глипикана-3) по настоящему изобретению. При использовании тутового шелкопряда, его можно заразить бакуловирусом, имеющим встроенный в вирусный геном полинуклеотид, кодирующий нужное антитело (например, антитело против глипикана-3). Представляющее интерес антитело (например, антитело против глипикана-3) получают из жидкости тела зараженного тутового шелкопряда (Susumu et al., Nature (1985) 315, 592-4).

Растение табак представляет собой пример растения, которое можно использовать для продуцирования антитела (например, антитела против глипикана-3) по настоящему изобретению. При использовании растения табак, полинуклеотид, кодирующий представляющее интерес антитело (например, антитело против глипикана-3), встраивают в вектор экспрессии этого растения, такой как pMON 530, и полученный рекомбинантный вектор переносят в бактерию, такую как Agrobacterium tumefaciens. Затем используют эту бактерию для того, чтобы заразить растение табак (например, Nicotiana tabacum) (Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-8), и из листьев зараженного растения табак получают нужное антитело (например, антитело против глипикана-3). Такой бактерией также может быть заражено растение Lemna minor, и нужное антитело (например, антитело против глипикана-3) может быть получено из клонированных клеток зараженного Lemna minor (Cox K.M. et al., Nat. Biotechnol. (2006) 24(12), 1591-7).

Антитело (например, антитело против глипикана-3) по настоящему изобретению, полученное описанным выше способом, может быть выделено из клеток хозяина или из внешней среды, окружающей эти клетки (например, культуральной среды или молока), и может быть очищено до, по существу, чистого гомогенного антитела. Методы выделения и очистки, обычно используемые для очистки полипептида, могут быть использованы соответствующим образом для выделения и очистки антитела по настоящему изобретению, без ограничений. Например, антитело может быть выделено соответствующим образом и очищено путем соответствующего выбора и комбинации методов, таких как колоночная хроматография, фильтрация, ультрафильтрация, высаливание, преципитация растворителем, экстракция растворителем, дистилляция, иммунопреципитация, электрофорез в SDS-полиакриламидном геле, изоэлектрическое фокусирование, диализ, перекристаллизация и т.д.

Хроматографические методы включают аффинную хроматографию, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, гельфильтрационную хроматографию, обращенно-фазовую хроматографию, адсорбционную хроматографию и т.д. (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed. Daniel R. Marshak et al. (1996) Cold Spring Harbor Laboratory Press). Хроматографию можно выполнять, используя жидко-фазную хроматографию, например ВЭЖХ, ВЭИХ (высокоэффективную ионообменную хроматографию, FPLC) и т.д. Колонка, используемая в аффинной хроматографии, включает, например, колонку с А-белком или колонку с G-белком. Примерами колонок с А-белком являются Hyper D, POROS и сефароза F.F. (Pharmacia).

Другой предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ получения антитела (например, антитела против глипикана-3) с кинетическими показателями в плазме, модулированными по настоящему изобретению, включающий стадии: культивирование клетки-хозяина по настоящему изобретению, как описано выше, и выделение антитела (например, антитела против глипикана-3) из клеточной культуры.

Вся литература, приведенная в виде цитаты в настоящем описании, включена в него в виде ссылки.

Настоящее изобретение более подробно описано ниже, но оно не ограничено приведенными ниже примерами.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

(1) Конструирование генов с точечной мутацией гуманизированного антитела H0L0

Из гена, кодирующего антитело против глипикана-3, содержащего CDR гуманизированного антитела GC33, раскрытого в WO 2006/046751, конструировали различные гены с точечной мутацией. Синтезировали олиго-ДНК, разработанные на основе последовательностей смысловой и антисмысловой цепей, содержащих сайты модификации. Сконструировали множество генов с точечной мутацией, используя коммерческий набор сайт-направленного мутагенеза QuikChange (Stratagene). Конструирование генов с точечной мутацией выполняли с помощью ПЦР в следующих условиях. После нагревания в течение 30 секунд при 95°C, реакционную смесь, содержащую 10 нг матричной плазмиды, 10 пмоль синтетической олиго-ДНК с прямой цепью и обратной цепью и 10X буфер, смесь dNTP и ДНК-полимеразу Pfu Turbo, предоставленные в наборе, подвергли 18 циклам при температуре 95°C в течение 30 секунд, при 55°C в течение 1 минуты и при 68°C в течение 4 мин. К реакционной смеси добавляли предоставленную в наборе DpnI и проводили рестрикционное расщепление с помощью фермента рестрикции в течение 1 часа при 37°C. DH5α-компетентные клетки (Toyobo) трансформировали с помощью полученного реакционного раствора для получения трансформантов. Введение точечной мутации подтверждали путем определения нуклеотидной последовательности плазмидной ДНК, выделенной из трансформантов. Каждый ген с точечной мутацией клонировали в векторы экспрессии, способные к экспрессии представляющего интерес гена в животных клетках. Модифицированные гены получали с помощью модификаций, как описано ниже.

Транзитную экспрессию гуманизированного антитела H0L0 и антител, полученных из него путем модификации точечной мутацией, выполняли, используя полиэтиленимин (Polysciences Inc). Клетки HEK293 разделяли трипсином с ЭДТА (Invitrogen) и засевали на 10 см² культуральные чашки с плотностью 6×10⁶ клеток/10 мл. На следующий день культуральную среду SFMII и полиэтиленимин смешивали с экспрессирующей тяжелую цепь плазмидной ДНК и экспрессирующей легкую цепь плазмидной ДНК согласно инструкции изготовителя и полученную смесь выдерживали в течение 10 минут при комнатной температуре. Всю смесь по каплям добавляли в культуральную чашку, содержащую клетки HEK293, засеянные как описано выше. Супернатант культуры извлекали примерно через 72 часа и экспрессированное гуманизированное антитело H0L0 и антитела, полученные из него путем модификации точечной мутацией, очищали, используя быстрый поток сефарозы™ rProteinA (GE Healthcare) согласно инструкции изготовителя.

(1-1) Модификация значения Tm гуманизированного антитела H0L0

Среднюю температуру тепловой денатурации (Tm) определяли по вершине пика денатурации в термограмме (зависимости Cp от T), полученной после нагревания тестируемого раствора с образцами при программно заданной постоянной скорости нагревания. Значение Tm гуманизированного антитела H0L0 измеряли, используя раствор с образцами для измерения DSC, приготовленный как описано ниже. Сначала в течение 24 часов проводили диализ раствора антител (соответствующий 50-100 мкг), залитого в диализную мембрану, против внешнего диализного раствора, состоящего из 20 моль/л раствора натрий ацетатного буфера (pH 6,0), содержащего 150 ммоль/л хлорида натрия. Затем доводили концентрацию антител в растворе с образцами до 50-100 мкг/мл, используя внешний диализный раствор и использовали его для DSC-измерения (дифференциальной сканирующей калориметрии) в качестве раствора с образцами.

Использовали подходящий для этого эксперимента DSC-инструмент, например DSC-II (Calorimetry Sciences Corporation). Раствор с образцами, приготовленный как описано выше, и референсный раствор (внешний диализный раствор) полностью дегазировали, каждый из этих тестируемых образцов помещали в калориметрическую ячейку и поддерживали температуру на уровне 40°C. Затем выполняли DSC-сканирование от 40 до 100°C при скорости сканирования, равной примерно 1 K/мин. Результаты этих измерений получали в виде вершин пиков денатурации как функцию от температуры. Среднюю температуру тепловой денатурации гуманизированного антитела H0L0 вычисляли по положению пика домена Fab согласно Rodolfo et al., Immunology Letters (1999), 47-52. В качестве специфического примера на Фиг.1 показан график для антитела Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2), полученный с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC).

Гуманизированное антитело H0L0, содержащее тяжелую цепь SEQ ID NO:1 и легкую цепь SEQ ID NO:7, имеет вычисленное описанным выше способом значение Tm, равное 76,6°C. Измеренное значение Tm для Synagis и Herceptin, приведенных в качестве примеров имеющихся антител, было равно 85,4 и 81,8°C, соответственно. Таким образом, было показано, что значение Tm гуманизированного антитела H0L0 ниже значения Tm для имеющихся антител.

По этой причине для увеличения значения Tm модифицированные антитела создавали из гуманизированного антитела H0L0. Для получения антитела H15 (SEQ ID NO:2) в FR2 тяжелой цепи антитела H0L0, приведенной в SEQ ID NO:1, вводили модификации V37I, A40P, M48I и L51I, причем подкласс антитела был изменен с VH1b на VH4. Значение Tm увеличилось до 79,1°C. Легкая цепь антитела H0L0, приведенная в SEQ ID NO:7, также была модифицирована путем введения L42Q, S48A и Q50R модификаций в FR2, что изменило подкласс с VK2 на VK3, и путем введения модификации V2I для замены V2 в FR1 на I (последовательность зародышевой линии (germline)), таким образом получили L4 (SEQ ID NO:8). Значение Tm каждого антитела измеряли как описано выше. Значения Tm для H15L0 и H0L4 было равно 79,2 и 77,2°C, соответственно, что показало улучшение по сравнению со значением Tm для H0L0, равным 76,6°C. Значение Tm для антитела H15L4, содержащего комбинацию этих двух модификаций, было улучшено до 80,5°C.

(1-2) Модификация значения pI гуманизированного антитела H0L0

Время полужизни антитела в плазме продлевали путем уменьшения значения pI антитела. Напротив, характеристики транслокации антитела в тканях улучшали, увеличивая pI антитела. Неизвестно, будет ли увеличение или уменьшение значения pI эффективного для лечения рака антитела усиливать эффект подавления развития опухоли. Поэтому создавали модифицированное гуманизированное антитело H0L0 с пониженным pI и модифицированное гуманизированное антитело H0L0 с увеличенным pI и сравнивали их противоопухолевую активность для определения того, имеет ли какая-либо из модификаций более высокую активность подавления развития опухоли.

Значение pI каждого антитела вычисляли на основе анализа, выполненного с помощью изоэлектрического фокусирования. Электрофокусирование выполняли как описано ниже. Используя PhastSystem Cassette (Amersham Bioscience), Phast-Gel Dry IEF (Amersham Bioscience), оставляли гель набухать в течение примерно 60 минут в растворе для набухания, содержащем нижеприведенную композицию.

(a) Композиция раствора для набухания для высокой pI:

1,5 мл 10% глицерина,

100 мкл фармалита 8-10,5 для IEF (Amersham Bioscience).

(b) Композиция раствора для набухания для низкой pI:

1,5 мл очищенной воды,

20 мкл фармалита 8-10,5 для IEF (Amersham Bioscience),

80 мкл фармалита 5-8 для IEF (Amersham Bioscience).

Примерно 0,5 мкг антитела загружали в набухший гель и прогоняли с помощью изоэлектрического фокусирования, используя PhastSystem (Amersham Bioscience), под управлением нижеописанной программы. На этапе 2 этой программы в гель добавляли образец. Для pI маркеров использовали набор для pI-калибровки (Amersham Bioscience).

Этап 1: 2000 В, 2,5 мА, 3,5 Вт, 15°C, 75 В·ч.

Этап 2: 200 В, 2,5 мА, 3,5 Вт, 15°C, 15 В·ч.

Этап 3: 2000 В, 2,5 мА, 3,5 Вт, 15°C, 410 В·ч.

После электрофореза гель фиксировали 20%-ным TCA и затем окрашивали серебром, используя набор для окраски серебром Protein (Amersham Bioscience) согласно прилагаемой к набору инструкции. После окрашивания вычисляли изоэлектрическую точку для каждого антитела (тестируемый образец), основываясь на уже известных изоэлектрических точках pI-маркеров. Электрофореграмма, полученная в результате изоэлектрического фокусирования для высокой pI, приведена на Фиг.2, а электрофореграмма, полученная в результате изоэлектрического фокусирования для низкой pI, приведена на Фиг.3.

(a) Повышающие pI модификации

Получали Hspu2.2 (Hu2.2) (SEQ ID NO:6), в котором в H15 вводили дополнительные модификации Q43K, D52N и Q107R. Также создавали Lspu2.2 (Lu2.2) (SEQ ID NO:12), в котором в L4 вводили модификации E17Q, Q27R, Q105R и S25A, причем модификация S25A заменила S25 в CDR2 на А (имеющийся в зародышевой линии в избытке). Измеренное значение Tm для антитела Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2), составленного из Hspu2.2 (Hu2.2) и Lspu2.2 (Lu2.2), было равно 76,8°C, а измеренное значение pI этого антитела бало равно 9,6. Поскольку pI антитела H0L0 равно 8,9, то pI антитела Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) увеличилось на 0,7.

(b) Понижающие pI модификации

Получали Hspd1.8 (Hd1.8) (SEQ ID NO:5), в котором в H15 вводили дополнительные модификации K19T, Q43E, K63S, K65Q и G66D. Получали Lspd1.6 (Ld1.6) (SEQ ID NO:11) с помощью следующих модификаций: модификация Q27E в L4; модификация KISRVE в положениях 79-84 FR3 в L4 на TISSLQ; и модификация S25A для получения такой же модификации, как и для Lspu2.2 (Lu2.2). Измеренное значение pI для антитела Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6), составленного из Hspd1.8 (Hd1.8) и Lspd1.6 (Ld1.6), было равно 7,4. Поскольку pI антитела H0L0 равен 8,9, то pI антитела Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6) понизился на 1,5.

(2) Оценка связывающей активности антител, полученных путем модификации антитела H0L0 точечной мутацией, конкурентным методом ELISA

Антитело H0L0 и антитела, полученные из него путем модификации точечной мутацией, очищенные на стадии (1), оценивали конкурентным методом ELISA. 100 мкл 1 мкг/мл растворимого минимального полипептида GPC3 (SEQ ID NO:13) добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета. Растворимый коровый полипептид GPC3 иммобилизовали на планшете, оставив на ночь при 4°C. Растворимый коровый полипептид GPC3, иммобилизованный на планшете, 3 раза промывали буфером для промывки, используя Skan WASHER400 (Molecular Devices); и блокировали 200 мкл блокирующего буфера при 4°C по меньшей мере в течение 30 мин.

Затем планшет с блокированным иммобилизованным растворимым коровым полипептидом GPC3 промывали 3 раза буфером для промывки, используя Skan WASHER400. После этого в каждую лунку планшета вносили по 200 мкл смеси, содержащей 100 мкл биотинилированного антитела H0L0 (с конечной концентрацией 0,3 мкг/мл) и 100 мкл антитела H0L0 или антитела, полученного из него путем модификации точечной мутацией (при различных концентрациях). Антитело H0L0 биотинилировали, используя набор для мечения биотином (Roche) согласно предоставленной в наборе инструкции. Планшет выдерживали в течение 1 часа при комнатной температуре, затем промывали 5 раз буфером для промывки, используя Skan WASHER400 (Molecular Devices). 100 мкл конъюгата козьих антител к щелочной фосфатазе со стрептавидином (ZYMED) с 20000X разведением субстратным буфером добавляли в каждую лунку и полученный планшет выдерживали в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем промывали 5 раз буфером для промывки, используя Skan WASHER400. Субстрат для фосфатазы (Sigma) готовили, используя 1 мг/мл субстратный буфер, добавляемый по 100 мкл на лунку, в течение 1 часа. В каждой лунке измеряли оптическую плотность реакционного раствора при 405 нм, используя Benchmark Plus (BIO-RAD) с контрольной оптической плотностью при 655 нм.

Как показано на Фиг.4, антиген-связывающая активность антитела H15L4 была почти такой же, как и активность антитела H0L0, которое было подвергнуто модификации. Кроме того, как показано на Фиг.5, антиген-связывающая активность антитела Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) была такой же, как и активность антитела H0L0, которое было подвергнуто модификации. Кроме того, как показано на Фиг.6, антиген-связывающая активность антитела Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6) была такой же, как и активность антитела H0L0, которое было подвергнуто модификации.

Ссылочный пример 2

Разрушение гена транспортера фукозы в клетках CHO

(1) Конструирование целевого вектора

(1-1) Конструирование вектора KO1

Методом ПЦР, используя pcDNA3.1/Hygro (Invitrogen) с праймерами Hyg5-BH и Hyg3-NT, к 5'-концу стартового кодона гена устойчивости к гигромицину (Hygr) добавляли сайт BamHI и последовательность TGCGC для получения такой же последовательности, как и на 5'-конце стартового кодона гена транспортера фукозы. Также к 3'-концу, включающему область вплоть до сигнала присоединения поли(A) SV40, добавляли сайт NotI. Затем вырезали ген Hygr.

Прямой праймер

Hyg5-BH 5'-GGATCCTGCGCATGAAAAAGCCTGAACTCACC-3' (SEQ ID NO:14)

Обратный праймер

Hyg3-NT 5'-GCGGCCGCCTATTCCTTTGCCCTCGGACG-3' (SEQ ID NO:15)

Конструировали целевой вектор транспортера фукозы ver.1 (называемый вектором KO1) путем встраивания 5'-конца транспортера фукозы (от SmaI под № 2780 в SEQ ID NO:16 до BamHI под № 4232), 3'-конца (от № 4284 до SacI под № 10934) и Hygr-фрагмента в вектор pMC1DT-A (Yagi Т., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87, 9918-22). Характерной особенностью этого вектора является то, что после гомологичной рекомбинации Hygr начинает экспрессироваться под управлением промотора транспортера фукозы, поскольку к гену Hygr промотор не прикреплен. Однако при введении в клетку с помощью гомологичной рекомбинации только одной копии вектора, Hygr не всегда экспрессируется в степени, достаточной для проявления устойчивости к гигромицину В. Вектор KO1 расщепляли в сайте Not1 и трансфицировали в клетку. Предполагалось, что удаление 41-й пары оснований экзона 1, включая стартовый кодон, из транспортера фукозы путем введения вектора KO1 привело к потере функции.

(1-2) Конструирование pBSK-pgk-1-Hygr

Сконструировали pBSK-pgk-1, вырезав промотор гена мыши pgk-1 из вектора pKJ2 (Popo H., Biochemical Genetics (1990) 28, 299-308) с EcoRI-PstI и клонируя его в сайтах EcoRI-PstI pBluescript (Stratagene). Что касается сайта Hygr, то с помощью ПЦР, используя pcDNA3.1/Hygro с праймерами Hyg5-AV и Hyg3-BH, на 5'-конец Hygr добавляли сайт EcoT22I и последовательность Kozak, а на 3'-конец, включающий область вплоть до сигнала присоединения поли(A) SV40, добавляли сайт BamHI. Затем вырезали ген Hygr.

Прямой праймер

Hyg5-AV 5'-ATGCATGCCACCATGAAAAAGCCTGAACTCACC-3' (SEQ ID NO:17)

Обратный праймер

Hyg3-BH 5'-GGATCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTC-3' (SEQ ID NO:18)

Сконструировали pBSK-pgk-1-Hygr, встроив фрагмент Hygr (EcoT22I-BamHI) в сайты PstI-BamHI в pBSK-pgk-1.

(1-3) Конструирование вектора KO2

Целевой вектор транспортера фукозы ver.2 (называемый вектором KO2) конструировали путем встраивания 5'-конца транспортера фукозы (от сайта SmaI под № 2780 в SEQ ID NO:16 до BamHI под № 4232), 3'-конца (от № 4284 до SacI под № 10934) и фрагмента pgk-1-Hygr в вектор pMC1DT-A. В отличие от случая, описанного для вектора KO1, вектор KO2 имеет промотор гена pgk-1, прикрепленный к Hygr, таким образом он приобретает устойчивость к гигромицину В даже при введении в клетку путем гомологичной рекомбинации только одной копии вектора. Вектор KO2 расщепляли в NotI и трансфицировали в клетку. При введении вектора KO2 из транспортера фукозы были удалены 46 пар оснований в экзоне 1, включая стартовый кодон, что привело к потере функции.

(1-4) Конструирование pBSK-pgk-1-Puror

Вектор pPUR (BD Biosciences) расщепляли с помощью PstI и BamHI и вырезанный фрагмент (Puror) вставляли в сайты PstI-BamHI pBSK-pgk-1 для создания pBSK-pgk-1-Puror.

(1-5) Конструирование вектора KО3

Целевой вектор транспортера фукозы ver.3 (называемый вектором KО3) конструровали путем встраивания 5'-конца транспортера фукозы (от сайта SmaI под № 2780 SEQ ID NO:16 до BamHI под № 4232), 3'-конца (от № 4284 до SacI под № 10934) и фрагмента pgk-1-Puror в вектор pMC1DT-A. Последовательность для связывания для скрининга приведенного ниже праймера предварительно прикрепляли к 3'-концу pgk-1-Puror. Вектор KО3 расщепляли в NotI и трансфицировали в клетку. При введении вектора KО3 из транспортера фукозы были удалены 46 пар оснований в экзоне 1, включая стартовый кодон, что привело к потере функции.

Обратный праймер

RSGR-A 5'-GCTGTCTGGAGTACTGTGCATCTGC-3' (SEQ ID NO:19)

Ген транспортера фукозы “нокаутировали”, используя описанные выше три целевых вектора.

(2) Введение вектора в клетки CHO

К CHO-S-SFMII HT- (Invitrogen) добавляли HT добавку (100×) (Invitrogen) и стрептомицин+пенициллин (Invitrogen), каждый в объеме 1/100 CHO-S-SFMII HT-, для получения культуральной среды (далее в настоящем описании называемой SFMII(+)). Клетки CHO DXB11 субкультивировали в SFMII(+). Клетки CHO в количестве 8×10⁶ суспендировали в 0,8 мл фосфатного буфера Дульбекко (Dulbecco) (Invitrogen) (далее в настоящем описании называемом PBS). В суспензию клеток добавляли 30 мкг целевого вектора и переносили в кювету Gene Pulser (4 мм) (BioRad). После выдерживания в течение 10 минут на льду вектор трансфицировали в клетки с помощью электропорации, используя GENE PULSER II (BioRad), при 1,5 кВ и 25 мкФ. После трансфекции вектора клетки суспендировали в 200 мл среды SFMII(+) и засевали в двадцать 96-луночных планшетов с плоским дном (Iwaki) по 100 мкл на лунку. Планшеты культивировали в течение 24 часов при 37°C в CO₂-инкубаторе, затем добавляли реагент.

(3) Нокаут: стадия 1

Вектор KO1 или вектор KO2 трансфицировали в клетки CHO и через 24 часа после трансфекции вектора отбирали с помощью гигромицина В (Invitrogen). Гигромицин В растворяли в SFMII(+) с концентрацией 0,3 мг/мл и добавляли в лунки по 100 мкл.

(4) Скрининг методом ПЦР на гомологичные рекомбинанты

(4-1) Получение образца для ПЦР

Гомологичные рекомбинанты скринировали с помощью ПЦР. Клетки CHO культивировали в 96-луночных планшетах с плоским дном, супернатант культуры удаляли, добавляли буфер для лизиса клеток по 50 мкл на лунку и инкубировали при 55°C в течение 2 часов. Затем, нагревая при 95°C в течение 15 минут, дезактивировали протеиназу K для получения матрицы для ПЦР. Буфер для лизиса клеток состоял из следующих компонентов, из расчета на одну лунку: 5 мкл 10× LA буфера II (приобретенного у Takara LA Taq), 2,5 мкл 10%-ного NP-40 (Roche), 4 мкл протеиназы K (20 мг/мл, Takara) и 38,5 мкл дистиллированной воды (Nacalai Tesque).

(4-2) Условия для проведения ПЦР

Реакционная смесь для проведения ПЦР состояла из 1 мкл образца для ПЦР, как описано выше, 5 мкл 10× LA буфера II, 5 мкл MgCl₂ (25 мМ), 5 мкл dNTP (2,5 мМ), 2 мкл праймера (каждого по 10 мкМ), 0,5 мкл LA Taq (5 М.Е./мкл) и 29,5 мкл дистиллированной воды (общее количество 50 мкл). Для скрининга клеток, трансфицированных вектором КО1, в качестве ПЦР-праймеров использовали праймеры TP-F4 и THygro-R1, а для скрининга клеток, трансфицированных вектором КО2, в качестве ПЦР-праймеров использовали прймеры TP-F4 и THygro-F1.

ПЦР-скрининг клеток, трансфицированных вектором KO1, выполняли путем предварительного нагревания в течение 1 минуты при 95°C; 40 циклов из 95°C/30 секунд, 60°C/30 секунд и 60°C/2 минуты; и повторного нагревания в течение 7 минут при 72°C. ПЦР-скрининг клеток, трансфицированных вектором KO2, выполняли путем предварительного нагревания в течение 1 минуты при 95°C; 40 циклов из 95°C/30 секунд и при 70°C/3 минут; и повторного нагревания в течение 7 минут при 70°C.

Праймеры приведены ниже. В клеточных образцах, в которых произошла гомологичная рекомбинация, амплифицировалось примерно 1,6 т.п.н. ДНК вектора KO1 и примерно 2,0 т.п.н. ДНК вектора KO2. Праймер TP-F4 создавали в геномной области транспортера фукозы на 5'-конце вне вектора, а праймеры THygro-F1 и THygro-R1 создавали в Hygr внутри вектора.

Прямой праймер (KO1, KO2)

TP-F4 5'-GGAATGCAGCTTCCTCAAGGGACTCGC-3' (SEQ ID NO:20)

Обратный праймер (KO1)

THygro-R1 5'-TGCATCAGGTCGGAGACGCTGTCGAAC-3' (SEQ ID NO:21)

Обратный праймер (KO2)

THygro-F1 5'-GCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAGC-3' (SEQ ID NO:22)

(5) Результаты ПЦР-скрининга

Проанализировали 918 клеток, трансфицированных вектором KO1, и нашли, что гомологичным рекомбинантом была 1 клетка (эффективность гомологичной рекомбинации = примерно 0,1%). Проанализировали 537 клеток, трансфицированных вектором KO2, и нашли, что гомологичными рекомбинантами были 17 клеток (эффективность гомологичной рекомбинации = примерно 3,2%).

(6) Саузерн-блот анализ

Дополнительное подтверждение получали с помощью саузерн-блот анализа. 10 мкг геномной ДНК получали из культивируемых клеток стандартным способом и анализировали с помощью саузерн-блот анализа. Используя два приведенных ниже праймера, с помощью метода ПЦР получали зонд размером 387 п.н., охватывающим область от № 2113 до № 2500 в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:16, и использовали в саузерн-блот анализе. Геномную ДНК расщепляли с помощью Bg1II.

Прямой праймер

Bgl-F 5'-TGTGCTGGGAATTGAACCCAGGAC-3' (SEQ ID NO:23)

Обратный праймер

Bgl-R 5'-CTACTTGTCTGTGCTTTCTTCC-3' (SEQ ID NO:24)

Расщепление с помощью BglII дает полосу размером примерно 3,0 т.п.н. из хромосомы транспортера фукозы, полосу размером примерно 4,6 т.п.н. из хромосомы, в которой произошла гомологичная рекомбинация с вектором KO1, и полосу размером примерно 5,0 т.п.н. из хромосомы, в которой произошла гомологичная рекомбинация с вектором KO2. В экспериментах использовали одну клетку, полученную с помощью гомологичной рекомбинации с вектором KO1, и 7 клеток, полученных с помощью гомологичной рекомбинации с вектором KO2. Единственная клетка, полученная с использованием вектора KO1, обозначена 5C1; однако последующий анализ показал, что она содержит многочисленные клеточные популяции. Поэтому перед ее использованием в последующих экспериментах выполняли клонирование методом предельных разбавлений. Одна из клеток, полученных с использованием вектора KO2, обозначена 6E2.

(7) Нокаут: стадия 2

Для выявления клеточных линий, имеющих полностью дефектный ген транспортера фукозы, один из трех векторов вводили в клетки, в которых произошла гомологичная рекомбинация с вектором KO1 или вектором KO2. Комбинации вектор/клетка были следующими: способ 1: вектор KO2 и клетка 5C1 (KO1); способ 2: вектор KO2 и клетка 6E2 (KO2); способ 3: вектор КО3 и клетка 6E2 (KO2). Вектор трансфицировали в соответствующую клетку и через 24 часа после трансфекции вектора производили отбор с помощью гигромицина В и пуромицина (Nacalai Tesque). Конечная концентрация гигромицина В составляла 1 мг/мл в способе 1 и 7 мг/мл в способе 2. В способе 3 гигромицин В добавляли с конечной концентрацией 0,15 мг/мл, а пуромицин добавляли с конечной концентрацией 8 мкг/мл.

(8) ПЦР-скрининг гомологичных рекомбинантов

Образцы получали как описано выше. В скрининге для способа 1 выполняли ПЦР-скрининг обоих типов клеток: определенных как клетки, в которых произошла гомологичная рекомбинация с вектором KO1, как клетки, в которых произошла гомологичная рекомбинация с вектором KO2. Приведенные ниже ПЦР-праймеры были разработаны для способа 2. TPS-F1 соответствует области от № 3924 до № 3950 в нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:16, в то время как SHygro-R1 соответствует области от № 4248 до № 4274. Эти ПЦР-праймеры амплифицировали область гена транспортера фукозы размером 350 п.н., которую, в любом случае, удаляли с помощью вектора KO2. Поэтому при ПЦР-скрининге в способе 2 клетки, не продуцирующие продукт амплификации размером 350 п.н., считались клетками, у которых полностью отсутствует ген транспортера фукозы. Условия проведения ПЦР были следующими: предварительное нагревание в течение 1 минуты при 95°C; 35 циклов амплификации: 95°C/30 секунд и 70°C/1 минуты; и повторное нагревание при 70°C в течение 7 минут.

Прямой праймер

TPS-F1 5'-CTCGACTCGTCCCTATTAGGCAACAGC-3' (SEQ ID NO:25)

Обратный праймер

SHygro-R1 5'-TCAGAGGCAGTGGAGCCTCCAGTCAGC-3' (SEQ ID NO:26)

В случае способа 3 в качестве прямого праймера использовали TP-F4, а в качестве обратного праймера использовали RSGR-A. Условия проведения ПЦР были следующими: предварительное нагревание в течение 1 минуты при 95°C; 35 циклов амплификации: 95°C/30 секунд, 60°C/30 секунды и 72°C/2 минуты; повторное нагревание при 72°C в течение 7 минут. Из клеточных образцов, в которых произошла гомологичная рекомбинация с вектором КО3, амплифицируется примерно 1,6 п.н. ДНК. Клетки, в которых произошла гомологичная рекомбинация с вектором КО3, детектировали с помощью ПЦР, и при детектировании также было подтверждено, что в этих клетках также сохранилась гомологичная рекомбинация вектором KO2.

(9) Результаты ПЦР-скрининга

Было найдено, что 18 клеток из 616 клеток, проанализированных способом 1, представляли собой гомологичные рекомбинанты (эффективность гомологичной рекомбинации = 2,9%). Нашли, что из 524 клеток, проанализированных способом 2, 2 клетки представляли собой гомологичные рекомбинанты (эффективность гомологичной рекомбинации = приблизительно 0,4%). Нашли, что из 382 клеток, проанализированных способом 3, 7 клеток представляли собой гомологичные рекомбинанты (эффективность гомологичной рекомбинации = приблизительно 1,8%).

(10) Саузерн-блот анализ

Саузерн-блот анализ выполняли описанным выше способом и идентифицировали 1 клетку как полностью потерявшую ген транспортера фукозы. Результаты анализа методом ПЦР и саузерн-блот анализ показали, что нокаут произошел на на стадии 1, а не на стадии 2.

(11) Анализ экспрессии фукозы

26 клеток, которые, как было найдено, представляли собой гомологичные рекомбинанты, анализировали на экспрессию фукозы методом ПЦР. 1×10⁶ клеток окрашивали в 100 мкл PBS, содержащем 5 мкг/мл агглютинина Lens culinaris, конъюгат FITC (Vector Laboratory), 2,5% FBS и 0,02% азида натрия (называемого в настоящем описании раствором FACS) в течение 1 часа при охлаждении льдом. Затем клетки промывали 3 раза раствором FACS и анализировали с помощью FACSCalibur (Becton Dickinson). Результаты показали, что экспрессия фукозы уменьшилась только в клетках FTP-KO, которые, как было показано с помощью саузерн-блот анализа, полностью потеряли ген транспортера фукозы.

Ссылочный пример 3

Выявление антитело-продуцирующих клеток, полученных из линии FTP-KO, и очистка антител, продуцированных этими клетками

Линию с дефицитом транспортера фукозы, полученную в Примере 1 (клетки FTP-KO, название клона: 3F2), инкубировали в SFMII(+), содержащем гигромицин В с конечной концентрацией 1 мг/мл. 8×10⁶ клеток 3F2 суспендировали в 0,8 мл фосфатного буфера Дульбекко. 25 мкг вектора экспрессии гуманизированного антитела против глипикана-3 добавляли в клеточную суспензию и переносили в кювету Gene Pulser. После выдерживания в течение 10 минут на льду вектор трансфицировали в клетки с помощью электропорации, используя GENE PULSER II, при 1,5 кВ и 25 мкФ. После трансфекции вектора клетки суспендировали в 40 мл среды SFMII(+) и засевали в 96-луночный планшет с плоским дном (Iwaki) по 100 мкл на лунку. После инкубации планшета в течение 24 часов при 37°C в CO₂-инкубаторе добавляли генетицин (Invitrogen) с конечной концентрацией 0,5 мг/мл. Для получения клеточных линий, продуцирующих гуманизированные антитела против глипикана-3, измеряли уровень продуцирования антитела клетками, устойчивыми к лекарственному веществу.

Супернатант культуры из продуцирующих антитело линий собирали и наносили на колонку Hitrap rProtein А (Pharmacia) с помощью насоса P-1 (Pharmacia). Колонку промывали буфером для связывания (20 мМ натрия фосфат (pH 7,0)) и связанное антитело затем элюировали, используя буфер для элюции (0,1 М глицин-HCl (pH 2,7)). Элюат сразу нейтрализовали буфером для нейтрализации (1 М Трис-HCl (pH 9,0)). Элюированные фракции антитела отбирали, используя DC-анализ белка (BioRad), объединяли в пулы и концентрировали примерно до 2 мл с помощью Centriprep-YM10 (Millipore). Затем выполняли гель-фильтрацию концентрированного раствора на супердексе200 26/60 (Pharmacia), уравновешенном 20 мМ уксуснокислым буфером (pH 6,0), содержащим 150 мМ NaCl. Пик мономерной фракции в элюате собирали и концентрировали с помощью Centriprep-YM10. Концентрированный раствор фильтровали, используя 0,22 мкм фильтр MILLEX-GW (Millipore), и хранили при 4°C. Концентрацию очищенного антитела определяли вычислением из молярного коэффициента поглощения, основываясь на коэффициенте поглощения при 280 нм.

Ссылочный пример 4

Анализ сахарных цепей, связанных с гуманизированным антителом против глипикана-3, продуцируемым клетками FTP-KO

(1) Получение сахарных цепей, меченных 2-аминобензамидом (2-AB-меченные цепи)

Антитело по настоящему изобретению, продуцированное клетками FTP-KO, и антитело, продуцированное клетками CHO (контроль), обрабатывали N-гликозидазой F (Roche Diagnostics) для высвобождения сахарных цепей, связанных с антителом (Weitzhandler M. et al., Journal of Pharmaceutical Sciences (1994) 83(12), 1670-5). После депротеинации этанолом (Schenk B. et al., The Journal of Clinical Investigation (2001), 108(11), 1687-95), высвобожденные сахарные цепи концентрировали до сухого состояния и метили с помощью флуоресцентного 2-аминопиридина (Bigge J.C. et al., Analytical Biochemistry (1995) 230(2), 229-238). Полученные 2-AB-меченные сахарные цепи отделяли от реактива твердофазной экстракцией, используя целлюлозный картридж, концентрировали центрифугированием для получения очищенных 2-AB-меченных сахарных цепей. Очищенные 2-AB-меченные сахарные цепи обрабатывали β-галактозидазой (Seikagaku Kogyo Co., Ltd) для получения агалактозил 2-AB-меченной сахарной цепи, которую анализировали как описано ниже.

(2) Анализ агалактозил 2-AB-меченных сахарных цепей с помощью нормально-фазной ВЭЖХ

Агалактозил 2-AB-меченные сахарные цепи, полученные вышеописанным способом, высвобождали из антитела по настоящему изобретению, продуцированного клетками FTP-KO, и антитела, продуцированного клетками CHO (контроль), анализировали с помощью нормально-фазной ВЭЖХ, используя амидную колонку TSKgel Amide-80 (TOSOH Corp.), и сравнивали хроматограммы. Относительно антитела, продуцированного клетками CHO, была сделана следующая оценка: G(0) был представлен как основной компонент сахарных цепей, в то время как G(0)-Fuc, без фукозы, составлял примерно 4% от общего количества сахарных цепей по оценке, полученной путем вычисления, исходя из отношения пиковых областей. В случае антитела, продуцированного клетками FTP-KO, G(0)-Fuc был основным компонентом. Что касается антитела, продуцированного клеточными линиями, то по оценке, полученной путем вычислений, исходя из отношения пиковых областей, по меньшей мере 90% всей сахарной цепи в продуцированном антителе были сахарными цепями без фукозы.

Относительные отношения каждой сахарной цепи, оцененные по результатам анализа для агалактозил 2-AB-меченных сахарных цепей методом нормально-фазовой ВЭЖХ
Сахарная цепь	CHO	FTP-KO-a	FTP-KO-b	FTP-KO-c
G(0)-Fuc	4%	92,4%	92,5%	93,2%
G(0)	96,0%	7,6%	7,5%	6,8%

Пример 5

Выявление клеточных линий, стабильно экспрессирующих гуманизированное антитело H0L0, и антитела, полученные из него путем модификации точечной мутацией

Гены, кодирующие антитело Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2), антитело Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6) (антитела, полученные путем модификации антитела H0L0 способом, описанным в Примере 1) или антитело H0L0, предназначенное для модификации, клонировали в векторе экспрессии. При клонировании гены, кодирующие тяжелую цепь и легкую цепь, вставляли в разные векторы экспрессии для экспрессии каждого гена, кодирующего тяжелую цепь и легкую цепь антитела. Два вектора экспрессии отбирали таким образом, чтобы обеспечить необходимую комбинацию генов, кодирующих тяжелую цепь и легкую цепь, как описано выше, расщепляли с помощью PvuI и трансфицировали с помощью электропорации в линию FTP-KO, полученную в ссылочном примере 2.

Трансформанты, которые стабильно продуцировали антитело H0L0 или модифицированное антитело, получали с помощью электропорации, используя Gene Pulser II (BioRad). 0,75 мл клеток CHO (1×10⁷ клеток/мл), суспендированных в PBS, смешивали с 10 мкг каждой плазмидной ДНК экспрессии, обеспечивая требуемую комбинацию тяжелой цепи и легкой цепи, и смесь выдерживали на льду в течение 10 минут. Смесь переносили в кювету Gene Pulser II и прикладывали электрический импульс силой 1,5 кВ при емкости в 25 мкФ. Смесь, подвергнутую импульсу, инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре и суспендировали в CHO-S-SFMII/1% HT/1% PS среде. 100 мкл разбавленной суспензии (5-кратно, 10-кратно и 50-кратно, приготовленных из одной и той же среды) добавляли в каждую лунку 96-луночного культурального планшета. Планшет инкубировали в течение 24 часов в CO₂-инкубаторе, поддерживая CO₂ на 5%-ном уровне. Затем в каждую лунку добавляли генетицин (Gibco) с конечной концентрацией 500 мкг/мл, и зеоцин (Invitrogen) с конечной концентрацией 600 мкг/мл. Планшеты инкубировали в течение 2 недель. Затем путем субкультивирования в той же среде, содержащей 500 мкг/мл генецитина (Gibco) и 600 мкг/мл зеоцина (Invitrogen), отбирали колонии трансформированных клеток, которые показывали устойчивость к генетицину и зеоцину. Супернатант культуры трансформированных клеток, отобранных таким способом, оценивали на концентрацию антитела, используя BiacoreQ (BIACORE), для выявления клеточной линии трансформантов, экспрессирующих нужное антитело на высоком уровне. Концентрацию антитела в супернатанте культуры измеряли согласно инструкциям, предоставленным BiacoreQ (BIACORE). Выявленную таким образом клеточную линию культивировали в среде CHO-S-SFMII (Invitrogen), содержащей 500 мкг/мл генетицина (Invitrogen) и 600 мкг/мл зеоцина (Invitrogen). После культивирования в течение соответствующего промежутка времени супернатант культуры собирали и очищали, используя колонку rProteinA-Sepharose (GE Healthcare). Очищенное антитело концентрировали с помощью Amicon Ultra-4 (MILLIPORE) и производили смену буфера на обессаливающей колонке PD-10 (Amersham Biosciences), используя 20 мМ уксуснокислый буфер (рН 6,0), содержащий 200 мМ NaCl. Проводили количественную оценку очищенного антитела методом абсорбции при 280 нм с помощью спектрофотометра ND-1000 (NanoDrop) или спектрофотометра DU-600 (BECKMAN). Концентрацию антитела вычисляли способом RACE.

Пример 6

Терапевтическая эффективность в in vivo модели гуманизированного антитела H0L0 и модифицированных точечной мутацией антител

(1) Поддержание клеточной линии, используемой для трансплантации, в in vivo модели

Использовали клетки HepG2 (ATCC). Клетки HepG2 поддерживали с помощью субкультуры в, по существу, минимальной среде Игла (Sigma), содержащей пируват натрия (Invitrogen) в количестве 1 ммоль/л MEM и несущественные аминокислоты (Invitrogen) в количестве 1 ммоль/л MEM (эта среда называется средой для субкультур).

(2) Получение мышиной модели трансплантированных клеток HepG2

Используя раствор, содержащий среду для субкультур и матрикс MATRIGEL (BD Bioscience) в отношении 1:1, получали суспензию клеток HepG2 в количестве 5×10⁷ клеток/мл. 100 мкл клеточной суспензии (5×10⁶ клеток/мышь) подкожно трансплантировали в брюшную область мышей SCID (5-недельные самцы, CLEA Japan, Inc). За день до трансплантации клеток мышам вводили внутрибрюшинно 100 мкл антител к асиало-GM1 (содержимое 1 пузырька растворяли в 5 мл вышеуказанного раствора, Wako Pure Chemical Industries, Ltd). Объем опухоли вычисляли по следующей формуле:

объем опухоли=длинный диаметр×короткий диаметр×короткий диаметр/2.

Когда средний объем опухоли достигал от 130 до 330 мм³, мышь использовалась в качестве модели.

(3) Получение образца для введения, содержащего тестируемое антитело

В день введения, используя физиологический раствор, приготовили образцы для введения, содержащие антитело H0L0, антитело Hu2.2Lu2.2 или антитело Hd1.8Ld1.6 в количестве 0,5 мг/мл (5 мг/кг группы) или 0,1 мг/мл (1 мг/кг группы).

(4) Введение образца для введения, содержащего антитело

Образец для введения, полученный согласно стадии (3), вводили дозой 10 мл/кг через хвостовую вену в мышиную модель, полученную на стадии (2), раз в неделю в течение трех недель начиная с 27 дня после трансплантации клеток HepG2. В качестве отрицательного контроля вводили физиологический раствор дозой 10 мл/кг через хвостовую вену раз в неделю в течение трех недель. Все группы состояли из 5 животных, и каждый образец для введения, содержащий тестируемое антитело, вводили соответствующей группе. Примерно в это же время у 3 животных в каждой группе брали венозную кровь и анализировали на концентрацию антител в плазме мыши. В частности, кровь брали из дорсальной вены стопы два раза: через 0,5 часов после начального введения и сразу перед вторым введением. 20 мкл собранной крови обрабатывали гепарином и отделяли плазму центрифугированием.

(5) Оценка противоопухолевой активности тестируемых антител

Противоопухолевую активность каждого тестируемого антитела оценивали в мышиной модели с трансплантированным раком печени человека. Объем опухоли измеряли через неделю после последнего дня введения образца. Результаты приведены на Фиг.7. Антитело Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6) показало более сильную терапевтическую эффективность, в то время как антитело Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) показало слабую терапевтическую эффективность.

(6) Концентрации тестируемых антител в плазме

Концентрацию тестируемых антител в плазме мыши измеряли методом ELISA, описанным в Примере 1. Приготовили стандартные образцы со следующими концентрациями в плазме: 12,8, 6,4, 3,2, 1,6, 0,8, 0,4 и 0,2 мкг/мл. Стандартные образцы и тестируемые образцы плазмы мыши (разведенные соответствующим образом для получения требуемой концентрации) вносили на иммунопланшеты (Nunc-ImmunoPlate, MaxiSorp (Nalge Nunc International)), на которых был иммобилизован растворимый коровый глипикан-3 (Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha), и планшеты инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Добавляли козьи против человека IgG-BIOT (Southern Biotechnology Associates), а затем добавляли конъюгат стрептавидин-щелочная фосфатаза (Roche Diagnostics) и проводили хромогенную реакцию, используя в качестве субстрата систему субстратов для фосфатазы BluePhos Microwell (Kirkegaard & Perry Laboratories). С помощью микропланшетного ридера определяли цвет реакционного раствора в каждой лунке, измеряя коэффициент поглощения реакционного раствора при 650 нм. Затем вычисляли концентрацию антител в плазме мыши, используя аналитическое программное обеспечение SOFTmax PRO ((Molecular Devices), относительно стандартной кривой, построенной с использованием значений коэффициентов поглощения, полученных на основе стандартных образцов.

Концентрации в плазме мыши после 30 минут и 7 дней после введения показаны на Фиг.8. Более высокая концентрация антител наблюдалась в плазме мыши через 7 дней после введения тестируемого антитела, имеющего более низкие значения pI для обеих тестируемых доз введения.

Пример 7

ADCC-активность тестируемых антител, измеренная с использованием в качестве эффекторной клетки моноцитов периферической крови человека

ADCC-активность тестируемых антител исследовали как описано ниже, используя в качестве эффекторной клетки моноцит периферической крови человека (называемый PBMC).

(1) Получение раствора PBMC человека

Используя шприц, заранее загруженный 200 мкл раствором гепарина с концентрацией 1000 ед./мл (Novo Heparin Injection 5000 Units, Novo Nordisk), у здорового добровольца (взрослого мужчины) из Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha брали 50 мл периферической крови. Кровь дважды разбавляли PBS(-), делили на 4 равные части и вводили в пробирку для разделения лимфоцитов Leucosep (Greiner, Bio-one), в которую предварительно загрузили 15 мл Ficoll-Paque PLUS, и центрифугировали. Пробирку для разделения, загруженную периферической кровью, центрифугировали в течение 10 минут при комнатной температуре при 2150 об/мин и отбирали слой фракции моноцитов. Содержащиеся в этом слое клетки промывали один раз средой Игла в модификации Дульбекко (Sigma), содержащей 10% FBS (называемой ниже 10% FBS/D-MEM), и суспендировали в 10% FBS/D-MEM с плотностью клеток 5×10⁶/мл. Клеточную суспензию использовали в следующем эксперименте в качестве раствора PBMC человека.

(2) Получение клеток-мишеней

Клетки HepG2 отделяли от чашки и засевали в 96-луночный планшет с U-дном с плотностью 1×10⁴ клеток на лунку. Планшет инкубировали в течение ночи при 37°C в инкубаторе с 5% CO₂. На следующий день в каждую лунку планшета добавляли 5,55 MBq Cr-51 и инкубировали планшет в течение 3 часов при 37°C в инкубаторе с 5% CO₂. Клетки HepG2, находящиеся в лунках планшета, использовали в качестве клеток-мишеней в анализе ADCC-активности, как описано ниже.

(3) Анализ высвобождения хрома (ADCC-активность)

ADCC-активность оценивали по удельной скорости высвобождения хрома, определенной способом высвобождения хрома. Клетки-мишени, полученные как описано на стадии (2), промывали средой и 100 мкл каждого антитела (антитела H0L0, антитела Hu2.2Lu2.2 или антитела Hd1.8Ld1.6) добавляли с концентрациями 0, 0,004, 0,04, 0,4, 4 или 40 мкг/мл. Планшет оставляли для прохождения реакции на 15 минут при комнатной температуре и раствор с антителами удаляли. В каждую лунку добавляли 100 мкл среды для субкультуры и планшет инкубировали в течение 1 часа при 37°C в инкубаторе с 5% CO₂. 100 мкл раствора PBMC человека, приготовленного как описано на стадии (1), добавляли в каждую лунку (5×10⁵ клеток на лунку) и планшет инкубировали в течение 4 часов при 37°C в инкубаторе с 5% CO₂ и центрифугировали. Радиоактивность в 100 мкл супернатанта культуры в каждой лунке планшета измеряли с помощью гамма-счетчика. Удельную скорость высвобождения хрома определяли по следующей формуле: удельная скорость высвобождения хрома (%) = (А-C)×100/(B-C),

где A представляет собой среднее значение радиоактивности (cpm) 100 мкл супернатанта культуры в каждой лунке; В представляет собой среднее значение радиоактивности (cpm) 100 мкл супернатанта культуры в лунках, в которых к клеткам-мишеням добавляли 100 мкл 2%-ного водного раствора NP-40 (Nonidet P-40, Nacalai Tesque) и 50 мкл 10%-ной среды FBS/D-MEM; и С представляет собой среднее значение радиоактивности (cpm) 100 мкл супернатанта культуры в лунках, в которых к клеткам-мишеням добавляли 150 мкл 10%-ной среды FBS/D-MEM. Тесты выполняли в трех экземплярах и по результатам теста вычисляли среднее значение и стандартное отклонение удельной скорости высвобождения хрома (%), отражающей ADCC-активность антитела.

(4) Оценка ADCC-активности тестируемых антител

Результаты оценки ADCC-активности, проявляемой PBMC человека посредством тестируемого антитела, показали, что все тестируемые антитела обладают ADCC-активностью. Результаты представлены на Фиг.9. Критерий значимости показал, что ни при каких концентрациях между тестируемыми антителами и контрольным антителом H0L0 не наблюдалось никаких существенных различий в удельной скорости высвобождения хрома антителами. Статистический анализ выполняли, используя SAS Preclinical Package (SAS Institute Inc.). Эти результаты свидетельствуют об отсутствии каких-либо различий между ADCC-активностями pI-модифицированных тестируемых антител.

Пример 8

Получение и характеристика антитела с pI, модифицированным с помощью точечной мутации

(1) Выбор сайтов модификации для уменьшения pI

Для улучшения активности подавления развития опухоли у антитела Hd1.8Ld1.6 выбирали сайты модификации для получения возможности уменьшить значение pI вариабельной области. Находили аминокислотные остатки, имеющие отношение к уменьшению значения pI вариабельной области, которые суммированы в таблице 2 (тяжелая цепь) и таблице 3 (легкая цепь). Специфическими примерами таких модификаций для уменьшения значения pI являются антитело pH7pL14 и антитело pH7pL16. Эти антитела с модифицированным pI получали следующим образом.

Сайты модификации создавали с помощью ПЦР-набора. Синтезировали олиго-ДНК, разработанные на основе смысловой и антисмысловой последовательностей, содержащих сайт модификации. Пару из антисмысловой олиго-ДНК, содержащей сайт модификации, и смысловой олиго-ДНК, соответствующей вектору, несущему предназначенный для модификации ген, или пару из смысловой олиго-ДНК, содержащей сайт модификации, и антисмысловой олиго-ДНК, соответствующей вектору, несущему предназначенный для модификации ген, использовали в ПЦР с PrimeSTAR (TAKARA) для получения фрагментов 5'-конца и 3'-конца, содержащих сайт модификации. Эти два фрагмента соединяли, используя ПЦР-набор для получения каждого мутанта.

Полученный таким образом мутант вставляли в вектор экспрессии, который обеспечивал экспрессию встроенного гена в животных клетках. Нуклеотидную последовательность вектора экспрессии определяли способом, известным в данной области. Введение точечной мутации подтверждали с помощью нуклеотидной последовательности плазмидной ДНК. Ген, содержащий сайт мутации, клонировали в вектор экспрессии, который обеспечивает экспрессию встроенного гена в животных клетках. Экспрессию и очистку антитела проводили согласно способу, описанному в примере 1, или аналогичным способом.

В Hd1.8 61-й глутамин (Q) (согласно нумерации Кабата), находящийся в CDR1 Hd1.8, заменили глутаминовой кислотой (E) для получения pH7 (SEQ ID NO:27). В Ld1.6 24-й аргинин (R) (согласно нумерации Кабата), находящийся в CDR1 Ld1.6, заменили глутамином (Q), 37-й глутамин (Q) заменили лейцином (L), 43-й аланин (A) заменили серином (S), 45-й аргинин (R) заменили глутамином (Q), 74-й треонин (T) заменили лизином (K), 77-й серин (S) заменили аргинином (R), 78-й лейцин (L) заменили валином (V) и 79-й глутамин (Q) заменили глутаминовой кислотой (E), каждый из которых находился в FR2 и FR3, для получения pL14 (SEQ ID NO:28).

В pL14 104-й лейцин (L) (согласно нумерации Кабат) заменили валином (V), 107-й лизин (K) заменили глутаминовой кислотой (E), каждый из которых находился в FR4 pL14, для получения pL16 (SEQ ID NO:29).

(2) Измерение значения pI антител с pI, модифицированным точечной мутацией

Значения pI антитела Hd1.8Ld1.6, антитела pH7pL14 и антитела pH7pL16 измеряли с помощью электрофореза с PhastGel IEF 4-6.5 (GE Healthcase), используя способ, описанный в Примере 1, или аналогичным способом. Значения pI антитела Hd1.8Ld1.6, антитела pH7pL14 и антитела pH7pL16 были равны 7,47, 7,07 и 6,52, соответственно, что указывает на то, что значения pI антитела pH7pL14 и антитела pH7pL16 ниже значения pI антитела Hd1.8Ld1.6 на 0,4 и 0,95, соответственно.

(3) Измерение значения Tm антитела с pI, модифицированным точечной мутацией

Значения Tm Fab, полученные для антитела Hd1.8Ld1.6, антитела pH7pL14 и антитела pH7pL16, измеряли с помощью VP-DSC ((Micro Cal), используя способ, аналогичный способу в Примере 1. В этом эксперименте PBS использовали в качестве диализного раствора и концентрацию антител в тестируемом растворе для измерения DSC доводили до 25-100 мкг/мл. DSC-сканирование проводили с 20 до 115°C со скоростью сканирования, равной примерно 4 K/мин, используя референсный раствор (диализный раствор) и тестируемый раствор для DSC-измерения. Средняя температура тепловой денатурации Fab для антитела Hd1.8Ld1.6, антитела pH7pL14 и антитела pH7pL16 была равна 77,5, 78,0 и 74,7°C, соответственно.

(4) Оценка конкурентным методом ELISA связывающей активности с антигеном антител с pI, модифицированным точечной мутацией

Связывающую активность с антигеном, глипикан-3, антитела с pI, модифицированным точечной мутацией, измеряли способом, описанным в Примере 1 (Фиг.10). Было показано, что связывающая активность с глипиканом-3 у антитела pH7pH14 и антитела pH7pL16 сравнима со связывающей активностью антитела H0L0.

Пример 9

Получение антитела с pI, модифицированным точечной мутацией, с использованием клеточной линии FTP-KO

Вектор экспрессии, несущий ген, кодирующий каждое из антител с pI, модифицированным точечной мутацией, полученных в Примере 8, вводили в клетки клеточной линии FTP-KO, полученной в ссылочном примере 2 с использованием полиэтиленимина (Polysciences Inc), и экспрессировали антитело. Модифицированное антитело очищали от супернатанта клеточной культуры с использованием колонки с белком А (rProtein Sepharose^TM Fast Flow, Amersham Biosciences). Раствор очищенных антител получали согласно способу, описанному в примере 5, и измеряли концентрацию антител.

Пример 10

Терапевтическая эффективность в in vivo модели гуманизированного антитела GC33 и антител с pI, модифицированным точечной мутацией

(1) Поддержание клеточной линии, используемой для трансплантации в in vivo модели

Использовали клетки HepG2 (ATCC). Клетки HepG2 поддерживали с помощью субкультуры в минимальной эссенциальной среде Игла (SIGMA), дополненной 10% FBS, 1 ммоль/л МЕМ пируватом натрия (Invitrogen) и 1 ммоль/л МЕМ несущественными аминокислотами (Invitrogen) (называемой средой для субкультуры).

(2) Получение мышиной модели с трансплантированными клетками HepG2

Используя раствор, содержащий среду для субкультуры и матрикс MATRIGEL ((BD Bioscience) в соотношении 1:1, получали суспензию клеток HepG2 с плотностью 5×10⁷ клеток/мл. 100 мкл клеточной суспензии (5×10⁶ клеток/мышь) вводили подкожно в брюшную область мышей SCID (5-недельные самцы, CLEA Japan, Inc). За день до трансплантации клеток мышам вводили внутрибрюшинно 100 мкл антител к асиало-GM1 (содержимое 1 пузырька растворяли в 5 мл вышеуказанного раствора, Wako Pure Chemical Industries, Ltd). Объем опухоли вычисляли по следующей формуле:

объем опухоли=длинный диаметр×короткий диаметр×короткий диаметр/2.

Когда средний объем опухоли достиг 400 мм³, мышь использовали в качестве модели.

(3) Получение образца для введения, содержащего тестируемое антитело

Образцы для введения, содержащие антитело H0L0, антитело Hd1.8Ld1.6, антитело pH7pL14 или антитело pH7pL16 с концентрацией 0,1 мг/мл (1 мг/кг группы), готовили, используя физиологический раствор, в день введения.

(4) Введение образца для введения, содержащего антитело

Образец для введения, приготовленный согласно стадии (3), вводили дозой 10 мл/кг через хвостовую вену мышиной модели, полученной на стадии (2), раз в неделю в течение пяти недель, при этом введение образца начинали через 34 дня после трансплантации клеток HepG2. В качестве отрицательного контроля вводили физиологический раствор дозой 10 мл/кг через хвостовую вену один раз в неделю в течение пяти недель. Все группы состояли из 5 животных, и каждый образец для введения, содержащий тестируемое антитело, вводили соответствующей группе. Примерно в то же время, когда вводили образец, у 3 животных в каждой группе брали венозную кровь и анализировали на концентрацию антител в плазме мыши. Более конкретно, кровь брали из дорсальной вены ступни в двух временных точках: через 0,5 часов после начального введения и сразу перед вторым введением. 20 мкл полученной крови обрабатывали гепарином и центрифугированием отделяли плазму.

(5) Оценка противоопухолевой активности тестируемых антител

Противоопухолевую активность каждого тестируемого антитела оценивали в мышиной модели с трансплантированным раком печени человека. Объем опухоли измеряли через неделю после последнего дня введения образца. Как показано на Фиг.11, более сильная терапевтическая эффективность обнаружена у антитела pH7pL14 и антитела pH7pL16 по сравнению с антителом H0L0 и антителом Hd1.8Ld1.6.

Пример 11

PK-тестирование гуманизированного антитела GC33 и антител с точечной мутацией с использованием in vivo модели

(1) Получение образца для введения, содержащего тестируемое антитело

Образцы для введения, содержащие антитело H0L0, антитело Hd1.8Ld1.6, антитело pH7pL14, антитело pH7pL16 или антитело pH7M85pL16 с концентрацией 0,5 мг/мл (5 мг/кг группы), готовили, используя физиологический раствор, в день введения.

(2) Введение образца для введения, содержащего антитело

Образец для введения, приготовленный на стадии (1), вводили дозой 10 мл/кг через хвостовую вену мышам C.B-17/Icr-scid. Все группы состояли из 3 животных, и каждый образец для введения, содержащий тестируемое антитело, вводили соответствующей группе. У животных брали кровь из вены и анализировали на концентрацию антитела в плазме мыши. Более конкретно, кровь брали из дорсальной вены стопы в семи временных точках: 0,5 часа, 2 часа, 8 часов, 24 часа, 72 часа, 168 часов после первого введения. 20 мкл полученной крови обрабатывали гепарином и центрифугированием отделяли плазму.

(3) Концентрации тестируемых антител в плазме

Концентрацию тестируемых антител в плазме мыши измеряли методом ELISA, описанным в Примере 6. Готовили стандартные образцы с концентрациями плазмы 12,8, 6,4, 3,2, 1,6, 0,8, 0,4 и 0,2 мкг/мл. Стандартные образцы и образцы тестируемой плазмы мыши (растворенной соответствующим образом для получения требуемой концентрации) вносили на иммунопланшеты (Nunc-ImmunoPlate, MaxiSorp (Nalge Nunc International)) с иммобилизованным растворимым коровым глипиканом-3 (Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha) и планшеты инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Добавляли козьи против человека IgG-BIOT (Southern Biotechnology Associates), а затем добавляли конъюгат стрептавидин-щелочная фосфатаза (Roche Diagnostics) и проводили хромогенную реакцию, используя в качестве субстрата систему субстратов для фосфатазы BluePhos Microwell (Kirkegaard & Perry Laboratories). С помощью микропланшетного ридера определяли цвет реакционного раствора в каждой лунке, измеряя коэффициент поглощения реакционного раствора при 650 нм. Затем вычисляли концентрацию антител в плазме мыши, используя аналитическое программное обеспечение SOFTmax PRO (Molecular Devices), относительно стандартной кривой, построенной с помощью значений коэффициентов поглощения, полученных на основе стандартных образцов.

Концентрации в плазме мыши после введения показаны на Фиг.12. Более высокая концентрация антител наблюдалась в плазме мышей, которые получили тестируемое антитело с более низким значением pI.

Пример 12

ADCC-активность тестируемых антител, измеренная с использованием в качестве эффекторной клетки моноцитов периферической крови человека

ADCC-активность тестируемых антител исследовали как описано ниже, используя в качестве эффекторной клетки моноцит периферической крови человека (называемый PBMC).

(1) Получение раствора PBMC человека

Используя шприц, заранее загруженный 200 мкл раствора гепарина с концентрацией 1000 ед./мл (Novo Heparin Injection 5000 Units, Novo Nordisk), у здорового добровольца (взрослого мужчины) из Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha брали 50 мл периферической крови. Кровь дважды разбавляли PBS(-), делили на 4 равные части и вводили в пробирку для разделения лимфоцитов Leucosep (Greiner, Bio-one), в которую предварительно загружали 15 мл Ficoll-Paque PLUS, и центрифугировали. Пробирку для разделения, загруженную периферической кровью, центрифугировали в течение 10 минут при комнатной температуре при 2150 об/мин и отбирали слой с фракцией моноцитов. Содержащиеся в этом слое клетки промывали один раз средой Игла в модификации Дульбекко (Sigma), содержащей 10% FBS (называемой ниже 10% FBS/D-MEM) и суспендировали в 10% FBS/D-MEM с плотностью клеток 5×10⁶/мл. Клеточную суспензию использовали в следующем эксперименте в качестве раствора PBMC человека.

(2) Получение клеток-мишеней

Клетки HepG2 отделяли от чашки и засевали в 96-луночный планшет с U-дном с плотностью 1×10⁴ клеток на лунку. Планшет инкубировали в течение ночи при 37°C в инкубаторе с 5% CO₂. На следующий день в каждую лунку планшета добавляли 5,55 MBq Cr-51 и инкубировали планшет в течение 3 часов при 37°C в инкубаторе с 5% CO₂. Клетки HepG2, находящиеся в лунках планшета, использовали в качестве клеток-мишеней при исследовании ADCC-активности как описано ниже.

(3) Анализ высвобождения хрома (ADCC-активность)

ADCC-активность оценивали по удельной скорости высвобождения хрома, определенной способом высвобождения хрома. Клетки-мишени, полученные как описано на стадии (2), промывали средой и 100 мкл каждого антитела (антитела H0L0, антитела Hd1.8Ld1.6, антитела pH7pL14 или антитела pH7pL16) добавляли с концентрациями 0, 0,004, 0,04, 0,4, 4 или 40 мкг/мл. Планшет оставляли для прохождения реакции на 15 минут при комнатной температуре и раствор антител удаляли. В каждую лунку добавляли 100 мкл среды для субкультуры и планшет инкубировали в течение 1 часа при 37°C в инкубаторе с 5% CO₂. 100 мкл раствора PBMC человека, приготовленного как описано на стадии (1), добавляли в каждую лунку (5×10⁵ клеток на лунку) и планшет инкубировали в течение 4 часов при 37°C в инкубаторе с 5% CO₂ и центрифугировали. Радиоактивность в 100 мкл супернатанта культуры в каждой лунке планшета измеряли с помощью гамма-счетчика. Удельную скорость высвобождения хрома определяли по следующей формуле: удельная скорость высвобождения хрома (%) = (А-C)×100/(B-C),

где A представляет собой среднее значение радиоактивности (cpm) 100 мкл супернатанта культуры в каждой лунке; В представляет собой среднее значение радиоактивности (cpm) 100 мкл супернатанта культуры в лунках, в которых к клеткам-мишеням добавляли 100 мкл 2%-ного водного раствора NP-40 (Nonidet P-40, Nacalai Tesque) и 50 мкл 10%-ной среды FBS/D-MEM; и С представляет собой среднее значение радиоактивности (cpm) 100 мкл супернатанта культуры в лунках, в которых к клеткам-мишеням добавляли 150 мкл 10%-ной среды FBS/D-MEM. Тесты выполняли в трех экземплярах и по результатам теста вычисляли среднее значение и стандартное отклонение удельной скорости высвобождения хрома (%), отражающей ADCC-активность антитела.

(4) Оценка ADCC-активности тестируемых антител

Результаты оценки ADCC-активности, проявляемой PBMC человека посредством тестируемых антител, показали, что все тестируемые антитела обладают ADCC-активностью. Результаты представлены на Фиг.13. Критерий значимости показал, что ни при каких концентрациях между тестируемыми антителами и контрольным антителом H0L0 не наблюдалось никаких существенных различий в удельной скорости высвобождения хрома антителами. Статистический анализ выполняли, используя SAS Preclinical Package (SAS Institute Inc.). Эти результаты свидетельствуют об отсутствии каких-либо различий между ADCC-активностями pI-модифицированных тестируемых антител.

Пример 13

Получение и оценка модифицированных антител, способных уменьшить значение pI константной области

(1) Выбор сайтов модификации для снижения значения pI константной области

IgG1ΔGK (SEQ ID NO:32) является константной областью IgG1, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:31, в которой отсутствуют 446-й Gly и 447-й Lys (согласно EU нумерации) в константной области IgG1. Делеция этих двух аминокислотных остатков дает возможность уменьшить гетерогенность, обусловленную терминальной константной областью тяжелой цепи антитела.

Антитело модифицировали для уменьшения значения pI в константной области путем замены некоторых аминокислотных остатков в IgG1ΔGK соответствующими аминокислотными остатками, находящимися в последовательности константной области IgG4 человека, согласно нумерации EU.

В частности, 268-й гистидин (H) IgG1ΔGK (согласно нумерации EU) заменили на глутамин (Q) последовательности IgG4, 274-й лизин (K) заменили на глутамин (Q), 355-й аргинин (R) заменили на глутамин (Q), 356-ю аспарагиновую кислоту (D) заменили на глутаминовую кислоту (E), 358-й лейцин (L) заменили на метионин (M) и 419-й глутамин (Q) заменили на глутаминовую кислоту (E). Эти замены содержат последовательность из 9-12 аминокислот, которая может служить в качестве T-клеточного эпитопа, получаемого только из константной области человека, и, таким образом, предполагается получение более низкого риска иммуногенности. Эти 6 модификаций вводили в IgG1ΔGK для получения M85 (SEQ ID NO:33).

Константную область M85 объединяли с вариабельной областью pH7 и H0 для получения pH7M85 (SEQ ID NO:34) и H0M85 (SEQ ID NO:35), соответственно. Антитело H0M85L0 получали из H0M85, служащего в качестве тяжелой цепи, и L0, служащего в качестве легкой цепи, а антитело pH7M85pL16 получали из pH7M85, служащего в качестве тяжелой цепи, и pL16, служащего в качестве легкой цепи. Кроме того, антитело H0L0 и антитело pH7pL16, имеющие константную область IgG1, получали способами, описанными в Примере 1 и Примере 8. Антитела H0M85L0, pH7M85pL16, H0L0 и pH7pL16 экспрессировали в клеточной линии FTP-KO или клетках HEK293 и очищали как описано в Примере 1 или 9.

(2) Измерение значения pI константной области антитела с модифицированным pI

Значение pI антитела H0L0, антитела H0M85L0, антитела pH7pL16 и антитела pH7M85pL16 измеряли с помощью электрофореза, используя PhastGel IEF 4-6.5 (GE Healthcase) в условиях, аналогичных условиям в Примере 1. Значения pI антитела H0L0, антитела H0M85L0, антитела pH7pL16 и антитела pH7M85pL16 были равны 8,85, 8,16, 6,52 и 5,78, соответственно, что указывало на то, что модификация в константной области способствует дополнительному уменьшению значения pI, не затрагивая иммуногенность антитела.

(3) Оценка конкурентным методом ELISA связывающей активности антитела с модифицированным pI в константной области

Связывающую активность с антигеном каждого антитела с модифицированным pI в константной области измеряли, используя способ, описанный в Примере 1 (Фиг.14). Было показано, что связывающие активности с глипиканом-3 антитела H0L0, антитела H0M85L0, антитела pH7pL16 и антитела pH7M85pL16 были практически одинаковыми.

Пример 14

ADCC-активность антитела с модифицированным pI в константной области, измеренная с использованием в качестве эффекторной клетки моноцита периферической крови человека

ADCC-активность антитела pH7pL16 и антитела pH7M85pL16 оценивали, используя способ, который описан в Примере 12. Результаты показаны на Фиг.15. Критерий значимости показал, что ни при каких концентрациях между тестируемыми антителами и контрольным антителом H0L0 не наблюдалось никаких существенных различий в удельной скорости высвобождения хрома антителами. Статистический анализ выполняли, используя SAS Preclinical Package (SAS Institute Inc.). Эти результаты свидетельствуют об отсутствии каких-либо различий между ADCC-активностью антитела pH7pL16 и антитела pH7M85pL16.

1. Антитело против глипикана-3, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:27 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:29.

2. Антитело по п.1, содержащее константную область антитела человека.

3. Антитело по п.2, где константная область содержит последовательность SEQ ID NO:32 и 33.

4. Антитело по п.1, где антитело имеет уменьшенное количество фукозы, присоединенной к Fc-области антитела.

5. Противораковая композиция, содержащая эффективное количество антитела по любому из пп.1-4 и фармацевтически приемлемый носитель.

6. Противораковое средство, содержащее антитело по пп.1-4 в качестве активного ингредиента.

7. Противораковое средство по п.6, где раком является рак печени.

8. Нуклеиновая кислота, которая кодирует полипептид антитела по любому из пп.1-4.

9. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.8, для продукции антитела по любому из пп.1-4.

10. Клетка-хозяин по п.9, где клетка-хозяин является клеткой животного, лишенной транспортера фукозы, клеткой животного с удаленной фукозилтрансферазой или клеткой животного с модифицированной сложной разветвленной цепью сахара.

11. Способ получения антитела, включающий культивирование клетки-хозяина по п.9 или 10 и выделение полипептида из клеточной культуры.