Способ количественного определения цефалоспориновых антибиотиков в биосредах
Владельцы патента RU 2445624:
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского" (RU)
Изобретение относится к диагностике, в частности к способу количественного определения цефалоспориновых антибиотиков в жидкости ротовой полости и в цельной крови. Способ количественного определения цефалоспориновых антибиотиков в жидкости ротовой полости и в цельной крови, включающий отбор пробы жидкости ротовой полости и цельной крови, содержащих антибиотик, ее пробоподготовки, включающей удаление твердых элементов с последующим осаждением и удалением белков, измерения УФ-спектра собственного поглощения антибиотиков и определения концентрации антибиотика в определенном диапазоне по градуировочному графику, построенному по эталонной среде, при этом градуировочный график строят по измеренным значениям оптической плотности от содержания антибиотика в эталонном растворе; при использовании в качестве биологической среды цельной крови в процессе пробоподготовки удаляют форменные элементы. Вышеописанный способ позволяет сократить время определения цефалоспориновых антибиотиков при снижении предела их обнаружения, увеличить точность определения, снизить погрешность определения результата. 1 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл.
Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано для определения концентрации цефалоспориновых антибиотиков (цефазолина, цефатоксима, цефуроксима, цефалексина и др.) в исследуемых жидких средах, например, для токсикологического и технического анализа лекарственных средств, в медицине для определения концентрации антибиотика в биосистемах (сыворотке крови, слюне и др.) с целью регулирования введения оптимальных доз антибиотиков при лечении различных инфекционных заболеваний, при исследовании фармакокинетики и др.
Заявляемый способ может быть также применен для определения антибиотиков в пищевых продуктах, сточных водах фармацевтических производств.
Антибиотики применяются в медицине, ветеринарии, пищевой промышленности при консервировании, для обработки пищевых продуктов при их транспортировке. В связи с этим требуется контроль содержания антибиотиков в лекарственных формах, определение их содержания в биологических жидкостях организма человека и животных, продуктов питания, сточных водах фармацевтических предприятий и других объектах.
Из уровня техники известны различные способы количественного определения антибиотиков: микробиологические, спектрофотометрические, флуориметрические, хемилюминесцентные, различные варианты хроматографических методов, в т.ч. высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), хроматомасспектрометрия, инверсионная вольтамперометрия, электроаналитическое определение с модифицированными электродами.
Однако для определения β-лактамных антибиотиков предпочтительным является использование спектроскопических способов, основанных на использовании определенных свойств антибиотиков: собственное поглощение, цветные реакции, появление или исчезновение характерных полос в УФ, видимой или ИК-областях спектра под воздействием различных реагентов.
Известны спектрофотометрические методы определения цефалоспоринов, в основном, в лекарственных средах.
В частности, известен спектрофотометрический способ определения антибиотиков пеницилленовой группы - ампициллина, амоксициллина, клоксациллина, сулбенициллина, карбенициллина, тикарциллина в готовых лекарственных формах [Amin A.S. Pyrocatechol violet in pharmaceutical analysis. Part I. A spectrophotometric method for the determination of some β-lMactam antibiotics in pure and in pharmaceutical dosage forms // Farmaco. - 2001. - V.56, №3. - P.211-218.], основанный на измерении поглощения (λ=323-346 нм) продуктом реакции пенициллинов с раствором 1,2,4 - триазола, содержащим хлорид ртути (II). Данный способ применим преимущественно для определения вещества в лекарственных формах, составляющих его основу.
Однако фармакокинетические исследования, проводимые на биологических средах, требуют определения низких концентраций антибиотиков Cmin<10 мкг/мл, а следовательно, для данных целей необходим более чувствительный и экспрессный метод.
Известны спектрофотометрический и спектрофлуориметрический способы определения 4 пенициллинов (амоксициллина, бакампициллина, пиперациллина и сультамициллина) и 10 цефалоспориновых антибиотиков в фармацевтических препаратах, которые основаны на окислении антибиотиков церием (IV) в среде ОДМ H2SO4 при 100°C. Способы включают операцию измерения уменьшения светопоглощения церия (IV) при λ=317 нм или интенсивности флуоресценции образовавшегося церия (III) при длинах волн возбуждения и испускания 256 и 356 нм соответственно [El Walily М., Gazy A., Belal S. Use of cerium (IV) in the spectrophotometric and spectrofluorimetric determinations of penicillins and cephalosporins in their pharmaceutical preparations // Spectrosc Lett, 2000. - Vol.33. - №6. - P.931-948.].
Однако данные способы предназначены для определения антибиотиков в лекарственных средах и в силу недостаточной чувствительности не могут быть использованы для анализа биологических сред на содержание антибиотиков.
Известен спектрофотометрический способ определения ампициллина, амоксициллина и карбенициллина с применением фенольного реактива Фолина-Чокальтеу [Ахмад А.С., Рахман Н., Ислам Ф. Спектрофотометрическое определение ампициллина, амоксициллина и карбенициллина с применением фенольного реактива Фолина-Чокальтеу // Журн. аналит. химии, 2004. - Т.12. - №2. - С.138-142.]. Смесь определяемых пенициллинов с реактивом при pH 2,25 нагревают в термостатируемой водяной бане при 95±2°C и возникающую синюю окраску образующихся гетерополисоединений измеряют спектрофотометрически при λ=750 нм для ампициллина и карбенициллина и при λ=770 нм для амоксициллина.
Однако обычно применяемые наполнители фармацевтических композиций (например, сахар) влияют на результат определения, поэтому такие наполнители должны быть удалены из анализируемых материалов перед определением пенициллинов в капсулах и таблетках. Метод предложен для определения антибиотиков в модельных растворах. Данный способ характеризуется также длительностью процесса, требует операции нагрева, которая отрицательно сказывается на состоянии антибиотика и, следовательно, на метрологических параметрах методики определения.
Известен способ определения натриевых солей цефотаксима и моногидрата цефадроксила в двух составляющих смесях методом производной спектрофотометрии [Morelli В. Derivative spectrophotometry in the analysis of mixtures of cefotaxime sodium and cefadroxil monohydrate // J Pharm and Biomed Anal., 2003. - Vol.32. - №2. - P.257-267.]. Способ заключается в снятии спектров поглощения антибиотиков и оценке первой и второй производных спектров поглощения. Пределы чувствительности от 0,28 до 0,51 мг/мл.
Способ не требует предварительной обработки и разделения образцов. Однако имеет очень высокий предел обнаружения и реализован на модельных смесях. Метод применим только для определения основного вещества во флаконах и таблетках лекарств (от 99,8 до 102,0%).
Наиболее близким к предлагаемому техническому решению является спектрофотометрический способ количественного определения пенициллиновых антибиотиков в лекарственных средах, основанный на использовании гидроксамовой реакции при λ=475 нм [Красникова А.В., Иозеп А.А. Спектрофотометрическое определение пенициллиновых антибиотиков // Хим. фарм. журн., 2003. - Т.37. - №9. - С.49-51.]. Ацильные соединения, реагируя с гидроксиламином, превращаются в гидроксамовые кислоты, которые с солями железа (III) образуют окрашенные комплексы. Способ заключается в приготовлении растворов антибиотиков, добавлении гидроксиламина для разрушения β-лактамного кольца в молекулах пенициллинов с образованием гидроксамовых кислот, добавление хлорида железа для образования окрашенного комплекса пенициллинов с ионами железа и измерением оптической плотности окрашенных соединений антибиотиков с ионами железа (III). Количественное содержание антибиотиков определяют по градуировочному графику. Для построения градуировочного графика используют следующую методику. Получают окрашенные комплексы к точной навеске (от 2 до 6*10-3 г) антибиотика добавлением 0,4 мл щелочного раствора гидроксиламина, который получают смешением 2 мл 2 М раствора гидроксиламина гидрохлорида с 1,2 мл 4 н. гидроксида натрия и 0,8 мл 2 н. раствора карбоната калия. Смесь оставляют на 20 мин при 0°C, после чего к ней добавляют 0,5 мл 4 н. раствора соляной кислоты и 0,5 мл 10% раствора хлорида железа (III) в 0,1 н. соляной кислоте и доводят объем раствора дистиллированной водой до 20 мл. Оптическую плотность окрашенных растворов измеряют при 485 и 487 нм на фотоколориметре КФК-3 в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм. Раствор сравнения - те же компоненты без антибиотика.
Однако способ характеризуется длительностью процесса, многостадийностью, требует охлаждения раствора. Кроме того, данный способ предназначен только для определения ампициллина тригидрата и ампициллина натриевой соли, амоксициллина тригидрата и амоксициллина натриевой соли и не может быть распространен на другие группы антибиотиков и биологические среды.
Задачей изобретения является создание экспрессного и чувствительного способа количественного определения цефалоспориновых антибиотиков, например цефуроксима в биологических средах (в т.ч. жидкости ротовой полости, сыворотке крови и др.).
Техническим результатом является сокращение времени определения при снижении предела обнаружения антибиотиков и оптимизации метрологических характеристик способа (увеличение точности определения, снижение погрешности определения результата).
Кроме того, одним из преимуществ заявляемого способа является возможность использования в качестве биологической среды смешанной слюны, что, по сравнению с анализом крови, характеризуется безболезненностью взятия пробы, простотой, удобством, отсутствием риска внесения инфекции, невозможностью травмы кожи и стенки сосудов, адекватностью концентрации вещества фармакотерапевтическому эффекту в полости рта.
Поставленная задача решается тем, что способ количественного определения цефалоспориновых антибиотиков в биологических средах состоит из отбора пробы биологической среды, содержащей антибиотик, ее пробоподготовки, включающей удаление твердых элементов с последующим осаждением и удалением белков, измерения УФ-спектра собственного поглощения антибиотиков и определения концентрации антибиотика по градуировочному графику, построенному по эталонной среде, в качестве которой используют биологическую среду без содержания антибиотика, прошедшую аналогичную пробоподготовку, с последующим введением в подготовленную пробу раствора определяемого антибиотика в различных концентрациях, при этом градуировочный график строят по измеренным значениям оптической плотности от содержания антибиотика в эталонном растворе. Для удаления твердых элементов из пробы биологической среды без содержания антибиотика и с содержанием антибиотика, пробу предварительно центрифугируют 10-20 мин при 2000-3500 об/мин, а осаждение белков проводят сульфатом цинка в среде гидроксида натрия, удаление белков осуществляют центрифугированием в течение 10-20 мин при 2000-3500 об/мин. В качестве биологической среды может быть использована жидкость ротовой полости или цельная кровь, при этом в процессе пробоподготовки из жидкости ротовой полости удаляют твердые остатки пищи, а из цельной крови - форменные элементы.
Способ заключается в следующем: сначала готовят раствор цефуроксима в дистиллированной воде, затем последовательным разбавлением готовят растворы меньших концентраций, помещают различные количества препарата в кварцевую кювету и до 2-3 мл добавляют биологической среды, например смешанной слюны (жидкости ротовой полости - ЖРП) или сыворотки крови практически здорового человека (не принимающего в течение 7-10 дней антибиотики). Объем исследуемого раствора задается объемом кварцевой кюветы, в которой осуществляют перемешивание компонентов. Затем снимают спектр поглощения антибиотиков относительно жидкости ротовой полости (сыворотки крови) без антибиотика. Предварительно пробы смешанной слюны (сыворотки крови) центрифугируют 10-20 минут при 2000-3500 об/мин для отделения из смешанной слюны остатков пищи и белков, а из сыворотки крови - форменных элементов, затем проводят осаждение остатков белков, например, 2-4 мл сульфата цинка (с=3-5 г/л) при добавлении 1 мл 0,1-0,2 М гидроксида натрия, нагревают на водяной бане и снова центрифугируют. Строят градуировочный график зависимости оптической плотности в максимуме поглощения от содержания стандартного раствора цефуроксима в пробе биологической среды здорового человека.
Затем готовят пробу исследуемой среды, содержащую цефуроксим, центрифугируют и осаждают белки при аналогичных режимах, измеряют оптическую плотность антибиотика в максимуме светопоглощения относительно биопробы без антибиотика и по градуировочному графику находят содержание цефуроксима в исследуемой среде.
Пример 1. Для оценки возможности применения заявляемого способа для спектроскопического определения цефуроксима в ЖРП способ был опробован на смешанной слюне здорового человека с внесенными добавками цефуроксима. Отбор проб смешанной слюны практически здоровых лиц осуществляли путем сплевывания ротовой жидкости в чистые сухие полиэтиленовые пробирки. Пробу отбирали спустя 1-2 часа после приема пищи, перед сбором ротовую полость ополаскивали водой. Пробу ЖРП центрифугировали в течение 15 минут при 3500 об/мин. Затем добавляли в пробу 1 мл NaOH (с=0,12 моль/л) и 4 мл ZnSO4 (с=5,4 г/л) и нагревали на водяной бане. После осаждения белков отбирали надосадочную жидкость и снова центрифугировали 15 минут при 3500 об/мин.
Для приготовления серии водных растворов цефуроксима навеску таблетки 0,046 г, содержащую 250 мг антибиотика, растворяли в мерной колбе вместимостью 25 мл и до метки доводили дистиллированной водой (концентрации исходного раствора 1 мг/мл). Отбирали 2,5 мл исходного раствора цефуроксима в мерную колбу вместимостью 25 мл, получали раствор с концентрацией 100 мкг/мл.
Для приготовления серии растворов цефуроксима в жидкости ротовой полости с внесенными добавками антибиотика 2-50 мкг/мл помещали в кювету для измерения 0,1; 0,2; 0,66; 0,9; 1,1 мл раствора цефуроксима (с=100 мкг/мл) и до 3 мл добавляли надосадочной жидкости смешанной слюны. Растворы перемешивали и снимали спектры поглощения цефуроксима относительно смешанной слюны без антибиотика. Спектрофотометрические исследования проводились на спектрофотометре Shimadzu UV-1800, совмещенным с IBM PC, использовались кюветы из кварцевого стекла 1=1 см. Концентрацию цефуроксима в смешанной слюне определяли способом градуировочного графика. Для отделения белковых компонентов из смешанной слюны использовали центрифугу Wirowka MPW-6.
Для спектров поглощения цефуроксима на фоне ЖРП установлено, что λmax=261 нм. Строили градуировочный график в координатах оптическая плотность - концентрация антибиотика, мкг/мл.
Зависимость оптической плотности от концентрации цефуроксима на фоне ЖРП линейны, коэффициент корреляции практически равен 1, что свидетельствует о незначительном разбросе точек от усредненной зависимости: диапазон определяемых содержаний цефуроксима в ЖРП составляет 2-50 мкг/мл (на фиг.1 представлен спектр поглощения цефуроксима 9*10-5 М на фоне смешанной слюны здорового человека, на фиг.2 - зависимость оптической плотности (λ=261 нм) от концентрации цефуроксима в смешанной слюне), минимально определяемое содержание антибиотика составляет 2 мкг/мл.
Пример 2. Для оценки возможности применения заявляемого способа для спектроскопического определения цефуроксима в сыворотке крови способ был опробован на сыворотке крови здорового человека с внесенными добавками цефуроксима. Кровь (4-5 мл), отобранную из локтевой вены, выдерживали в течение 30 минут без стабилизатора при комнатной температуре, затем центрифугировали для отделения форменных элементов. Осаждение белков, снятие спектров поглощения и построение градуировочнрых графиков проводили по технологиям, представленным в Примере 1. Результаты спектроскопического поведения цефуроксима в сыворотке крови характеризовались параметрами, аналогичными Примеру 1.
Пример 3 - Заявленный способ был опробован для определения цефуроксима в смешанной слюне больных с инфекционно-соматической патологией. Проведено определение цефуроксима в смешанной слюне больной К., принимающей перорально цефуроксим по 250 мг 2 раза в сутки. Отбор проб смешанной слюны проводился через каждые 2 часа. Пробы центрифугировали, проводили осаждение белков, снова центрифугировали, помещали в кварцевую кювету 3 мл пробы смешанной слюны больных, снимали спектр поглощения относительно жидкости ротовой полости доноров (без содержания антибиотика). На фиг.3 представлены спектры поглощения цефуроксима в пробах жидкости ротовой полости для проб, отобранных в различные промежутки времени: - 11 часов (кривая 1); 14 часов (кривая 2); 21:30 час (кривая 3). По градуировочному графику определяли содержание цефуроксима в жидкости ротовой полости больных с инфекционно-соматической патологией.
Результаты определения цефуроксима в смешанной слюне больной К. приведены в таблице.
| Таблица | |||
| Результаты определения цефуроксима в пробах смешанной слюны больной К. (гайморит) (n=3; p=0,95) | |||
| Период приема цефуроксима, сут | Время приема цефуроксима, час | Время отбора проб ЖРП, час | Содержание цефуроксима в ЖРП (мкг/мл) |
| первые | 8:00 | 11:00 | 61±2 |
| 14:00 | 77±4 | ||
| 17:00 | 62±4 | ||
| 19:00 | 55±3 | ||
| 20:00 | |||
| 21:30 | 49±3 | ||
| вторые | 8:00 | 11:00 | 40±2 |
| 15:00 | 45±3 | ||
| 17:30 | 40±2 | ||
| третьи | 8:00 | 10:00 | 46±4 |
| 17:30 | 44±3 | ||
| 19:30 | 40±4 | ||
| 20:00 | 21:30 | 54±2 | |
| четвертые | 8:00 | 9:30 | 33±2 |
| 13:30 | 36±3 | ||
| 16:30 | 51±4 | ||
| пятые | 8:00 | 10:00 | 46±2 |
| 13:30 | 53±1 | ||
| 18:30 | 62±2 |
Полученные данные свидетельствуют о возможности спектроскопического определения цефуроксима в жидкости ротовой полости больных с инфекционно-соматической патологией при фармакокинетических исследованиях. На фиг.4 представлена зависимость концентрации цефуроксима в смешанной слюне больной К. от времени забора пробы. Показано, что максимальная концентрация цефуроксима в ЖРП достигается к 14-15 часам после приема в 8 часов утра 250 мг препарата, затем происходит уменьшение концентрации до начальных значений. После вечернего приема 250 мг цефуроксима концентрация препарата в ЖРП снова повышается.
С учетом сложности анализируемых объектов и самого определяемого вещества достоверность полученных результатов при реализации способа оценивалась следующим образом. В пробу смешанной слюны здорового человека вводили определенную добавку стандартного раствора цефуроксима и далее пробу проводили через все операции пробоподготовки. Погрешность определения не превышала 4%.
Таким образом, заявляемый способ расширяет функциональные возможности экспрессного определения антибиотиков в биологических жидкостях за счет расширения спектра используемых объектов цефалоспориновых антибиотиков. Способ отличается экспрессностью, возможностью определения активной концентрации антибиотиков в широком концентрационном интервале и дает возможность определения цефуроксима в смешанной слюне больных при инфекционных заболеваниях, например у больных гайморитами.
Пример 4 - применение заявляемого способа для определения цефуроксима в водных средах. Был приготовлен стандартный раствор цефуроксима 1 мг/мл. Для этого навеску таблетки 0,046 г, содержащей 250 мг антибиотика, растворяли в мерной колбе вместимостью 25 мл и до метки доводили дистиллированной водой (концентрации исходного раствора 1 мг/мл). Отбирали 2,5 мл исходного раствора цефуроксима в мерную колбу вместимостью 25 мл, получали раствор с концентрацией 100 мкг/мл.
Для приготовления серии водных растворов цефуроксима с внесенными добавками антибиотика 2-50 мкг/мл помещали в кювету для измерения 0,1; 0,2; 0,66; 0,9; 1,1 мл раствора цефуроксима (с=100 мкг/мл) и до 3 мл разбавляли дистиллированной водой. Растворы перемешивали и снимали спектры поглощения цефуроксима относительно воды. На фиг.5 представлены спектры поглощения водных растворов цефуроксима при различных концентрациях антибиотика: кривые 1 - 5 для концентраций цефуроксима 10; 16,9; 27,1; 33,9; 42,4 мкг/мл соответственно.
Для спектров поглощения водных растворов цефуроксима установлено, что λmax=281 нм.
Зависимость оптической плотности от концентрации водных растворов цефуроксима линейна, коэффициент корреляции практически равен 1, что свидетельствует о незначительном разбросе точек от усредненной зависимости: диапазон определяемых содержаний цефуроксима в водных растворах составляет 2-50 мкг/мл, минимально определяемое содержание антибиотика составляет 2 мкг/мл (фиг.6). На фиг.6 представлена зависимость оптической плотности (λ=281 нм) от концентрации цефуроксима в водных растворах.
Таким образом, результаты исследований показали возможность применения способа для определения цефалоспориновых антибиотиков, в водных средах, в т.ч лекарственных препаратах, сточных водах фармацевтических производств, при достижении заявленных количественных характеристик и метрологических параметров.
При этом время определения количественного содержания цефуроксима во всех примерах не превышало 30 минут, что является показателем экспрессности заявляемого способа по сравнению с аналогами.
1. Способ количественного определения цефалоспориновых антибиотиков в жидкости ротовой полости и в цельной крови, состоящий из отбора пробы жидкости ротовой полости и цельной крови, содержащих антибиотик, ее пробоподготовки, включающей удаление твердых элементов с последующим осаждением и удалением белков, измерения УФ-спектра собственного поглощения антибиотиков и определения концентрации антибиотика в диапазоне 2-50 мкг/мл по градуировочному графику, построенному по эталонной среде, при этом градуировочный график строят по измеренным значениям оптической плотности от содержания антибиотика в эталонном растворе; при этом при использовании в качестве биологической среды цельной крови в процессе пробоподготовки удаляют форменные элементы.
2. Способ по п.1, характеризующийся тем, что для удаления твердых элементов из пробы жидкости ротовой полости и цельной крови без содержания антибиотика и с содержанием антибиотика пробу предварительно центрифугируют 10-20 мин при 2000-3500 об/мин, а осаждение белков проводят сульфатом цинка в среде гидроксида натрия, удаление белков осуществляют центрифугированием в течение 10-20 мин при 2000-3500 об/мин.
