Способ оценки степени тяжести нарушения агрегации эритроцитов

Авторы патента:

Назарова Ольга Анатольевна (RU)

Низар Шаалали (RU)

Кудряшова Марина Владимировна (RU)

Абрашкина Елена Данииловна (RU)

Пахрова Ольга Александровна (RU)

G01N33/86 - основанные на времени свертываемости крови

Владельцы патента RU 2447450:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Ивановская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" (RU)

Изобретение относится к медицине, а именно к внутренним болезням, и может быть использовано для оперативной оценки нарушений микроциркуляции. Способ заключается в том, что в плазме крови через 4 минуты после начала спонтанной агрегации эритроцитов определяют количество свободных эритроцитов и количество клеток в агрегатах. Затем рассчитывают процентное содержание неагрегированных эритроцитов (ПНЭ) по формуле ПНЭ=КСЭ×100/(СЭА+КСЭ), где КСЭ - количество свободных эритроцитов, СЭА - сумма всех эритроцитов в агрегатах. При ПНЭ от 56 до 30% устанавливают I степень тяжести, от 30% до 4% - II степень тяжести, менее 4% - III степень тяжести. Использование изобретения позволит объективизировать и повысить точность оценки агрегации эритроцитов, быстро оценить выраженность нарушений микроциркуляции пациента и, соответственно, своевременно провести адекватный комплекс лечебно-профилактических мероприятий или внести коррективы в лечение. 3 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к внутренним болезням, и может быть использовано для оперативной оценки нарушений микроциркуляции.

В последнее десятилетие как за рубежом, так и в России достигнуты существенные успехи в создании принципиально новых подходов в исследовании реологических свойств крови в клинической практике. Необходимость применения простых и информативных диагностических тестов для выявления внутрисосудистых нарушений микроциркуляции определяется потребностями практического здравоохранения в решении проблем методологии диагностики и коррекции гемореологических нарушений при лечении больных с различной патологией, а также для прогнозирования результатов и контроля эффективности терапии.

Одним из наиболее важных патологических феноменов, возникающих в системе микроциркуляции, является внутрисосудистая агрегация форменных элементов крови /преимущественно эритроцитов/(Фирсов Н.Н., Сирко И.В., Приезжев А.В. Современные проблемы агрегометрии цельной крови. Тромбоз, гемостаз и реология. 2000, №2 (2), С.9-11; Муравьев Л.В., Тихомирова И.А., Борисов Д.В. Анализ влияния плазменных и клеточных факторов на агрегацию эритроцитов разных возрастных популяций. Физиология человека, 2002, Т.28, №4, С.144-148). В связи с этим представляется актуальным исследование агрегационного потенциала эритроцитов и правильная ее интерпретация.

В основе патогенеза многих заболеваний и их осложнений лежат процессы нарушения агрегации эритроцитов, инициирующие развитие тромбоза в сосудах. Необходимость исследования агрегации эритроцитов очевидна, а стандартизованные приборы отсутствуют. В разных лабораториях существуют различные способы оценки агрегации эритроцитов, что затрудняет интерпретацию полученных данных. Часто используемым методом количественного определения агрегации эритроцитов является фотометрический способ регистрации уменьшения интенсивности света, рассеиваемого кровью после прекращения перемешивания исследуемого образца в специальных кюветах. Аппараты, использующие этот эффект, были разработаны как в нашей стране (Левтов В.А., Левкович Ю.Н., Ашкенази И.Я., Потапова И.В. Об исследовании агрегационных свойств крови. - Физиология человека, 1978, т.4, №3, с.504-513.; Люсов В.А., Белоусов Ю.Б., Парфенов А.С. Метод определения агрегации эритроцитов. - Кардиология, 1978, №8, с.15-21; С.А.Селезнев, Г.И. Назаренко, В. С.Зайцев. Клинические аспекты микрогемоциркуляции. Л., Медицина, 1985, с.103-106), так и за рубежом (Schmid-Schnnbein Н., Eline £.А., Tolger Е, Velocity of red cell aggregation (RCA): photometric determination of the half-teme and aggregation constant.-Bibl. Anat, 1975. N 13, p.71-92; Firsov N. N., Priezzhev A. V., Ryaboshapka O.M., Sirko J.V. Aggregation properties of erythrocytes of whole blood under shear stress by backscattering nephelometry. Proc.of SPIE, 1993, v. 1884, p.283-290). Однако данный способ требует специальной аппаратуры и включает сложные подсчеты, поэтому не позволяет врачу быстро оценить выраженность нарушений микроциркуляции пациента и, соответственно, внести коррективы в лечение. Отсутствие стандартизованных приборов приводит к различию в геометрии течения и в способах регистрации выходящего из образца крови света, что ведет к различию получаемых результатов.

Широко известен прямой оптический метод определения агрегации эритроцитов, рекомендованный для использования комитетом экспертов ВОЗ по стандартизации в гематологии (International committee for standardization in hematology (expert panel on blood theology). Guidelines on selection of laboratory tests for monitoring the acute phase response. J. Clin. Pathol. 1988., V.41, P.1203-1212). Этот метод удобен и прост в исполнении и отвечает следующим требованиям: агрегация эритроцитов учитывается в условиях, исключающих ее искусственное усиление, агрегация учитывается при стандартном исходном объемном соотношении массы эритроцитов и плазмы, приближающемся к физиологическому, для разведения плазменной взвеси эритроцитов (и одновременно «фиксации» агрегатов) используют ту же суспензирующую среду (плазма±агрегирующее вещество), количественное определение агрегации в камере (Горяева) позволяет одновременно оценить величину и форму агрегатов визуально (Fernandez de СМ. et al., 1989).

Для повышения точности измерений, детализации измеряемых параметров, оценки выраженности нарушения агрегации эритроцитов возник вопрос о классификации агрегационных нарушений по степени тяжести. Попытка классификации гемореологических нарушений приведена в работе Фирсова (Фирсов Н.Н., Коротаева Т.В., Вышлова М.А. Классификация тяжести гемореологических устройств. Сб. «Реологические исследования в медицине» (вып.2), М., 2000, с.136-141). Принимая в качестве прототипа предложенный Фирсовым способ разделения гемореологических нарушений на степени - I, II и III степень тяжести, мы предлагаем в качестве определяющего показателя, характеризующего степень агрегационного нарушения, взять процент неагрегированных эритроцитов. Этот показатель доступен и прост для определения в любой лаборатории, достаточно информативен и не требует больших материальных затрат.

В работе Н.Н. Фирсова (2000) приводится принцип разделения на степени тяжести. За основу берется среднее значение показателя (М), полученного у здоровых доноров, и стандартное отклонения (σ), определяющее рассеяние параметра вокруг среднего значения. Именно стандартное отклонение является параметром, надежно отделяющим одну среднюю величину от другой на расстояние своей удвоенной величины (2σ). При нормальном распределении в интервале М±σ находится около 70% всех случаев, поэтому перекрывание соседних распределений происходит только на 15%.

Технический результат предлагаемого способа оценки степени тяжести нарушения агрегации эритроцитов заключается в том, что в качестве определяющего показателя, характеризующего степень тяжести агрегационных нарушений, рассчитывают процент неагрегированных эритроцитов (ПНЭ) по формуле, и при ПНЭ от 56 до 30% устанавливают I степень тяжести, от 30% до 4% - II степень тяжести, менее 4% - III степень тяжести (см. таблица).

Способ оценки степени тяжести нарушения агрегации эритроцитов заключается в том, что стабилизированную кровь после 15-минутного центрифугирования при 3000 об/мин разделяли на плазму и форменные элементы. Микропипеткой на 0,2 мл раскапывали плазму в пластиковые планшеты, далее добавляем 0,02 мл отмытой в фосфатном буфере эритроцитарной массы. Через 4 минуты после начала спонтанной агрегации проводился подсчет количества свободных (неагрегированных) эритроцитов с помощью светового микроскопа в камере Горяева, а также количества клеток в агрегатах. Подсчет производился в 2 больших (32 малых) квадратах камеры Горяева. Определяли процентное содержание неагрегированных эритроцитов (ПНЭ) по формуле ПНЭ=КСЭ×100/(СЭА+КСЭ), где КСЭ - количество свободных эритроцитов, СЭА - сумма всех эритроцитов в агрегатах.

С помощью заявленного способа нами при гемореологическом обследовании 66 практически здоровых человек выявлена средняя величина и стандартное отклонение процента неагрегированных эритроцитов, составившая 69,0±13,0%. Таким образом, распределение по степеням тяжести следующее: норма 82%-56%, I степень 56%-30%, II степень 30%-4%, III степень менее 4%. Среди 66 обследованных практически здоровых людей ПНЭ в нормальных пределах наблюдался у 42 человек (64%), I степень тяжести - у 24 человек (36%).

Из 86 больных гипертонической болезнью без поражения органов мишеней нормальный уровень ПНЭ наблюдался у 24 человек (28%>), I степень нарушения агрегации эритроцитов наблюдалась у 49 человек (57%), II степень у 13 человек (15%). Из 75 больных ишемической болезнью сердца и инфарктом миокарда нормальный уровень ПНЭ наблюдался у 6 человек (8%), I степень нарушения агрегации эритроцитов наблюдалась у 37 человек (49%), II степень у 30 человек (40%), III степень у 2 человек (3%)

Клинический пример №1

Больная Л., 43 лет находилась на лечении в терапевтическом отделении клиники ИвГМА ГОУ ВПО Росздрава с 20.10.2007 г. по 4.11.2007 г. с диагнозом: гипертоническая болезнь I ст., АГ 2 ст., дислипидемия, риск 3. Гипертонический анамнез 2 года.

При гемореологическом обследовании уровень ПНЭ составил 42,86%, что относится к I степени тяжести агрегационных нарушений. Остальные реологические параметры следующие: средний размер агрегата - 6,07; показатель агрегации - 1,91; вязкость крови при скорости сдвига 200 с^-1 - 4,5 мПа·с, при скорости 50 с^-1-5,5 мПа·с, при скорости сдвига 10 с^-1 - 8,6 мПа·с, вязкость плазмы - 2,0 мПа·с; гематокрит - 36,8%.

Клинический пример №2

Больная Б., 60 лет находилась на лечении в кардиологическом отделении МУЗ «3-я городская клиническая больница» с 13.10.2007 по 2.11.2007 года с диагнозом: ИБС, острый Q-инфаркт миокарда передне-перегородочной области левого желудочка от 13.10.2007 года. Гипертоническая болезнь III ст., ХСН 2 ст., ФК 3, сахарный диабет 2 типа, средней тяжести, декомпенсация, риск 4. ИБС диагностирована в 2006 году.

При гемореологическом обследовании уровень ПНЭ составил - 17,54%, что относится к II степени тяжести агрегационных нарушений. Остальные реологические параметры следующие: средний размер агрегата - 7,12, показатель агрегации - 3,43, вязкость крови при скорости сдвига 200 с^-1 - 5,1 мПа·с, при скорости 50 с^-1 - 6,2 мПа·с, при скорости сдвига 10с^-1-10,1 мПа·с, вязкость плазмы - 1,8 мПа·с; гематокрит - 41,2%.

Клинический пример №3

Больная Л., 67 лет находилась на лечении в кардиологическом отделении МУЗ «3-я городская клиническая больница» с 14.10.2006 по 12.11.2006 года с диагнозом: ИБС, рецидивирующий Q-инфаркт миокарда передне-перегородочной области левого желудочка от 14.10.2006 года, осложненный отеком легких. Гипертоническая болезнь III ст., ХСН 2А ст., ФК 3, сахарный диабет 2 типа, средней тяжести, декомпенсация, риск 4. ИБС диагностирована в 2002 году.

При гемореологическом обследовании ПНЭ составил - 3.97%, что относится к III степени тяжести агрегационных нарушений. Остальные реологические параметры следующие: средний размер агрегата - 11,46, показатель агрегации - 8,10, вязкость крови при скорости сдвига 200 с^-1 - 5,6 мПа·с, при скорости 50 с^-1 - 6,5 мПа·с, при скорости сдвига 10 с^-1 - 19,2 мПа·с, вязкость плазмы - 2,7 мПа·с; гематокрит - 49,8%.

Таким образом, приведенные примеры демонстрируют целесообразность применения процента неагрегированных эритроцитов для оценки степени тяжести нарушения агрегации эритроцитов.

Способ оценки степени тяжести нарушения агрегации эритроцитов, включающий определение клинико-лабораторных показателей, отличающийся тем, что в плазме крови через 4 мин после начала спонтанной агрегации эритроцитов определяют количество свободных эритроцитов и количество клеток в агрегатах, затем рассчитывают процентное содержание неагрегированных эритроцитов (ПНЭ) по формуле ПНЭ=КСЭ·100/(СЭА+КСЭ), где КСЭ - количество свободных эритроцитов, СЭА - сумма всех эритроцитов в агрегатах, и при ПНЭ от 56 до 30% - устанавливают I степень тяжести, от 30% до 4% - II степень тяжести, менее 4% - III степень тяжести.

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимическому способу определения концентрации компонентов свертывания крови и продуктов их превращения в биологических жидкостях.

Устройство мониторинга образования тромба и способ мониторинга образования тромба // 2432577

Способ определения функционального состояния системы гемостаза // 2430380

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для определения функционального состояния системы гемостаза. .

Способ определения активности тромбина // 2429488

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторным методам исследования. .

Измерение активности тромбина в цельной крови // 2422835

Изобретение относится к способу in vitro измерения активности тромбина в образце крови. .

Способ оценки риска повторных тромботических событий у больных острым коронарным синдромом // 2419800

Изобретение относится к медицине, клинико-лабораторной диагностике и экспериментальной медицине. .

Способ экспресс-оценки функционального состояния системы гемостаза // 2413954

Изобретение относится к области медицины, а именно к инструментальным способам оценки функционального состояния системы гемостаза и касается способа экспресс-оценки функционального состояния системы гомеостаза.

Способ диагностики резистентности к ацетилсалициловой кислоте // 2413953

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и касается способа диагностики резистентности к ацетилсалициловой кислоте. .

Способ коррекции внутрисосудистой активности тромбоцитов у детей со сколиозом // 2408351

Изобретение относится к области медицины, а именно к гематологии, и ортопедии. .

Способ коррекции тромбопластинообразования у детей со сколиозом // 2405522

Изобретение относится к области медицины, а именно к гематологии и ортопедии. .

Анализатор для автоматического определения показателей гемостаза // 2452936

Изобретение относится к медицинской технике, а именно к анализаторам для автоматического определения показателей гемостаза (коагуляторам)

Способ определения активности и функциональности тромбина и фибриногена // 2462721

Изобретение относится к биохимии

Диагностика тромбоэмболических заболеваний вен путем определения содержания d-димеров и растворимого фибрина // 2475760

Способ определения окислительной модификации белков в пуле веществ средней молекулярной массы в сыворотке крови, плазме, эритроцитах и в моче // 2525437

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической биохимии, и предназначено для определения окислительной модификации белков в пуле веществ средней молекулярной массы в биологической среде при любых патологических состояниях путем биохимического исследования. Производят забор биологической среды, выбранной из плазмы крови, эритроцитов или мочи, осаждают белки путем добавления 10% раствора трихлоруксусной кислоты, и в случае образования осадка проводят центрифугирование при 1000 об/мин в течение 15 минут, затем добавляют 0,05 М раствор 2,4-динитрофенилгидразина в 2 М соляной кислоте, после чего пробу центрифугируют при 1000 об/мин в течение 20 минут, и в случае выпадения осадка осадок промывают 2 раза раствором этанол-этилацетат (1:1), затем подсушивают на водяной бане 10 минут и затем растворяют в 8 М растворе мочевины, выдерживая пробы в кипящей водяной бане в течение 10 минут до полного растворения, с последующим анализом раствора спектрофотометрическим методом. Способ обеспечивает увеличение информативности биохимических тестов, снижение расходов биологического материала. Способ пригоден как для однократного исследования, так и для мониторинга состояния окислительной модификации белков и уровня средних молекул в раннем послеоперационном периоде. 9 табл., 2 прим.

Способ диагностики нарушений агрегации тромбоцитов при муковисцидозе у детей // 2533287

Изобретение относится к области медицины и представляет собой способ диагностики нарушений агрегации тромбоцитов при муковисцидозе у детей, включающий проведение теста на агрегацию тромбоцитов с индукторами на агрегометре «Multiplate», при этом в кюветы с магнитной мешалкой и электродами добавляют 400 мкл NaCl при 37°C и затем сразу добавляют 400 мкл цельной крови из пробирки с гирудином, инкубируют в камере прибора две минуты, затем добавляют в кювету 30 мкл индуктора агрегации, выбранного из группы: растворимый рецептор тромбина - пептид-6, аденозиндифосфат, арахидоновая кислота, при этом скорость агрегации тромбоцитов изображается на экране прибора в виде кривой и автоматически рассчитывается площадь под кривой U, по значению площади U под кривой судят о состоянии агрегации трмбоцитов в сравнении с референсными значениями в группе здоровых детей и при повышении порогового значения площади U выше референсного судят о гиперагрегации тромбоцитов, а при понижении порогового значения площади U ниже референсного судят о гипоагрегации тромбоцитов. Изобретение обеспечивает своевременную диагностику нарушений в микроциркуляторном русле при муковисцидозе. 2 пр., 1 ил.

Способ определения резистентности тромбоцитов к ацетилсалициловой кислоте // 2538219

Изобретение относится к способу определения резистентности тромбоцитов к ацетилсалициловой кислоте (АСК) путем импедансного исследования агрегационной функции тромбоцитов in vitro, при котором исследуют агрегационную активность после инкубации образца биологического материала с АСК с использованием индуктора агрегации, причем агрегацию тромбоцитов индуцируют коллагеном в оптимальной концентрации 2 мг/мл и одновременно с измерением импеданса проводят определение динамики освобождения гранул тромбоцитов люминесцентным методом, где перед проведением агрегации пробы калибруются с помощью стандарта аденозинтрифосфата (АТФ), по полученным агрегатограммам определяют значения амплитуды агрегации в Омах и присваивают полученным значениям баллы: значения ≤6 соответствуют 0 баллов, значения 7-9 соответствуют 1 баллу, значения 10-12 соответствуют 2 баллам, значения >12 соответствуют 3 баллам; затем определяют интенсивность высвобождения АТФ из гранул тромбоцитов в нмолях и присваивают полученным значениям баллы: значения <0,5 соответствуют 0 баллам, значения 0,5-1,0 соответствуют 1 баллу, значения 1,0-1,5 соответствуют 2 баллам, значения >1,5 соответствуют 3 баллам, и далее рассчитывают индекс резистентности (ИР) по формуле, при этом значение показателя ИР более 4 указывает на наличие аспиринорезистентности тромбоцитов. Изобретение обеспечивает проведение быстрой комплексной диагностики резистентности тромбоцитов к АСК с оценкой функционального состояния гранул тромбоцитов до начала лечения и возможность предотвращения развития нежелательных тромботических или геморрагических осложнений. 2 ил., 1 табл., 2 пр.

Способ определения функционального состояния системы гемостаза // 2548780

Изобретение относится к медицине, а именно к гемокоагулогии, и может быть использовано для выявления лиц группы риска развития гемокоагуляционных осложнений. Сущность способа: проводят измерение амплитуды записи процесса свертывания крови в его начале, определяют показатели начала и конца процесса свертывания электрокоагулограммы крови и сравнивают их с одноименными показателями процесса свертывания крови в норме и при разнонаправленных отклонениях диагностируют нарушения функционального состояния системы гемостаза. Определяют постоянную времени по калибровочной характеристике, калибровку проводят априори для двух измеренных U1, U2 и известных U01, U02 значений нижней t1 и верхней t2=kt1 границ адаптивного диапазона, калибровочной характеристикой U0i служит функция предельного напряжения крови, компенсирующая неопределенность постоянной времени Т0, выбранной произвольно T*, и связывающая эталонную Uэi и измеренную Ui характеристики за счет нормирования измеренных значений известными по калибровочной характеристике U0i находят действительные значения постоянной времени Т0 и предельного напряжения U0 крови по которым последовательно строят калибровочную характеристику предельного напряжения крови, эталонную характеристику Uэi и определяют показатели начала Тн и конца Тк процесса свертывания крови где Uн, Uк - нормированные пороги напряжения начала и конца процесса свертывания крови. Изобретение позволяет снизить методическую погрешность на десятки порядков, повысить точность времени свертывания на 4 порядка, а оперативность сокращает в три раза, что в итоге повышает метрологическую эффективность компьютерных анализаторов для автоматизации выявления лиц группы риска развития гемокоагуляционных осложнений. 4 ил.

Высокоселективный ингибитор контактной активации на основе инфестина 4 // 2556116

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, конкретно к получению мутантов инфестина 4, и может быть использовано для диагностических целей при определении характеристик свертывания крови и ее компонентов. Полипептид характеризуется последовательностью мутанта инфестина 4 MutB SEQ ID NO: 1. При этом указанная последовательность может иметь модификации вне участка ингибирующей петли, существенно сохраняющие активность указанного полипептида. Изобретение позволяет получить высокоселективный ингибитор фХIIа, селективность или активность которого выше, чем у нативного инфестина 4 и Mut15. Полипептид используют для ингибирования контактной активации в тестируемом образце крови или ее продукта для увеличения времени хранения образца. 3 н. и 22 з.п. ф-лы, 7 ил., 3 табл., 4 пр.

Способ двухфазного получения липосом и способы их применения при изготовлении диагностических реагентов // 2567746

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложены способ двухфазного получения липосом, способ получения диагностического реагента для определения протромбинового времени и способ получения диагностического реагента для определения тромбопластинового времени. Способ двухфазного получения липосом включает получение липосомной эмульсии. Липосомную эмульсию с концентрацией липидов в ней 0,5-1,5 г/мл получают путем механического смешивания. Способ получения диагностического реагента для определения протромбинового времени включает использование липосомы по вышеуказанному способу. Липосомную эмульсию и природный или рекомбинантный тканевый фактор смешивают в пропорции 2:1 в буферной среде. Способ получения диагностического реагента для определения тромбопластинового времени включает использование липосомы по вышеуказанному способу. Липосомную эмульсию и отрицательно заряженный активный компонент смешивают в пропорции 1:1 в буферной среде. Преимуществом изобретений является техническое упрощение способа получения липосомных эмульсий, простота реализации методов получения диагностических объектов. 3 н. и 4 з.п. ф-лы, 13 пр.

Обогащенные фосфолипидами везикулы, несущие тканевой фактор, обладающие гемостатической активностью, и их применения // 2595406

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу улучшения прокоагулянтных свойств тканевого фактора (TF), экспрессированного в эукариотических клетках, и может быть использовано в медицине. Полученная в соответствии с настоящим изобретением модифицированная несущая тканевый фактор микровезикула может применяться в качестве прокоагулянтного средства для лечения кровоизлияний, заживления ран и стимуляции ангиогенеза в тканях. Изобретение позволяет улучшить прокоагуляторные свойства тканевого фактора за счет того, что полученная несущая TF микровезикула формируется из липидных мембран или их фрагментов из эукариотических клеток, в которых экспрессируется тканевый фактор, а также дополнительной добавки отрицательно заряженного фосфолипида. 7 н. и 11 з.п. ф-лы, 16 ил., 2 табл., 5 пр.