Лечение и предупреждение болезней сердца с использованием двух или более изоформ фактора роста гепатоцитов

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к применению изоформ фактора роста гепатоцитов (HGF), и может быть использовано в медицине. Композиция включает эффективное количество полноразмерного фактора роста гепатоцитов (flHGF) и варианта фактора роста гепатоцитов с делецией (dHGF), или один или несколько полинуклеотидов, кодирующих указанные изоформы. Изобретение позволяет эффективно лечить и предупреждать болезни сердца у субъекта, а также активировать рост эндотелиальных клеток в кровеносном сосуде. 4 н. и 35 з.п. ф-лы, 15 ил., 4 табл., 8 пр.

 

Область техники

Данное изобретение относится к способам лечения или предупреждения болезней сердца у субъекта, включающим введение субъекту двух или более изоформ фактора роста гепатоцитов (HGF). Настоящее изобретение, кроме того, относится к способам активирования роста эндотелиальных клеток в кровеносном сосуде, включающим введение в кровеносный сосуд двух или более изоформ фактора роста гепатоцитов (HGF). В одном варианте осуществления две или более изоформ HGF вводят в виде одного или нескольких полинуклеотидов, кодирующих указанные изоформы.

Предпосылки создания изобретения

HGF является гепаринсвязывающим гликопротеином, также известным как рассеивающий фактор или гепатопоэтин А. HGF, первоначально идентифицированный как сильный гепатотропный фактор роста (Nakamura et al., Nature 342: 440 (1989)), представляет собой гепаринсвязывающий белок мезенхимального происхождения, который имеет множество биологических эффектов, таких как митогенез, мотогенез и морфогенез различных типов клеток. Кодирующий HGF ген, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 (Seki Т., et al., Gene 102: 213-219 (1991)), находится на хромосоме 7q21.1 и включает 18 экзонов и 17 интронов. Транскрипт размером 6 т.п.о. транскрибируется с гена HGF, и затем на его основе синтезируется полноразмерный полипептид-предшественник HGF (flHGF), состоящий из 728 аминокислот, включающий следующие домены: N-концевая «петля-шпилька» - «двойная петля» 1 - «двойная петля» 2 - «двойная петля» 3 - «двойная петля» 4 - домен инактивированной серинпротеазы. Одновременно несколько отличных изоформ полипептида HGF синтезируются при альтернативном сплайсинге гена HGF. Известные изоформы включают вариант HGF с делецией (полноразмерный HGF за исключением делеции пяти остатков в «двойной петле» 1), NK1 (N-концевая «петля-шпилька» - «двойная петля» 1), NK2 (N-концевая «петля-шпилька» - «двойная петля» 1 - «двойная петля» 2) и NK4 (N-концевая «петля-шпилька» - «двойная петля» 1 - «двойная петля» 2 - «двойная петля» 3 - «двойная петля» 4). Кроме того, существуют аллельные варианты каждой изоформы. Под действием протеазы в сыворотке биологически неактивные предшественники могут превращаться в активные формы связанного с помощью дисульфидной связи гетеродимера. В гетеродимерах альфа-цепь с высокой молекулярной массой образует четыре домена «двойная петля» и N-концевую «петлю-шпильку», характерные для преактивированного пептидного района плазминогена. Домены «двойные петли» связанной с помощью трех дисульфидных связей петлеобразной структуры, состоящей из приблизительно 80 аминокислот, могут играть важную роль в межбелковых взаимодействиях. Низкомолекулярная бета-цепь образует подобный неактивной серинпротеазе домен. Состоящий из 723 аминокислот dHGF является полипептидом с делецией пяти аминокислот в первом домене «двойная петля» альфа-цепи, т.е. F, L, P, S и S, благодаря альтернативному сплайсингу между экзоном 4 и экзоном 5.

In vivo две изоформы HGF (flHGF, имеющий 728 аминокислот, и dHGF, имеющий 723 аминокислот) образуются благодаря альтернативному сплайсингу между экзоном 4 и экзоном 5. Хотя обе изоформы flHGF и dHGF имеют несколько общих биологических функций, они являются различными по иммунологическим и нескольким биологическим свойствам.

Установлено, что HGF стимулирует ангиогенез путем регулирования роста эндотелиальных клеток и миграции гладкомышечных клеток сосудов. Из-за своей ангиогенной активности HGF рассматривается в качестве одного из многообещающих кандидатов в терапевтическом ангиогенезе. «Терапевтический ангиогенез» означает вмешательство, при котором используются ангиогенные факторы, или в виде рекомбинантных белков, или в виде генов, для лечения ишемических болезней, таких как болезнь коронарных артерий (CAD) или болезнь периферических артерий (PAD). Также известно, что HGF стимулирует не только рост, но также и миграцию эндотелиальных клеток (Bussolino et al., J. Cell Biol. 119: 629 (1992); Nakamura et al., J. Hypertens 14: 1067 (1996)), и была также исследована его роль в качестве стимулирующего реэндотелизацию агента (Yasuda et al., Circulation 101: 2546 (2000); Hayashi et al., Gene Ther. 7: 1664 (2000)).

HGF был использован в качестве агента для терапевтического ангиогенеза. Morishita и коллеги по работе использовали ген HGF для лечения PAD и CAD. Они наблюдали некоторый терапевтический ответ в случае PAD после введения гена HGF, но было неясно, является ли перенос гена HGF эффективным для лечения CAD. На данное число перенос гена HGF был исследован в различных моделях CAD на животных (Miyagawa et al., Circulation 105: 2556 (2002); Azuma et al., Gene Ther. 13: 1206 (2006); Aoki et al., Gene Ther. 7: 417 (2000); Funatsu et al., J. Thoracic Cardiovasc. Surg. 124: 1099 (2002)). Однако все еще остается спорным то, оказывает ли перенос гена HGF целебные эффекты на CAD. Например, Miyagawa и его коллеги по работе установили, что перенос HGF человека не мог увеличить фракцию изгнания левого желудочка (LVEF) пораженного инфарктом сердца через 8 недель после лечения в модели инфаркта миокарда на крысах (Miyagawa et al., Circulation 105: 2556 (2002), фиг.2). Кроме того, перенос гена HGF имел незначительный эффект на фракцию укорочения в процентах и толщину передней стенки левого желудочка через 8 недель после лечения в той же модели (Miyagawa et al., Circulation 105: 2556 (2002), фиг.3 и 5).

HGF был также использован в качестве агента для ингибирования рестеноза. Методы ангиопластики коронарных сосудов, например, надувной баллон или стен, являются широко используемыми способами лечения перекрытых кровеносных сосудов. Однако утолщение интимы, например рестеноз коронарных артерий, создает значительную проблему при использовании ангиопластики. Одной из причин рестеноза является гиперпролиферация и миграция гладкомышечных клеток сосудов с сопутствующим синтезом экстраклеточного матрикса, что является следствием ответа на повреждение сосуда. Существуют данные, что быстрое восстановление эндотелиальной поверхности могло подавлять пролиферацию гладкомышечных клеток и, тем самым, ингибировать рестеноз (например, Bauters et al., Prog. Cardiovasc. Dis. 40: 107 (1997)). В качестве одного из способов предупреждения рестеноза была проверена локальная доставка факторов роста эндотелия, таких как фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) или фактор роста гепатоцитов (HGF), в поврежденный кровеносный сосуд, и она продемонстрировала эффекты на ослабление рестеноза (Asahara et al., Circulation 94: 3291 (1996); Yasuda et al., Circulation 101; 2546 (2000); Hayashi et al., Gene Ther. 7: 1664 (2000); Walter et al., Circulation 110: 36 (2004)).

Все исследования в отношении HGF-генной терапии, описанные выше, были проведены с использованием кДНК flHGF, кодирующей 728 аминокислот, но не с кДНК dHGF, кодирующей 723 аминокислот (Miyagawa et al.; Azuma et al.; Aoki et al.; Funatsu et al.; Yasuda et al.; и Hayashi et al.). Настоящим изобретением предоставляется первое доказательство того, что перенос нуклеотидных последовательностей, экспрессирующих многочисленные изоформы HGF (например, flHGF и dHGF), может эффективно лечить CAD у животных и людей, по сравнению с кДНК flHGF, которую проверяли в большинстве предшествующих работ. Настоящим изобретением также предоставляется первое доказательство того, что перенос нуклеотидных последовательностей, экспрессирующих многочисленные изоформы HGF, может ускорить процесс реэндотелизации кровеносного сосуда.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Соответственно, одной задачей настоящего изобретения является обеспечение применения композиции, включающей две или более изоформ HGF.

Один аспект настоящего изобретения относится к применению композиции, включающей две или более изоформ HGF или один или несколько полинуклеотидов, кодирующих изоформы, для производства лекарственного средства для лечения или предупреждения болезни сердца у субъекта.

Другой аспект настоящего изобретения относится к применению композиции, включающей две или более изоформ HGF или один или несколько полинуклеотидов, кодирующих изоформы, для производства лекарственного средства для активирования роста эндотелиальных клеток в кровеносном сосуде.

Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение способов лечения или предупреждения болезни сердца путем введения двух или более изоформ HGF.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способам увеличения перфузии ишемизированной ткани сердца или увеличения плотности сосудов в миокарде у субъекта, включающим введение субъекту композиции, включающей две или более изоформ HGF.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способам лечения болезни сердца у субъекта, включающим введение субъекту композиции, включающей две или более изоформ HGF.

Дальнейший аспект настоящего изобретения относится к способам усиления восстановления эндотелия или обеспечения лечения в месте повреждения сосуда или пораженного болезнью сосуда у субъекта, включающим введение субъекту композиции, включающей две или более изоформ HGF.

Дальнейшая задача настоящего изобретения имеет отношение к способам активирования роста эндотелиальных клеток в кровеносном сосуде, включающим введение в кровеносный сосуд композиции, включающей две или более изоформ HGF. В одном варианте осуществления кровеносный сосуд является поврежденным. В дальнейшем варианте осуществления активируется реэндотелизация кровеносного сосуда.

В одном варианте осуществления две или более изоформ HGF включают полноразмерный HGF (именуемый здесь flHGF) и вариант HGF с делецией (именуемый здесь dHGF). В другом варианте осуществления две или более изоформ HGF также включают NK1.

В дальнейшем варианте осуществления две или более изоформ HGF вводят в форме полинуклеотидов, кодирующих изоформы.

В одном аспекте настоящего изобретения композицию вводят путем инъекции.

В другом аспекте настоящего изобретения композицию вводят, используя средство доставки. В одном варианте осуществления средством доставки является стент. В дальнейшем варианте осуществления стент выбирают из группы, состоящей из стента из нержавеющей стали без слоя полимера, стента из нержавеющей стали со слоем полимера, стента из хромокобальтового сплава без слоя полимера и стента из хромокобальтового сплава со слоем полимера.

В одном аспекте настоящего изобретения две или более изоформ HGF вводят непосредственно в ишемизированную ткань сердца у субъекта.

Дальнейший аспект настоящего изобретения относится к композициям, включающим две или более изоформ HGF.

В одном варианте осуществления композиции включают полинуклеотиды, кодирующие две или более изоформ HGF.

Дальнейший аспект настоящего изобретения относится к композиции для увеличения перфузии ишемизированной ткани сердца у субъекта, включающей две или более изоформ HGF.

Дальнейший аспект настоящего изобретения относится к композиции для активирования роста эндотелиальных клеток в кровеносном сосуде у субъекта, включающей две или более изоформ HGF.

В одном варианте осуществления введение композиции в кровеносный сосуд субъекта активирует эндотелизацию кровеносного сосуда. В другом варианте осуществления введение композиции в кровеносный сосуд субъекта активирует и/или ускоряет реэндотелизацию кровеносного сосуда.

В дальнейшем варианте осуществления субъект нуждается в предупреждении или лечении рестеноза.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Вышеприведенные и другие задачи и отличительные признаки настоящего изобретения станут явными из следующего описания настоящего изобретения, взятого вместе с сопроводительными чертежами.

На фиг.1 демонстрируются эффекты изоформ HGF на миграцию HUVEC.

На фиг.2 демонстрируются эффекты изоформ HGF на миграцию клеток С2С12.

На фиг.3 демонстрируются эффекты изоформ HGF на миграцию клеток Н9С2.

На фиг.4 демонстрируются эффекты изоформ HGF на пролиферацию HUVEC.

На фиг.5 демонстрируется схематическое представление порядка проведения эксперимента для оценки фармакологической эффективности HGF в модели ишемической болезни сердца на крысах.

На фиг.6 демонстрируется эффект HGF на функцию - фракцию изгнания левого желудочка.

На фиг.7 демонстрируется эффект HGF на функцию - межжелудочковую перегородку во время систолы.

На фиг.8 демонстрируется эффект инъецирования HGF в ишемизированный миокард на плотность капилляров.

На фиг.9 демонстрируется эффект инъецирования HGF в ишемизированный миокард на фиброз миокарда.

На фиг.10 демонстрируется область коронарной артерии в 20-сегментной модели MIBI-SPECT.

На фиг.11 демонстрируется выбор миокардиальной области для инъецирования pCK-HGF-X7. pCK-HGF-X7 вводят путем интрамиокардиальных инъекций в обе ветви коронарной артерии в пределах миокардиальной области, имеющей уменьшение перфузии по оценке с помощью MIBI-SPECT.

На фиг.12 демонстрируется эффект pCK-HGF-X7 на перфузию миокарда при MIBI-SPECT.

На фиг.13 демонстрируется перфузия миокарда (κ), оцениваемая с помощью контрастной стресс-эхокардиографии миокарда.

На фиг.14 демонстрируется ускорение реэндотелизации с помощью элюирующего плазмиду для HGF стента согласно OCT.

На фиг.15 демонстрируется ускорение реэндотелизации с помощью элюирующего плазмиду для HGF согласно SEM.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано на открытии того, что введение двух или более изоформ HGF субъекту, страдающему болезнью сердца, такой как CAD, является эффективным для увеличения перфузии ишемизированной ткани сердца и, следовательно, для лечения или предупреждения болезни сердца. Дальнейшие аспекты настоящего изобретения имеют отношение к открытию того, что введение двух изоформ HGF активирует эндотелизацию кровеносного сосуда, например, для ослабления рестеноза посредством быстрой реэндотелизации кровеносного сосуда. Соответственно, задачей настоящего изобретения является обеспечение способов лечения или предупреждения болезни сердца, например, CAD или рестеноза коронарных артерий, путем введения двух или более изоформ HGF. Другой задачей настоящего изобретение является обеспечение способов активирования роста эндотелиальных клеток в кровеносном сосуде, например, если кровеносный сосуд является поврежденным.

Один аспект настоящего изобретения относится к применению композиции, включающей две или более изоформ HGF или один или несколько полинуклеотидов, кодирующих изоформы, для производства лекарственного средства для лечения или предупреждения болезни сердца у субъекта.

Другой аспект настоящего изобретения относится к применению композиции, включающей две или более изоформ HGF или один или несколько полинуклеотидов, кодирующих изоформы, для производства лекарственного средства для активирования роста эндотелиальных клеток в кровеносном сосуде.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способам увеличения перфузии ишемизированной ткани сердца или увеличения плотности сосудов в миокарде у субъекта, включающим введение субъекту композиции, включающей две или более изоформ HGF.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способам лечения или предупреждения болезни сердца у субъекта, включающим введение субъекту композиции, включающей две или более изоформ HGF.

Дальнейший аспект настоящего изобретения относится к способам усиления восстановления эндотелия или обеспечения лечения в месте повреждения сосуда или пораженного болезнью сосуда у субъекта, включающим введение субъекту композиции, включающей две или более изоформ HGF.

Другая задача настоящего изобретения имеет отношение к способам активирования роста эндотелиальных клеток в кровеносном сосуде, включающим введение в кровеносный сосуд композиции, включающей две или более изоформ HGF, причем рост эндотелиальных клеток в кровеносном сосуде активируется.

В одном варианте осуществления способы включают введение композиции, включающей три или более изоформ HGF, например, четыре или более изоформ HGF. В одном варианте осуществления композиция включает две или более изоформ HGF, выбираемых их группы, состоящей из flHGF, dHGF, NK1, NK2 и NK4. В другом варианте осуществления композиция включает две или более изоформ HGF, выбираемых их группы, состоящей из flHGF, dHGF, NK1 и NK2. В еще одном варианте осуществления композиция включает две или более изоформ HGF, выбираемых их группы, состоящей из flHGF, dHGF и NK1. В дальнейшем варианте осуществления две или более изоформ HGF включают flHGF и dHGF. В дальнейшем варианте осуществления две или более изоформ HGF состоят из flHGF и dHGF. В другом варианте осуществления две или более изоформ HGF включают flHGF, dHGF и NK1. В другом варианте осуществления две или более изоформ HGF вводят в форме полинуклеотидов, кодирующих изоформы.

В настоящем изобретении болезнью сердца, подвергаемой лечению или предупреждаемой, является любое заболевание, связанное с уменьшением кровотока в сердце, аорте или коронарных артериях, или ишемизированной ткани сердца. Примеры болезней сердца включают, без ограничения, окклюзию коронарных артерий (например, являющуюся следствием или связанную с отложением липидов/холестерина, привлечением макрофагов/клеток воспаления, отрывом бляшек, тромбозом, отложением тромбоцитов или разрастанием неоинтимы); ишемические синдромы (например, являющиеся следствием или связанные с инфарктом миокарда, стабильной стенокардией, нестабильной стенокардией, рестенозом коронарных артерий или реперфузионным повреждением), кардиомиопатию (например, являющуюся следствием или связанную с ишемическим синдромом, кардиотоксином, инфекцией, гипертонией, болезнью обмена веществ (такой как уремия, алиментарный полиневрит или гликогеноз), облучением, нервно-мышечным заболеванием, инфильтративным заболеванием (таким как саркоидоз, гемохроматоз, амилоидоз, болезнь Фабри или синдром Гурлер), травмой или неясной этиологией); аритмию (например, являющуюся следствием или связанную с ишемическим синдромом, кардиотоксином, адриамицином, инфекцией, гипертонией, болезнью обмена веществ, облучением, нервно-мышечным заболеванием, инфильтративным заболеванием, травмой или неясной этиологией); инфекцию (например, вызванную патогенным агентом, таким как бактерия, вирус, гриб или паразит) и воспалительное заболевание (например, связанное с миокардитом, перикардитом, эндокардитом, иммунным отторжением сердца или воспалительными заболеваниями, являющимися следствием идиопатического, аутоиммунного заболевания или заболевания соединительной ткани).

В одном варианте осуществления способы настоящего изобретения можно использовать для лечения или предупреждения атеросклероза (например, в аорте или коронарных артериях) для предупреждения связанных с атеросклерозом осложнений (например, стенокардии, инфаркта миокарда, аритмий, сердечной недостаточности, почечной недостаточности, цирроза печени, болезни Легга-Кальве-Пертеса, ишемического удара, окклюзии периферических артерий, аневризмы, эмболии) или для ослабления ранних симптомов и признаков атеросклероза (например, невозможности увеличения при необходимости кровотока в поврежденной ткани, как при стенокардии, усилии или синдроме Шарко).

В другом варианте осуществления способы настоящего изобретения можно использовать для лечения или предупреждения болезней сердца, являющихся следствием сосудистой хирургии, в том числе, без ограничения, ангиопластики (например, чрескожной транслюминальной ангиопластики коронарных сосудов, чрескожной транслюминальной ангиопластики сонной артерии, коронарной ангиопластики с имплантацией стента), стентирования, атерэктомии или имплантации (например, имплантации шунта для коронарных артерий). В этом варианте осуществления способы настоящего изобретения могут выполняться до, во время и/или после хирургического вмешательства. В определенных вариантах осуществления болезнью сердца является рестеноз коронарных артерий.

В одном аспекте настоящего изобретения две и более изоформ HGF вводят субъекту, имеющему заболевание коронарных артерий. В одном варианте осуществления субъект имеет частичную или полную закупорку одной или нескольких коронарных артерий. В другом варианте осуществления субъект имел, имеет инфаркт миокарда или подвержен риску его развития. В дальнейшем варианте осуществления субъект, как определено, например, на основе ангиограммы, электрокардиограммы, эхокардиограммы или другого метода, имеет ишемизированную ткань сердца, или у него предполагается наличие такой ткани. В одном варианте осуществления субъект является кандидатом на имплантацию шунта для коронарных артерий (CABG). В другом варианте осуществления субъект имеет одну или несколько коронарных артерий, которые частично или полностью закупорены, но не подходят для CABG. В дальнейшем варианте осуществления субъект был подвергнут CABG, но произошла неполная реваскуляризация миокарда.

В одном аспекте настоящего изобретения две или более изоформ HGF вводят в кровеносный сосуд для активации роста эндотелиальных клеток. В одном варианте осуществления кровеносный сосуд является перекрытым или поврежденным. В определенных вариантах осуществления перекрытый кровеносный сосуд, просвет которого сужен и кровоток через который уменьшен, может включать артерию или вену. В одном варианте осуществления введение двух и более изоформ HGF активирует реэндотелизацию кровеносного сосуда, например, после повреждения стенки кровеносного сосуда, например, во время метода ангиопластики. В определенных вариантах осуществления реэндотелизация может быть активирована и/или ускорена, например, наблюдается увеличение скорости роста эндотелиальных по сравнению с ростом эндотелиальных клеток в отсутствие двух или более изоформ HGF. В другом варианте осуществления введение двух или более изоформ HGF, например, субъекту, нуждающемуся в предупреждении или лечении рестеноза, подавляет пролиферацию гладкомышечных клеток в кровеносном сосуде.

Используемый здесь термин «лечить» или «лечение» болезни, например болезни сердца или перекрытого или поврежденного кровеносного сосуда, относится к введению субъекту фактора в количестве, достаточном для вызова уменьшения интенсивности одного или нескольких симптомов болезни или предотвращения развития болезни, или вызова регрессии болезни, например, вследствие активирования ангиогенеза или роста эндотелиальных клеток. Например, что касается уменьшения интенсивности симптома болезни сердца, лечение приводит к измеримому уменьшению интенсивности симптома, составляющему по крайней мере 5%, предпочтительно по крайней мере 10%, по крайней мере 15%, по крайней мере 20%, по крайней мере 25%, по крайней мере 30%, по крайней мере 35%, по крайней мере 40%, по крайней мере 45%, по крайней мере 50%, по крайней мере 55%, по крайней мере 60%, по крайней мере 65%, по крайней мере 70%, по крайней мере 75%, по крайней мере 80%, по крайней мере 85%, по крайней мере 90%, по крайней мере 95% или по крайней мере 100%. Физиологические эффекты, имеющие отношение к лечению болезни сердца, которые можно выявить и измерить для определения лечения, включают, без ограничения, увеличение производительности сердца (определяемой по, как минимум, одному клиническому показателю функции сердца, такому как минутный сердечный выброс, давления в легочной артерии и центральных венах или фракция изгнания желудочка), кровотока в стенке миокарда в покое или в состояниях нагрузки, регенерации ткани миокарда, образования, достижения полного развития и/или роста коллатеральных кровеносных сосудов (например, локального неоангиогенеза, увеличение капиллярной плотности, артериогенеза, лимфоангиогенеза, васкулогенеза), кардиомиогенеза (например, клеток поперечно полосатых мышечных волокон, гладких мышечных клеток или эпителиально-мышечных клеток), васкуляризации миокардиальной ткани, сократительной функции сердца, фракции изгнания левого желудочка или межжелудочковой перегородки, или уменьшение миокардиального фиброза, утолщения интимы (разрастания/гиперплазии неоинтимы), пролиферации эндотелиальных или гладкомышечных клеток, боли в груди или одышки.

Используемые здесь термины «предупреждать» или «предупреждение» относятся к уменьшению возникновения одного или нескольких симптомов болезни (например, изменения функции сердца или уменьшения кровотока вследствие перекрытого или поврежденного кровеносного сосуда) у животного. Предупреждение может быть полным, например, полным отсутствием симптомов у субъекта. Предупреждение может быть также частичным, так что частота симптомов у субъекта меньше частоты, которая наблюдалась бы без настоящего изобретения.

В одном варианте осуществления изоформы HGF или полинуклеотиды, кодирующие изоформы HGF, вводят в сосудистую сеть или сердце субъекта, например, поврежденный кровеносный сосуд, частично или полностью закупоренную коронарную артерию, ишемизированную миокардиальную ткань, перикардиальное пространство или коронарный синус.

Изоформы HGF или полинуклеотиды, кодирующие изоформы HGF, могут доставляться в требуемое место, используя любые средства, известные в данной области техники. Примеры средств доставки, которые могут использоваться, включают, без ограничения, катетеры (например, баллонный катетер, инфузионный катетер, катетер со стилетным концом), иглы, безигольные инъекторы, стенты, инфузионную канюлю, сетку, передаточные механизмы для сердца, шунты, кардиостимуляторы, имплантируемые фибриляторы, шовные материалы, металлические клипсы, накрутки вокруг сосудов, гибкие листы или мембраны, которые могут в значительной степени принимать очертания места ранения, средства каналирования, имплантаты и насосы. Конкретные примеры способов доставки изоформ HGF включают, без ограничения, доставку посредством баллонного катетера, помещаемого в вену, дренирующую в коронарный синус (например, большую вену сердца, среднюю вену сердца, заднюю вену левого желудочка или переднюю межжелудочковую вену или любую из их боковых ветвей); доставку через катетер, проведенный в просвет одной или нескольких коронарных артерий (например, правую или левую коронарную артерию), причем изоформами HGF покрыт баллон, который надувается на месте, или эти изоформы инъецируются из наконечника катетера; доставку через иглу во время операции на открытом сердце или трансплантации сердца (например, в левое или правое предсердие или левый или правый желудочек); доставку в перикардиальное пространство, используя внутренний ввод через левое предсердие, правый желудочек или левый желудочек или используя внешний ввод посредством операции со вскрытием грудной клетки, в минимальной степени инвазивной хирургии, или чрескожный ввод, выполняемый с помощью инъекции, катеризации, создания с помощью лазера перфузионных каналов, канюлизации, использования генной пушки или использования насоса; доставку с помощью антероградной перфузии из катетера, помещаемого в канал, доставляющий кровь в ткань, или ретроградной перфузии из катетера, помещаемого в канал, получающий кровь из ткани; или доставку посредством находящегося внутри просвета средства или внутрисосудистого протеза для сохранения сосудистой проходимости (например, стента, имплантата, стента-имплантата, фильтрующего контура в полой вене). В одном варианте осуществления средство является биодеградабельным, вследствие чего его не нужно удалять после того, как оно больше не требуется. В определенных вариантах осуществления две изоформы HGF доставляют, используя стент. В дальнейшем варианте осуществления стент выбирают из группы, состоящей из стента из нержавеющей стали без слоя полимера, стента из нержавеющей стали со слоем полимера, стента из хромокобальтового сплава без слоя полимера и стента из хромокобальтового сплава со слоем полимера.

В одном варианте осуществления полинуклеотиды, кодирующие изоформы HGF, доставляют в форме клеток, включающих полинуклеотиды и экспрессирующие полипептиды HGF. Клетки могут быть аутологичными или неаутологичными (например, аллогенными или ксеногенными) клетками. Можно использовать любую клетку, которая является жизнеспособной после трансплантации, в том числе, например, фибробласты, кардиомиоциты, эндотелиальные клетки или стволовые клетки (например, эмбриональные стволовые клетки, гемопоэтические стволовые клетки, мезенхимные стволовые клетки). Клетки, включающие полинуклеотиды, можно вводить в виде инъецируемого препарата жидкой суспензии, например, для инъекции в место поврежденного миокарда или внутривенно. Клетки можно вводить в инфарктную зону для уменьшения степени рубцового образования и для увеличения желудочковой функции. При введении полинуклеотидов в клетки ex vivo клетки можно получить от субъекта с помощью любого метода, известного в данной области техники, включающего, но без ограничения, биопсии, соскоб или хирургическое излечение ткани. Выделенные клетки можно культивировать в течение периода времени, достаточного для позволения полинуклеотидам внедриться в клетки, например, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 18, 24, 36, 48 часов или более. Способы культивирования эмбриональных клеток в течение коротких периодов времени широко известны в данной области техники. Например, клетки можно культивировать в планшетах (например, микролуночных планшетах) или в виде прикрепленных клеток, или в суспензии. В одном варианте осуществления присутствие полинуклеотидов в клетках определяют до введения клеток обратно субъекту. В другом варианте осуществления отбирают (например, на основе присутствия селектируемого маркера в полинуклеотидах) клетки, содержащие полинуклеотиды, и субъекту снова вводят только клетки, содержащие полинуклеотиды.

Когда изоформы HGF или полинуклеотиды, кодирующие изоформы HGF, доставляют с помощью инъекции, инъекция может быть внутрисердечной инъекцией, например, внутрь предсердия (левого и/или правого) или желудочка (левого и/или правого). Инъекция может также быть интрамиокардиальной инъекцией. Место инъекции может быть в ишемизированной/характеризующейся гипоксией области или вблизи такой области, на границе нормальной ткани и ишемизированной/характеризующейся гипоксией области, или в нормальную ткань. Инъекция может быть в месте одной или нескольких коронарных артерий, например, закупоренной артерии. Инъекции могут быть трансэпикардиальными или трансэндокардиальными. Доставка может состоять из одной инъекции или множественных инъекций в одно или несколько мест. Доставка может быть осуществлена с помощью интраперикардиальной инъекции. Доставка в являющееся сосудом место может быть внутрисосудистой инъекцией, например, внутривенной или внутриартериальной (внутрикоронарной, внутриаортальной). Доставка может быть в по крайней мере две коронарные артерии, например, по крайней мере одну левую и одну правую коронарную артерию, например, в место как минимум приблизительно 1 см к просвету коронарной артерии. Сосудистая инъекция может быть, например, в месте, прилегающем к ишемизированной или пораженной болезнью ткани, в месте сосудистого повреждения или в месте стеноза.

Введение изоформ HGF может быть повторено неоднократно, например, спустя промежуток времени, составляющий 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 дней или более, например, спустя 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 недель или более. В одном варианте осуществления после каждого введения изоформ HGF контролируют состояние сердечной перфузии или здоровое состояние сосудов, например, с помощью ангиограммы, электрокардиограммы, эхокардиограммы или другого способа, и, при необходимости, предоставляются дополнительные введения.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения две или более изоформ HGF вводят субъекту, испытывающему на данный момент ишемический эпизод. В другом варианте осуществления две или более изоформы HGF вводят как можно раньше после того, как ишемический эпизод имел место, например, в пределах 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 18, 24, 36, 48 или 72 часов от ишемического эпизода.

Две или более изоформ HGF вводят в терапевтически эффективной дозе, например дозе, которая приводит к измеряемому улучшению болезни сердца и/или сосудистого заболевания у субъекта, например увеличению перфузии ишемизированной ткани сердца, увеличению капиллярной плотности в ишемизированной ткани сердца, уменьшению фиброза в ишемизированной ткани сердца, уменьшению степени сосудистого повреждения, увеличению эндотелизации и т.п. Эффективная доза будет меняться от субъекта к субъекту в зависимости от степени болезни и/или потребности в эндотелизации, выбранного пути введения, возраста, пола и веса тела отдельного субъекта, состояния здоровья субъекта и тяжести симптомов у субъекта и может вводиться в однократной дозе или в разделенной на курс лечения общей дозе. Поэтому ежедневная доза не должна рассматриваться как ограничение объема настоящего изобретения никоим образом. Например, когда две или более изоформ HGF водятся в виде белков, терапевтически эффективная доза может находиться в диапазоне, составляющем от приблизительно 1 мкг до приблизительно 100 мг, например, от приблизительно 10 мкг до приблизительно 10 мг каждого белка. Когда две или более изоформ HGF водятся в виде полинуклеотидов, терапевтически эффективная доза может находиться в диапазоне, составляющем от приблизительно 1 мкг до приблизительно 10 мг, например, от приблизительно 5 мкг до приблизительно 5 мг, например, от приблизительно 10 мкг до приблизительно 2 мкг, от 100 мкг до приблизительно 1 мг. Когда введение изоформ HGF повторяется неоднократно, вводимая доза может быть одной и той же или различной каждый раз.

В одном варианте осуществления способы, кроме того, включают назначение субъекту дополнительных терапевтических средств или способов (например, ангиопластики), которые, как известно, являются эффективными для лечения болезни сердца и/или сосудистого заболевания. Примеры терапевтических средств включают, без ограничения, активаторы ангиогенеза (например, фактор роста сосудистого эндотелия, высвобождающие или образующий окись азота агенты, фактор роста фибробластов, тромбоцитарный фактор роста, интерлейкин-6, белок-1, вызывающий хемотаксис моноцитов, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, трансформирующий фактор-β роста), антитромбозные средства (например, аспирин, гепарин, РРАСК, эноксаприн, гирудин), антикоагулянты, антибиотики, антитромбоцитарные средства, тромболитики (например, активатор тканевого плазминогена), антипролиферативные средства, противовоспалительные средства, агенты, которые ингибируют гиперплазию, агенты, которые ингибируют рестеноз, ингибиторы гладкомышечных клеток, факторы роста, ингибиторы факторов роста, ингибиторы клеточной адгезии, химиотерапевтические средства и их комбинации.

Следующие определения предоставлены и должны помочь понять объем и осуществление на практике настоящего изобретения.

Термин «выделенный» для целей настоящего изобретения обозначает биологический материал (клетку, нуклеиновую кислоту или белок), который был извлечен из его первоначального окружения (окружения, в котором он присутствует в природе). Например, полинуклеотид, находящийся в своем природном состоянии в растении или животном, не является выделенным, однако этот же полинуклеотид, отделенный от соседних нуклеиновых кислот, с которыми он присутствуют в природе, считается «выделенным».

«Нуклеиновая кислота», «молекула нуклеиновой кислоты», «олигонуклеотид» и «полинуклеотид» используются взаимозаменяемо и относятся к образованной с помощью фосфатно-эфирных связей полимерной форме рибонуклеозидов (аденозина, гуанозина, уридина или цитидина; «молекулам РНК») или дезоксирибонуклеозидов (дезоксиаденозина, дезоксигуанозина, дезокситимидина или дезоксицитидина; «молекулам ДНК») или любым их фосфоэфирным аналогам, таким как фосфоротиоаты и тиоэфиры, или в одноцепочечной форме, или в виде двухцепочечной спирали. Возможны двухцепочечные ДНК-ДНК, ДНК-РНК и РНК-РНК спирали. Термин «молекула нуклеиновой кислоты» и, в частности, молекула ДНК или РНК относится только к первичной и вторичной структуре молекулы и не ограничивает ее какими-либо конкретными третичными формами. Таким образом, этот термин включает двухцепочечную ДНК, обнаруживаемую, среди прочего, в линейных или кольцевых молекулах ДНК (например, рестрикционных фрагментах), плазмидах, суперскрученных ДНК и хромосомах. При обсуждении структуры конкретной двухцепочечной молекулы ДНК последовательности могут здесь описываться в соответствии со стандартным правилом дачи последовательности только в направлении от 5' к 3' вдоль нетранскрибируемой цепи ДНК (т.е. цепи, имеющей последовательность, гомологичную мРНК). «Рекомбинантная молекула ДНК» является молекулой ДНК, которая подверглась молекулярно-биологической манипуляции. ДНК включает, но без ограничения, кДНК, геномную ДНК, плазмидную ДНК, синтетическую ДНК и полусинтетическую ДНК.

Термин «фрагмент», применяемый к полинуклеотидной последовательности, относится к нуклеотидной последовательности уменьшенной длины по сравнению со ссылочной нуклеиновой кислотой, включающей, на всем протяжении общей части, нуклеотидную последовательность, идентичную ссылочной нуклеиновой кислоте. Такой фрагмент нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением может быть, когда это уместно, включен в больший полинуклеотид, составной частью которого он является. Такие фрагменты включают олигонуклеотиды, длина которых находится в пределах от по крайней мере 6, 8, 9, 10, 12, 15, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 39, 40, 42, 45, 48, 50, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 70, 75, 78, 80, 90, 100, 105, 120, 135, 150, 200, 300, 500, 720, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000 или более следующих друг за другом нуклеотидов нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением, или в альтернативном случае состоят из них.

«Ген» относится к полинуклеотиду, включающему нуклеотиды, которые кодируют функциональную молекулу, в том числе функциональные молекулы, получаемые путем только транскрипции (например, биоактивные разновидности РНК) или путем транскрипции и трансляции (например, полипептид). Термином «ген» охватываются кДНК и геномные нуклеиновые кислоты - ДНК. «Ген» также относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, который экспрессирует конкретную РНК, белок или полипептид, включающему регуляторные последовательности, предшествующие (5' некодирующие последовательности) кодирующей последовательности и следующие за ней (3' некодирующие последовательности). «Природный ген» относится к гену, обнаруживаемому в природе, со своими собственными регуляторными последовательностями. «Химерный ген» относится к любому гену, который не является природным геном, включающему регуляторные и/или кодирующие последовательности, которые не обнаруживаются вместе в природе. Соответственно, химерный ген может включать регуляторные последовательности и кодирующие последовательности, которые происходят из различных источников, или регуляторные последовательности и кодирующие последовательности, происходящие из одного и того же источника, но расположенные таким образом, который отличен от того, который обнаруживается в природе. Химерный ген может включать кодирующие последовательности, происходящие из различных источников, и/или регуляторные последовательности, происходящие из различных источников. «Эндогенный ген» относится к природному гену в своем природном расположении в геноме организма. «Чужеродный» ген или «гетерологичный» ген относится к гену, обычно не обнаруживаемому в организме хозяина, но который введен в организм хозяина с помощью переноса гена. Чужеродные гены могут включать природные гены, введенные в неприродный организм», или химерные гены. «Трансген» является геном, который был введен в клетку способом переноса гена.

«Гетерологичная ДНК» относится к ДНК, не находящейся в природе в клетке или в хромосомном сайте клетки. Гетерологичная ДНК может включать ген, чужеродный для клетки.

Термин «геном» включает хромосомную, а также митохондриальную, хлоропластную и вирусную ДНК или РНК.

Молекула нуклеиновой кислоты является «гибридизуемой» с другой молекулой нуклеиновой кислоты, такой как кДНК, геномная ДНК или РНК, когда одноцепочечная форма молекулы нуклеиновой кислоты может подвергаться отжигу с другой молекулой нуклеиновой кислоты при соответствующих условиях, состоящих из температуры и ионной силы раствора. Условия гибридизации и промывки широко известны и приведены в качестве примеров Sambrook и др. в Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989), особенно в главе 11 и таблице 11.1 (документе, который в целом включен сюда посредством ссылки). Условия, состоящие из температуры и ионной силы, определяют «жесткость» гибридизации.

Условия жесткости можно адаптировать для отбора от в умеренной степени схожих фрагментов, таких как гомологичные последовательности из состоящих в дальнем родстве организмов, до в высокой степени схожих фрагментов, таких как гены, которые воспроизводят функциональные ферменты из близкородственных организмов. Для предварительного отбора гомологичных нуклеиновых кислот можно использовать условия гибридизации низкой жесткости, соответствующие температуре плавления (Tm), составляющей 55°С, например, 5X SSC, 0,1% SDS, 0,25% молока и отсутствие формалина; или 30% формалина, 5X SSC, 0,5% SDS. Условия гибридизации умеренной жесткости соответствуют более высокой Tm, например, 40% формалина, с 5Х или 6Х SSC. Условия гибридизации высокой жесткости соответствуют самой высокой Tm, например, 50% формалина, 5Х или 6Х SSC.

Для гибридизации требуется, чтобы две нуклеиновые кислоты содержали комплементарные последовательности, хотя в зависимости от жесткости гибридизации возможны несоответствия между основаниями. Термин «комплементарные» используется для характеристики связи между нуклеотидными основаниями, которые способны к гибридизации друг с другом. Например, что касается ДНК, аденозин комплементарен тимину, а цитозин комплементарен гуанину. Соответственно, настоящее изобретение также включает выделенные фрагменты нуклеиновых кислот, которые комплементарны полным последовательностям, описываемым или используемым здесь, а также в значительной степени схожим последовательностям нуклеиновых кислот.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения полинуклеотиды выявляют, используя условия гибридизации, включающие стадию гибридизации при Tm, составляющей 55°C, и используя условия, изложенные выше. В других вариантах осуществления Tm составляет 60°C, 63°C или 65°С.

Промывки после гибридизации также определяют условия жесткости. В одной совокупности условий используется ряд промывок, начинающихся с 6X SSC, 0,5% SDS при комнатной температуре в течение 15 минут (мин), затем повторенных в 2X SSC, 0,5% SDS при 45°C в течение 30 мин и затем дважды повторенных в 0,2X SSC, 0,5% SDS при 50°С в течение 30 мин. Более высокие температуры используются в предпочтительной совокупности жестких условий, в которой промывки являются одинаковыми с указанными выше за исключением того, что температура конечных двух 30-минутных промывок в 0,2X SSC, 0,5% SDS увеличена до 60°С. В другой предпочтительной совокупности в высокой степени жестких условий используются две конечные промывки в 0,1X SSC, 0,1% SDS при 65°С.

Жесткость, соответствующая для гибридизации нуклеиновых кислот, зависит от длины нуклеиновых кислот и степени комплементарности, переменных, широко известных в данной области техники. Чем выше степень схожести или гомологии между двумя нуклеотидными последовательностями, тем выше значение Tm для гибридов нуклеиновых кислот, имеющих эти последовательности. Относительная прочность (соответствующая более высокой Tm) гибридизаций нуклеиновых кислот уменьшается в следующем порядке: РНК:РНК, ДНК:РНК, ДНК:ДНК. Для гибридов длиной, превышающей 100 нуклеотидов, были выведены уравнения для расчета Tm (см. Sambrook и др., выше, 9.50-0.51). При гибридизации с более короткими нуклеиновыми кислотами, т.е. олигонуклеотидами, положение несоответствий становится более важным, и длина олигонуклеотида определяет его специфичность (см. Sambrook и др., выше, 11.7-11.8).

В одном варианте осуществления настоящего изобретения полинуклеотиды выявляют, используя условия гибридизации, включающие стадию гибридизации в менее чем 500 мМ соли и при по крайней мере 37°C и стадию промывки в 2Х SSPE при температуре, составляющей по крайней мере 63°С. В другом варианте осуществления условия гибридизации включают менее чем 200 мМ соль и по крайней мере 37°С для стадии гибридизации. В дальнейшем варианте осуществления условия гибридизации включают 2Х SSPE и 63°С и для стадии гибридизации, и для стадии промывки.

В другом варианте осуществления длина гибридизуемой нуклеиновой кислоты составляет по крайней мере приблизительно 10 нуклеотидов. Предпочтительно минимальная длина гибридизуемой нуклеиновой кислоты составляет по крайней мере приблизительно 15 нуклеотидов, например, по крайней мере приблизительно 20 нуклеотидов, например, по крайней мере 30 нуклеотидов. Более того, квалифицированный специалист поймет, что температуру и концентрацию соли в промывочном растворе можно отрегулировать в необходимых случаях в соответствии с такими факторами, как длина зонда.

Термин «зонд» относится к одноцепочечной молекуле нуклеиновой кислоты, которая может подвергаться спариванию оснований с комплементарной одноцепочечной нуклеиновой кислотой-мишенью с образованием двухцепочечной молекулы.

Используемый здесь термин «олигонуклеотид» относится к короткой нуклеиновой кислоте, которая может гибридизоваться с молекулой геномной ДНК, молекулой кДНК, плазмидной ДНК или молекулой мРНК. Олигонуклеотиды могут быть меченными, например, ³²Р-нуклеотидами или нуклеотидами, с которыми была ковалентно конъюгирована метка, такая как биотин. Меченые олигонуклеотиды могут использоваться в качестве зонда для обнаружения присутствия нуклеиновой кислоты. Олигонуклеотиды (один или оба из которых могут быть мечеными) могут использоваться в качестве праймеров для ПЦР, или для клонирования полноразмерной нуклеиновой кислоты или ее фрагмента, для секвенирования ДНК или для обнаружения присутствия нуклеиновой кислоты. Олигонуклеотид может также использоваться для образования тройной спирали с молекулой ДНК. Как правило, олигонуклеотиды приготовляют синтетически, предпочтительно в синтезаторе нуклеиновых кислот. Соответственно, олигонуклеотиды можно приготовить с не встречающимися в природе связями - аналогами фосфоэфирных связей, такими как тиоэфирные связи, т.п.

«Праймер» относится к олигонуклеотиду, который гибридизуется с последовательностью нуклеиновой кислоты-мишени с образованием двухцепоченого района нуклеиновых кислот, который может служить в качестве точки инициации для синтеза ДНК в подходящих условиях. Такие праймеры могут использоваться в полимеразной цепной реакции или для секвенирования ДНК.

«Полимерная цепная реакция» - ПЦР в сокращенном виде относится к in vitro способу ферментативной амплификации конкретных последовательностей нуклеиновых кислот. ПЦР включает повторяющийся ряд температурных циклов, при этом каждый цикл включает три стадии: денатурацию матричной нуклеиновой кислоты для разделения цепей молекулы-мишени, отжиг одноцепочечного олигонуклеотидного праймера для ПЦР с матричной нуклеиновой кислотой и удлинение подвергшегося отжигу праймера(ов) с помощью ДНК-полимеразы. ПЦР обеспечивает средство для обнаружения присутствия молекулы-мишени и, в количественных или полуколичественных условиях, для определения относительного количества молекулы мишени внутри исходного пула нуклеиновых кислот.

«Полимерная цепная реакция с обратной транскрипцией» - ОТ-ПЦР в сокращенном виде относится к in vitro способу ферментативной продукции молекул или молекулы кДНК-мишени из молекул или молекулы РНК с последующей ферментативной амплификацией конкретных последовательностей(и) нуклеиновых кислот внутри описанных выше молекул или молекулы кДНК-мишени. ОТ-ПЦР также обеспечивает средство для обнаружения присутствия молекулы-мишени и, в количественных или полуколичественных условиях, для определения относительного количества молекулы мишени внутри исходного пула нуклеиновых кислот.

«Кодирующая последовательность» ДНК относится к последовательности двухцепочечной ДНК, которая кодирует полипептид и может транскрибироваться и транслироваться в полипептид в клетке in vitro или in vivo после установления под контроль подходящих регуляторных последовательностей. «Подходящие регуляторные последовательности» относятся к нуклеотидным последовательностям, лежащим выше (5' некодирующие последовательности), внутри или ниже (3' некодирующие последовательности) кодирующей последовательности и оказывающим влияние на транскрипцию, процессирование или стабильность РНК, или трансляцию связанной с ними кодирующей последовательности. Регуляторные последовательности могут включать промоторы, направляющие трансляцию последовательности, интроны, определяющие полиаденилирование последовательности, сайты процессирования РНК, сайты связывания эффекторов и структуры петли с «ножкой». Границы кодирующей последовательности определяются инициирующим кодоном на 5' (амино)-конце и стоп-кодоном трансляции на 3' (карбоксильном) конце. Кодирующая последовательность может включать, но без ограничения, прокариотические последовательности, кДНК из мРНК, последовательности геномной ДНК и даже синтетические последовательности ДНК. Если кодирующая последовательность предназначена для экспрессии в эукариотической клетке, сигнал полиаденилирования и последовательность терминации транскрипции будут обычно находиться 3' от кодирующей последовательности.

«Открытая рамка считывания» - ORF в сокращенном виде относится к куску последовательности нуклеиновой кислоты, или ДНК, кДНК, или РНК, который включает инициирующий трансляцию сигнал или инициирующий кодон, такой как ATG или AUG, и стоп-кодон и может потенциально транслироваться в полипептидную последовательность.

Термин «нижележащая» относится к нуклеотидной последовательности, которая находится 3' от ссылочной нуклеотидной последовательности. В частности, нижележащие нуклеотидные последовательности в основном относятся к последовательностям, идущим за точкой начала транскрипции. Например, инициирующий трансляцию кодон гена находится ниже места начала транскрипции.

Термин «вышележащая» относится к нуклеотидной последовательности, которая находится 5' от ссылочной нуклеотидной последовательности. В частности, вышележащие нуклеотидные последовательности в основном относятся к последовательностям, находящимся с 5' стороны кодирующей последовательности или точки начала транскрипции. Например, большинство промоторов расположено выше места начала транскрипции.

«Гомологичная рекомбинация» относится к вставке последовательности чужеродной ДНК в другую молекулу ДНК, например, вставке вектора в хромосому. Предпочтительно вектор выявляет специфический сайт на хромосоме для гомологичной рекомбинации. Для специфической гомологичной рекомбинации вектор будет содержать достаточно длинные районы гомологии с последовательностями на хромосоме для того, чтобы сделать возможным комплементарное связывание и включение вектора в хромосому. Более длинные районы гомологии и большие степени схожести последовательностей могут увеличить эффективность гомологичной рекомбинации.

Вектор относится к любой системе для клонирования и/или переноса нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина. Вектор может быть репликоном, к которому присоединен другой сегменту ДНК для того, чтобы вызывать репликацию прикрепленного сегмента. «Репликон» относится к любому генетическому элементу (например, плазмиде, фагу, космиде, хромосоме, вирусу), который функционирует в виде автономной единицы репликации ДНК in vivo, т.е. способному к репликации под своим собственным контролем. Термин «вектор» включает и вирусные, и невирусные системы для введения нуклеиновой кислоты в клетку in vitro, ex vivo или in vivo. Большое число векторов, известных в данной области техники, можно использовать для манипулирования нуклеиновыми кислотами, включения ответных элементов и промоторов в гены, т.п. Возможные векторы включают, например, плазмиды или модифицированные вирусы, включающие, например, аденовирус, ретровирус, аденоассоциированный вирус, герпесвирус, или плазмиды, такие как производные плазмид pBR322 или pUC, или вектор Bluescript. Например, встраивание фрагментов ДНК, соответствующих ответным элементам или промоторам, в подходящий вектор может быть выполнено с помощью лигирования соответствующих фрагментов ДНК с выбранным вектором, который имеет комплементарные «липкие» концы. Альтернативно, концы молекул ДНК могут быть ферментативно модифицированы, или может быть продуцирован любой сайт с помощью лигирования нуклеотидных последовательностей (линкеров) с концами ДНК. Такие векторы можно сконструировать так, чтобы они содержали гены селектируемых маркеров, которые обеспечивают отбор клеток, которые включили маркер в клеточный геном. Такие маркеры позволяют идентифицировать и/или отобрать клетки-хозяев, которые включают и экспрессируют белки, кодируемые таким маркером.

Вирусные векторы были использованы в широком выборе применений доставки генов в клетки, а также субъектам живым животным. Вирусные векторы, которые могут использоваться, включают, но без ограничения, векторы на основе аденовируса, ретровируса, вируса коровьей оспы, поксвируса, аденоассоциированного вируса, вируса простого герпеса, лентивируса, бакуловируса, вируса Сендай, вируса кори, вируса обезьяны 40 и вируса Эпштейна-Барра. Невирусные векторы включают плазмиды, липоплексы (комплекс катионная липосома-ДНК), полиплексы (комплекс катионный полимер-ДНК) и комплексы белок-ДНК. Помимо нуклеиновой кислоты вектор может также включать один или несколько регуляторных районов и/или селектируемых маркеров, используемых для отбора, измерения и контролирования результатов переноса нуклеиновых кислот (переноса в какие ткани, продолжительности экспрессии и т.п.).

Термин «плазмида» относится к внехромосомному элементу, часто несущему ген, который не является частью основного метаболизма клетки, и обычно находящемуся в форме кольцевых двухцепочечных молекул ДНК. Такие элементы могут быть автономно реплицирующимися последовательностями, интегрирующимися в геном последовательностями, фаговыми или нуклеотидными последовательностями, линейными, кольцевыми или суперскрученными, одноцепочечной или двухцепочечной ДНК или РНК, происходящей из любого источника, в которых ряд нуклеотидных последовательностей были составлены и перекомпонованы в уникальную конструкцию, которая способна к введению фрагмента промотора и последовательность ДНК для выбранного продукта гена вместе с соответствующей 3' нетранслируемой последовательностью в клетку.

«Вектор для клонирования» относится к «репликону, который является единичным куском нуклеиновой кислоты, предпочтительно ДНК, который реплицируется последовательно и который включает начало репликации, такому как плазмида, фаг или космида, к которому может быть присоединен другой сегмент нуклеиновой кислоты для того, чтобы вызывать репликацию присоединенного сегмента. Векторы для клонирования могут быть способны к репликации в одном типе клеток и экспрессии в другом типе клеток («челночный вектор»). Векторы для клонирования могут включать одну или несколько последовательностей, которые могут использоваться для отбора клеток, включающих вектор, и/или один или нескольких сайтов для множественного клонирования для введения представляющих интерес последовательностей.

Термин «экспрессионный вектор» относится к вектору, плазмиде или системе, сконструированным так, чтобы сделать возможной экспрессию встроенной последовательности нуклеиновой кислоты после трансформации хозяина. Клонируемый ген, т.е. встраиваемую последовательность нуклеиновой кислоты, обычно помещают под контроль контролирующих элементов, таких как промотор, минимальный промотор, энхансер или подобные. Контролирующие инициацию районы или промоторы, которые применимы для управления экспрессией нуклеиновой кислоты в желаемой клетке-хозяине, являются многочисленными и давно известны квалифицированным в данной области техники специалистам. В экспрессионном векторе можно использовать фактически любой промотор, способный к управлению экспрессией этих генов, включающий, но без ограничения, вирусные промоторы, бактериальные промоторы, промоторы животных, промоторы млекопитающих, синтетические промоторы, конститутивные промоторы, тканеспецифические промоторы, связанные с патогенезом или заболеванием промоторы, связанные с развитием специфические промоторы, индуцибельные промоторы, светорегулируемые промоторы; в том числе, без ограничения, район раннего промотора SV40, промотор, содержащийся в 3' длинном концевом повторе (LTR) вируса саркомы Рауса, Е1А или основной поздний промотор (MLP) аденовирусов (Ad), непосредственно ранний промотор цитомегаловируса человека (HCMV), промотор тимидинкиназы (TK) вируса простого герпеса (HSV), промотор IE1 бакуловируса, промотор фактора 1 альфа элонгации (EF1), промотор глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (GAPDH), промотор фосфоглицераткиназы (PGK), промотор убиквитина С (Ubc), промотор альбумина, регуляторные последовательности промотора металлотионеина-L мыши и контролирующие его транскрипцию районы, убиквитарные промоторы (HPRT, виментина, β-актина, тубулина и подобных), промоторы промежуточных микрофиламентов (десмина, нейрофиламентов, кератина, GFAP и подобных), промоторы терапевтических генов (MDR, CFTR или фактора типа VIII и подобных), связанные с патогенезом или заболеванием промоторы и промоторы, которые проявляют специфичность в отношении ткани и использовались у трансгенных животных, такие как контролирующий район гена эластазы I, который является активным в панкреатических ацинарных клетках; контролирующий район гена инсулина, активный в панкреатических бета-клетках, контролирующий район гена иммуноглобулина, активный в лимфоидных клетках, контролирующий район вируса опухоли молочной железы мыши, активный в клетках яичка, молочной железы, лимфоидных и тучных клетках, контролирующие районы гена альбумина, Apo AI и Apo AII, активные в печени, контролирующий район гена альфа-фетопротеина, активный в печени, контролирующий район гена альфа 1-антитрипсина, активный в печени, контролирующий район гена бета-глобулина, активный в миелоидных клетках, контролирующий район гена основного белка миелина, активный в олигодендроцитах в головном мозге, контролирующий район гена легкой цепи-2 миозина, активный в скелетной мышце, и контролирующий район гена гонадотропного рилизинг-гормона, активный в гипоталамусе, промотор пируваткиназы, промотор виллина, промотор связывающего жирные кислоты кишечного белка, промотор β-актина гладкомышечных клеток и подобные. Кроме того, эти последовательности для экспрессии можно модифицировать путем добавления энхансера или регуляторных последовательностей и подобных.

Экспрессионные векторы, сконструированные, как описано выше, затем вводят субъекту в форме фармацевтической композиции. Две или более изоформ HGF можно вводить порознь, или последовательно, или в одно и то же время, т.е. вводить совместно; можно вводить или совместно вводить отдельные плазмиды для двух или более изоформ HGF, или можно вводить единственную экспрессионную плазмиду, содержащую гены для двух или более изоформ HGF и способную к экспрессии генов для двух или более изоформ HGF. Например, две изоформы flHGF и dHGF можно вводить, используя две отдельные плазмиды. Альтернативно, две отдельные плазмиды, содержащие гены для flHGF и dHGF, можно использовать для совместного введения. В конце концов, можно вводить единственную экспрессионную плазмиду, содержащую гены для и flHGF, и dHGF. В определенных аспектах настоящего изобретения flHGF и dHGF на единственной экспрессионной плазмиде кодируются одним и тем же полинуклеотидом или отдельными полинуклеотидами. Для включения более чем одного полинуклеотида, способного к экспрессии изоформы HGF, в единственную плазмиду существует ряд подходов. Они включают, например, использование последовательностей внутренних участков посадки рибосомы (IRES), спаренных промоторов/экспрессионных кассет и слитых белков. Две или более изоформ, экспрессируемых с одной и той же плазмиды или на двух отдельных плазмидах, обсуждаемых выше, выбирают из группы, состоящей из flHGF, dHGF, NK1 и NK2, или выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-5 и 11-12. Две или более изоформ могут также включать дополнительные изоформы HGF, известные специалисту со средним уровнем компетентности в данной области техники.

Векторы можно вводить в желаемые клетки-хозяева с помощью способов, известных в данной области техники, например инъекции, трансфекции, электропорации, микроинъекции, трансдукции, клеточного слияния, липофекции, использования генной пушки или транспортера ДНК-вектора (см., например, Wu et al., J. Biol. Chem. 267: 963 (1992), Wu et al., J. Biol. Chem. 263: 14621 (1988) и Hartmut et al., заявка на патент Канады №20123311).

Полинуклеотид в соответствии с настоящим изобретением можно также вводить in vivo с помощью липофекции. В течение последнего десятилетия наблюдалось увеличение использования липосом для инкапсуляции и трансфекции нуклеиновых кислот in vivo. Для приготовления липосом для in vivo трансфекции гена можно использовать синтетические катионные липиды, предназначенные для ограничения затруднений и рисков, встречаемых при использованием опосредованной липосомами трансфекции (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84: 7413 (1987); Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8027 (1988) и Ulmer et al., Science 259: 1745 (1993)). Использование катионных липидов может содействовать инкапсуляции отрицательно заряженных нуклеиновых кислот и также способствовать слиянию с отрицательно заряженными клеточными мембранами (Felgner et al., Science 337: 387 (1989)). Особенно используемые липидные соединения и композиции для переноса нуклеиновых кислот описываются в WO95/18863, WO96/17823 и в патенте США №5459127. Использование липофекции для введения экзогенных генов в специфические органы in vivo имеет определенные практические преимущества. Молекулярная нацеленность липосом на специфические клетки представляет одну сторону преимущества. Очевидно, что нацеленность трансфекции на конкретные типы клеток могла бы быть особенно предпочтительной в ткани с клеточной гетерогенностью, такой как поджелудочная железа, печень, почка и головной мозг. С целью нацеленности липиды можно химически соединить с другими молекулами (Mackey et al. 1988, выше). Нацеленные пептиды, например, гормоны или нейромедиаторы, и белки, такие как антитела, или непептидные молекулы, могли бы быть соединены с липосомами химически.

Другие молекулы, такие как катионный олигопептид (например, WO95/21931), пептиды, происходящие из ДНК-связывающих белков (например, WO96/25508), или катионный полимер (например, WO95/21931), также применимы для способствования трансфекции нуклеиновой кислоты in vivo.

Также можно ввести вектор in vivo в виде «голой» ДНК-плазмиды (см., патенты США №5693622, 5589466 и 5580859). Можно также использовать способы опосредованной рецепторами доставки ДНК (Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3: 147 (1992) и Wu et al., J. Biol. Chem. 262: 4429 (1987)).

Термин «трансфекция» относится к захвату экзогенной или гетерологичной РНК или ДНК клеткой. Клетка была «трансфецирована» экзогенной или гетерологичной РНК или ДНК, когда такая РНК или ДНК была введена внутрь клетки. Клетка была «трансформирована» экзогенной или гетерологичной РНК или ДНК, когда трансфецированная РНК или ДНК вызывает фенотипическое изменение. Трансформирующая РНК или ДНК может интегрироваться (ковалентно связываться) в хромосомную ДНК, составляющую геном клетки.

«Трансформация» относится к переносу фрагмента нуклеиновой кислоты в организм хозяина, приводящему к генетически устойчивому наследованию. Организмы хозяев, содержащие трансформированные фрагменты нуклеиновых кислот, именуют «трансгенными», или «рекомбинантными», или «трансформированными» организмами.

Кроме того, рекомбинантный вектор, включающий полинуклеотид, может включать одно или несколько начал репликации в клеточных хозяевах, в которых их амплификация или их экспрессия является желательной, маркеры или селектируемые маркеры.

Термин «селектируемый маркер» относится к идентифицирующему фактору, обычно гену устойчивости к антибиотику или химической устойчивости, отбор которого можно провести на основе эффекта маркерного гена, т.е. устойчивости к антибиотику, устойчивости к гербициду, колометрических маркеров, ферментов, флуоресцентных маркеров и подобных, причем эффект используют для прослеживания наследования представляющей интерес нуклеиновой кислоты и/или идентификации клетки или организма, которые унаследовали представляющую интерес нуклеиновую кислоту. Примеры генов селектируемых маркеров, известных и используемых в данной области техники, включают гены, обеспечивающие устойчивость к ампициллину, стрептомицину, гентамицину, канамицину, гигромицину, биалафосу, гербициду, сульфаниламиду и подобным, и гены, которые используются в качестве фенотических маркеров, т.е. регулируемые антоцианинами гены, ген изопентанилтрансферазы и подобные.

Термин «репортерный ген» относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей идентифицирующий фактор, который можно идентифицировать на основе эффекта репортерного гена, причем эффект используют для прослеживания наследования представляющей интерес нуклеиновой кислоты, идентификации клетки или организма, которые унаследовали представляющую интерес нуклеиновую кислоту, и/или измерения индукции экспрессии или транскрипции гена. Примеры репортерных генов, известных и используемых в данной области техники, включают люциферазу (Luc), зеленый флуоресцентный белок (GFP), хлорамфеникол-ацетилтрансферазу (САТ), β-галактозидазу (LacZ), β-глюкуронидазу (Gus) и подобные. Гены селектируемых маркеров могут также считаться репортерными генами.

«Промотор» и «промоторная последовательность» используются взаимозаменяемо и относятся к последовательности ДНК, способной к контролированию экспрессии кодирующей последовательности или функциональной РНК. Как правило, кодирующая последовательность находится 3' от промоторной последовательности. Промоторы могут происходить в своей целостности из природного гена или быть составлены из различных элементов, происходящих из различных промоторов, обнаруживаемых в природе, или даже включать сегменты синтетической ДНК. Квалифицированным в данной области техники специалистам понятно, что различные промоторы могут управлять экспрессией гена в различных тканях или типах клеток, или на различных стадиях развития, или в ответ на различные условия окружающей среды или физиологические условия. Промоторы, вызывающие экспрессию гена в большинстве типов клеток в большинстве периодов времени, обычно именуют «конститутивными промоторами». Промоторы, которые вызывают экспрессию гена в специфическом типе клеток, обычно именуют «клеточноспецифическими» или «тканеспецифическими» промоторами. Промоторы, которые вызывают экспрессию гена на специфической стадии развития или клеточной дифференциации, обычно именуют «специфичными в отношении развития промоторами» или «специфичными в отношении клеточной дифференциации промоторами». Промоторы, которые индуцируются и вызывают экспрессию гена после воздействия или обработки клетки агентом, биологической молекулой, химическим веществом, лигандом, светом и подобными, которые индуцируют промотор, обычно именуют «индуцибельными промоторами» или «регулируемыми промоторами». Дополнительно признается, что, поскольку в большинстве случаев точные границы регуляторных последовательностей не вполне определены, фрагменты ДНК различных длин могут иметь одинаковую промоторную активность.

Промоторная последовательность обычно ограничена на своем 3' конце местом инициации транскрипции и простирается выше (в 5' направлении) с включением минимального числа оснований или элементов, необходимых для инициации транскрипции на уровнях, определяемых выше фона. Внутри промоторной последовательности будут обнаруживаться место инициации транскрипции (подходящим образом определяемое, например, с помощью картирования с использованием нуклеазы S1), а также белоксвязывающие домены (консенсусные последовательности), ответственные за связывание РНК-полимеразы.

Кодирующая последовательность находится «под контролем» контролирующих транскрипцию и трансляцию последовательностей в клетке, когда РНК-полимераза транскрибирует кодирующую последовательность в мРНК, которая затем подвергается сплайсингу поперек РНК (если кодирующая последовательность содержит интроны) и транслируется в белок, кодируемый кодирующей последовательностью.

«Контролирующие транскрипцию и трансляцию последовательности» относятся к регуляторным последовательностям ДНК, таким как промоторы, энхансеры, терминаторы и подобные, которые обеспечивают экспрессию кодирующей последовательности в клетке-хозяине. В эукариотических клетках сигналы полиаденилирования являются контролирующими последовательностями.

Термин «ответный элемент» относится к одному или нескольким действующим в цис-положении элементам ДНК, которые придают промотору способность к реагированию, опосредуемую через взаимодействие с ДНК-связывающими доменами транскрипционного фактора. Этот элемент ДНК может быть или палиндромным (совершенным или несовершенным) по своей последовательности, или состоять из мотивов последовательности или неполных сайтов, разделенных переменным числом нуклеотидов. Неполные сайты могут быть схожими или идентичными и упорядочены в виде или прямых, или инвертированных повторов или в виде одного частичного сайта или мультимеров примыкающих один к другому частичных сайтов. Ответный элемент может включать минимальный промотор, выделенный из различных организмов в зависимости от природы клетки или организма, в которые будет включен ответный элемент. ДНК-связывающий домен транскрипционного фактора связывается, в присутствии или в отсутствие лиганда, с ДНК-последовательностью ответного элемента с инициацией или подавлением транскрипции нижележащего гена(ов), регулируемого этим ответным элементом.

Термин «функционально связанные» относится к такому соединению последовательностей нуклеиновых кислот в одном фрагменте нуклеиновой кислоты, что на функционирование одной последовательности оказывает влияние другая. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, когда он способен влиять на экспрессию этой кодирующей последовательности (т.е. кодирующая последовательность находится под транскрипционным контролем промотора). Кодирующие последовательности могут быть функционально связаны с регуляторными последовательностями в смысловой или антисмысловой ориентации.

Используемый здесь термин «экспрессия» относится к транскрипции и устойчивому накоплению смысловой (мРНК) или антисмысловой РНК, получаемой из нуклеиновой кислоты или полинуклеотида. Экспрессия может также относиться к трансляции мРНК в белок или полипептид.

Термины «кассета», «экспрессионная кассета» и «кассета для экспрессии гена(ов)» относятся к сегменту ДНК, который может быть встроен в нуклеиновую кислоту или полинуклеотид в специфических рестрикционных сайтах или путем гомологичной рекомбинации. Сегмент ДНК включает полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес полипептид, и кассету и рестрикционные сайты конструируют так, чтобы обеспечить вставку кассеты в правильной рамке считывания для транскрипции и трансляции. «Кассета для трансформации» относится к специфическому вектору, включающему полинуклеотид, который кодирует представляющий интерес полипептид, и имеющему, помимо полинуклеотида, элементы, которые содействуют трансформации конкретной клетки-хозяина. Кассеты, экспрессионные кассеты, кассеты для экспрессии гена(ов) и кассеты для трансформации могут также включать элементы, которые позволяют усилить экспрессию полинуклеотида, кодирующего представляющий интерес полипептид в клетке-хозяине. Эти элементы могут включать, но без ограничения, промотор, минимальный промотор, энхансер, ответный элемент, последовательность терминатора, последовательность полиаденилирования и подобные.

Термин «выключатель гена» относится к комбинации ответных элементов, связанных с промотором, и основанной на лиганд-зависимых транскрипционных факторах системы, которая, в присутствии одного или нескольких лигандов, модулирует экспрессию гена, в который включены ответный элемент и промотор.

Термин «модулируют» и «модулирует» имеют значение индуцируют, уменьшают или ингибируют экспрессию нуклеиновой кислоты или гена, приводя к соответствующей индукции, уменьшению или ингибированию продукции белка или полипептида.

Энхансеры, которые могут использоваться в вариантах осуществления настоящего изобретения, включают, но без ограничения, энхансер SV40, энхансер цитомегаловируса (CMV), энхансер фактора 1 элонгации (EF1), энхансеры дрожжей, энхансеры вирусных генов и подобные.

Контролирующие терминацию районы, т.е. последовательности терминаторов или полиаденилирования, могут также происходить из различных генов, встречающихся в природе в предпочтительных хозяевах. По желанию, сайт терминации может быть ненужным, однако наиболее предпочтительно, если он включен. В одном варианте осуществления настоящего изобретения контролирующий терминацию район может быть в составе или происходить из синтетической последовательности, синтетического сигнала полиаденилирования, позднего сигнала полиаденилирования SV40, сигнала полиаденилирования SV40, сигнала полиаденилирования бычьего гормона роста (BGH), последовательностей вирусных терминаторов или подобных.

Термины «3' некодирующие последовательности» или «3' нетранслируемый район (UTR)» относятся к последовательностям ДНК, лежащим ниже (3') кодирующей последовательности, и могут включать определяющие полиаденилирование [поли(А)] последовательности и другие последовательности, кодирующие регуляторные сигналы, способные оказывать влияние на процессирование мРНК или экспрессию гена. Сигнал полиаденилирования обычно характеризуется действием на добавление участков полиадениловой кислоты к 3' концу предшественника мРНК.

«Регуляторный район» относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая регулирует экспрессию второй последовательности нуклеиновой кислоты. Регуляторный район может включать последовательности, которые в природе ответственны за экспрессию конкретной нуклеиновой кислоты (гомологичный район), или может включать последовательности отличного происхождения, которые ответственны за экспрессию других белков или даже искусственных белков (гетерологичный район). В частности, последовательностями могут быть последовательности прокариотических, эукариотических или вирусных генов или производные последовательности, которые стимулируют или подавляют транскрипцию гена специфическим или неспецифическим образом и индуцибельным или неиндуцибельным образом. Регуляторные районы включают начала репликации, сайты сплайсинга РНК, промоторы, энхансеры, последовательности для терминации транскрипции и сигнальные последовательности, которые направляют полипептид по секреторным путям клетки-мишени.

Регуляторный район из «гетерологичного источника» относится к регуляторному району, который в природе не связан с экспрессируемой нуклеиновой кислотой. В группу гетерологичных регуляторных районов включены регуляторные районы из отличных видов, регуляторные районы из отличных генов, гибридные регуляторные последовательности и регуляторные последовательности, которые не встречаются в природе, но которые сконструированы специалистом со средним уровнем компетентности в данной области техники.

«РНК-транскрипт» относится к продукту, являющемуся результатом катализируемой РНК-полимеразой транскрипции последовательности ДНК. Когда РНК-транскрипт является полностью комплементарной копией последовательности ДНК, его именуют первичным транскриптом, или он может быть последовательностью РНК, полученной в результате посттрансляционного процессирования первичного транскрипта, и именуется зрелой РНК. «Информационная РНК (мРНК)» относится к РНК без интронов, которая может транслироваться клеткой в белок. «кДНК» относится к двухцепочечной ДНК, которая является комплементарной мРНК и является ее производной. «Смысловая» РНК относится к РНК-транскрипту, который включает мРНК и, значит, может транслироваться клеткой в белок. «Антисмысловая РНК» относится к РНК-транскрипту, который комплементарен всей мишени - РНК-транскрипту или мРНК или ее части и который блокирует экспрессию гена-мишени. Антисмысловая РНК может быть комплементарна любой части транскрипта конкретного гена, т.е. 5' некодирующей последовательности, 3' некодирующей последовательности или кодирующей последовательности. «Функциональная РНК» относится к антисмысловой РНК, рибозимной РНК или другой РНК, которая не транслируется, однако оказывает эффект на клеточные процессы.

«Полипептид», «пептид» и «белок» используются взаимозаменяемо и относятся к полимерному соединению, составленному из ковалентно связанных аминокислотных остатков.

«Выделенный полипептид», «выделенный пептид» или «выделенный белок» относятся к полипептиду или белку, который в значительной степени свободен от тех соединений, с которыми он обычно связан в своем природном состоянии (например, других белков или полипептидов, нуклеиновых кислот, углеводов, липидов). Не подразумевается, что «выделенный» исключает искусственные или синтетические смеси с другими соединениями или присутствие примесей, которые не вносят помехи в биологическую активность и которые могут присутствовать, например, вследствие неполной очистки, добавления стабилизаторов или составления в фармацевтически приемлемый препарат.

Мутация может быть произведена любым методом мутагенеза, известным в данной области техники, включающим, но без ограничения, in vitro сайт-направленный мутагенез (Hutchinson et al., J. Biol. Chem. 253: 6551 (1978); Zoller et al., DNA 3: 479 (1984); Oliphant et al., Gene 44: 177 (1986); Hutchinson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 710 (1986)); использование линкеров TAB® (Pharmacia); расщепление эндонуклеазами рестрикции/делецию и замену фрагмента, ПЦР-опосредованный мутагенез с использованием олигонуклеотидов и подобные. Для сайт-направленного мутагенеза предпочтительными являются методы на основе ПЦР (см. Higuchi, 1989, “Using PCR to Engineer DNA” в PCR Technology: Principles and Applications for DNA Applications, H. Erlich, ed. Stockton Press, Chapter 6, pp. 61-70).

«Вариант» полипептида или белка относится к любому аналогу, фрагменту, производному или мутанту, происходящему из полипептида или белка и сохраняющему по крайней мере одно биологическое свойство полипептида или белка. В природе могут существовать различные варианты полипептида или белка. Эти варианты могут быть аллельными вариантами, характеризующимися различиями в нуклеотидных последовательностях структурного гена, кодирующего белок, или в их образование может быть вовлечен дифференциальный сплайсинг или посттрансляционная модификация. Квалифицированный специалист может получить варианты, имеющие одну или множество аминокислотных замен, делеций, добавлений или перестановок. Эти варианты могут включать, в числе других, (а) варианты, в которых один или несколько аминокислотных остатков заменены консервативными или неконсервативными аминокислотами, (b) варианты, в которых одна или несколько аминокислот добавлены к полипептиду или белку, (с) варианты, в которых одна или несколько аминокислот включает замещающую группу, и (d) варианты, в которых полипептид или белок слит с другим полипептидом, таким как сывороточный альбумин. Специалистам со средним уровнем компетентности в данной области техники известны методы получения этих вариантов, включающие генетические (супрессии, делеции, мутации и т.п.), химические и ферментативные методы.

Термин «гомология» относится к проценту идентичности между двумя полинуклеотидными или двумя полипептидными составляющими. Соответствие между последовательностью одной составляющей другой можно определить с помощью методов, известных в данной области техники. Например, гомологию можно определить с помощью прямого сравнения данных о последовательностях между двумя полипептидными молекулами путем совмещения данных о последовательностях и использования легкодоступных компьютерных программ. Альтернативно, гомологию можно определить с помощью гибридизации полинуклеотидов в условиях, при которых образуются прочные дуплексы между гомологичными районами, с последующим расщеплением специфичными в отношении одноцепочечных участков нуклеазами(ой) и определением размера расщепленных фрагментов.

Используемый здесь термин «гомологичный» во всех его грамматических формах и орфографических вариантах относится к родству между белками, которые обладают «общим эволюционным происхождением», включающими белки из суперсемейств (например, суперсемейства иммуноглобулинов) и гомологичные белки из различных видов (например, легкую цепь миозина и т.п.) (Reeck et al., Cell 50: 667 (1987)). Такие белки (и кодирующие их гены) имеют гомологию последовательностей, отражаемую высокой степенью схожести их последовательностей. Однако при обычном употреблении и в настоящей заявке термин «гомологичный», после модификации таким наречием, как «высоко» (в высокой степени), может относиться к схожести последовательностей, а не к общему эволюционному происхождению.

Соответственно, термин «схожесть последовательностей» во всех его грамматических формах относится к степени идентичности или соответствия между последовательностями нуклеиновых кислот иди аминокислотными последовательностями белков, которые могут иметь или могут не иметь общее эволюционное происхождение (см. Reeck et al., Cell 50: 667 (1987)). В одном варианте осуществления две последовательности ДНК «в значительной степени гомологичны» или «в значительной степени схожи», когда по крайней мере 50% (например, по крайней мере приблизительно 75%, 90% или 95%) нуклеотидов совпадают на протяжении определенной длины последовательностей ДНК. Последовательности, которые в значительной степени гомологичны, можно идентифицировать путем сравнения, используя стандартное программное обеспечение, последовательностей, имеющихся в банных данных, касающихся последовательностей, или в эксперименте гибридизации по Саузерну, например, в жестких условиях, определенных для конкретной системы. Определение соответствующих условий гибридизации не выходит за рамки знаний в данной области техники (см., например, Sambrook et al., 1989, выше).

Как здесь используется, термин «в значительной степени схожие» относится к фрагментам нуклеиновых кислот, в которых замена одного или нескольких нуклеотидных оснований приводит к замене одной или нескольких аминокислот, но не оказывает влияния на функциональные свойства белка, кодируемого последовательностью ДНК. Термин «в значительной степени схожие» также относится к фрагментам нуклеиновых кислот, в которых замена одного или нескольких нуклеотидных оснований не оказывает влияния на способность фрагмента нуклеиновой кислоты к опосредованию изменения экспрессии гена антисмысловым способом или способом косупрессии. Термин «в значительной степени схожие» также относится к модификациям фрагментов нуклеиновых кислот настоящего изобретения, таким как делеция или вставка одного или нескольких нуклеотидных оснований, которые не оказывают значительного влияния на функциональные свойства результирующего транскрипта. Поэтому понятно, что настоящим изобретением охватываются более чем конкретные, приводимые в качестве примеров последовательности. Каждая предлагаемая модификация не выходит за рамки обычных знаний в данной области техники, как и определение сохранения биологической активности у кодируемых продуктов.

Кроме того, квалифицированному специалисту понятно, что в значительной степени схожие последовательности, охватываемые этим изобретением, также определяются по их способности к гибридизации, в жестких условиях (0,1X SSC, 0,1% SDS, 65°C и с промывкой 2X SSC, 0,1% SDS, а затем 0,1X SSC, 0,1% SDS), с последовательностями, приводимыми здесь в качестве примеров. В значительной степени схожими фрагментами нуклеиновых кислот настоящего изобретения являются такие фрагменты нуклеиновых кислот, ДНК-последовательности которых идентичны на по крайней мере приблизительно 70%, 80%, 90% или 95% ДНК-последовательности фрагментов нуклеиновых кислот, сообщаемых здесь.

Две аминокислотные последовательности являются «в значительной степени гомологичными» или «в значительной степени схожими», когда более чем приблизительно 40% аминокислот являются идентичными, или более чем 60% аминокислот являются схожими (функционально идентичными). Предпочтительно схожие или гомологичные последовательности идентифицируют с помощью совмещения, используя, например, программу группы GCG (Genetics Computer Group, Руководство по работе с набором программ GCG, версии 7, Madison, Wisconsin).

Термин «соответствующие», как здесь используется, относится к схожим или гомологичным последовательностям, независимо от того, является ли точное положение идентичным или отличным от молекулы, по отношению к которой определяют схожесть или гомологию. Совмещение последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислотных последовательностей может включать пробелы. Следовательно, термин «соответствующие» относится к схожести последовательностей, а не к нумерации аминокислотных остатков или нуклеотидных оснований.

«Существенная часть» аминокислотной или нуклеотидной последовательности включает такую часть аминокислотной последовательности полипептида или нуклеотидной последовательности гена, которая является достаточной для предполагаемой идентификации этого полипептида или гена, или с помощью мануальной оценки последовательности квалифицированным в данной области техники специалистом, или с помощью компьютерно-автоматизированного сравнения и идентификации последовательностей, используя такие алгоритмы, как BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403 (1993), имеющийся на сайте ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Как правило, последовательность из десяти или более следующих друг за другом аминокислот или тридцати или более нуклеотидов необходима для предполагаемой идентификации последовательности полипептида или нуклеиновой кислоты в качестве последовательности, гомологичной известному белку или гену. Кроме того, что касается нуклеотидных последовательностей, геноспецифические олигонуклеотидные зонды, включающие 20-30 следующих друг за другом нуклеотидов, можно использовать в зависимых от последовательностей способах идентификации (например, при гибридизации по Саузерну) и выделения гена (например, при in situ гибридизации бактериальных колоний или бактериофаговых бляшек). Кроме того, короткие олигонуклеотиды из 12-15 оснований можно использовать в качестве праймеров для амплификации в ПЦР для получения конкретного фрагмента нуклеиновой кислоты, включающего праймеры. Соответственно, «существенная часть» нуклеотидной последовательности включает часть последовательности, достаточную для специфической идентификации и/или выделения фрагмента нуклеиновой кислоты, включающего эту последовательность.

Термин «идентичность в процентах», известный в данной области техники, представляет собой связь между двумя или более полинуклеотидными последовательностями или двумя или более полинуклеотидными последовательностями, определяемую с помощью сравнения последовательностей. В данной области техники «идентичность» также означает степень связанности полипептидных или полинуклеотидных последовательностей, в зависимости от конкретной ситуации, определяемую по совпадению между цепочками таких последовательностей. «Идентичность» и «схожесть» можно без труда рассчитать с помощью известных способов, включающих, но без ограничения, способы, описанные в Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D.W., ed.) Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds.) Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, New York (1991). Предпочтительные способы определения идентичности разработаны для предоставления наибольшего совпадения между проверяемыми последовательностями. Способы определения идентичности и схожести подвергнуты кодификации в общедоступных компьютерных программах. Совмещения последовательностей и расчеты идентичности в процентах можно выполнить, используя программное обеспечение для анализа последовательностей, такое как программу Megalign системы обработки биоинформационных данных LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI). Множественное совмещение последовательностей можно выполнить, используя способ совмещения Clustal (Higgins et al., CABIOS. 5: 151 (1989)) с параметрами по умолчанию (штраф за пропуск в последовательности = 10, штраф за длину пропуска = 10). Могут быть выбраны параметры по умолчанию для попарных совмещений, используя способ Clustal: длина слова = 1, штраф за пропуск = 2, окно = 5 и сохраняемые диагонали = 5.

Термин «программное обеспечение для анализа последовательностей» относится к любому алгоритму для вычислительной машины или программе программного обеспечения, которые применимы для анализа нуклеотидных или аминокислотных последовательностей. «Программное обеспечение для анализа последовательностей» может иметься в продаже или быть независимо разработано. Обычное программное обеспечение для анализа последовательностей включает, но без ограничения, набор программ GCG (пакет Wisconsin, версии 9,0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI), BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403 (1990)) и DNASTAR (DNASTAR, Inc. 1228 S. Park St. Madison, WI 53715, США). Будет понятно в контексте этой заявки, что, если программное обеспечение для анализа последовательностей используется для анализа, результаты анализа будут основываться на «значениях по умолчанию» ссылочной программы, кроме особо оговоренных случаев. Как здесь используются, «значения по умолчанию» будут означать любую совокупность значений или параметров, которые изначально загружаются с программным обеспечением после его первого инициирования.

Термин «химически синтезированная», имеющий отношение к последовательности ДНК, означает, что составные нуклеотиды собраны in vitro. Мануальный химический синтез ДНК можно выполнить, используя прочно установившиеся способы, или автоматизированный химический синтез можно выполнить, используя одно из ряда имеющихся в продаже устройств. Соответственно, гены могут быть специально адаптированы для оптимальной экспрессии гена на основе оптимизации нуклеотидной последовательности для отражения сдвига частот использования кодонов в клетке-хозяине. Квалифицированный специалист оценит вероятность эффективной экспрессии гена, если использование кодонов сдвинуто в сторону кодонов, преимущественных у хозяина. Определение предпочтительных кодонов может быть основано на исследовании генов, происходящих из клетки-хозяина, если имеются касающиеся последовательностей данные.

Термин «экзогенный ген» означает ген, чужеродный для субъекта, т.е. ген, который вводят субъекту через процесс трансформации, немутированный вариант эндогенного мутированного гена или мутированный вариант эндогенного немутированного гена. Способ трансформации не является важным для этого изобретения и может быть любым подходящим для субъекта способом, известным в данной области техники. Экзогенные гены могут быть или природными, или синтетическими генами, которые вводят субъекту в форме ДНК или РНК, которая может функционировать через промежуточный ДНК-продукт, например, с помощью обратной транскриптазы. Такие гены можно ввести в клетки-мишени, непосредственно ввести субъекту или опосредованного ввести субъекту с помощью переноса трансформированных клеток.

Термин «субъект» означает интактное животное, предпочтительно позвоночное, наиболее предпочтительно млекопитающее.

Термин «изоформа HGF» относится к любому полипептиду HGF, имеющему аминокислотную последовательность, которая идентична на по крайней мере 80% (например, по крайней мере 90% или 95%) аминокислотной последовательности HGF, которая природно образуется у животного, в том числе всем аллельным вариантам. В одном варианте осуществления термин относится к изоформам, о которых известно, что они обладают способностью к вызову пролиферации клеток. Изоформы HGF включают, без ограничения, flHGF, dHGF, NK1, NK2 и NK4.

Термин «flHGF» относится к полноразмерному белку HGF животного, например, млекопитающего, например, аминокислотам 1-728 HGF человека.

Термин «dHGF» относится к варианту белка HGF с делецией, образуемому при альтернативном сплайсинге гена HGF у животного, например, млекопитающего, например, HGF человека, состоящему из 723 аминокислот, с делецией пяти аминокислот в первом домене «двойная петля» альфа-цепи (F, L, P, S и S) из полноразмерной последовательности HGF.

Термин «NK1» относится к изоформе HGF животного, например, млекопитающего, например, человека, состоящей из доменов: N-концевая «петля-шпилька» и «двойная петля» 1.

Термин «NK2» относится к изоформе HGF животного, например, млекопитающего, например, человека, состоящей из доменов: N-концевая «петля-шпилька», «двойная петля» 1 и «двойная петля» 2.

Термин NK4 относится к изоформе HGF животного, например, млекопитающего, например, человека, состоящей из доменов: N-концевая «петля-шпилька», «двойная петля» 1, «двойная петля» 2, «двойная петля» 3 и «двойная петля» 4.

Способы настоящего изобретения включают введение субъекту, имеющему болезнь сердца и/или сосудистое заболевание, композиции, включающей две или более изоформ HGF. В одном варианте осуществления две или более изоформ HGF являются изоформами HGF млекопитающего, например, HGF человека. Аминокислотная последовательность HGF из различных видов хорошо известна в данной области техники, и ее можно найти в базах данных, касающихся последовательностей, таких как GenBank (аминокислотную последовательность HGF человека, имеющую входящий номер ВАА14348, включенную сюда посредством ссылки). В одном варианте осуществления одной из изоформ HGF является flHGF человека (SEQ ID NO: 2). В другом варианте осуществления одной из изоформ HGF является dHGF человека (SEQ ID NO: 3). В другом варианте осуществления одной из изоформ HGF является NK1 человека (SEQ ID NO: 4). В другом варианте осуществления одной из изоформ HGF является NK2 человека (SEQ ID NO: 5). В другом варианте осуществления одной из изоформ HGF является NK4 человека (SEQ ID NO: 6). В дальнейшем варианте осуществления две или более изоформ HGF включают flHGF и dHGF. В отличном варианте осуществления две или более изоформ HGF состоят из flHGF и dHGF.

В одном варианте осуществления изоформами HGF являются варианты изоформ HGF человека дикого типа. Например, изоформами могут быть варианты последовательности flHGF, dHGF, NK1, NK2 или NK4 человека, идентичные на по крайней мере 80%, например, на по крайней мере 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%, последовательности flHGF (SEQ ID NO: 2), dHGF (SEQ ID NO: 3), NK1 (SEQ ID NO: 4), NK2 (SEQ ID NO: 5) или NK4 (SEQ ID NO: 6) человека дикого типа. Вариант может включать добавления, делеции, замены или их комбинации в аминокислотной последовательности изоформы HGF человека дикого типа. Добавления или замены также включают использование не встречающихся в природе аминокислот и могут иметь место в любом количестве внутри последовательности, на N-конце и/или С-конце.

Предпочтительно любые замены являются консервативными аминокислотными заменами. «Консервативной аминокислотной заменой» является замена, при которой аминокислотный остаток замещают аминокислотным остатком, имеющим схожую боковую цепь. В данной области техники определены семейства аминокислотных остатков, имеющих схожие боковые цепи. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновую кислоту, глютаминовую кислоту), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глютамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин).

Идентичность последовательностей рассчитывают путем сравнения двух оптимально совмещенных последовательностей в пределах района сравнения, определения числа положений, в которых идентичный аминокислотный остаток встречается в обеих последовательностях, для получения числа совпадающих положений, деления числа совпадающих положений на общее число положений в районе сравнения (т.е. размер окна) и умножения результата на 100 для получения процента идентичности последовательностей. В одном аспекте процент идентичности рассчитывают как процент аминокислотных остатков в меньшей из двух последовательностей, которые совмещены с идентичным аминокислотным остатком в последовательности, которую сравнивают, когда четыре пропуска длиной 100 аминокислот могут быть введены для максимизации совмещения (Dayhoff, in Atlas of Protein Sequence and Structure, Vol. 5, p. 124, National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C. (1972), включенном сюда посредством ссылки). Определение идентичности обычно осуществляют с помощью компьютерной программы для определения гомологии, известной в данной области техники. Приводимой в качестве примера программой является программа Gap (пакет для анализа последовательностей Wisconsin, версии 8 для UNIX, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison, WI) с использованием настроек по умолчанию, в которой используется алгоритм Смита и Уотермана (Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)), который включен сюда в целом посредством ссылки.

В одном варианте осуществления вариант изоформы HGF сохраняет по существу всю из любой одной или нескольких биологических активностей белка изоформы HGF дикого типа. Используемый здесь термин «по существу вся биологическая активность HGF дикого типа» относится к варианту изоформы HGF, который сохраняет по крайней мере 70% любой одной или нескольких биологических активностей изоформы HGF (например, способности к стимуляции ангиогенеза и к активированию пролиферации клеток). В некоторых вариантах осуществления сохраняется по крайней мере 75, 80, 85, 90 или 95% одной или нескольких биологических активностей изоформы HGF. Активность HGF можно определить с помощью обычных in vitro и in vivo анализов, широко известных в данной области техники (например, in vivo анализов с использованием имплантата матригеля неоваскуляризации роговицы, in vivo/in vitro анализа хорион-аллантоисной мембраны (САМ) куриного яйца, in vitro клеточных анализов (пролиферации, миграции, образования трубок) и органотических исследований (аортального кольца)).

Структура и функция HGF были тщательно изучены, и квалифицированному в данной области техники специалисту известны аминокислоты в последовательности HGF, которые важны для сохранения по существу всей биологической активности белка и которые предпочтительно не изменены или изменены разве лишь консервативно в любом варианте последовательности HGF. См., например, Hartmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 11574 (1992); Lokker et al., EMBO J. 11: 2503 (1992); Zhou et al., Structure 6: 109 (1998): Ultsch et al., Structure 6: 1389 (1998); Shimizu et al., Biochem. Bioshys, Res. Commun. 189: 1329 (1992); Yoshiyama et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 175: 660 (1991), все из которых включены сюда в целом посредством ссылки. Например, доказано, что домены: N-концевая «петля-шпилька» и «двойная петля» 1 - требуются для вызова пролиферации клеток. Другие аминокислоты, которые не важны для биологической активности, можно делетировать и/или заменять беспрепятственнее. Квалифицированный в данной области техники специалист может приготовить варианты изоформ HGF, используя обычные методы мутагенеза, такие как методы, описанные в приведенных выше ссылках, и идентифицировать варианты, сохраняющие по существу всю биологическую активность изоформы HGF.

В одном аспекте настоящего изобретения две или более изоформ HGF вводят субъекту в виде полинуклеотидов, кодирующих изоформы. В одном варианте осуществления полинуклеотиды кодируют изоформы HGF млекопитающего, например, HGF человека. Полинуклеотидные последовательности гена HGF из различных видов хорошо известны в данной области техники, и их можно найти в базах данных, касающихся последовательностей, таких как GenBank (полинуклеотидную последовательность гена HGF человека, имеющую входящий номер NM000601, включенную сюда посредством ссылки). В одном варианте осуществления полинуклеотид кодирует flHGF. В другом варианте осуществления полинуклеотид кодирует dHGF. В другом варианте осуществления полинуклеотид кодирует NK1. В другом варианте осуществления полинуклеотид кодирует NK2. В другом варианте осуществления полинуклеотид кодирует NK4. В дальнейшем варианте осуществления полинуклеотиды кодируют и flHGF, и dHGF. В дальнейшем варианте осуществления полинуклеотиды кодируют flHGF, dHGF и NK1.

В одном варианте осуществления один или несколько полинуклеотидов, кодирующих две или более изоформ HGF, включают последовательность гена HGF человека дикого типа. В другом варианте осуществления полинуклеотиды включают вариант последовательности гена HGF дикого типа, но все еще кодируют аминокислотную последовательность изоформы HGF дикого типа вследствие вырожденности генетического кода. В дальнейшем варианте осуществления полинуклеотиды кодируют варианты последовательностей белков изоформ HGF, описанные выше. В одном варианте осуществления варианты полинуклеотидной последовательности - последовательности гена изоформы HGF человека идентичны по последовательности на по крайней мере 80%, например, на по крайней мере 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%, последовательности гена изоформы HGF человека дикого типа.

В одном аспекте настоящего изобретения две или более изоформ HGF кодируются гибридным геном HGF, который одновременно экспрессирует две или более изоформ, например, flHGF и dHGF. Гибридный ген HGF, описываемый в заявке на патент США 2005/0079581 (тем самым включенной в целом посредством ссылки), включает кДНК, соответствующую экзонам 1-18 HGF, и собственный (наследственный) или чужеродный интрон, вставленный между экзонами 4 и 5 кДНК, причем гибридный ген лишен других интронов между экзонами, отличных от интрона между экзонами 4 и 5. Интрон включает фрагмент собственного интрона или рекомбинантную последовательность.

Вариант гибридного гена HGF, включающий собственный интрон, имеет длину 7113 п.о. и имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 7. Гибридный ген HGF одновременно экспрессирует как flHGF, так и dHGF и обладает большей способностью к экспрессии, чем кДНК flHGF.

Вырожденность генетического кода позволяет модифицировать или изменять гибридный ген HGF в кодирующей и/или некодирующей области без изменения аминокислотной последовательности белка и экспрессии гена. Соответственно, в объем настоящего изобретения входят полинуклеотиды, которые в значительной степени идентичны гибридному гену HGF с SEQ ID NO: 7, и их фрагменты. Термин «в значительной степени идентичные» означает, что идентичность последовательностей составляет не менее 80%, например, не менее 90%, например, не менее 95%.

Гибридный ген HGF может включать фрагмент собственного интрона, необязательно имеющий небольшую рекомбинантную последовательность, вставленный там между экзонами 4 и 5 кДНК HGF. Здесь такой гибридный ген HGF, включающий фрагмент собственного интрона, обозначают «HGF-X». Примеры включают HGF-X6, HGF-X7 и HGF-X8, имеющие нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 8-10, соответственно.

Две или более вводимых изоформ HGF могут кодироваться отдельными полинуклеотидами или единственным полинуклеотидом. Полинуклеотиды могут быть функционально связаны с одной или несколькими регуляторными последовательностями, например, промоторами или энхансерами, контролирующими экспрессию изоформ HGF. Промотор может быть конститутивным промотором (например, промотором цитомегаловируса человека) или индуцибельным промотором. Регуляторные последовательности могут быть частью выключателя гена, который регулирует экспрессию изоформ HGF при добавлении или удалении специфического лиганда. Примеры лиганд-зависимых транскрипционных факторов, которые могут использоваться в выключателях генов настоящего изобретения, включают, без ограничения, члены суперсемейства ядерных рецепторов, активируемых соответствующими им лигандами (например, глюкокортикоидом, эстрогеном, прогестином, ретиноидом, экдизоном и их аналогами и миметиками), и rTTA, активируемый тетрациклином. В дальнейшем варианте осуществления промотором является специфичный для кардиомиоцитов промотор (например, повторный белок анкирин сердца, MYBPC3). Когда две или более изоформ HGF кодируются отдельными полинуклеотидами, каждый полинуклеотид может быть функционально связан со своими собственными регуляторными последовательностями. В другом варианте осуществления два или более полинуклеотидов могут находиться по контролем одной регуляторной последовательности в виде части тандемной кассеты, необязательно с последовательностями, вставленными между двумя или более полинуклеотидами, например, участком внутренней посадки рибосом, для активирования экспрессии всех изоформ.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения один или несколько полинуклеотидов, кодирующих две или более изоформ HGF, являются частью вектора, например, экспрессионного вектора. Вектором может быть, например, плазмидный вектор (например, вектор pCK, описанный в Lee et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 272: 230 (2000); WO 2000/040737) или вектор на основе вируса с одно- или двухцепочечной РНК или ДНК. Такие векторы можно ввести в клетки с помощью широко известных методов введения ДНК и РНК в клетки. Вирусные векторы могут быть компетентными по репликации или дефектными по репликации. В последнем из двух названных случаев размножение вирусов будет происходить только в комплементирующих клетках-хозяевах. Как здесь используется, термин «клетка-хозяин» или «хозяин» используется для обозначения клетки настоящего изобретения, которая несет один или несколько полинуклеотидов настоящего изобретения.

Таким образом, векторы, как минимум, должны включать полинуклеотиды настоящего изобретения. Другие компоненты вектора могут включать, но без ограничения, селектируемые маркеры, домены модификации хроматина, дополнительные промоторы, управляющие экспрессией других полипептидов, которые могут присутствовать на векторе (например, полипептида летального гена), сайты интеграции в геном, сайты рекомбинации и места вставки молекул. Векторы могут включать любое число этих дополнительных элементов, или внутри полинуклеотидов или вне их, так что вектор может быть специально адаптирован к конкретным целям желаемых терапевтических способов.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения векторы, которые вводят в клетки, включают, кроме того, «ген селектируемого маркера», который после экспрессии свидетельствует о том, что вектор был введен в клетку-хозяина. Таким образом ген селектора может быть положительным маркером в отношении присутствия вектора. Присутствие гена селектируемого маркера, несмотря на то, что оно не является важным для способов настоящего изобретения, позволяет практикующему специалисту отобрать популяцию живых клеток, в которые была введена векторная конструкция. Таким образом, определенные варианты осуществления настоящего изобретения включают отбор клеток, в которые вектор был успешно введен. Подразумевается, что, как здесь используется, термин «отбирать» или его варианты, при использовании в связи с клетками, означает стандартные, широко известные способы отбора клеток со специфической генетической структурой или фенотипом. Типичные способы включают, но без ограничения, культивирование клеток в присутствии антибиотиков, таких как G418, пуромицин и ампициллин. Другие примеры генов селектируемых маркеров включают, но без ограничения, гены, которые придают устойчивость к метотрексату, гигромицину или микофеноловой кислоте. Клетки, включающие векторную конструкцию, включающую ген или гены устойчивости к антибиотикам, будут, возможно, затем способны переносить антибиотик в культуре. Подобным образом, клетки, не включающие векторную конструкцию, включающую ген или гены устойчивости к антибиотикам, будут, возможно, не способны переносить антибиотик в культуре.

Как здесь используется, «домен модификации хроматина» (CMD) относится к нуклеотидным последовательностям, которые взаимодействуют с рядом белков, связанных с поддержанием и/или изменением структуры хроматина, таким как, но без ограничения, ДНК-инсуляторы. См., Ciavatta et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103: 9958 (2006), который включен сюда посредством ссылки. Примеры CMD включают, но без ограничения, инсулятор β-глобулина цыпленка и гиперчувствительный сайт 4 цыпленка (cHS4). Использование различных последовательностей CMD между одним или несколькими представлениями генов (т.е. промотором, кодирующей последовательностью и 3' регуляторным районом), например, может способствовать использованию дифференциальных ДНК-последовательностей CMD в качестве «плечей с минимальной гомологией» в сочетании с различными микроорганизмами или in vitro методами рекомбинирования для «обмена» генными представлениями между существующими мультигенными и моногенными «челночными» векторами. Другие примеры доменов модификации хроматина известны в данной области техники или могут быть без труда идентифицированы.

Конкретными векторами для применения с настоящим изобретением являются экспрессионные векторы, кодирующие белки или полипептиды. Как правило, такие векторы включают действующие в цис-положении районы контроля, эффективные для экспрессии в хозяине, функционально связанные с экспрессируемым полинуклеотидом. Соответствующие действующие в транс-положении факторы обеспечиваются хозяином, обеспечиваются комплементирующим вектором или обеспечиваются самим вектором после введения в хозяина.

Широкий выбор экспрессионных векторов можно использовать для экспрессии белков или полинуклеотидов. Такие векторы включают хромосомные, эписомные векторы и векторы вирусного происхождения, например, векторы, происходящие из бактериальных плазмид, из бактериофага, из дрожжевых эписом, из дрожжевых хромосомных элементов, из вирусов, таких как аденоассоциированные вирусы, лентивирусы, бакуловирусы, паповавирусы, SV40, вирусы коровьей оспы, аденовирусы, поксвирусы птиц, вирусы псевдобешенства и ретровирусы, и векторы, являющиеся результатом их сочетаний, такие как векторы, происходящие из генетических элементов плазмиды и бактериофага, такие как космиды и фагемиды. Все они могут использоваться для экспрессии в соответствии с этим аспектом настоящего изобретения. Как правило, любой вектор, подходящий для сохранения, копирования или экспрессии полинуклеотидов или белков в хозяине, может использоваться для экспрессии в этом отношении.

В экспрессионном векторе полинуклеотидная последовательность функционально связана с соответствующей контролирующей экспрессию последовательностью(ями), включающей, например, промотор для управления транскрипцией мРНК. Представители дополнительных промоторов включают, но без ограничения, конститутивные промоторы и тканеспецифические или индуцибельные промоторы. Примеры конститутивных эукариотических промоторов включают, но без ограничения, промотор гена металлотионеина I мыши (Hamer et al., J. Mol. Appl. Gen. 1: 273 (1982)); промотор ТК герпесвируса (McKnight, Cell 31: 355 (1982); ранний промотор SV40 (Benoist et al., Nature 290: 304 (1981)) и промотор вируса коровьей оспы. Все из перечисленных выше ссылок включены сюда посредством ссылки. Дополнительные примеры промоторов, которые могли бы использоваться для управления экспрессией белка или полинуклеотида, включают, но без ограничения, тканеспецифические промоторы и другие эндогенные промоторы для конкретных белков, такие как промотор альбумина (в гепатоцитах), промотор проинсулина (в бета-клетках поджелудочной железы) и подобные. Обычно экспрессионные конструкции будут содержать сайты для инициации и терминации транскрипции и, в транскрибируемой области, участок посадки рибосом для трансляции. Кодирующая часть зрелых транскриптов, экспрессируемых конструкциями, может включать инициирующий трансляцию кодон AUG в начале и стоп-кодон (UAA, UGA или UAG), соответствующим образом расположенный на конце транслируемого полипептида.

Кроме того, конструкции могут содержать контролирующие районы, которые регулируют, а также вызывают экспрессию. Обычно такие районы, например, сайты связывания репрессоров и энхансеры, среди прочих, будут функционировать путем контролирования транскрипции.

Примеры эукариотических векторов включают, но без ограничения, pW-LNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 и pSG, поставляемые Stratagene; pSVK3, pBPV, pMSG и pSVL, поставляемые Amersham Pharmacia Biotech; и pCMVDsRed2-express, pIRES2-DsRed2, pDsRed2-Mito и pCMV-EGFP, поставляемые Clontech. Многие другие векторы широко известны и имеются в продаже.

Выбор соответствующих векторов и промоторов для экспрессии в клетке-хозяине является общеизвестной процедурой, и методы, необходимые для конструирования вектора и его введения в хозяина, а также его экспрессии в хозяине, являются обычными знаниями в данной области техники.

Введение полинуклеотидов в клетки может быть транзиторной трансфекцией или стабильной трансфекцией вектора. Транзиторную трансфекцию векторов в клетку-хозяина можно произвести с помощью прямой инъекции, трансфекции с использованием кальция фосфата, опосредованной DEAE-декстраном трансфекции, опосредованной катионными липидами трансфекции, электропорации, трансдукции, инфекции или других способов. Такие способы описаны во многих стандартных лабораторных руководствах, например, Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986); Keown et al., Meth. Enzymol. 185: 527 (1990); Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, A laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., которые включены сюда посредством ссылки.

Две или более изоформ HGF или один или несколько полинуклеотидов, кодирующих изоформы HGF, могут быть введены субъекту в форме фармацевтической композиции. В одном варианте осуществления композицию составляют для инъекции.

Фармацевтическая композиция может, кроме того, включать фармацевтически приемлемые носители. Любой из общепринятых в фармацевтической области способов можно использовать для приготовления пероральных препаратов, таких как таблетки, капсулы, пилюли, гранулы, суспензии и растворы, инъецируемых композиций, таких как растворы, суспензии или сухие порошки, которые можно смешать с дистиллированной водой перед инъецированием; местно применимых препаратов, таких как мази, кремы и лосьоны, и других препаратов.

Обычно используемые в фармацевтической области носители можно использоваться в композициях настоящего изобретения. Например, вводимые орально препараты могут включать связующие вещества, эмульгаторы, дезинтегрирующие агенты, наполнители, солюбилизаторы, диспергаторы, стабилизаторы, суспендирующие агенты, красители или специи. Инъецируемые препараты могут включать консерванты, не вызывающие страдания агенты, солюбилизаторы или стабилизаторы. Препараты для местного применения могут содержать основы, наполнители, смазывающие вещества или консерванты. Любой из подходящих препаратов, известных в данной области техники (Remington's Pharmaceutical Science (18^th edition), Mack Publishing Company, Eaton PA), можно использовать в настоящем изобретении.

Фармацевтические композиции можно клинически вводить в качестве различных пероральных и парентеральных препаратов. Соответствующий препарат можно приготовить, используя такие наполнители, как добавки, усилители, связующие вещества, смачивающие вещества, дезинтегрирующие агенты и поверхностно-активные вещества, или разбавители. Твердые препараты для орального введения включают пилюли, таблетки, присыпку, гранулы и капсулы. Эти твердые препараты можно приготовить смешиванием одного или нескольких наполнителей, например, крахмала, кальция карбоната, сахарозы, лактозы и желатина, с дибензилбутиллактоновыми производными лигнанов. Также в препараты могут быть включены смазывающие вещества, такие как магния стеарат и тальк. Жидкие препараты для орального введения включают суспензию, раствор, эмульсию и сироп. Эти препараты могут содержать смачивающие вещества, подсластители, душистые вещества и консерванты, помимо обычных простых разбавителей, таких как вода и жидкий парафин. Препараты для парентерального введения включают стерилизованный водный раствор, суспензию, эмульсию, обработку лиофилизированного варианта и суппозитории. Не растворимые в воде наполнители и суспендирующие агенты включают растительные жиры, такие как пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и оливковое масло, и инъецируемые сложные эфиры, такие как этилолеат. В качестве основ суппозиториев могут использоваться Witepsol®, Macrogol®, Tween® 61, какаовые жиры, лауриновые жиры и глицерожелатин.

Следующие примеры даны только с иллюстративной целью и, как предполагается, не ограничивают объем настоящего изобретения.

ПРИМЕР 1: Конструирование плазмид

Вектор pCK может управлять экспрессией гена с промотора цитомегаловируса человека (HCMV) и был ранее описан (Lee et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 272: 230 (2000); WO 2000/040737).

pCK-VEGF165 был сконструирован путем встраивания кДНК VEGF165 в вектор pCK и был ранее описан (Lee et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 272: 230 (2000); WO 2000/040737).

pCK-cHGF содержит кДНК, кодирующую HGF₇₂₈, под контролем промотора HCMV и был ранее описан (US 2005/0079581).

pCK-dHGF содержит кДНК, кодирующую HGF₇₂₃, под контролем промотора HCMV и был ранее описан (PCT/KR03/00548).

pCK-HGF-X7 содержит гибридную кДНК HGF (SEQ ID No: 9), которая была сконструирована для экспрессии 2 изоформ HGF, одновременно встроенных в вектор рСК, и был ранее описан (US 2005/0079581).

ПРИМЕР 2: Эффект HGF на миграцию и пролиферацию клеток

Задачей этого исследование была оценка эффекта HGF на миграцию и пролиферацию клеток in vitro.

1. Материалы и методы

(1) Приготовление белка HGF

Клетки 293Т трансфецировали pCK-HGF-X7, используя FuGENE6^TM (Roche Diagnostics, Германия). В качестве контролей использовали pCK, pCK-cHGF и pCK-dHGF. Через два дня после трансфекции получали супернатанты культур, содержащие белок HGF, и количество HGF измеряли с помощью ELISA для HGF человека (R&D System, MN, США) в соответствии с рекомендациями производителя.

(2) Анализ миграции клеток

Эффект HGF на миграцию эндотелиальных клеток пуповинной вены человека (HUVEC, Agiolab Co., Ltd., AL01-0122S), скелетных миобластов мыши (C2C12, ATCC №CRL-1772) и кардиомиобластов крысы (H9C2, ATTT №CRL-1446) оценивали в анализе с использованием модифицированной камеры Бойдена. Вставки 24-транслуночной камеры для культивирования клеток (Corning, NY, США), имеющие пористые поликарбонатные фильтры (с размером пор 8 мкм), покрывали 1% желатином в PBS. HUVEC (n=15), суспендированные в среде M199, дополненной 1% FBS, и клетки С2С12 (n=10) или Н9С2 (n=10), суспендированные в среде DMEM, дополненной 3% FBS, соответственно, добавляли к вставкам при 1×10⁴ клеток на лунку. Испытуемые вещества (супернатанты от клеток 293Т, трансфецированных pCK, pCK-cHGF, pCK-dHGF или pCK-HGF-X7) разводили до конечной концентрации HGF, составляющей 50 нг/мл, в среде М199 или DMEM, дополненной 1% или 3% FBS, соответственно, и 600 мкл разведенных испытуемых веществ помещали в нижнюю камеру. Клеткам предоставляли возможность мигрировать в течение 3 ч при 37°C в термостате с СО₂, затем вставки поднимали, ополаскивали PBS, фиксировали с использованием 4% формальдегида в течение 10 мин и окрашивали 0,2% кристаллическим фиолетовым. Миграцию клеток определяли количественно путем подсчета клеток, находящихся с противоположной стороны вставок. Клетки подсчитывали в 5 полях зрения под большим увеличением (×200) в каждой вставке. Изображение анализировали, используя Image-Pro® plus (Media Cybernetics, US).

(3) Анализ пролиферации клеток

Эффект HGF на пролиферацию клеток HUVEC оценивали, используя анализ включения [³H]тимидина. Клетки HUVEC (n=10), суспендированные в среде M199, дополненной 1% FBS, помещали в 96-луночный планшет при 5×10³ клеток на лунку. Десять нанограмм белка HGF (супернатантов от клеток 293Т, трансфецированных pCK, pCK-cHGF, pCK-dHGF или pCK-HGF-X7) добавляли к клеткам. Клеткам предоставляли возможность пролиферировать в течение 48 часов при 37°С в термостате с СО₂. Впоследствии в каждую лунку добавляли 1 мкКи [³H]тимидина, и клетки инкубировали в течение еще 16 часов при 37°С. Клетки собирали, и включение [³H]тимидина измеряли, используя жидкостной сцинтилляционный счетчик (Wallac, Turku, Финляндия).

2. Результаты и обсуждение

Для изучения биологических результатов действия двух изоформ HGF был исследован их эффект на миграцию и пролиферацию клеток. Эти анализы выполняли, используя супернатанты от клеток 293Т, трансфецированных каждым из экспрессионных векторов, описанных в разделе «Материалы и методы». Во всех экспериментах использовали равные количества белка HGF.

Как продемонстрировано на фиг.1, 2 и 3, присутствие двух изоформ HGF, продуцируемых с pCK-HGF-X7, индуцировало миграцию клеток HUVEC, C2C12 и H9C2, соответственно, более эффективно, чем в том случае, когда присутствовала только одна изоформа. Присутствие двух изоформ HGF также активировало эффективную пролиферацию клеток HUVEC (фиг.4). Полученный от трансфецированных pCK-HGF-X7 клеток супернатант индуцировал пролиферацию клеток HUVEC более эффективно, чем супернатант, полученный от трансфецированных pCK-dHGF клеток. Эти результаты показывают, что комбинированные действия двух изоформ HGF вызывали более сильную миграцию эндотелиальных клеток и пролиферативные активности у этих клеток, и более сильные миграционные активности у скелетных миобластов и кардиомиобластов.

Миграция эндотелиальных клеток сосудов сильно коррелирует с ангиогенезом, а миграция миокардиальных и скелетно-мышечных клеток-предшественников является важной стадии мышечного развития и мышечного восстановления после повреждения. Таким образом, эти результаты показывают, что обе изоформы HGF могут обеспечить более эффективное средство для индукции неоваскуляризации и регенерации ишемизированных тканей. Миграция и пролиферация эндотелиальных клеток сосудов являются также природным процессом, связанным с образованием стенки сосуда. Следовательно, эти результаты также показывают, что введение обеих изоформ HGF может активировать реэндотелизацию стенок кровеносных сосудов.

ПРИМЕР 3. Оценка эффективности HGF в модели ишемической болезни сердца на крысах

Задачей этого исследования была оценка кардиопротективного эффекта интрамиокардиальной инъекции HGF в модели ишемической болезни сердца на крысах. Порядок проведения эксперимента представлен на фиг.5.

1. Материалы и методы

(1) Животные

Тридцать восемь крыс Sprague-Dawley (самцов возрастом 12 недель, 350-400 г, SLC) обеспечивали неограниченно пищей и водой после доставки, и им предоставляли 7-дневный покой до подвергания хирургическому вмешательству.

(2) Модель инфаркта миокарда

Для анализа фармакологической эффективности HGF в настоящем исследовании использовали модель ишемической болезни сердца на крысах, одну из широко используемых моделей патологии CAD. Крыс подвергали анестезии с использованием внутримышечной инъекции ксилазина (5 мг/кг), а затем кетамина (50 мг/кг). После стерилизации 95% этиловым спиртом и йодом грудную клетку покрывали стерильной хирургической тканью, и открывали только область разреза, обеспечивая, тем самым, полностью стерильное условие для хирургического вмешательства. Эндотрахеальную интубацию осуществляли оротрахеальным путем. Во время операции сохраняли положительную нагнетательную вентиляцию. Электрокардиограммы и насыщенность кислородом контролировали постоянно. Осуществляли срединную торакотомию. После открытия перикарда с последующим нахождение передней стенки левого желудочка на проксимальную одну треть левой передней нисходящей коронарной артерии (LAD) накладывали лигатуру, используя 6-0 полипропиленовые нити, опорой для которых служил небольшой кусочек нелатона (5Fr). Подтверждали возрастание ST-сегмента на отслеживаемой электрокардиограмме. После перевязки LAD в течение 60 минут осуществляли реперфузию ишемизированного миокарда крыс. Раны перикарда и торакотомические раны закрывали. Единственную плевральную дренажную трубку, соединенную с всасывающей системой для средостения, удаляли после возращения самопроизвольного дыхания в достаточной степени, и удаляли эндотрахеальную трубку. Затем разрез проверяли на наличие кровотечения. После остановки кровотечения на разрезанные мышцу, фасцию и кожу накладывали швы. После хирургического вмешательства для предотвращения инфекции внутримышечно вводили гентамицин (3 мг/кг/день) в течение 3 дней. Трансторакальную эхокардиографию проводили через 28 дней после хирургического вмешательства для подтверждения вызова инфаркта миокарда у крыс.

(3) Схема исследования для оценки эффективности

Эффективность HGF провели с помощью прямого инъецирования плазмид, содержащих ген HGF, в ишемизированную сердечную мышку и наблюдения за кардиопротективным эффектом физиологически и анатомически. Содержащие ген HGF плазмиды вводили немедленно после вызова ишемии (день 0). Каждому животному интрамиокардиально инъецировали общую дозу, составляющую 250 мкг pCK-cHGF (n=12) или pCK-HGF-X7 (n=10). Ради отрицательных и положительных контролей инъецировали такое же количество вектора pCK, в котором отсутствует кодирующая HGF последовательность (n=7), и pCK-VEGF165 (n=9). Улучшения физиологической функции сердца определяли с помощью трансторакальной эхокардиографии в день 1, 14, 28 и 56 после инъекции ДНК. Степень ангиогенеза и противофиброзного эффекта определяли после аутопсии.

(4) Кардиофизиологический анализ

В день 1 измеряли фракцию изгнания левого желудочка и межжелудочковую перегородку во время систолы, используя трансторакальную эхокардиографию. Полученные в день 1 значения устанавливали в качестве значений исходного состояния. В дни 14, 28 и 56 снова проводили эхокардиографию. Полученные в дни 1, 14, 28 и 56 значения сравнивали между группами лечения pCK, pCK-HGF-X7, pCK-cHGF и pCK-VEGF165. Кроме того, для анализа изменений капиллярной плотности и фиброза в левом желудочке из ишемизированных сердец получали срезы тканей.

(5) Анализ капиллярной плотности

В день 56 миокардиальные ткани получали из ишемизированного сердца и фиксировали в 10% растворе формалина в течение 2 дней, а затем заделывали в парафин. Из каждого образца готовили несколько серийных срезов. В тканевых срезах идентифицировали эндотелиальные клетки капилляров с помощью окрашивания антителом против CD31. Плотность капилляров анализировали количественно под микроскопом при увеличении 400х и представляли как число капилляров на 0,15 мм² (Image-Pro® plus, версии 4.1, Media Cybernetics, Bethesda, Maryland, США). Значение затем сравнивали между группами лечения.

(6) Анализ противофиброзного эффекта

В день 56 миокардиальные ткани получали из ишемизированного сердца и фиксировали в 10% растворе формалина в течение 2 дней и затем заделывали в парафин. Из каждого образца несколько серийных срезов готовили и окрашивали трихромом для оценки содержания коллагена. Фиброзную область в левом желудочке анализировали количественно под микроскопом при увеличении 8х. Значение затем сравнивали между группами лечения.

(7) Статистические данные

Результаты представляли как среднее ± стандартная ошибка среднего и анализировали, используя SPSS (версии 10.0, SPSS, Inc., Chicago, IL, США). Статистический анализ всех данных осуществляли, используя однофакторный дисперсионный анализ и последующий анализ минимально значимого различия или критерий Тьюки для определения значимости различий при множественных сравнениях. Р-значения, составляющие менее 0,05, считались значимыми.

2. Результаты

(1) Вызов инфаркта миокарда левого желудочка у крысы

Трансторакальную эхокардиографию проводили в день 28 после вызова инфаркта миокарда для подтверждения модели заболевания у животного. Наблюдали, что физиологическая функция левого желудочка значительно снижена после хирургического вызова ишемии миокарда. Также наблюдали фиброз миокарда в переднебоковой стенке левого желудка.

(2) Эффект HGF на функцию левого желудочка

Изменения во фракции изгнания левого желудочка (LVEF) после инъекции ДНК сравнивали между группами лечения. В дни 1 и 14 не было статистически значимого различия в LVEF между группами. Однако ко 28 дню после интрамиокардиального введения ДНК значение LVEF было статистически значительно выше в группе лечения pCK-HGF-X7 (40,77±2,92%), чем в группе лечения pCK (31,24±3,58%, p=0,028) или группе лечения pCK-cHGF (33,99±2,26%, p=0,069). Значение LVEF в группе лечения pCK-VEGF165 (39,63±2,44%) представлялось выше, чем в группе лечения pCK (p=0,056) или группе лечения pCK-cHGF (p=0,138), но различие не было статистически значимым. Схожую тенденцию наблюдали в день 56 после лечения (фиг.6).

Также сравнивали изменения в межжелудочковой перегородке во время систолы (IVS) после лечения ДНК. IVS во время систолы была значительно увеличена только в группе лечения pCK-HGF-X7; в день 56 значение для IVS в группе лечения pCK-HGF-X7 было значительно выше, чем в группе лечения pCK (p=0,061), pCK-VEGF165 (р=0,012) или pCK-cHGF (p=0,011) (фиг.7).

(3) Эффект HGF на плотность капилляров

В день 56 капиллярная плотность в ткани миокарда ишемизированной пограничной зоны составляла 300,00±14,71 на 0,15 мм² для группы лечения pCK-HGF-X7. Это значение для капиллярной плотности было значительно выше, чем 227,54±6,16 на 0,15 мм² для группы лечения pCK (p<0,001), 247,38±7,52 на 0,15 мм² для группы лечения pCK-VEGF165 (p=0,001) или 231,35±5,55 на 0,15 мм² для группы лечения pCK-cHGF (p<0,001) (фиг.8).

(4) Эффект HGF на фиброз миокарда

В день 56 степень фиброза в левом желудочке составляла 18,88±1,81% для группы лечения pCK-HGF-X7. Этот процент фиброза был значительно ниже, чем 30,20±2,35% для группы лечения pCK (p=0,009). Степень фиброза в группе лечения pCK-VEGF165 (20,96±2,25%) была также ниже, чем в группе лечения pCK (p=0,049), хотя различие было статистически менее значимым по сравнению с группой лечения pCK-HGF-X7. Но степень фиброза в группе лечения pCK-cHGF (25,02±2,49%) не была значительно ниже, чем степень фиброза в группе лечения pCK (p=0,411) (фиг.9).

3. Обсуждение

Лечебные возможности HGF оценивали в модели ишемической болезни сердца на крысах, которая является широко известной моделью CAD на животных. В день 0 с помощью хирургического вмешательства была вызвана ишемия сердца, и в ишемизированный миокард было инъецировано всего 250 мкг плазмид, содержащих ген HGF, или контрольных ДНК. Эффекты HGF оценивали с помощью эхокардиографических и/или гистологических анализов. Функционирование ишемизированного сердца было значительно улучшено в группе лечения pCK-HGF-X7. Группа pCK-cHGF не продемонстрировала какого-либо значительного улучшения в функционировании сердца, даже хотя pCK-cHGF экпрессирует одну изоформу белка HGF.

ПРИМЕР 4: Оценка эффективности pCK-HGF-X7 в клиническом испытании на людях

Эффективность pCK-HGF-X7 оценивали в клиническом испытании на людях. Двум субъектам, подвергающимся имплантации шунта для коронарных артерий (CABG), инъецировали 0,5 мг pCK-HGF-X7.

1. Способы

(1) Субъекты

В испытание включали субъектов, если они удовлетворяли следующим критериям: 1) были возрастом 19-75 лет, 2) имели обратимый недостаток перфузии (составляющее более 7 процентов различие между перфузиями в покое и при нагрузке) по оценке MIBI-SPECT, 3) по оценке все еще имели область неполной реваскуляризации после CABG или по оценке имели область перфузии миокарда, которая не подходит для CABG.

Субъекты исключались, если они имели предшествующую историю или текущее доказательство 1) злокачественного новообразования, 2) неконтролируемой желудочковой аритмии, 3) прогрессирующей сердечной недостаточности или доказательство дисфункции левого желудочка, превышающей класс II по Киллипу, и имели фракцию изгнания левого желудочка <25% при трансторакальной двумерной эхокардиографии, 4) тяжелого инфекционного заболевания, 5) неконтролируемого заболевания крови, 6) клапанного порока сердца и нуждались в операции для сокращения объема левого желудочка, 6) пролиферативной ретинопатии, 7) удара, 8) неконтролируемой значительной гипертонии по оценке JNC II, 9) тяжелого заболевания печени и почки или 10) CABG ранее.

Протокол был разрешен Институтским наблюдательным советом Seoul National University Hospital, а также Управлением по контролю за продуктами и лекарствами Кореи.

(2) Исследование перфузии миокарда с помощью MIBI-SPECT

Однофотонную эмиссионную компьютерную томографию (SPECT) с пропускание ^99mTc-MIBI (Vertex EPIC, ADAC Labs, CA, США) в покое и после фармакологической нагрузки аденозином проводили для всех пациентов до лечения pCK-HGF-X7 и через 3 и 6 месяцев после лечения pCK-HGF-X7. Изображения SPECT создавали при синхронизации с электрокардиографией и анализировали с использованием полуколичественной 20-сегментной модели, используя программу для автоподсчета (AutoQUANT, ADAC Labs, CA, США).

Семипроцентное различие между показателями перфузии в покое и при нагрузке при SPECT является нижней чертой обратимого недостатка перфузии при ишемии миокарда. Следовательно, составляющее ≥7% различие между перфузиями в покое и при нагрузке свидетельствует о том, что миокард имеет обратимый недостаток перфузии, а составляющее <7% различие свидетельствует о том, что миокард имеет нормальную перфузию.

Показатели перфузии в покое и при нагрузке были получены из номера сегмента 10 и 16 SPECT-изображения в виде концентрической окружности, и различие в показателях оценивали в период скрининга, 3 и 6 месяцев после инъецирования pCK-HGF-X7 (фиг.10).

(3) Интрамиокардиальное инъецирование pCK-HGF-X7 при CABG

Имплантацию шунта для коронарных артерий (CABG): левой передней нисходящей коронарной артерии и огибающей коронарной артерии - проводили через стандартную срединную стернотомию. 0,5 мг pCK-HGF-X7 (0,125 мг/0,25 мл/инъекцию; 4 места/пациента) вводили с помощью интрамиокардиального инъецирования в обе ветви задней нисходящей артерии, которая не подходила для CABG после оценки с помощью MIBI-SPECT, хотя имела уменьшенную перфузию. Номерами сегментов, в которые вводили pCK-HGF-X7, были 10 и 16 полученного при MIBI-SPECT изображения в виде концентрической окружности.

2. Результат и обсуждение

(1) Эффект pCK-HGF-X7 на перфузию миокарда при MIBI-SPECT

Сравнивали различие между показателями перфузии в покое и при нагрузке при SPECT до и после инъецирования pCK-HGF-X7. У первого субъекта среднее различие между показателями перфузии в покое и при нагрузке до инъецирования pCK-HGF-X7 составляло 16%. Через 3 и 6 месяцев после инъецирования pCK-HGF-X7 среднее различие между показателями перфузии в покое и при нагрузке в области инъецирования (номера сегментов 10 и 16) составляло 3,5% и 0,5%, что значительно отличалось от показателя исходного состояния. У второго субъекта среднее различие между показателями перфузии в покое и при нагрузке до инъецирования pCK-HGF-X7 составляло 9%. Через 3 и 6 месяцев после инъецирования pCK-HGF-X7 среднее различие между показателями перфузии в покое и при нагрузке в области инъецирования (номера сегментов 10 и 16) составляло 4% и 3,5%, что значительно отличалось от показателя исходного состояния (фиг.12).

В заключение, интрамиокардиальное инъецирование pCK-HGF-X7 пораженному субъекту может изменить состояние перфузии миокарда с обратимого недостатка до нормального состояния. Эти результаты свидетельствуют о том, что введение pCK-HGF-X7 может значительно улучшить перфузию миокарда.

ПРИМЕР 5: Оценка эффективности pCK-HGF-X7 в амероидной модели ишемии на свиньях

Задачей этого исследования была оценка кардиопротективного эффекта чрескожной эндокардиальной инъекции pCK-HGF-X7, используя катетер под контролем системы формирования изображения сердца, в амероидной модели ишемии на свиньях.

1. Материалы и методы

(1) Животные

Кастрированных домашних свиней йоркширской породы (n=9, самцов, 20-40 кг) обеспечивали неограниченно пищей и водой после доставки, и им предоставляли 7-дневный покой до подвергания хирургическому вмешательству.

(2) Амероидная модель ишемии на свиньях

Модель хронической ишемии миокарда, вызванной амероидным констриктором, является прочно установившейся, клинически релевантной и принятой преклинической моделью хронической ишемии миокарда для проверки новых ангиогенных терапевтических средств. В этой модели имитируется как анатомия коронарных сосудов человека, так и степень образования сосудов в ответ на ишемию у людей. Кроме того, эта модель на свиньях является прочно установившейся для проверки сердечно-сосудистых медицинских устройств, вследствие схожести по размеру и анатомии с сердечно-сосудистой системой человека.

Свиней подвергали хирургической имплантации амероидного констриктора в проксимальную левую огибающую ветвь для создания хронической ишемии. Свиней усыпляли посредством внутримышечной инъекции 4-6 мг/кг Telazol® и 0,02-0,05 мг/кг атропина сульфата. Затем вводили изофлуран через маску для вызова общей анестезии для хирургических вмешательств. Свиней интубировали и соответствующим образом готовили для хирургического вмешательства. Свиней помещали в правое боковое лежачее положение. Внутривенное капельное вливание плазмалита и лидокаина восполняло потерю жидкости на протяжении всего хирургического вмешательства и контролировало любые аритмии. Конечный промывочный раствор наносили на стерильно подготовленное место хирургического вмешательства, грудную клетку покрывали стерильными салфетками, и все животное покрывали простыней для тела. Панкурония бромид вводили внутривенно для мышечной релаксации после установления глубокого уровня анестезии. 20-сантиметровой разрез делали в левой части грудкой клетки в 5-ом межреберном промежутке. Отводили назад ребра, а затем легкие, которые обертывали в марлевые тампоны, пропитанные физиологическим раствором. Перикард открывали непосредственно дистальнее диафрагмального нерва с помощью горизонтального разреза, и сердце задерживали в перикардиальном ложе. Огибающую коронарную артерию (LCX) рассекали на отрезке приблизительно 0,5 см непосредственно проксимальнее первой маргинальной ветви, и амероидный констриктор соответствующего артерии размера размещали вокруг нее. На все коллатеральные сосуды, которые могли бы влиять на LCX-ложе, накладывали постоянные лигатуры. Для контролирования аритмий, при необходимости, вводили болюсную инъекцию лидокаина. Перикард обычно не сшивали вплотную, а использовали в качестве помощника для закрепления амероида на месте на артерии. Для закрытия мышечных слоев использовали шовный материал - хромированный кетгут (PDS II) без оставления внешних связей. Подкожно использовали шовный материал Braided Dexon^TM. Для закрытия кожи использовали хирургические скобки. Для предотвращения инфекции все свиньи затем получали внутримышечно энрофлоксацин (5,0 мг/кг/день) в течение 3 дней.

(3) Схема исследования для оценки эффективности

Через четыре недели после имплантации амероида свиней рандомизировали для введения 1 мг pCK-HGF-X7 [группа лечения низкой дозы: 1 мг/2 мл (n=3)], 4 мг pCK-HGF-X7 [группа лечения высокой дозы: 4 мг/8 мл (n=3)] и контрольного продукта, состоящего из тех же буферов в качестве наполнителей, которые использовались с pCK-HGF-X7 [контрольная группа введения носителя: 8 мл (n=3)]. Продукты вводили, используя катетер для доставки NOGA® MyoStar (Biosense Webster, США), трансэндокардиально. Каждое животное получало восемь (группа лечения низкой дозы: 0,125 мг/0,25 мл/место инъекции) или шестнадцать (группа лечения высокой дозы: 0,25 мг/0,5 мл/место инъекции) инъекций pCK-HGF-X7 или контрольного продукта (контрольная группа введения носителя: 0,5 мл/место инъекции) в пограничную зону жизнеспособного и ишемизированного миокарда на боковой и задней стенке. Для оценки функционального результата лечения pCK-HGF-X7 определяли перфузию миокарда (κ) при максимальной нагрузке до и после лечения ДНК, измеряемую с помощью контрастной стресс-эхокардиографии миокарда.

2. Результаты

Изменения в перфузии миокарда при максимальной нагрузке до и после инъекции плазмидной ДНК сравнивали между группами лечения. В контрольной группе введения носителя в день 30 была выявлена тенденция к уменьшению перфузии по сравнению с перфузией в день 0. Но для двух групп лечения pCK-HGF-X7 в день 30 была выявлена тенденция к сохранению перфузии по сравнению с перфузией в день 0 (фиг.13). Эти результаты наводили на мысль, что трансэндокардиальный перенос pCK-HGF-X7 может защитить от уменьшения перфузии миокарда, вызванного ишемией миокарда.

Эти результаты показывают, что HGF можно доставлять, используя катетер. Катетер для чрескожной трансэндокардиальной инъекции был использован для эндокардиальной инъекции различных лекарственных средств, например, стволовых клеток, аденовирусной и «голой» ДНК под контролем электромеханической навигационной системы для сердца в клинических испытаниях. Эти результаты свидетельствуют о том, что плазмидную ДНК pCK-HGF-X7 можно неопасно вводить в миокард, имеющий уменьшение перфузии, в виде чрескожной трансэндокардиальной инъекции, используя катетер, под электромеханическим контролем. Таким образом, системы инъекции с использованием катетера для переноса pCK-HGF-X7 в сердце можно использовать для пациентов, имеющих ишемизированную ткань сердца, такую как стабильная, нестабильная стенокардия или острый, хронический инфаркт миокарда.

ПРИМЕР 6: Доставка экспрессирующих HGF клеток

HGF можно доставлять в форме клеток, включающих pCK-HGF-X7. От субъекта получают мезенхимные стволовые клетки. Источником мезенхимных стволовых клеток могут быть аспираты костного мозга или мобилизованная периферическая кровь. Полученные мезенхимные стволовые клетки культивируют и трансфецируют pCK-HGF-X7, используя липосому. Клетки затем собирают, промывают физиологическим раствором, ресуспендируют в инфузионном растворе и вводят субъекту. Мезенхимные стволовые клетки, трансфецированные pCK-HGF-X7, можно вводить в ишемизированную и пораженную инфарктом ткань сердца i) в виде интрамиокардиальной инъекция, используя шприц, или ii) в виде чрескожной трансэндокардиальной инъекции, используя катетер, под электромеханическим контролем.

ПРИМЕР 7: pCK-HGF-X7-элюирующий стент

В этом примере демонстрируется изготовление элюирующих плазмиду стентов.

А. Изготовление элюирующего плазмиду стента из нержавеющей стали

1. Материалы и методы

(1) Стент из нержавеющей стали

Стенты из нержавеющей стали (стент из SS, Librte®, 3,0 мм × 20 мм) покупали у Boston Scientific (США).

(2) Изготовление pCK-HGF-X7-элюирующего стента из SS

а. Изготовление pCK-HGF-X7-элюирующего стента из SS без слоя полимера

Для мойки поверхности стратов стентов из SS стенты обрабатывали три раза ультразвуком в этаноле в течение 3 минут (Vibra-Cell^TM, Sonics & Materials INC., Швейцария) и сушили в течение 30 минут при 37°C. Затем стенты погружали один раз в 5 мг/мл pCK-HGF-X7 на 5 минут и сушили в течение 30 минут при 37°С.

b. Изготовление pCK-HGF-X7-элюирующего стента из SS со слоем полимера

Для изготовления стентов из SS со слоем полимера стенты погружали один раз в 5 мг/мл полимера - фосфорилхолина (РС) (CM5208, Vertellus Specilities INC, Соединенное Королевство) в этаноле. Затем стенты из SS со слоем полимера РС погружали один раз в 5 мг/мл pCK-HGF-X7 на 5 минут и сушили в течение 20 минут при 37°С.

(3) Определение количества pCK-HGF-X7, элюируемого со стента из SS

Для анализа количества pCK-HGF-X7, которые было нагружено на стент из SS, был выбран большой объем раствора, удаляемого и пополняемого (0,8 мл из 1 мл), для количественного определения элюции pCK-HGF-X7 быстрым и эффективным образом.

Покрытые pCK-HGF-X7 стенты из SS по отдельности погружали в криопробирки, содержащие 1 мл физиологического раствора. Содержащие стенты пробирки помещали на вальцовый смеситель (HIP-RMF40, Hyunil LAB-MATE, Корея) на 60 минут при условии 40 вращений в минуту. Элюаты pCK-HGF-X7 собирали через 1, 5, 10, 20 и 40 минут. В каждый момент времени извлекали 0,8 мл раствора для анализа в ультрафиолетовой области спектра, и 0,8 мл нового физиологического раствора добавляли обратно в криопробирку для сохранения общего объема раствора. Криопробирку затем помещали на вальцовый смеситель для продолжения эксперимента. Концентрацию извлеченного pCK-HGF-X7 в элюатах, полученных в каждый момент времени, определяли при 260 нм, используя Ultraspec 3000 (Amersham Pharmacia Biotech, Швеция). В качестве отрицательного контроля также проверяли стент из SS без pCK-HGF-X7, используя вышеприведенный способ количественного определения.

2. Результаты

Результаты приведены в таблицах 1 и 2. Почти 78 мкг pCK-HGF-X7 элюировалось со стента из SS без полимерного слоя через одну минуту и 115 мкг pCK-HGF-X7 элюировалось через 40 минут. Также почти 43 мкг pCK-HGF-X7 элюировалось со стента из SS со слоем полимера через 60 минут. Эти результаты свидетельствуют о том, что плазмидой могут быть покрыты стенты из SS как без полимерного слоя, так и с таким слоем, и что плазмиду на покрытии можно элюировать со стента из SS. Поэтому был сделан вывод, что элюирующий плазмиду стент из SS был с успехом изготовлен.

Таблица 1
Количественное определение pCK-HGF-X7, элюируемой со стента из SS без слоя полимера
Время экстракции (мин)	Суммарно экстрагированная pCK-HGF-X7
	Отрицательный контроль	Стент из SS без слоя полимера
мкг pCK-HGF-X7	Относительное извлечение (%)	мкг pCK-HGF-X7	Относительное извлечение (%)
1	0,53±0,14	0	77,98±29,29	67,88
5	0,87±0,03	0	108,97±13,20	94,86
10	1,41±0,18	0	112,48±14,23	97,92
20	1,55±0,11	0	114,15±13,76	99,38
40	1,83±0,24	0	114,87±13,84	100,00

Таблица 2
Количественное определение pCK-HGF-X7, элюируемой со стента из SS со слоем полимера
Время экстракции (мин)	Суммарно экстрагированная pCK-HGF-X7
	Отрицательный контроль	Стент из SS без слоя полимера
мкг pCK-HGF-X7	Относительное извлечение (%)	мкг pCK-HGF-X7	Относительное извлечение (%)
10	1,85±0,07	0	39,74±9,27	84,45
20	1,37±0,03	0	41,64±9,14	88,49
30	1,35±0,00	0	43,35±9,12	92,12
40	1,41±0,07	0	44,55±9,03	94,69
50	1,00±0,08	0	45,82±8,89	97,37
60	0,96±0,05	0	47,05±9,02	100,00

В. Изготовление элюирующего плазмиду стента из хромокобальтового сплава

1. Материалы и методы

(1) Стент из хромокобальтового сплава

Стенты из хромокобальтового сплава (стент из Co-Cr, ARTHOSPico, 2,75 мм × 12 мм) покупали у AMG International (Германия).

(2) Изготовление pCK-HGF-X7-элюирующего стента из Co-Cr

а. Изготовление pCK-HGF-X7-элюирующего стента из Co-Cr без слоя полимера

Для мойки поверхности стратов стентов из Co-Cr стенты обрабатывали три раза ультразвуком в этаноле в течение 3 минут и сушили в течение 30 минут при 37°C. Затем стенты погружали один раз в 5 мг/мл pCK-HGF-X7 на 5 минут и сушили в течение 30 минут при 37°С.

b. Изготовление pCK-HGF-X7-элюирующего стента из Co-Cr со слоем полимера

Для изготовления стентов из Co-Cr со слоем полимера стенты погружали один раз в 5 мг/мл полимера - фосфорилхолина (РС) (CM5208, Vertellus Specilities INC, Соединенное Королевство) в этаноле. Затем стенты из Co-Cr со слоем полимера РС погружали три раза в 5 мг/мл pCK-HGF-X7 на 5 минут и сушили в течение 10 минут при 37°С.

(3) Определение количества pCK-HGF-X7, элюируемого со стента из Co-Cr

Для анализа количества pCK-HGF-X7, которые было нагружено на стент из Co-Cr, был выбран большой объем раствора, удаляемого и пополняемого (0,8 мл из 1 мл), для количественного определения элюции pCK-HGF-X7 быстрым и эффективным образом.

Покрытые pCK-HGF-X7 стенты из Co-Cr по отдельности добавляли в криопробирки, содержащие 1 мл физиологического раствора. Пробирки помещали на вальцовый смеситель (HIP-RMF40, Hyunil LAB-MATE, Корея) на 60 минут при условии 40 вращений в минуту. Элюаты pCK-HGF-X7 собирали через 10, 20, 30, 40, 50 и 60 минут. В каждый момент времени извлекали 0,8 мл раствора для анализа в ультрафиолетовой области спектра, и 0,8 мл нового физиологического раствора добавляли обратного в криопробирку для сохранения общего объема раствора. Криопробирку затем помещали на вальцовый смеситель для продолжения эксперимента. Концентрацию извлеченного pCK-HGF-X7 в элюатах, полученных в каждый момент времени, определяли при 260 нм, используя Ultraspec 3000. В качестве отрицательного контроля также проверяли стент из Co-Cr без pCK-HGF-X7, используя вышеприведенный способ количественного определения.

2. Результаты и обсуждение

Результаты приведены в таблицах 3 и 4. Почти 60 мкг и 85 мкг pCK-HGF-X7 элюировалось со стента из Co-Cr без полимерного слоя через одну минуту и 20 минут, соответственно. Также почти 43 мкг pCK-HGF-X7 элюировалось со стента из Co-Cr со слоем полимера через 60 минут. Эти результаты свидетельствуют о том, что плазмидой могут быть покрыты стенты из Co-Cr как без полимерного слоя, так и с таким слоем, и что плазмиду на покрытии можно элюировать со стента из Co-Cr, хотя количество плазмиды, элюируемой со стента из Co-Cr, меньше количества, элюируемого со стента из SS. Поэтому был сделан вывод, что элюирующий плазмиду стент из Co-Cr был с успехом изготовлен.

Таблица 3
Количественное определение pCK-HGF-X7, элюируемой со стента из Co-Cr без слоя полимера
Время экстракции (мин)	Суммарно экстрагированная pCK-HGF-X7
	Отрицательный контроль	Стент из Co-Cr без слоя полимера
мкг pCK-HGF-X7	Относительное извлечение (%)	мкг pCK-HGF-X7	Относительное извлечение (%)
1	0,53±0,14	0	60,20±11,18	70,48
5	0,87±0,03	0	80,52±4,13	94,28
10	1,41±0,18	0	83,52±4,10	97,79
20	1,55±0,11	0	84,77±3,99	99,25
40	1,83±0,24	0	85,41±4,11	100,00

Таблица 4
Количественное определение pCK-HGF-X7, элюируемой со стента из Co-Cr со слоем полимера
Время экстракции (мин)	Суммарно экстрагированная pCK-HGF-X7
	Стент из Co-Cr со слоем полимера
мкг pCK-HGF-X7
60	21,9±0,00

ПРИМЕР 8: Оценка эффективности HGF-X7-элюирующего стента в модели денудации посредством надувного баллона на кроликах

Задачей этого исследования была оценка ускорения реэндотелизации с помощью HGF-X7-элюирующего стента в модели денудации посредством надувного баллона на кроликах.

1. Материалы и методы

(1) Животные

Десять Новозеландских белых кроликов (самцов весом 3,5-4 кг, Doo-Yeol Biotech, Корея) обеспечивали неограниченно пищей и водой после доставки, и им предоставляли 7-дневный покой до подвергания имплантации стента.

(2) Модель денудации посредством надувного баллона и имплантации стента на кроликах

Кроликов подвергали анестезии с использованием внутримышечной инъекции ксилазина (5 мг/кг), а затем кетамина (50 мг/кг). После стерилизации 95% этиловым спиртом и йодом шею покрывали стерильной хирургической тканью, и открывали только область разреза, обеспечивая, тем самым, полностью стерильное условие для хирургического вмешательства. После хирургического обнажения наружной сонной артерии стилет-катетер 5F (Cordis, США) перемещали в наружную сонную артерию. Микрокатетер 2,8F перемещали в проксимальную часть наружной подвздошной артерии после внедрения проволочного направителя 1,4F (Terumo, Япония) в бедренную артерию, используя стандартные рентгеноскопические способы. Вводили 1000 Е гепарина и 0, 1 мг нитроглицерина.

Денудацию посредством надувного баллона наружной подвздошной артерии осуществляли следующим образом. Баллонный катетер 2,5×8 мм (GoodMan Япония) внедряли в наружную подвздошную артерию благодаря проволочному направителю с последующим удалением микрокатетера из кролика. После надувания баллонного катетера (10 атм) эндотелий наружной подвздошной артерии подвергался денудации на приблизительно 1-см участке путем последовательного десятикратного извлечения. Баллонный катетер для денудации наружной подвздошной артерии удалили из кролика, и новый баллонный катетер, оснащенный pCK-HGF-X7-элюирующим стентом из SS (PES) или стентом из чистого металла (BMS), перемещали в наружную подвздошную артерию, которую подвергали денудации. Имплантацию стента осуществляли за 15 секунд при 12 атм надувания баллона. PES (n=10) и BMS (n=10) имплантировали билатерально.

(3) Анализ с использованием оптической когерентной томографии (ОСТ)

Для анализа с использованием оптической когерентной томографии (ОСТ) закупоривающий баллонный катетера Helios (LightLab, США) перемещали в проксимальную часть наружной подвздошной артерии благодаря проволочному направителю, который затем извлекали из кролика. Кабель для передачи изображения ОСТ (LightLab, США) затем помещали на расстоянии 1,5 см от дистального края имплантированного стента. Изображения ОСТ получали, используя 10-мл промывку физиологическим раствором. После извлечения всех устройств из кролика на наружную сонную артерию накладывали лигатуру с использованием 3-0 шелковой нити. Затем разрез проверяли на наличие кровотечения. После остановки кровотечения на разрезанные мышцу, фасцию и кожу накладывали швы. Для предотвращения инфекции внутримышечно вводили гентамицин (3 мг/кг/день) в течение трех дней. Также ежедневно вводили 32,5 мг клопидогрела (Sanofi-Aventis, Франция) и 25 мг аспирина (Bayer, Германия).

(4) Сканирующая электронная микроскопия (SEM)

В день 14 и 28 после имплантации стента животных умерщвляли, и сосуды получали и фиксировали с использованием 2,5% раствора глутаральдегида в течение 2 часов. Фиксированные сосуды промывали трижды забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS), и последующую фиксацию выполняли с использованием 1% раствора OsO₄. После фиксации сосуды промывали трижды PBS, и обезвоживающие процедуры выполняли последовательно с использованием от 60 до 95% этилового спирта. Наконец, осуществляли покрытие золотом обезвоженных сосудов.

(5) Статистические данные

Результаты представляли как среднее ± стандартная ошибка среднего и анализировали, используя SPSS (версии 10.0, SPSS, Inc., Chicago, IL, США). Статистический анализ всех данных осуществляли, используя t-критерий Стьюдента. Р-значения, составляющие менее 0,05, считались значимыми.

2. Результаты и обсуждение

Для определения того, может ли pCK-HGF-X7-элюирующий стент ускорить процесс реэндотелизации, изменения толщины интимы и природы клеток, покрывающих стент, исследовали с помощью OCT и SEM, соответственно.

ОСТ-изображения получали в день 0, 14 и 28 после имплантации стента. Получали девять изображений поперечных сечений из каждого стента. На фиг.14 продемонстрированы данные исходного состояния и последующие данные ОСТ. Результаты после вмешательства были схожими в обеих группах (фиг.14А, день 0). Однако поперечное сечение толщины интимы (ID-CSA, мм²) в PES-группе было значительно расширенным по сравнению с таковым в BMS-группе (фиг.14В, PES в сравнении с BMS, 0,23±0,05 мм² в сравнении с 0,48±0,09 мм², р=0,03). В день 28 после имплантации стента ID-CSA между двумя группами были схожими (фиг.14В, PES в сравнении с BMS, 0,91±0,08 мм² в сравнении с 0,98±0,09 мм², р=0,76). Эти результаты показывают, что pCK-HGF-X7-элюирующий стент усиливал рост клеток на поверхности стента по сравнению со стентом из чистого металла.

Затем с помощью анализа с использованием SEM определи тип клеток, которые подвергаются пролиферации на стенте. SEM проводили в день 14 и 28. На фиг.15 демонстрируется, что эндотелиальные клетки (см. черную стрелку) равномерно покрыли поверхность стента в PES-группе, в то время как в BMS-группе наблюдали смешанную неоинтиму, состоящую из гладкомышечных клеток (см. белую стрелку) и эндотелиальных клеток.

Эти результаты показывают, что pCK-HGF-X7-элюирующий стент может ускорять реэндотелизацию и поэтому быть полезным средством для лечения перекрытых кровеносных сосудов.

Вышеприведенные результаты показывают, что присутствие 2 изоформ HGF (flHGF и dHGF) может эффективнее индуцировать рост и миграцию эндотелиальных клеток in vitro, чем отдельно flHGF или dHGF, и что перенос нуклеотидной последовательности, экспрессирующей обе из 2 изоформ HGF (flHGF и dHGF), in vivo может ускорить процесс реэндотелизации кровеносного сосуда. Эти результаты свидетельствуют о том, что 2 изоформы могут ослаблять рестеноз эффективнее благодаря способности к вызову быстрой реэндотелизации, чем одиночная изоформа HGF.

Полное раскрытие всех приводимых здесь публикаций (включающих патенты, заявки на патенты, журнальные статьи, лабораторные руководства, книги или другие документы) включено сюда посредством ссылки.

1. Применение композиции, включающей эффективное количество двух или более изоформ HGF или одного или нескольких полинуклеотидов, кодирующих изоформы, для производства лекарственного средства для лечения или предупреждения болезни сердца у субъекта, где указанные изоформы HGF включают полноразмерный фактор роста гепатоцитов (flHGF) и вариант фактора роста гепатоцитов с делецией (dHGF).

2. Применение по п.1, при котором лечение или предупреждение болезни сердца происходит путем увеличения перфузии или плотности капилляров ткани сердца у субъекта.

3. Применение по п.2, при котором тканью сердца является ишемизированная ткань сердца.

4. Применение по п.1, при котором лечение или предупреждение болезни сердца происходит путем усиления восстановления эндотелия в месте повреждения сосуда или пораженного болезнью сосуда у субъекта.

5. Применение композиции, включающей эффективное количество двух или более изоформ HGF или одного или нескольких полинуклеотидов, кодирующих изоформы, для производства лекарственного средства для активирования роста эндотелиальных клеток в кровеносном сосуде, где указанные изоформы HGF включают полноразмерный фактор роста гепатоцитов (flHGF) и вариант фактора роста гепатоцитов с делецией (dHGF).

6. Применение по п.5, при котором кровеносный сосуд является поврежденным.

7. Применение по п.6, при котором активируется или ускоряется реэндотелизация указанного кровеносного сосуда.

8. Применение по п.5, при котором кровеносный сосуд находится у субъекта, нуждающегося в предупреждении или лечении рестеноза.

9. Применение по любому из пп.1-8, при котором две или более изоформ HGF вводят в виде полинуклеотидов, кодирующих эти изоформы.

10. Применение по любому из пп.1-4, при котором указанную композицию вводят путем инъекции.

11. Применение по любому из пп.1-8, при котором указанную композицию вводят, используя средство доставки.

12. Применение по п.11, при котором средством доставки является стент.

13. Применение по п.12, при котором стент выбирают из группы, состоящей из стента из нержавеющей стали без слоя полимера, стента из нержавеющей стали со слоем полимера, стента из хромокобальтового сплава без слоя полимера и стента из хромокобальтового сплава со слоем полимера.

14. Применение по п.12, при котором указанная композиция элюируется с указанного стента.

15. Применение по п.1, при котором указанные две или более изоформ HGF, кроме того, включают NK1.

16. Применение по п.1, при котором указанные две или более изоформ HGF состоят из flHGF и dHGF.

17. Применение по п.1, при котором указанные flHGF и dHGF идентичны, каждый по крайней мере на 80%, последовательности дикого типа flHGF человека и dHGF человека.

18. Применение по п.17, при котором указанные flHGF и dHGF идентичны, каждый по крайней мере на 90%, последовательности дикого типа flHGF человека и dHGF человека.

19. Применение по п.18, при котором указанные flHGF и dHGF идентичны, каждый по крайней мере на 95%, последовательности дикого типа flHGF человека и dHGF человека.

20. Применение по п.19, при котором указанные flHGF и dHGF представляют собой flHGF человека и dHGF человека.

21. Применение по п.1, при котором указанные flHGF и dHGF кодируются отдельными полинуклеотидами.

22. Применение по п.1, при котором указанные flHGF и dHGF кодируются одним и тем же полинуклеотидом.

23. Применение по п.1, при котором указанные один или несколько полинуклеотидов функционально связаны с промотором.

24. Применение по п.23, при котором указанным промотором является конститутивный промотор.

25. Применение по п.1, при котором указанные один или несколько полинуклеотидов находятся в различных векторах.

26. Применение по п.1, при котором указанные один или несколько полинуклеотидов находятся в одном и том же векторе.

27. Применение по п.26, при котором указанным вектором является плазмидный вектор.

28. Применение по п.27, при котором указанным плазмидным вектором является вектор рСК.

29. Применение по п.26, при котором указанным вектором является вирусный вектор.

30. Применение по п.1, при котором указанный flHGF и указанный dHGF кодируются гибридной конструкцией HGF, включающей экзоны 1-18 HGF или их вырожденные варианты, которые не изменяют кодируемую аминокислотную последовательность, и дополнительно включающей интрон между экзонами 4 и 5, причем указанная конструкция лишена других интронов между экзонами, отличных от указанного интрона между экзонами 4 и 5.

31. Применение по п.30, при котором указанный интрон является собственным (наследственным) интроном.

32. Применение по п.31, при котором указанная гибридная конструкция HGF включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:7.

33. Применение по п.30, при котором указанный интрон является фрагментом собственного интрона.

34. Применение по п.33, при котором указанная гибридная конструкция HGF включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:8, 9 или 10.

35. Применение по п.1, при котором указанным субъектом является человек, и указанные изоформы HGF вводят в дозе, составляющей от приблизительно 1 мкг до приблизительно 100 мг каждой.

36. Применение по п.1, при котором указанным субъектом является человек, и указанные полинуклеотиды вводят в дозе, составляющей от приблизительно 1 мкг до приблизительно 10 мг.

37. Композиция для лечения или предупреждения болезни сердца у субъекта, включающая эффективное количество двух или более изоформ HGF или одного или нескольких полинуклеотидов, кодирующих изоформы, в качестве активных ингредиентов, где указанные изоформы HGF включают полноразмерный фактор роста гепатоцитов (flHGF) и вариант фактора роста гепатоцитов с делецией (dHGF).

38. Композиция по п.37, для которой лечение или предупреждение болезни сердца происходит путем увеличения перфузии ишемизированной ткани сердца у субъекта.

39. Композиция для активирования роста эндотелиальных клеток в кровеносном сосуде у субъекта, включающая эффективное количество двух или более изоформ HGF или одного или нескольких полинуклеотидов, кодирующих изоформы, в качестве активных ингредиентов, где указанные изоформы HGF включают полноразмерный фактор роста гепатоцитов (flHGF) и вариант фактора роста гепатоцитов с делецией (dHGF).