Липосомы, содержащие олигопептиды - фрагменты основного белка миелина, фармацевтическая композиция и способ лечения рассеянного склероза
Владельцы патента RU 2448685:
Российская Федерация в лице Министерства промышленности и торговли Российской Федерации (RU)
Открытое акционерное общество "Фармсинтез" (RU)
Группа изобретений относится к области медицины и касается липосом, содержащих олигопептиды - фрагменты основного белка миелина, фармацевтической композиции и способа лечения рассеянного склероза. Сущность изобретений включает моноламеллярные липосомы размером 100-200 нм, состоящие из смеси, содержащей 1 мас. часть тетраманнозил-три-L-лизин-диолеоил глицерола и 99 мас. частей 2,3-дипальмитоил-sn-глицеро-1-фосфатидилхолина, и содержащие три олигопептида, последовательность которых соответствует последовательностям фрагментов: 46-62, 124-139 и 147-170 основного белка миелина. В качестве средства для лечения рассеянного склероза предложена фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного компонента моноламмелярные липосомы, а также способ лечения рассеянного склероза, включающий введение пациенту указанной фармацевтической композиции. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 7 пр., 1 табл.
Изобретение относится к медицине, в частности к применению иммунокорригирующих средств для лечения рассеянного склероза (PC), а именно липосом, содержащих интегрированные (нековалентно конъюгированные) олигопептиды, и их использования в качестве активного компонента в фармацевтических композициях, а также к способу использования этих фармацевтических композиций для лечения рассеянного склероза.
Известны лекарственные средства на основе олигопептидов и смесей олигопептидов. Эти олигопептиды представляют собой по химической структуре (аминокислотной последовательности) фрагменты основного белка миелина человека (ОБМ). Такие олигопептиды обозначаются соответственно порядковому номеру первой и последней аминокислоты, считая от С-конца полной аминокислотной цепочки ОБМ. Например, ОБМ 18-32, то есть ASTMDHARHGFLPR, или, например ОБМ 75-98, то есть AGAPVVHPPLAIVTPAT.
Известно, что часть пролиферирующих Т-клеток у больных рассеянным склерозом направлена против ОБМ [Allegretta et al., Science, 1990, v.247, pp.718-721]. Эти Т-клетки человека могут узнавать множественные эпитопы на молекуле ОБМ [Richer I, et al., J. Neuroimmun, 1989, v.23, pp.55-66]. ОБМ, по-видимому, также способен к активации некоторых Т-клеток без вовлечения антиген-презентирующих клеток [Eur. J. Immunol., 1987, v.17, pp.1635-1640].
Возможно, что небольшие олигопептиды-фрагменты ОБМ могут распознаваться Т-клетками без внутриклеточного процессинга просто за счет их способности связывать антигены основного комплекса гистосовместимости класса II на поверхности антиген-презентирующих клеток.
Известны и хорошо изучены эпитопы (участки) ОБМ, ответственные за «узнавание» теми или иными специфическими Т-клетками, выделенными из крови больных PC и обеспечивающими иммунологическую «атаку» на ОБМ, а также В-клетками, которые вырабатывают аутоантитела, направленные против ОБМ.
В связи с обнаружением таких эпитопов предпринимались и предпринимаются попытки с помощью коротких синтетических пептидов (олигопептидов), имеющих последовательность, гомологичную такому эпитопу ОБМ, вызвать состояние иммунологической толерантности или заблокировать (связать) аутоантитела против ОМБ.
Признанной моделью рассеянного склероза человека у животных служит экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ), представляющий собой демиелинизирующий процесс, опосредованный Т-клетками. Течение ЭАЭ может быть приостановлено путем введением мышам синтетических пептидов, содержащих участки, гомологичные иммунодоминантным эпитопам ОБМ [Gaur, A. et al., Science, 1992, v.258, pp.1491-1494]. Более того, введение высоких доз ОБМ снижало количество аутореактивных Т-клеток и уменьшало клинические и патологические симптомы ЭАЭ у мышей [Gritchfield, J.M. et al., Science, 1994, v.263, pp.1139-1143]. Даже оральное введение МБР модулировало течение ЭАЭ за счет индукции периферической толерантности [Chen, W. et al., Science, 1994, v.265, pp.1237-1240].
Было высказано предположение, что толерантность может быть индуцирована у больных PC с помощью перорального введения миелиновых антигенов [Weiner, H.L. et al., Science, 1993, v.259, pp.1321-1324,]. Комбинация миелиновых антигенов и синтетических пептидов указанных антигенов, введенная пероральным, и/или внутривенным, и/или внутриоболочечным путем, возможно, необходима для модулирования Т-клеток, В-клеток и макрофагов, участвующих в деструкции миелина у больных PC.
Так, например, известны олигопептиды: ОБМ 75-98 (имеющий формулу AGAPVVHPPLAIVTPAT) [Заявка US 2005209156]; ОБМ 83-98 (имеющий формулу ENPVVHFFKNIVTPRT); ОБМ 146-160 (имеющий формулу AQGTLSKIFKLGGRD). Последние два были выбраны как олигопептиды несущие эпитопы, распознаваемы иммунодоминантными Т-клетками [Патент США №5858980].
Warren K.G. с соавторами [Warren, K.G. et al., Ann. Neurol, 1994, vol.35, pp.280-289] предложил в качестве средства для лечения PC такие олигопептиды «фрагменты» ОБМ, которые нейтрализуют или снижают продукцию антител против ОБМ у пациентов, страдающих PC.
Олигопептид ОБМ 84-102 был испытан в клиническом исследовании фазы I при лечении вторичного прогрессирующего PC. Дальнейшая разработка препарата была прекращена, поскольку не было выявлено влияния препарата на важнейшие показатели клинического течения PC [Goodkin, D.E. et al., Neurology, 2000, vol.54, pp.1414-1420], а именно изменение неврологического дефицита и скорость появления новых очагов демиелинизации в центральной нервной системе (ЦНС).
Также описан способ направленного подавления определенного клона Т-клеток, отвественного за развитие ЭАЭ у животных и несущего интерферон-индуцибельный маркер CXCR3 с помощью ДНК-плазмиды, помещенной в липосомы. [Chen, W. et al. In vivo administration of plasmid DNA encoding recombinant immunotoxin DT390-IP-10 attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis. J Autoimmun. 2007 Feb; 28(1):30-40. Epub 2007 Jan 30]. Также известно, что путь введения играет важную роль в осуществлении биологического (лечебного) эффекта олигопептидов - фрагментов ОБМ. Так, ингаляционное, но не пероральное введение энцефалитогенных пептидов - фрагментов ОБМ, несущих Т-клеточные доминантные эпитопы, приводило к уменьшению симптомов индуцированного ЭАЭ у животных [Metzler, В. and Wraith, D.C., Inhibition of experimental autoimmune encephalomyelitis by inhalation but not oral administration of the encephalitogenic peptide: influence of MHC binding affinity, Int Immunol., 1993 Sep; 5 (9):1159-65].
Хотя известно, что в случае использования липосомальных вакцин иммунный ответ усиливается вследствие того, что антигены, ассоциированные с липосомами, попадают непосредственно в антигенпредставляющие клетки [Gluck, R. (1995) In Vaccine Design: The Submit and Adjuvant Approch (Powell M.F., Newman M.J., eds)., Plenum Press. P.325-345], в случае олигопептидов - фрагментов ОМБ не является очевидным, что их введение в организм в составе тех или иных частиц приведет к появлению или усилению позитивного клинического эффекта.
Описано, что олигопептиды - фрагменты ОБМ (в частности, ОБМ 68-86 и ОБМ 87-99, но не ОБМ 110-128) оказывают синергидный лечебный эффект на течение ЭАЭ, когда вводятся совместно. При этом также использование интраназального пути введения приводило к большему эффекту, чем подкожное введение смеси этих олигопептидов в полном адъюванте Фрейнда [Liu, J.Q. et al., Inhibition of experimental autoimmune encephalomyelitis in Lewis rats by nasal administration of encephalitogenic MBP peptides: synergistic effects of MBP 68-86 and 87-99. Int Immunol., 1998 Aug; 10(8):1139-48].
Также предпринимались попытки усилить лечебное действие олигопептида - фрагмента ОБМ (а именно ОБМ 113-122) при ЭАЭ путем предварительной липофилизации олигопептида и внедрения в липосомы перед введением. Однако такая «липосомальная» адъюванитизация не приводила к усилению эффекта при подкожном введении [Avrilionis K and Boggs JM., Suppression of experimental allergic encephalomyelitis by the encephalitogenic peptide, in solution or bound to liposomes, J Neuroimmunol. 1991 Dec; 35(1-3):201-10].
Нельзя также не упомянуть глатирамера ацетат (ГА), представляющий собой сложную смесь полипептидов, полученных путем полимеризации четырех аминокислот: глутамата, лизина, аланина и тирозина (CAS No. 147245-92-9), который имеет следующую условную структурную формулу: (Glu, Ala, Lys, Туг), ХСН3СООН).
Способность ГА предотвращать ЭАЭ у животных была обнаружена случайно, и хотя к настоящему моменту препарат проявил свою эффективность у десятков тысяч пациентов PC, окончательной и однозначной теории механизма его действия не предложено. Как считается, иммуноспецифические эффекты ГА включают в себя: вытеснение ОБМ из связи с белками основного комплекса гистосовместимости; ингибирующее влияние на Т-клеточные рецепторы миелин-специфичных лимфоцитов; индукция клона ГА-специфичных Т-лимфоцитов 2 типа, подавляющих иммунный ответ в очагах демиелинизации благодаря выбросу противовоспалительных цитокинов IL-4 и IL-10 и др.
Таким образом, проблема эффективного лечения (или профилактики обострений) рассеянного склероза путем введения в организм пациента тех или иных коротких пептидов - фрагментов ОБМ и их сочетаний с помощью того или иного носителя и/или того или иного пути введения остается до конца нерешенной в клинической практике.
Наиболее близким к настоящему изобретению является фармацевтическая композиция и способ лечения рассеянного склероза, описанные в патенте RU 2198893, выбранные в качестве прототипа.
Однако в известном способе в качестве фрагмента ОМБ используют один пептид ОБМ 82-98: (Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn lie Val Thr Pro Arg Thr, то есть DENPVVHFFKNIVTPRT), что является недостаточным для индукции иммунологических реакций в отношении нескольких клональных пулов Т (или В) - лимфоцитов, обладающих активностью против нескольких эпитопов ОБМ.
При этом именно низкая «a priori» постулируемая антигенность этого короткого пептида указывается в качестве его преимущества. Кроме того, применение этого олигопептида у больных рассеянным склерозом в клинике оказалось неэффективным.
Задачей настоящего изобретения является создание средства (фармацевтической композиции), обладающего иммунокорригирующими свойствами, не вызывающего аллергических реакций обладающего высокой активностью как в отношении экспериментальных моделей рассеянного склероза (в частности ЭАЭ), так и в отношении течения рассеянного склероза у больных этим заболеванием.
Поставленная задача решена путем использования в качестве активного компонента средства для лечения рассеянного склероза смеси (1:1:1 по массе) трех олигопептидов - фрагментов ОБМ следующей структуры:
| Олигопептиды - фрагменты ОБМ | Формула/структура | Соответствие положению последовательности аминокислот в ОБМ человека |
| 1 | GGDRGAPKRGSGKDSHH | 46-62 |
| 2 | GFGYGGRASDYKSAHK | 124-139 |
| 3 | QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR | 147-170 |
причем указанная смесь заключена в моноламеллярные липосомы размером от 100 до 200 нм следующего состава: 1 мас. часть тетраманнозил-три-L-лизин-диолеоил глицерол и 99 мас. частей 2,3-дипальмитоил-sn-глицеро-1-фосфатидилхолина. Как было выявлено в процессе работы над изобретением (исследовали вариации различных размеров и состава липосом), наибольшую способность снижать степень выраженности ЭАЭ у животных проявляла смесь вышеуказанных олигопептидов, в которой их соотношение в смеси составляло 1:1:1 по молярной массе, а состав липидов моноламеллярных липосом был: 1 часть по массе тетраманнозил-три-L-лизин-диолеоил глицерол и 99 частей 2,3-дипальмитоил-sn-глицеро-1-фосфатидилхолина.
Таким образом, согласно изобретению предложены моноламелллярные липосомы размером от 100 до 200 нм, содержащие смесь олигопептидов GGDRGAPKRGSGKDSHH; GFGYGGRASDYKSAHK; QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR, молярное соотношение между которыми составляет 1:1:1, при этом массовое соотношение смеси олигопептидов и липидного компонента липосом составляет 1:50, а липиды липосом представляют собой смесь тетраманнозил-три-L-лизин-диолеоил глицерола - 1 часть и 2,3-дипальмитоил-sn-глицеро-1-фосфатидилхолина - 99 частей по массе.
Далее согласно изобретению предложена фармацевтическая композиция, включающая активный компонент и подходящие носители и/или растворители, отличающаяся тем, что содержит в качестве активного компонента моноламеллярные липосомы в эффективном количестве размером от 100 до 200 нм, содержащие олигопептиды GGDRGAPKRGSGKDSHH; GFGYGGRASDYKSAHK; QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR, молярное соотношение между которыми составляет 1:1:1, при этом массовое соотношение смеси олигопептидов и липидного компонента липосом составляет 1:50, а липиды липосом представляют собой смесь, содержащую 1 мас. часть тетраманнозил-три-L-лизин-диолеоил глицерола и 99 мас. частей 2,3-дипальмитоил-sn-глицеро-1-фосфатидилхолина.
Далее согласно изобретению предложен способ лечения рассеянного склероза, включающий введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции, которая содержит в качестве активного компонента моноламеллярные липосомы размером от 100 до 200 нм, содержащие олигопептиды GGDRGAPKRGSGKDSHH; GFGYGGRASDYKSAHK; QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR, молярное соотношение между которыми составляет 1:1:1, при этом массовое соотношение смеси олигопептидов и липидного компонента липосом составляет 1:50, а липиды липосом представляют собой смесь 1 мас. часть тетраманнозил-три-L-лизин-диолеоил глицерола и 99 мас. частей 2,3-дипальмитоил-sn-глицеро-1-фосфатидилхолина.
Не желая связывать изобретение с какой-либо конкретной теорией, авторы настоящего изобретения полагают, что причина высокой эффективности заявляемых липосом согласно настоящему изобретению заключается в том, что презентация нескольких специфических антигенов - олигопептидов GGDRGAPKRGSGKDSHH; GFGYGGRASDYKSAHK; QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR - фрагментов ОБМ в определенной форме (липосомы определенного подобранного состава) иммуноцитам (Т- и В-лимфоцитам, ответственным за аутоиммунное поражение тканей центральной нервной системы), приводит к значительному усилению эффективности лечения рассеянного склероза. Данные олигопептиды, введенные в липосомы определенного состава, попадают в эффекторные клетки иммунной системы непосредственно (преимущественно минуя контакт с антигенпрезентирующими клетками). Это приводит как к возникновению состояния более длительной и полной толерантности (в отношении аутоиммунных Т-клеток), так и к связыванию аутоантител с олигопептидами, внедренными в липидный бислой липосом. Такая конструкция (лиспосомы выбранного состава с включенными в нее вышеуказанными олигопептидами) имитирует мембрану живой клетки, и введение такой конструкции приводит в более полному и длительному связыванию аутоантител против ОБМ с тем или иным аналогом эпитопа ОБМ, находящемся в составе олигопептида. В процессе работы над изобретением были приготовлены и испытаны другие варианты липосом, в частности липосомы, постоенные из смеси яичного лецитина и дипальмитоилфосфатидилхолина; также испытывались и липосомы, содержащие некоторые другие маннозилированные липиды и некоторые другие олигопептиды - фрагменты ОБМ (в частности, DENPWHFFKNIVTPRT). Однако на основании данных об эффективности тех или иных вариантов липосом как активного компонента фармацевтической композиции при лечении ЭАЭ у животных были выбраны заявляемые липосомы, как обеспечивающие наибольшую лечебную эффективность заявляемой фармацевтической композиции.
При клиническом применении наиболее эффективным (как в плане снижения количества активированных в отношении ОБМ Т-лимфоцитов, так и в плане снижения количества аутоантител против ОБМ), неожиданно оказалось введение фармацевтической композиции, содержащей заявленные липосомы от одного до двух раз в день в разовых дозах от 50 до 200 мг.
Лабораторные испытания и клинические примеры подтверждают возможность широкого применения заявляемого изобретения.
Синтез олигопептидов осуществляли на автоматическом пептидном синтезаторе с использованием стандартной FMOC-стратегии. Строение олигопептидов было подтверждено с помощью MALDI-масс-спектрометрии. Фосфолипиды были закуплены в компании Sigma - Aldrich.
Размеры и ламеллярность липосом определяли с помощью динамического лазерного светорассеяния и электронной микроскопии.
Для выявления Т-лимфоцитов, опосредующих аутоиммунное повреждение ОБМ, мононуклеарные клетки периферической крови (МНПК) выделяли центрифугированием на градиенте плотности раствора Фиколл-Пак ("Sigma", США). С помощью камеры Горяева определяли количество МНПК в 1 мл питательной среды RPMI 1640 ("Биолот", г.Санкт-Петербург). Затем в стерильных условиях ламинарного бокса ("Labconco", США) МНПК вносили в лунки 24-луночных плоскодонных планшетов в конечной концентрации 1×106/мл и культивировали в среде RPMI 1640 с добавлением L-глутамина ("Биолот", г.Санкт-Петербург), эмбриональной телячьей сыворотки ("Биолот", г.Санкт-Петербург) и коктейля антибиотиков ("Sigma", США) в присутствии ОБМ ("Cusabio Biotech", США) или без него. Культивирование клеток проводили при 37°С в CO2-инкубаторе ("Joan", США). Между 5 и 14 днем суспензию культивируемых клеток переносили в 96-луночные планшеты с 3H-тимидином (0,5 микроКюри). После 18-часовой инкубации клеточную суспензию отмывали, центрифугировали и определяли на жидкостном сцинциляторе (LKB) радиоактивность образцов. Вычисляли индекс стимуляции (ИС), то есть количественную характеристику активности Т-лимфоцитов, опосредующих аутоиммунное повреждение ОБМ, по формуле:
ИС = радиоактивность с ОБМ / радиоактивность без ОБМ.
Уровень МВР-специфических IgG аутоантител в сыворотке пациентов с рассеянным склерозом определяли иммуноферментным методом [A.J.Chamczuk et al., A rapid ELISA-based serum assay for myelin basic protein in multiple sclerosis, Journal of Immunological Methods, Volume 262, Issues 1-2, 1 April 2002, Pages 21-27].
Пример 1. Приготовление липосом, содержащих олигопептиды GGDRGAPKRGSGKDSHH; GFGYGGRASDYKSAHK; QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR.
45 г смеси фософолипидов, содержащей 1 мас. часть тетраманнозил-три-L-лизин-диолеоил глицерола и 99 мас. частей 2,3-дипальмитоил-sn-глицеро-1-фосфатидилхолина, растворяют в 450 мл хлороформа и помещают в колбу ваккумного испарителя емкостью 1 л. Хлороформ выпаривают под вакуумом для образования липидной пленки на стенках колбы. После окончания выпаривания колба заполняется азотом и в нее медленно добавляется 800 мл воды для инъекций. Затем колбу помещают в ультразвуковую баню на 30 минут для дезинтегрирования липидов в водной среде для получения эмульсии дезинтегрированных липосом.
0,75 г смеси пептидов GGDRGAPKRGSGKDSHH; GFGYGGRASDYKSAHK; QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR (в молярном соотношении 1:1:1) растворяют в 40 мл воды для инъекций. К этому раствору олигопептидов добавляют эмульсию дезинтегрированных липосом и содержимое колбы перемешивают в течение 30 минут. Получившуюся эмульсию моноламеллярных липосом, размером 100-200 нм, содержащих олигопетиды, разливают по флаконам для лиофилизации и лиофилизируют.
Пример 2. Приготовление липосом, содержащих олигопептиды GGDRGAPKRGSGKDSHH; GFGYGGRASDYKSAHK; QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR.
45 г смеси фософолипидов, содержащей 1 мас. часть тетраманнозил-три-L-лизин-диолеоил глицерола и 99 мас. частей 2,3-дипальмитоил-sn-глицеро-1-фосфатидилхолина, растворяют в 450 мл хлороформа и помещают в колбу ваккумного испарителя емкостью 1 л. Хлороформ выпаривают под вакуумом для образования липидной пленки на стенках колбы. После окончания выпаривания колбу заполняют азотом и в медленно добавляют в нее 800 мл воды для инъекций. Затем полученную смесь и (эмульсию) переносят в проточный дезинтегратор. Устанавливают давление ударного объема дезинтегратора 150 МПа. За одну загрузку в в проточный дезинтегратор загружают 100 мл смеси, эмульсию получившихся липосом собирают в приемнике дезинтегратора.
0,75 г смеси пептидов GGDRGAPKRGSGKDSHH; GFGYGGRASDYKSAHK; QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR (в молярном соотношении 1:1:1) растворяют в 40 мл воды для инъекций. К этому раствору олигопептидов добавляют эмульсию дезинтегрированных липосом и содержимое колбы перемешивают в течение 30 минут. Получившуюся эмульсию моноламеллярных липосом, размером 100-200 нм, содержащих олигопетиды, разливают по флаконам для лиофилизации и лиофилизируют.
Пример 3. Приготовление фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного компонента липосомы, содержащие олигопептиды GGDRGAPKRGSGKDSHH; GFGYGGRASDYKSAHK; QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR.
К 1000 мг лиофилизированных липосом, приготовленных, как это описано в Примере 1, в стерильных условиях добавляют 100 мл ФБР с последующим легким встряхиванием и в качестве антиокислителя бета-каротин до концентрации 0,01%. Получились моноламеллярные липосомы, содержащие олигопептиды GGDRGAPKRGSGKDSHH; GFGYGGRASDYKSAHK; QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR. Размер липосом составил 100-200 нм. Эмульсия липосом в стерильных условиях в атомосфере азота разливается по 10 мл по флаконам из стекла гидролитического класса I и флаконы укупориваются резиновыми пробками и обжимаются алюминиевыми колпачками.
Пример 4. Приготовление фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного компонента липосомы, содержащие олигопептиды GGDRGAPKRGSGKDSHH; GFGYGGRASDYKSAHK; QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR (вариант).
К 1000 мг порошка лиофилизированных липосом, приготовленных, как это описано в Примере 1, в стерильных условиях добавляют в качестве антиокиcлителя 2 мг альфа-токоферола. В стерильных условиях в атомосфере азота смесь в сухом виде рассыпают по 100 мг по флаконам из стекла гидролитического класса I и флаконы укупоривают резиновыми пробками и обжимают алюминиевыми колпачками. Перед применением к содержимому флакона добавляют 1-2 мл воды для инъекций и встряхивают 1-2 мин до образования однородной эмульсии липосом (100-200 нм).
Пример 5. Ингибирующая активность липосом, содержащих олигопептиды GGDRGAPKRGSGKDSHH; GFGYGGRASDYKSAHK; QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR в отношении развития и течения экспериментального аллергического энцефаломиелита у крыс линии DA.
Для индукции ЭАЭ крысам линии DA, массой 220-250 г, (возраст 12-14 месяцев) подкожно в переднюю лапку вводили 10 мкг энцефалогенного фрагмента основного белка миелина (ARTTHYGSLPQKSQRSQ), («Anaspec», США), эмульсифицированного в полном адъюванте Фрейнда («Difco», США) (1:10, вес/объем). Крысы взвешивались каждый день и оценивались на наличие неврологических симптомов ЭАЭ. Оценка производилась в соответствии со следующей шкалой: (0) - отсутствие симптомов ЭАЭ; (1) - снижение тонуса хвоста; (2) - снижение рефлекса выпрямления; (3) - парезы; (4) - полный паралич; (5) - агония или смерть. Промежуточные по тяжести симтомы ЭАЭ оценивались, соответственно, путем уменьшения или увеличения балла оценки на 0,5. На 6 день после индукции ЭАЭ животные случайным образом распределялись в различные группы (по 12 животных в группе). Животным соответствующей группы с 6 по 11 дни включительно (после индукции) вводили подкожно: либо заявляемые липосомы, приготовленные, как это описано в Примере 2, разведенные (эмульгированные в фосфатном солевом растворе, рН 7.4) (ФБР), либо препарат позитивного контроля - глатирамера ацетат (ГА) (Копаксон, Teva Pharmaceutical Industries Ltd, Израиль), либо прототип (олигопептид DENPVVHFFKNIVTPRT), либо плацебо (растворитель - забуференный фосфатный солевой раствор (ФБР) (рН 7.4)). Все растворы олигопептидов, глатирамера ацетата и эмульсию заявляемых липосом готовили ех tempore с использованием в качестве растворителя забуференный фосфатный солевой раствор (ФБР) (рН 7.4). Исследуемые растворы или эмульсия заявленных липосом вводились в объеме 0,1 мл/животное ежедневно один раз в день. Разовая доза олигопептида DENPVVHFFKNIVTPRT (прототип), заявленных липосом и глатирамера ацетата составляли 160 мкг на животное.
Результаты эксперимента представлены в Таблице 1:
| Таблица 1 | ||||
| Влияние прототипа, заявляемых липосом, плацебо и глатирамерацетата на течение ЭАЭ у крыс линии DA | ||||
| Выраженность неврологических симптомов ЭАЭ в баллах (среднее) | ||||
| День после индукции ЭАЭ | Заявляемые липосомы | Прототип | Плацебо | ГА |
| -1 | 0,00 | 0,00 | 0,00 | 0,00 |
| 0 | 0,00 | 0,00 | 0,00 | 0,00 |
| 1 | 0,00 | 0,00 | 0,00 | 0,00 |
| 2 | 0,00 | 0,00 | 0,00 | 0,00 |
| 3 | 0,00 | 0,00 | 0,00 | 0,00 |
| 4 | 0,00 | 0,00 | 0,00 | 0,00 |
| 5 | 0,00 | 0,00 | 0,00 | 0,00 |
| 6 | 0,00 | 0,00 | 0,00 | 0,00 |
| 7 | 0,00 | 0,00 | 0,00 | 0,00 |
| 8 | 0,75 | 0,58 | 0,50 | 0,50 |
| 9 | 1,25 | 1,33 | 1,50 | 1,67 |
| 10 | 1,92 | 2,42 | 2,33 | 2,17 |
| 11 | 1,58 | 2,33 | 2,42 | 2,25 |
| 12 | 1,50 | 2,50 | 2,34 | 2,25 |
| 13 | 1,17 | 2,17 | 1,92 | 2,83 |
| 14 | 1,08 | 2,00 | 2,17 | 2,75 |
| 15 | 0,50 | 1,83 | 1,92 | 2,33 |
| 16 | 0,08 | 1,67 | 1,58 | 2,08 |
| 17 | 0,17 | 1,33 | 1,93 | 2,17 |
| 18 | 0,08 | 1,42 | 1,83 | 2,17 |
| 19 | 0,08 | 1,08 | 1,75 | 1,75 |
| 20 | 0,00 | 0,83 | 1,67 | 1,67 |
Как следует из таблицы 1, заявленные липосомы обладают гораздо большей способностью уменьшать выраженность и скорость развития симптомов ЭАЭ у животных, чем прототип и глатирамера ацетат.
Пример 6. Больная СДА, 30 лет. Диагноз: рассеянный склероз, церебро-спинальная форма, с прогрессирующим течением. Терапия кортикостероидными препаратами, интерфероном бета и глатирамера ацетатом не привела к успеху. Неврологический дефицит и когнитивные расстройства нарастали. Уровень антител к ОБМ составил 107 Ед/мл. ИС Т-лимфоцитов составил 6,5. Пациенту с его согласия начали введение заявляемой фармацевтической композиции, приготовленной, как это описано в Примере 3, в дозе 200 мг через день подкожно. Длительность введения составила 6 месяцев. За время лечения наблюдалась частичная регрессия неврологического дефицита. Оценка неврологического дефицита в баллах по шкале EDSS уменьшилась на 1,5 балла. Уровень аутоантител Ig G к ОБМ уменьшился до неопределяемых величин. ИС Т-лимфоцитов составил 2. Таким образом, заявляемая фармацевтическая композиция и способ лечения рассеянного склероза обладают значимой клинической эффективностью при лечении рассеянного склероза.
Пример 7. Больной МКЕ, 36 лет, с диагнозом рассеянный склероз, церебро-спинальная форма, ремитирующее течение, стадия обострения процесса. Длительность заболевания 3 года. Неоднократно лечился кортикостероидными препаратами. Неврологическом статус: горизонтальный нистагм при взгляде вправо, сухожильные рефлексы живые, на ногах S<D. Брюшные рефлексы верхние низкие, средние и нижние отсутствуют. Симптом Бабинского с двух сторон. Клонусы стоп, грубее справа. Парезов конечностей нет, мышечный тонус не изменен. Походка атактическая. В позе Ромберга неустойчив. Атаксия при выполнении пяточно-коленной пробы. Задержка мочеиспускания. Балл по шкале EDSS составлял 6.
Осмотр окулиста: побледнение височных половин дисков зрительных нервов.
При исследовании МНПК пациента у него были выявлена активность Т-лимфоцитов в отношении ОБМ с индексом стимуляции (ИС) 7,45. Уровень аутоантител IgG составил 75 Ед/мл.
С согласия пациента ему были проведены внутривенные инъекции прототипа 1 раз в 2 недели по 500 мг. (Всего 6 инъекций в течение 12 недель.) Через каждые 7 дней после каждой инъекции у пациента отбирались пробы периферической (венозной) крови на предмет изменений активности Т-лимфоцитов в отношении ОБМ и уровня аутоантител. На протяжении 7 недель клиническая картина умеренно ухудшалась. Уровень IgG составил к 4 неделе 112 Ед/мл, а ИС Т-лимфоцитов увеличился вдвое.
После этого в связи с неэффективностью предыдущей терапии пациенту с его согласия назначен заявляемый препарат в дозе 100 мг 1 раз в две недели. (Всего 6 инъекций в течение 12 недель.)
На 3-й неделе после начала терапии с помощью заявляемой фармацевтической композицией наступили признаки ремиссии. Уровень IgG составил к 8 неделе 25 Ед/мл, а ИС Т-лимфоцитов уменьшился втрое по отношению к ИС, измеренному перед началом лечения заявленной фармацевтической композицией. Нормализовалась мочеиспускание и походка. В позе Ромберга устойчив. Пяточно-коленную пробу выполняет четко. Оценка по шкале EDSS 5 баллов.
Таким образом, заявляемая фармацевтическая композиция и способ лечения рассеянного склероза обладают значимой клинической эффективностью.
1. Моноламеллярные липосомы размером от 100 нм до 200 нм, содержащие смесь олигопептидов, аминокислотная последовательность которых соответствует аминокислотным последовательностям фрагментов 46-62, 124-139, 147-170 основного белка миелина:
GGDRGAPKRGSGKDSHH;
GFGYGGRASDYKSAHK;
QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR,
молярное соотношение между которыми составляет 1:1:1, при этом массовое соотношение смеси олигопептидов и липидного компонента липосом составляет 1:50, а липиды липосом представляют собой смесь 1 мас.ч. тетраманнозил-три-L-лизин-диолеоил глицерола и 99 мас.ч. 2,3-дипальмитоил-sn-глицеро-1-фосфатидилхолина.
2. Фармацевтическая композиция для лечения рассеянного склероза, включающая моноламеллярные липосомы по п.1 в эффективном количестве и подходящие носители и/или растворители.
3. Способ лечения рассеянного склероза, включающий введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции по п.2.
4. Способ лечения по п.3, отличающийся тем, что фармацевтическую композицию вводят подкожно в дозе от 100 до 200 мг с частотой от одного раза в две недели до 1 раза в два дня.
5. Способ лечения по п.3 или 4, отличающийся тем, что фармацевтическую композицию вводят длительными курсами, продолжительностью от 12 недель до 6 месяцев.
