Штамм bifidobacterium bifidum, используемый для получения бифидосодержащей продукции

Изобретение относится к пищевой, косметической, биотехнологической и медицинской промышленности. Штамм Bifidobacterium bifldum 74-22 обладает кислотообразующей активностью и антагонистической активностью в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и депонирован в Государственной коллекции нормальной микрофлоры (ГКНМ) ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора под регистрационным номером 244. Изобретение позволяет получать кисломолочные, ферментированные и неферментированные пищевые продукты, гигиенические и косметические средства, биологически активные добавки и бактерийные препараты, обеспечивающие нормализацию микробиоценозов организма человека, в т.ч. желудочно-кишечного и мочеполового трактов, кожных и слизистых покровов. 2 табл., 5 пр.

 

Изобретение относится к пищевой, косметической, биотехнологической и медицинской промышленности, в частности, используется для приготовления кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств, биологически активных добавок и бактерийных препаратов.

В связи с неблагоприятными экологическими условиями, стрессами, длительной антибактериальной, лучевой и химиотерапией, дисбиозами, возникающими вследствие перенесенных заболеваний, увеличивается количество людей, страдающих нарушениями нормальной микрофлоры организма. Для лечения и профилактики этих нарушений все большее внимание уделяется как препаратам, обладающим пробиотическим действием, так и пищевым продуктам содержащим бифидобактерии.

В кишечнике человека, в основном, встречаются 5 видов бифидобактерий: B. bifidum, B. longum, B. adolescentis, B. breve и B. infantis. Из них с наибольшей частотой в биоценозе обнаруживаются виды B. bifidum и B. longum. Вид B. adolescentis чаще встречается у взрослых людей, а виды B.breve и B.infantis - преимущественно у детей грудного возраста.

Известны зарубежные моно- и комплексные препараты-эубиотики и кисломолочные продукты, включающие в свой состав бифидобактерии видов B. bifidum, B. lonqum, B. adolescentis, B. breve (патент 2336886, патент 2411008, Франция; патент 637297, Швейцария; патент 2134179, патент 2421066, ФРГ; патент 05227946, патент 0430642, Япония; патент 4645667, США, патент 6063935, Япония, патент 5922375, США, патент 5902743, США, патент 6746672, США, патент 6548057, США). У нас в стране для приготовления бактерийных препаратов, биологически активных добавок, продуктов лечебно-диетического питания применяют отечественные штаммы бифидобактерий видов B. bifidum 1,791,792; B. lonqum B379M, Я-2, Я-4; B. adolescentis MC-42, Г 7513; В. breve 79-119; B. infantis 79-43 (авторское свидетельство №343588, патент РФ 1347221, патент РФ 849779, патент РФ 2108383, патент РФ 2152993, патент 863639, патент РФ 2120991, патент РФ 2078814, патент РФ 2111248).

Качество лечебных продуктов и препаратов во многом обусловлено свойствами штамма-продуцента - его специфической активностью и технологичностью. Большой ассортимент биологически активных и технологичных штаммов бифидобактерий делает возможной разработку новых моно- и комплексных продуктов лечебного питания и бакпрепаратов, способных обеспечивать высокую колонизационную резистентность кишечника человека, восстановить его нормальную микрофлору и снизить заболеваемость различными кишечными инфекциями.

Задачей настоящего изобретения является получение штамма микроорганизмов вида B.bifidum 74-22 с высокой биологической активностью, устойчивостью к условиям внешней среды, обладающего стабилизирующим кислотообразованием во всем температурном диапазоне развития клеток, антагониститчески активного по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, быстро размножающегося на искусственных питательных средах.

Штамм Bifidobacterium bifidum 74-22 выделен из содержимого кишечника здорового ребенка грудного возраста и депонирован в Государственной коллекции нормальной микрофлоры (ГКНМ) ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора под №244.

Заявляемый штамм может быть использован при производстве кисломолочной продукции, ферментированных пищевых продуктов, например кваса, пива и т.п., неферментированных пищевых продуктов, например соков, напитков и т.п., биологически активных добавок к пище. Штамм Bifidobacterium bifidum 74-22 может широко использоваться также для производства гигиенических и косметических средств, например кремов, лосьонов, салфеток, мыла, присыпок, тампонов, питательных масок, гелей, женских прокладок, косметического молочка, различных пудр и т.д.

Кроме того, штамм Bifidobacterium bifidum 74-22 может быть использован при производстве бактериальных препаратов, в виде свечей, пероральных и других средств.

Техническим результатом заявленного изобретения является получение штамма Bifidobacterium bifidum 74-22, который может быть использован в качестве биологически активного вещества в составе кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств, биологически активных добавок и бактерийных препаратов. Штамм Bifidobacterium bifidum 74-22 обладает биологически и технологически значимыми свойствами, такими как высокая кислотообразующая активность и способность наращивать микробную биомассу в короткие сроки культивирования. Штамм Bifidobacterium bifidum 74-22 антагонистически активен по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам. Это позволит использовать штамм Bifidobacterium bifidum 74-22 в качестве биологически активного компонента в составе различных пробиотических средств, обеспечивающих нормализацию микробиоценозов организма человека, в т.ч. желудочно-кишечного и мочеполового трактов, кожных и слизистых покровов, и расширит арсенал аналогичных средств.

Культурально-морфологические свойства штамма.

Клетки представляют собой гр+ полиморфные палочки с бифуркацией или утолщением на 1-2 концах, в жидких питательных средах растут по всей высоте объема, кроме зоны аэробиоза. Отдельно выросшие колонии на печеночной питательной среде имеют удлиненную форму колоний. Логарифмическая фаза роста заканчивается к 12-24 часам культивирования.

Физико-биохимические свойства штамма.

Бесспоровый, неподвижный анаэроб. Оптимальная температура выращивания 38,0±0,5°С. Каталазу не образует, желатину не разжижает. Сбраживает глюкозу с образованием уксусной и L + молочной кислот, без образования газа, закисляя среду выращивания до рН 4,3-3,9.

Ферментирует лактозу, фруктозу, галактозу, сахарозу. Не ферментирует сорбит, арабинозу, салицин, инулин, целлобиозу, ксилозу, маннозу, манит. Штамм Bifidobacterium bifidum 74-22 обладает антагонистической активностью по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре (таблица 1).

Таблица 1
Антагонистическая активность штамма В. bifidum 74-22
Штамм	Зона задержки роста тест-культур мм/ М±т
Sh. sonnet	Sh. flexneri	E. coli	S. aureus	Pr. vulgaris
В. bifidum 74-22	28±2,6	20±2,8	12±2,4	18±1,6	16±2.2

Штамм активно наращивает микробную массу при росте на гидролизатно-молочной среде (ГМ), Бифидум-среде (БФ), продуцируя кислоты (таблица 2).

Таблица 2
Накопление микробной массы (КОЕ/мл lg 10 и активность кислотообразования ( в градусах Тернера) штамма B.bifidum 74-22 в динамике развития
ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА	ВРЕМЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
	12 ч	24 ч	48 ч
КОЕ	Т°	КОЕ	Т°	КОЕ	Т°
ГМ	7,6	92	8,0	106	7,0	118
БФ	8,2	86	9,4	118	7,6	134

Штамм максимально накапливает микробную массу к 12-24 часам, достигая в 1 мл lg 8-9 микробных клеток, активно продуцирует кислоты.

Таким образом, предлагаемый штамм В. bifidum 74-22 технологичен, поскольку размножается в различных питательных средах с накоплением производственной биомассы с высокой концентрацией бифидобактерий; обладает кислотообразующей активностью, а также антагонистической активностью в отношении к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам.

Кисломолочные, ферментированные, неферментированные пищевые продукты, гигиенические, косметические средства, биологически активные добавки и бактерийные препараты, содержащие штамм В. bifidum 74-22, могут найти широкое применение в пищевой, медицинской, биотехнологической и косметической промышленности.

Способность штамма В. bifidum 74-22 наращивать биомассу в питательной среде в короткие сроки культивирования, кислотообразующая активность, антагонистическая активность по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре, а также другие полезные для организма человека свойства, характерные для вида В. bifidum, делают возможным использование штамма в составе различных корригирующих средств лечебно-профилактического назначения.

Пример 1. Использование штамма В. bifidum 74-22 в составе биологически активных добавок.

1 пассаж: лиофилизированный штамм В. bifidum 74-22 в количестве 0,1 г сухой биомассы вносят в пробирки с питательной средой и титруют методом десятикратных разведений до 10^-9. Инкубируют при температуре 38,0±0,5°С до образования видимого роста в последних разведениях.

2 пассаж: выросшую культуру из 10^-7-9 разведении в объеме до 10% вносят в питательную среду и культивируют при температуре 38,0±0,5°С в течение 12-24 ч до образования густого роста с видимой зоной аэробиоза.

3 пассаж: полученную биомассу в количестве до 10% объема вносят в среду накопления и культивируют 12-24 ч при 38,0±0,5°С до получения биомассы с содержанием живых бифидобактерий не менее 10⁸/мл.

В результате получают биологически активную добавку, которая представляет собой жидкий концентрат с высоким, не менее 10⁸/мл, содержанием бифидобактерий. При выслушивании концентрата с защитными средами (сахарозо-желатиновая среда, обезжиренное молоко или другие) получают сухую биологически активную добавку с содержанием бифидобактерий не менее 10⁷/мл.

Пример 2. Использование штамма В. bifidum 74-22 для приготовления ферментированных и неферментированных пищевых продуктов.

1 пассаж: лиофилизированный штамм В. bifidum 74-22 в количестве 0,1 г сухой биомассы вносят в пробирки с питательной средой и титруют методом десятикратных разведений до 10^-9. Инкубируют при 38,0±0,5°С до образования видимого роста в последних разведениях.

2 пассаж: выросшую культуру из 10^-7-9 разведении в объеме до 10% вносят в питательную среду и культивируют при температуре 38,0±0,5°С в течение 12-24 ч до образования густого роста с хорошо видимой зоной аэробиоза.

3 пассаж: полученную биомассу в количестве до 10% объема вносят в среду накопления и культивируют 12-24 ч при 38,0±0,5°С до получения биомассы с содержанием живых бифидобактерий не менее 10⁸/мл.

Получение ферментированного или неферментированного пищевого продукта: выросшую биомассу вносят в пищевое сырье (молоко, соки, пиво, квас и пр.) в количестве до 10% от объема, перемешивают и разливают в емкости. В результате получают продукт с концентрацией живых бифидобактерий не менее 10⁶/мл.

Пример 3. Использование штамма В. bifidum 74-22 для приготовления кисломолочного продукта.

1 пассаж: лиофилизированный штамм вносят в среду культивирования и титруют методом десятикратных разведений до 10^-9. Инкубируют при 38,0±0,5°С до образования видимого роста в последних разведениях. Или сухую лиофилизированную биомассу бифидобактерий вносят в количестве 1-2 дозы в пробирку с 30 мл питательной среды. Культивируют при температуре 38,0±0,5°С до получения биомассы с содержанием живых бифидобактерий не менее 10⁷/мл.

2 пассаж: выросшую культуру штамма В. bifidum 74-22 из последних разведений или из пробирки с выросшей биомассой вносят в среду накопления объемом до 10% и культивируют при температуре 38,0±0,5°С до получения биомассы с содержанием бифидобактерий не менее 10⁸/мл.

3 пассаж: полученную биомассу штамма В. bifidum 74-22 (пассаж №2) вводят в состав кисломолочного продукта в количестве 5-10% к объему, получая в готовом продукте бифидобактерий не менее 10^6-7/мл. Количество пассажей №2 при этом может быть увеличено в зависимости от объема производства.

Пример 4. Использование штамма В. bifidum 74-22 для получения бактерийных препаратов.

Культуру штамма 1-го или 2-го пассажа (пример №1) вносят в питательную среду, культивируют при температуре 38,0±0,5°С до получения биомассы бифидобактерий с содержанием живых клеток не менее 10⁸в 1 мл. К полученной биомассе добавляют защитные среды высушивания (сахарозо-желатиновая среда, обезжиренное молоко). Полученную суспензию разливают в ампулы, флаконы и другие емкости, замораживают при температуре минус 35-45°С и лиофилизируют из замороженного состояния в вакуум-сушильных аппаратах. Полученный препарат содержит не менее 10⁷ живых клеток бифидобактерий. Данное содержание бифидобактерий согласуется с научно-технической документацией на аналогичный бифидосодержащий препарат "Бифидумбактерин сухой" и является достаточным для использования полученного средства в качестве препарата - эубиотика.

Пример 5. Использование штамма Bifidobacterium bifidum 74-22 для получения гигиенических и косметических средств. Культуру штамма 1-го или 2-го пассажа (пример 1) вносят в питательную среду, культивируют при температуре 37-38 градусов по Цельсию до получения биомассы бифидобактерий с содержанием живых клеток не менее 10⁸ в 1 мл, высушивают методом распыления или лиофилизации.

Полученную сухую биомассу бифидобактерий штамма Bifidobacterium bifidum 74-22 вводят в состав питательного крема в количестве не более 1% от объема.

Безвредность: при введении трем беспородным белым мышам дозы per os микробной культуры штамма в количестве 5×10⁷ КОЕ на животное, гибели, отклонений в состоянии здоровья мышей в период наблюдения не отмечено.

Штамм Bifidobacterium bifidum № 244, депонированный в ГКНМ ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора и используемый для получения бифидосодержащей продукции.