Способ определения in vitro гликемического индекса пищевых продуктов

Авторы патента:

ДИКАТАЛЬДО Сузанн Н. (US)

МАГАЛЕТТА Роберт Л. (US)

G01N33/66 - с использованием сахаров крови, например галактозы

Владельцы патента RU 2451938:

КРАФТ ФУДЗ ГЛОБАЛ БРЭНДС ЭлЭлСи (US)

Группа изобретений относится к области здравоохранения. Способ включает:

(1) определение содержания белка и содержания жира в исследуемом пищевом продукте;

(2) приведение исследуемого пищевого продукта в гомогенное и тонкодисперсное состояние для получения образца пищевого продукта, пригодного для исследования;

(3) переваривание указанного образца в гомогенном и тонкодисперсном состоянии в количестве, достаточном для обеспечения стандартного количества доступных углеводов, смесью пищеварительных ферментов за фиксированный период времени для получения переваренного образца;

(4) обработку всего переваренного образца, сразу после указанного фиксированного периода времени, для прекращения ферментативных реакций;

(5) определение количества глюкозы и, по меньшей мере, двух сахаров или сахарных спиртов, выбранных из группы, состоящей из фруктозы, галактозы, лактозы, сахарозы и мальтита, в переваренном образце стадии (4); и

(6) рассчитывание гликемического индекса исследуемого пищевого продукта, исходя из данных, полученных на стадиях (1) и (5), с использованием уравнения или метода расчета, полученного многовариантным анализом калибровочных данных для калибровки образцов, причем калибровочные данные относятся к тому же типу и получены тем же способом, что и данные для исследуемого пищевого продукта, полученные на стадиях (1) и (5), причем калибровочные образцы имеют известные in vivo показатели гликемического индекса. Приведены другие варианты осуществления способа. Достигается повышение достоверности и надежности определения. 3 н. и 17 з.п. ф-лы, 4 пр., 36 табл., 6 ил.

Настоящая заявка имеет приоритет заявки США Сер.№ 12/144056 от 23 июня 2008 года, описание которой включено сюда ссылкой в полном объеме.

Настоящее изобретение относится к осуществляемому in vitro способу определения гликемического индекса пищевых продуктов (ГИ). Настоящее изобретение относится к достоверному и недорогому способу определения in vitro гликемического индекса у большого разнообразия пищевых ингредиентов и готовых пищевых продуктов.

В последние годы значительно возрос интерес к гликемическому индексу пищевых продуктов. Гликемический индекс представляет собой индикатор относительного гликемического ответа на углеводы, содержащиеся в данном пищевом продукте, при его переваривании и позволяет классифицировать пищевые продукты, основываясь на скорости выделения и абсорбции углеводов. В действительности гликемический индекс позволяет определить так называемые «хорошие углеводы» (то есть углеводы с относительно низким гликемическим индексом) и так называемые плохие углеводы (то есть углеводы с относительно высоким гликемическим индексом). Применение гликемического индекса может обеспечить осознанное потребление углеводов и заботу о здоровье или, исходя из показателей, помочь при выборе пищевого продукта.

Согласно гликемическому индексу углеводы классифицируются по шкале от 0 до 100, исходя из изменения уровня сахара в крови после приема пищи. Пищевые продукты с высоким ГИ считаются быстро перевариваемыми и абсорбируемыми, следовательно, ведут к заметной флуктуации уровней сахара в крови. Считается, что при низких показателях гликемического индекса обеспечивается более постепенное повышение и, следовательно, более равномерная флуктуация уровней сахара в крови и инсулина за счет их более медленного переваривания и абсорбции в теле человека. Как правило, продукты с низким гликемическим индексом имеют индекс 55 или менее, продукты со средним гликемическим индексом имеют индекс от 56 до 69 и продукты с высоким гликемическим индексом имеют индекс 70 или более.

Потребление пищевых продуктов с высоким гликемическим индексом, как правило, приводит к более высокому и более быстрому повышению уровня глюкозы в крови по сравнению с потреблением пищевых продуктов с низким гликемическим индексом. Быстрое повышение глюкозы в крови сигнализирует поджелудочной железе о повышении секреции инсулина. Высокие уровни инсулина, индуцированные потреблением пищевых продуктов с высоким гликемическим индексом, могут вызвать резкое повышение уровней глюкозы в крови (гипогликемия), в то время как потребление пищевых продуктов с низким гликемическим индексом, как правило, ведет к более медленному и постепенному повышению уровня глюкозы в крови и снижает потребность в инсулине. Сообщается, что диеты с низким гликемическим индексом улучшают как показатели уровня глюкозы, так и показатели уровня липидов у людей с диабетом (1 и 2 типа). Также сообщается, что диета с низким гликемическим индексом приводит к улучшению контроля за массой тела, поскольку помогает контролировать аппетит и отсрочить появление чувства голода. Также диеты с низким ГИ могут снижать уровень инсулина и устойчивость к инсулину. Недавние исследования Школы общественного здоровья Университета Гарварда (Harvard School of Public Health) показывают, что риск заболевания диабетом, таким как диабет 2 типа, и сердечно-сосудистыми заболеваниями сильно взаимосвязан с гликемическим индексом диеты. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) и Продовольственная и сельскохозяйственная организация (FAO) Организации Объединенных Наций (ООН) рекомендует населению развитых стран увеличить в рационе долю пищевых продуктов с низким гликемическим индексом для профилактики наиболее распространенных заболеваний, таких как сердечно-сосудистые заболевания, диабет и ожирение. В частности, потребителям часто рекомендуют модифицировать свой рацион таким образом, чтобы относительное количество пищевых продуктов с низким гликемическим индексом превышало потребление пищевых продуктов с высоким гликемическим индексом. Показатели гликемических индексов, как правило, помогают потребителям заботиться о здоровье и снижать риск возникновения определенных заболеваний при выборе пищевых продуктов.

Гликемический индекс пищевых продуктов, как правило, определяют в in vivo исследовании уровня глюкозы в крови у группы людей (как правило, из 6 или более человек), которые съели этот пищевой продукт; ответный уровень глюкозы в крови для пищевых продуктов сравнивают с уровнем глюкозы, вызванным потреблением контрольного материала с известным гликемическим индексом за фиксированный период времени, и рассчитывают гликемический индекс. Осуществляемый in vivo способ определения гликемического индекса считается «золотым стандартом» в этой области. В общепринятом протоколе исследований измеряют порции пищевых продуктов, содержащие от 10 до 50 грамм углеводов, которые потребляют 6 или более здоровых людей после воздержания от приема пищи в течение ночи. Берут образцы крови, как правило, из пальца, перед потреблением пищевого продукта (время ноль) и в интервалы 15-30 минут в течение двух часов сразу же после потребления пищевого продукта и анализируют уровни глюкозы в крови. Полученные в результате данные (как правило, около 7 точек данных) используют для получения кривой отклика сахара, содержащегося в крови (то есть уровень глюкозы в крови изображается в зависимости от времени), в течение двух часов после потребления исследуемого пищевого продукта. Площадь под кривой сахара, содержащегося в крови, относится к общему повышению уровней глюкозы в крови после потребления исследуемого пищевого продукта. Аналогичное исследование проводят снова после воздержания от пищи в течение ночи, те же индивидуумы потребляют эквивалентную углеводам порцию глюкозного сахара (контрольный продукт, имеющий по определению гликемический индекс 100) или белый хлеб с определенным показателем ГИ; определяют кривую отклика уровней глюкозы в течение двух часов и измеряют площадь под кривой тем же способом, как для исследуемого пищевого продукта. Гликемический индекс исследуемого пищевого продукта рассчитывают делением площади под кривой исследуемого пищевого продукта на площадь под кривой контрольного продукта и умножением на 100. Применение стандартного пищевого продукта очень важно для снижения смещающего воздействия различных физических и/или других характеристик субъектов, наряду с совпадением физической формы исследуемых образцов (то есть, стандартный водный раствор глюкозы для анализа напитков и стандартный белый хлеб для анализа твердых пищевых продуктов). Поскольку для получения кривой сахара, содержащегося в крови, используют только около 7 точек данных (в течение двух часового периода времени), предполагается, что кривая проходит плавно через эти ограниченные точки данных, ошибки могут возникнуть, если выделение глюкозы значительно повышено или понижено по отношению к фактическим точкам данных.

Средний гликемический индекс всех исследуемых субъектов принимают за гликемический индекс пищевого продукта. Конечно, достоверность определения зависит, по меньшей мере, частично от степени соответствия исследуемых субъектов протоколам исследования и обоснованности допущения того, что физические и/или другие характеристики субъектов остаются по существу постоянными, по меньшей мере, как для анализа исследуемого пищевого продукта, так и для анализа контрольного пищевого продукта.

Поскольку такие способы определения in vivo гликемического индекса, как правило, требуют участия человека наряду с высокой стоимостью и большими временными затратами, существует необходимость в разработке протоколов исследования in vitro. Один из способов in vitro, основывающийся на исследованиях, проведенных K.N. Englyst и соавторами, и приведенный на Фиг.1, включает измерение глюкозы, выделяющейся из исследуемого пищевого продукта при выдержке его при температуре 37°C со смесью пищеварительных ферментов при использовании предельного колориметрического значения для определения уровня глюкозы. Englyst et al., Brit. J. Nutr., 75, 327-337 (1996). Этот in vitro способ недавно был модифицирован для включения предельного значения ВЭЖХ для определения количества выделившейся глюкозы. Englyst et al., Am. J. Clin. Nutr., 69, 448-454 (1999) (здесь и далее, указанный как «способ Englyst» или «in vitro способ Englyst»).

Способ Englyst включает измельчение (или иное разрушение или разделение на части) известного количества исследуемого пищевого продукта (как правило, содержащего около 0,5 г углеводов). Измельченные образцы выдерживают при температуре 37°C в течение 30 минут со смесью 10 мл 0,05M HCl, содержащей пепсин (5 г/л; для проведения гидролиза белков) и гуаровую камедь (5 г/л; чтобы удержать частицы пищевого продукта в суспензии во время проведения анализа). После этой начальной выдержки образцы забуферивают до рН 5,2 с использованием 0,5 M ацетата натрия. Затем в забуференный образец добавляют ферментную смесь (содержащую определенные количества панкреатина, амилоглюкозидазы и инвертазы) и образец помешают на водяную баню-шейкер при температуре 37°C (время=0). Для механического разрушения физической структуры образцов во время основной выдержки добавляют маленькие стеклянные шарики; добавленная гуаровая камедь помогает поддерживать образец в виде суспензии за счет стабилизации вязкости образцов. По прошествии точно 20 минут основной выдержки берут аликвоту образца и добавляют при перемешивании чистый этанол для прекращения гидролиза; этот образец используют для определения G₂₀ (то есть глюкозы, выделившейся через 20 минут; также именуемой как «легкодоступная глюкоза» или RAG) при использовании ВЭЖХ. Оставшийся образец выдерживают при температуре 37°C на водяной бане в течение дополнительных 100 минут, после которых берут вторую аликвоту образца и добавляют при перемешивании чистый этанол для прекращения гидролиза; этот образец используют для определения G₁₂₀ (то есть глюкозы, выделившейся через 120 минут) при использовании ВЭЖХ. Затем оставшийся образец обрабатывают, как показано на Фиг.1, добавляя дополнительные ферменты и подвергая затем воздействию температуры вплоть до 100°C для усиления степени гидролиза и, следовательно, определения всей глюкозы в образце.

Сравнивая пищевые продукты, для которых измеряли гликемический индекс при использовании способа исследования in vivo, установили, что показатель G₂₀ или легкодоступные углеводы, определенные при использовании способа Englyst, могут коррелировать с показателями гликемического индекса in vivo известных пищевых продуктов. Используя такие коэффициенты корреляции, метод может быть использован для оценки показателей гликемического индекса исследуемых пищевых продуктов.

Однако in vitro способ Englyst подвергается значительной критике, в частности, от защитников способа определения in vivo гликемического индекса. Например, Garsetti et al., J. Am. Coll. Nutr., 24, 441-447 (2005) использовал способ Englyst для оценки показателей гликемического индекса (то есть показателей легкодоступной глюкозы) и затем сравнивал их с показателями пищевых продуктов, определенными in vivo (то есть печенье), имеющих гликемический индекс от 35 до 60. Как показано на Фиг.2 по Garsetti и др. (введенный здесь ссылкой), диаграмма разброса показателей гликемического индекса, определенных in vivo, по сравнению с показателями легкодоступной глюкозы (то есть определенной способом Englyst), дает диаграмму разброса с показателем R², составляющим 0,25, указывая, что in vitro способ имеет низкую прогнозирующую ценность.

Brand-Miller et al., Eur. J. Clin. Nutr., 58, 700-701 (2004), определяют показатели гликемического индекса in vivo для коммерческих пищевых продуктов (один зерновой завтрак и два снэковых батончика), по их сообщению имеющих низкие показатели гликемического индекса (то есть <55), как определено способом исследования in vitro Englyst. Согласно Brand-Miller et al., три пищевых продукта имеют средние показатели гликемического индекса in vivo (± погрешность) 75±3, 68±5 и 65±5, соответственно, и, следовательно, не могут быть классифицированы как пищевые продукты с низким гликемическим индексом. Эти авторы заключают, что предположения, что «больше нет необходимости в трудоемкой работе по исследованию in vivo для измерения показателей ГИ пищевого продукта», просто некорректны, и «настоятельно советуют не применять любые способы in vitro определения показателей ГИ пищевых продуктов для обозначения на них гликемического индекса». Наконец, авторы «настаивают на том, что производители при определении ГИ должны использовать только используемый в лабораториях стандартизованный in vivo способ».

Следовательно, продолжает существовать необходимость в значительно более достоверном, точном и воспроизводимом in vitro способе определения показателей гликемического индекса пищевых продуктов. Кроме того, продолжает существовать необходимость в таком способе, который может быть применен к широкому ряду пищевых продуктов, включая твердые и жидкие пищевые продукты. Настоящее изобретение относится к таким in vitro способам исследования.

Настоящее изобретение относится к способу определения in vitro гликемического индекса исследуемого пищевого продукта, включающему:

(1) определение содержания белка и содержания жира в исследуемом пищевом продукте;

(2) придание исследуемому пищевому продукту по существу гомогенного и тонкодисперсного состояния для получения образца исследуемого пищевого продукта;

(3) переваривание образца исследуемого пищевого продукта в по существу гомогенном и тонкодисперсном состоянии в количестве, достаточном для обеспечения стандартного количества доступных углеводов, смесью пищеварительных ферментов за фиксированный период времени для получения переваренного образца;

(4) обработка всего переваренного образца, сразу после определенного периода времени, для прекращения ферментативных реакций;

(6) рассчитывание гликемического индекса исследуемого пищевого продукта, исходя из данных, полученных на стадиях (1) и (5), для исследуемого пищевого продукта с использованием уравнения расчета или метода расчета, полученного многовариантным анализом калибровочных данных для калибровки образцов, причем калибровочные данные относятся к тому же типу и получены тем же способом, что и данные для исследуемого пищевого продукта, полученные на стадиях (1) и (5), и где калибровочные образцы имеют известные in vivo показатели гликемического индекса.

Также настоящее изобретение относится к способу определения in vitro гликемического индекса исследуемого пищевого продукта, включающему:

(1) определение содержания белка и содержания жира в исследуемом пищевом продукте;

(2) придание исследуемому пищевому продукту по существу гомогенного и тонкодисперсного состояния для получения образца исследуемого пищевого продукта, причем исследуемый пищевой продукт измельчают по существу при температуре жидкого азота;

In vitro способ по настоящему изобретению может быть использован для определения показателей гликемического индекса твердых, полутвердых и жидких пищевых продуктов со значительно более высокой достоверностью и точностью по сравнению с in vitro способами по предшествующему уровню техники. Конечно, значительно более высокая достоверность и точность, получаемые способом по настоящему изобретению, сравнимы с коммерчески доступными in vivo способами, но значительно сокращают временные и денежные затраты.

Используемый здесь термин «по существу в гомогенном и тонкодисперсном состоянии» относится к степени измельчения, эквивалентной измельчению пищевого продукта при температуре достаточно низкой, такой, что пищевой продукт представляет собой хрупкое твердое тело. Как правило, температура ниже, чем около -40°C, предпочтительно температура ниже около -78°C, и более предпочтительно температура около температуры, достигаемой при использовании жидкого азота (-196°C), достаточна для измельчения большинства пищевых продуктов, которые при комнатной температуре представляют собой твердые и полутвердые тела. Также, как правило, предпочтительно твердые материалы разбиваются или грубо измельчаются при комнатной температуре перед таким низкотемпературным измельчением. В одном предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения по существу для твердых или полутвердых при комнатной температуре материалов измельчение проводят при использовании устройства для измельчения с охлаждением жидким азотом при температуре жидкого азота или близко к ней. В большинстве случаев жидкие пищевые продукты не требуют какого-либо измельчения, поскольку они по существу гомогенны, и компоненты растворены в носителе; однако, если требуется, такие жидкие пищевые продукты также могут быть измельчены при низкой температуре. Для полутвердых материалов может требоваться или может не требоваться такое измельчение при низкой температуре для придания им по существу гомогенного и тонкодисперсного состояния. Таким образом, например, йогурт без добавок не нуждается в дополнительном измельчении, при этом йогурт с фруктами или другими твердыми ингредиентами предпочтительно измельчают при низкой температуре с приданием по существу гомогенного и тонкодисперсного состояния. Дополнительное руководство по требованиям к «гомогенному и тонкодисперсному состоянию» могут быть найдены в примерах, приведенных в описании.

Предпочтительно количества глюкозы и, по меньшей мере, двух сахаров или сахарных спиртов, выбранных из группы, состоящей из фруктозы, галактозы, лактозы, сахарозы и мальтита, в переваренном образце стадии (4) определяют при использовании высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) или эквивалентных количественных способов определения. Предпочтительно для определения количеств сахаров, выделившихся во время обработки ферментами, используют высокоэффективную ионную хроматографию (ВЭИХ). Более предпочтительно количества глюкозы, фруктозы, галактозы, лактозы, сахарозы и мальтита в переваренном образце стадии (4) определяют при использовании высокоэффективной ионной хроматографии (ВЭИХ).

На Фиг.1 представлена технологическая схема, описывающая in vitro способ по предшествующему уровню техники (то есть способ Englyst) для оценки гликемического индекса и связанных с ним показателей.

На Фиг.2 представлена технологическая схема, иллюстрирующая in vitro способ по настоящему изобретению.

На Фиг.3 представлены типовые хроматограммы смешанных стандартов (Изображение A) и типовой неизвестный образец (Изображение B), полученные способом in vitro по Примеру 1.

На Фиг.4A представлено сравнение известных in vivo показателей гликемического индекса и определенных in vitro показателей гликемического индекса с использованием способа по настоящему изобретению построением графика кривой по данным нейронной сети на основе данных Примера 2; показатель R² для способа по настоящему изобретению составляет 0, 97. На Фиг. 4B и 4C представлены сравнения известных in vivo показателей гликемического индекса и легкодоступной глюкозы (RAG, выраженные в граммах выделившейся глюкозы за 20 минут/100 г пищевого продукта), как получено при использовании метода вычисления, используемого в способе Englyst (то есть только исходя из выделения глюкозы через 20 минут переваривания) с данными по Примеру 2. На Фиг.4B представлены графики in vivo ГИ по сравнению с RAG/(% доступных углеводов); На Фиг.4C представлены графики in vivo ГИ по сравнению с RAG. Используя метод вычисления Englyst по совокупности данных Примера 2, показатели 2 R² составляют 0,41 и 0,68 на диаграммах разброса, приведенных на Фигурах 4B и 4C, соответственно.

На Фиг.5A представлено сравнение известных in vivo показателей гликемического индекса и определенных in vitro показателей гликемического индекса с использованием способа по настоящему изобретению построением графика кривой по данным множественной линейной регрессии, исходя из данных Примера 3; показатель R² для способа по настоящему изобретению составляет 0, 94. На Фигурах 5B и 5C представлены сравнения известных in vivo показателей гликемического индекса и легкодоступной глюкозы (RAG, выраженные в граммах выделившейся глюкозы за 20 минут/100 г пищевого продукта), как получено при использовании метода вычисления, используемого в способе Englyst (то есть исходя только из выделения глюкозы через 20 минут переваривания), с данными по Примеру 3. На Фиг.5B представлены графики in vivo ГИ по сравнению с RAG/(% доступных углеводов); На Фиг.5C представлены графики in vivo ГИ по сравнению с RAG. Используя метод вычисления Englyst по совокупности данных Примера 3, показатели R² составляют 0,56 и 0,58 на диаграммах разброса, приведенных на Фигурах 5B и 5C, соответственно.

На Фиг.6 представлено сравнение известных in vivo показателей гликемического индекса и определенных in vitro показателей гликемического индекса с использованием способа по настоящему изобретению построением графика кривой по данным нейронной сети, исходя из данных Примера 4; показатель R² для способа по настоящему изобретению составляет 0, 96.

Настоящее изобретение относится к аналитическому способу in vitro, позволяющему получить более достоверный расчет гликемического индекса пищевого продукта по уровням белка, жира и сахаров/сахарных спиртов, высвобождающихся при использовании симуляции переваривания пищевого продукта ферментами. Способы определения гликемического индекса по предшествующему уровню техники, как правило, требуют участия человека наряду с высокой стоимостью и большими временными затратами. Способ по настоящему изобретению позволяет определить гликемический индекс вплоть до около 15 образцов продуктов в один день при участии одного специалиста, что значительно снижает расходы по сравнению с традиционным способом с участием людей. Кроме того, настоящее изобретение позволяет избежать препятствий, связанных с административным барьером при скрининге с участием людей, для получения согласия на основании полной информации. Показатели гликемического индекса, определяемые при использовании способа по настоящему изобретению, значительно коррелируют с результатами, полученными при использовании традиционного исследования с участием людей. Конечно, при использовании in vitro способа можно получить более достоверные результаты, чем при использовании клинического способа in vivo. Поскольку количество калибровочных образцов, используемых в in vitro способе, больше (и может продолжать увеличиваться за счет дополнительных калибровочных образцов (то есть образцов, для которых известны показатели in vivo ГИ), добавленных здесь) по сравнению с таковым, используемым для единичного определения способом in vivo, данные in vivo, используемые для калибровки способа in vitro, которым получают ГИ in vitro, основываются на результатах содержания глюкозы в крови значительно большего количества людей по сравнению с таковыми, используемыми в каком-либо единичном исследовании in vivo. Кроме того, способ по настоящему изобретению может быть использован для широкого ряда пищевых продуктов, включая твердые пищевые продукты наряду с полутвердыми пищевыми продуктами (например, йогурт и тому подобное) и жидкими пищевыми продуктами (например, напитки и тому подобное).

(1) определение содержания белка и содержания жира в исследуемом пищевом продукте;

Используемый здесь термин «по существу в гомогенном и тонкодисперсном состоянии» относится к степени измельчения, эквивалентной измельчению пищевого продукта при температуре достаточно низкой, такой, что пищевой продукт представляет собой хрупкое твердое тело. Как правило, температура ниже, чем около -40°C, предпочтительно температура ниже около -78°C, и более предпочтительно температура около температуры, достигаемой при использовании жидкого азота (-196°C), достаточна для измельчения большинства пищевых продуктов, которые представляют собой твердые и полутвердые тела при комнатной температуре. Также, как правило, предпочтительно твердые материалы разбиваются или грубо измельчаются при комнатной температуре перед таким низкотемпературным измельчением. В одном предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения по существу для твердых или полутвердых при комнатной температуре материалов измельчение проводят при использовании устройства для измельчения с охлаждением жидким азотом при температуре жидкого азота или близко к ней. В большинстве случаев жидкие пищевые продукты не требуют какого-либо измельчения, поскольку они по существу гомогенны, и компоненты растворены в носителе; однако, если требуется, такие жидкие пищевые продукты также могут быть измельчены при низкой температуре. Для полутвердых материалов может требоваться или может не требоваться такое измельчение при низкой температуре с приданием по существу гомогенного и тонкодисперсного состояния. Таким образом, например, йогурт без добавок не нуждается в дополнительном измельчении, при этом йогурт с фруктами или другими твердыми ингредиентами предпочтительно измельчают при низкой температуре с приданием по существу гомогенного и тонкодисперсного состояния. Дополнительное руководство по требованиям к «гомогенному и тонкодисперсному состоянию» могут быть найдены в примерах, приведенных в описании.

Предпочтительно количество глюкозы и, по меньшей мере, двух сахаров или сахарных спиртов, выбранных из группы, состоящей из фруктозы, галактозы, лактозы, сахарозы и мальтита, в переваренном образце стадии (4) определяют при использовании высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) или эквивалентных количественных способов определения. Предпочтительно для определения количества сахаров, выделившихся во время обработки ферментами, используют высокоэффективную ионную хроматографию (ВЭИХ). Более предпочтительно количество глюкозы, фруктозы, галактозы, лактозы, сахарозы и мальтита в переваренном образце стадии (4) определяют при использовании высокоэффективной ионной хроматографии (ВЭИХ). Конечно, для образцов конкретных пищевых продуктов перевариваемый образец может быть определен по существу как ноль для одного или более из этих сахаров или сахарных спиртов (то есть конкретные сахара или сахарные спирты могут отсутствовать). В этом случае показатель или показатели, связанные с конкретными сахарами и/или сахарными спиртами, будут ноль (или близкими к нолю), и вклад в ГИ этих сахаров и/или сахарных спиртов будет минимальным.

В настоящее время только мальтит является сахарным спиртом, о котором в научной литературе сообщается, что он оказывает значительное воздействие на концентрацию сахара, содержащегося крови, при содержании его в норме в пищевых продуктах. Поскольку ВЭИХ с подходящей колонкой позволяет определить основную часть большинства сахаров и сахарных спиртов (но только не мальтит), в анализ на стадии калибровки могут быть включены больше сахаров и больше сахарных спиртов, если требуется.

Количество образца исследуемого пищевого продукта по существу в гомогенном и тонкодисперсном состоянии достаточно для обеспечения стандартного количества углеводов на стадии переваривания образца смесью пищеварительных ферментов за фиксированный период времени для получения переваренного образца. Для целей настоящего изобретения количество образца исследуемого пищевого продукта по существу в гомогенном и тонкодисперсном состоянии, используемое на стадии переваривания, должно содержать «стандартное количество» доступных углеводов. Это стандартное количество доступных углеводов выбирают, таким образом, чтобы количество сахаров и/или сахарных спиртов, полученных на стадии переваривания, было достаточно для достоверного определения сахаров и сахарных спиртов; кроме того, это стандартное количество доступных углеводов позволяет пищеварительным ферментам иметь аналогичное количество субстрата для действия на нем. В конкретном протоколе, иллюстрированном в Примере 1, было установлено, что, как правило, стандартное количество доступных углеводов составляет от около 0,2 до около 1 г, и более предпочтительно около 0,5 г. Может быть использовано более высокое или более низкое содержание, если может быть проведено достаточно достоверное определение сахаров и сахарных спиртов. Конечно, как только выбрано стандартное количество, которое предпочтительно используют для всех определений (включая те, которые используют для калибровки способа наряду с только что откалиброванными и неизвестными образцами). Для целей этого способа содержание доступных углеводов определяют как общее содержание углеводов минус содержание пищевых волокон минус общее содержание сахарных спиртов, иных, чем мальтит. В случае, если дополнительные сахарные спирты, иные, чем мальтит, входят в анализ и калибровку, то содержание этих сахарных спиртов в образце нужно включить, как доступные углеводы.

Аналогично, для стадии переваривания выбирают фиксированный период времени, чтобы обеспечить количество сахаров и/или сахарных спиртов, достаточное для достоверного определения выделившихся сахаров и сахарных спиртов. В конкретном протоколе, приведенном в Примере 1, было установлено, что, как правило, фиксированный период составляет от около 15 до около 25 минут и более предпочтительно около 20 минут. Может быть использовано более длительное или более короткое время переваривания, если выделенное количество сахаров и/или сахарных спиртов достаточно для достоверного определения сахаров и сахарных спиртов. Конечно, как только выбрано фиксированное время, показатель используют для всех определений (включая те, которые используют для калибровки способа, наряду с только что откалиброванными неизвестными и образцами); другими словами, стандартное время переваривания должно быть использовано для определения всех калибровок и неизвестных образцов. Как правило, следует остановить стадию переваривания около ±10 секунд от выбранного фиксированного времени и еще более предпочтительно около ±5 секунд.

Фигура 2 иллюстрирует один вариант воплощения настоящего изобретения. Способ начинается с исследуемого образца пищевого продукта, который может представлять собой твердый, полутвердый или жидкий при комнатной температуре. Как указанно выше, этот исследуемый пищевой продукт должен быть «по существу в гомогенном и тонкодисперсном состоянии». Большинство твердых и полутвердых пищевых продуктов при комнатной температуре может быть измельчено при достаточно низкой температуре, такой, при которой пищевой продукт представляет собой хрупкое твердое тело. Как правило, температура ниже, чем около -40°C, предпочтительно температура ниже около -78°C, и более предпочтительно температура около температуры, достигаемой при использовании жидкого азота, достаточной для измельчения большинства пищевых продуктов, которые при комнатной температуре представляют собой твердые и полутвердые тела. Также, как правило, предпочтительно твердые материалы разбиваются или грубо измельчаются при комнатной температуре перед таким низкотемпературным измельчением. Следовательно, как показано на Фиг.2, образец исследуемого пищевого продукта предпочтительно грубо измельчен простым дроблением образца на более мелкие частицы и затем мелко измельчен с приданием по существу гомогенного и тонкодисперсного состояния. В предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения по существу для твердых или полутвердых при комнатной температуре материалов измельчение проводят при использовании устройства для измельчения с охлаждением жидким азотом при температуре жидкого азота или близко к ней. В большинстве случаев жидкие пищевые продукты не требуют какого-либо измельчения, поскольку они по существу гомогенны, и компоненты растворены в носителе; однако если требуется, такие жидкие пищевые продукты также могут быть измельчены при низкой температуре. Для полутвердых материалов может требоваться или может не требоваться такое измельчение при низкой температуре с приданием по существу гомогенного и тонкодисперсного состояния. Таким образом, например, йогурт без добавок не нуждается в дополнительном измельчении, при этом йогурт с фруктами или другими твердыми ингредиентами предпочтительно измельчают при низкой температуре с приданием по существу гомогенного и тонкодисперсного состояния.

Специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение, следует понимать, что нет необходимости и, конечно, трудно установить пределы размеров частиц для «по существу гомогенного и тонкодисперсного состояния». Большинство образцов пищевых продуктов, подходящих для анализа способом по настоящему изобретению, имеет достаточное содержание влаги. Следовательно, даже при измельчении при температуре жидкого азота (когда твердые вещества более легко измельчить за счет их хрупкости при такой температуре), частицы могут агломерировать при возвращении к значениям комнатной температуры за счет содержания в них влаги. По существу гомогенное и тонкодисперсное состояние достигается при измельчении при низкой температуре, что, по меньшей мере, отчасти, позволяет добиться достоверности и точности способу по настоящему изобретению. Следовательно, в большинстве случае применение измельчения при низкой температуре является наиболее подходящим средством получения гомогенной, тонкодисперсной смеси (по существу для образцов с высокой степенью гетерогенности, таких как печенье с шоколадной крошкой, походные смеси и тому подобное). Однако если образцы содержат физически связанный крахмал (защищенный от пищеварительных ферментов интактными или частично интактными клеточными стенками), это может подходить в большей степени для перехода непосредственно с грубого измельчения или дробления на переваривание, поскольку разрушение структуры клеток в результате может привести к тому, что крахмал становится слишком доступным для пищеварительных ферментов, что приводит в результате к ложному повышению показателей ГИ. Следовательно, такие образцы, как картофельные чипсы, предпочтительно не измельчают при низкой температуре. Измельчение картофельных чипсов до тонкого порошка при низкой температуре приводит к получению при анализе показателя ГИ, составляющего около 70-75. Если картофельные чипсы только грубо измельчены (что легко сделать, поскольку картофельные чипсы хрупкие при комнатной температуре), получаемый в результате анализа показатель ГИ составляет около 55-60, что в значительной степени совпадает с показателями, приводимыми в литературе (Am. J. Clin. Nutr., 76, 5-56 (2002) сообщается о среднем показателе 54±3). Следовательно, специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение, следует понимать, что технология получения образца сохраняет баланс при снижении гетерогенности образца без избыточного разрушения нативной структуры, которая может быть у медленно усваиваемого крахмала.

Как только образец достигает желаемого гомогенного и тонкодисперсного состояния, его подвергают обработке ферментами для имитации процесса пищеварения. Предпочтительно пепсин добавляют до начала гидролиза белков. Затем для переваривания углеводов, присутствующих в образце, используют смесь ферментов с получением сахаров и растворением свободных сахаров и сахарных спиртов, которые могут присутствовать в образце. Важно, что для определения стандартов используют стандартные условия (как для определения коэффициентов модели, так и для первого определения и затем как проверку всего способа) и неизвестные. Хотя эти стандартные условия могут варьироваться, сразу после выбора они должны поддерживаться настолько близко к выбранным, насколько это возможно во время калибровки способа и затем во время определения неизвестных образцов. Как правило, смесь ферментов содержит панкреатин, амилоглюкозидазу (AMG) и инвертазу в количествах, достаточных для превращения по существу всех углеводов в сахара и растворения любых свободных сахаров и сахарных спиртов в образце. Выдержку со смесью ферментов проводят, как правило, при температуре 37°C в течение 20 минут; использование для выдержки точной температуры и времени (при условии, что они позволяют работать ферментам) менее важно, чем использование той же самой температуры выдержки и времени переваривания (то есть фиксированное время переваривания) в процессе калибровки и определения неизвестных образцов.

Как только проходит заданное время выдержки (то есть стандартное время 20 минут ±10 секунд), ферментативные реакции сразу же останавливают. Предпочтительно для немедленной остановки ферментативных реакций добавляют этанол. Затем предпочтительно образец фильтруют для удаления любого осадка или мелких частиц, которые могут присутствовать, и собирают образец. Важно, что начиная с момента выдержки и до момента сбора образца (то есть после остановки ферментативных реакций) сохраняется существенная часть или образец полностью. Нет отделения или разделения образца в это время (за исключением фильтрации после остановки ферментативных реакций). Сохранение физической целостности образца во время этой операции позволяет избежать ошибок, связанных с образцами, не преобразованными в гомогенную смесь. Следовательно, например, в способе Englyst может появиться ошибка в значимой выборке во время забора аликвоты из перевариваемой смеси после 20 минут переваривания, поскольку в это время смесь, как правило, находится в состоянии суспензии. Способ по настоящему изобретению позволяет избежать таких проблем.

Как только получен готовый образец из переваренной смеси (предпочтительно после фильтрации для удаления любых оставшихся твердых материалов), измеряют содержание сахара и сахарного спирта при использовании высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) или эквивалентных количественных способов определения. Предпочтительно используют высокоэффективную ионную хроматографию (ВЭИХ), поскольку эта технология, как правило, дает превосходное отделение сахаров, в частности глюкозы и галактозы, позволяя определить как сахара, так и сахарные спирты (например, мальтит) в том же отделении, и, как правило, менее подвержена ошибкам за счет высокой избирательности импульсной электромеханической детекции. Подходящее устройство и технологические условия приведены в Примере 1. Специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение, следует понимать, что конкретное устройство и технологические условия менее важны по сравнению со стандартными условиями для определения и их поддержания. Предпочтительно в переваренном образце определяют количества глюкозы и, по меньшей мере, двух сахаров или сахарных спиртов, выбранных из группы, состоящей из фруктозы, галактозы, сахарозы и мальтита. Еще более предпочтительно в переваренном образце определяют количества глюкозы, фруктозы, галактозы, лактозы, сахарозы и мальтита. Как указанно выше, если требуется, на стадиях анализа и калибровки могут быть включены дополнительные сахара и сахарные спирты.

Дополнительно в исследуемом образце пищевого продукта определяют содержание белка и жира. Эти параметры могут быть определены при использовании стандарта и традиционных аналитических методов и/или могут быть рассчитаны, исходя из ингредиентов образца исследуемого продукта. Определение достоверного показателя гликемического индекса проводят при использовании многовариантного анализа, посредством сопоставления кривых с использованием такого метода, как, например, метод множественной линейной регрессии (MLR), метод частных наименьших квадратов (PLS) или метод нейронной сети. Сопоставление кривых по методу нейронной сети наилучшим образом подходит для данных, полученных в Примерах, и поэтому обычно является предпочтительным (смотрите диаграмму разброса на Фиг.4A). Переваренную смесь анализируют при использовании указанной выше процедуры ВЭИХ с получением количественных показателей по содержанию глюкозы, фруктозы, галактозы, лактозы, сахарозы и мальтита в конечном переваренном образце. Эти показатели вместе с общим % белка и % жира исходного образца предпочтительно вводят в подходящее программное обеспечение по статистике (например, JMP Statistical Software), которое затем рассчитывает показатели ГИ исходного образца с использованием подходящего уравнения для расчета или корреляции или метода расчета

Уравнение расчета или методы расчета получены из данных по калибровочным установкам, для которых известны клинические или in vivo показатели ГИ. Это показано на Фиг.2, где прерывающимися стрелками указанны параметры определения для уравнения расчета или методов расчета. Данные определяют при использовании тех же стандартных условий и процедур, как указано выше и в Примере 1. Калибровочные установки, используемые в Примере 1, включают пищевые продукты и серии чистых стандартов, для которых известны клинические показатели ГИ. Калибровочные стандарты, используемые в Примере 1, для показателей ГИ составляют от 19 до 100 и обрабатываются точно таким же способом, как образцы других пищевых продуктов при калибровке. Все калибровочные образцы и стандарты и все последующие неизвестные образцы должны быть проанализированы с использованием тех же стандартных условий и процедур. При использовании подходящего программного обеспечения данные калибровочных образцов и стандарты используют для получения уравнения или другой взаимосвязи, которая наилучшим образом подходит для корреляции между клиническими in vivo показателями ГИ и расчетными. Предпочтительно используют метод многовариантного анализа (например, MLR, PLS или нейронной сети). Дополнительно, если требуется, in vivo данные из новых доступных калибровочных образцов или стандартов могут быть введены в модель для обновления и улучшения варьирующихся переменных уравнения или методов расчета.

Способ по настоящему изобретению предпочтительно включает в калибровке все приведенные выше сахара плюс мальтит. Однако если известно, что образцы, которые могут встретиться, не содержат некоторые компоненты, они могут быть удалены из калибровки (например, мальтит, галактоза). Аналогично, могут быть включены дополнительные параметры или измерения, связанные с пищевым продуктом (например, содержание органической кислоты, содержание β-глюкана и тому подобное). Обнаруживаемое количество сахарозы в переваренном образце, как правило, по существу составляет ноль, поскольку считается, что инвертаза превращает любую присутствующую сахарозу в глюкозу и фруктозу. Если требуется, определение сахарозы может быть использовано как внутренняя проверка. Следовательно, при проведении способа собственно уровень сахарозы должен быть по существу равен нолю; если определены значительные количества сахарозы, анализ ошибочен, и образец должен быть проанализирован повторно. Конечно, этот способ, использующий сахарозу как эффективный внутренний стандарт, должен быть использован только, если стандартные условия и параметры выбраны для способа таким образом, что в результате по существу сахароза в переваренном образце отсутствует. Если образцы содержат какое-либо вещество, которое может ингибировать активность инвертазы, способность оценивать количественно оставшуюся сахарозу может быть использована для развития данных калибровочных установок, которые учитывают ингибирующее воздействие при расчете in vitro показателей ГИ.

Следующие примеры только иллюстрируют настоящее изобретение и не ограничивают его. Если не указанно иное, все проценты и соотношения приведены по массе. Все цитированные здесь публикации введены ссылкой.

Пример 1. Этот Пример относится к подробному аналитическому протоколу определения гликемического индекса in vitro способом по изобретению, как для калибровки, так и для определения неизвестных образцов. Во всех случаях, когда рекомендованы конкретные устройства, реагенты и/или конкретные процедуры и параметры обработки, следует понимать, что могут быть использованы эквивалентные устройства, реагенты и/или конкретные процедуры и параметры обработки.

Устройства:

1. Водяная баня-шейкер с температурным контролем (около 175 встряхиваний/минута);

2. Вихревой миксер;

3. Аналитические весы (с точностью ±0,0001 г);

4. Мерные колбы, Класс A, 100 мл, 1000 мл;

5. Пипетки, Класс A, 1 мл, 2 мл, 5 мл, 6 мл, 10 мл;

6. Стеклянные шарики, 6 мм (Fisher #11 -312-D или эквивалент);

7. Стеклянные емкости для пробы (40 мл) с навинчивающимися крышками (VWR #66014-389 или эквивалент);

8. Пластиковые центрифужные пробирки (50 мл) с навинчивающимися крышками (VWR #21008-730 или эквивалент);

9. Центрифуга;

10. Криогенная дробильная установка Spex CertiPrep 6850 или эквивалент;

11. 1-квартовые сосуды с широким горлышком для образца;

12. Фильтр-воронки;

13. Бумага для быстрой фильтрации Whatman #4, круги 12,5 см или эквивалент;

14. Кольцевой штатив;

15. Шприцевой фильтр Anotop 10 Plus 0,2 микрон диаметром 10 мм;

16. Устройство для ВЭИХ и реагенты, приведенные ниже в части, озаглавленной «Процедура ВЭИХ»; и

17. Программное обеспечение JMP Statistical Software, version 5.1, SAS Institute, или эквивалент.

Реагенты:

1. 0,5 N хлористоводородная кислота (HCl) (VWR #VW3201-1);

2. Ацетат натрия (NaAc) (Acros #42425-5000);

3. Этиловый спирт USP, 190 крепость - 95% (95% EtOH) (Aaper Alcohol & Chemical Co.);

4. Инвертаза из пекарских дрожжей, 215 ед/мг сухих веществ (Sigma #1-9274);

5. Амилоглюкозидаза (AMG), 300 ед/мл (Novozymes #AMG 300 L) (примечание: должна храниться при температуре 0-25°C и использоваться в течение 3 месяцев с момента доставки);

6. Пепсин из слизистой желудка свиньи 439 ед/мг сухих веществ (Sigma #P-7000);

7. Гуаровая камедь (Sigma #G4129-250G);

8. Панкреатин из поджелудочной железы свиньи (Sigma #P-7545);

9. Деионизированная вода (H₂O); и

10. Жидкий азот; и

11. Чистые стандарты безводной глюкозы, фруктозы, сахарозы, лактозы, галактозы и мальтита (чистота минимум 99%, Sigma Aldrich Company или эквивалент; должны храниться в дессикаторе до момента использования).

Растворы:

1. 0,05 N раствор HCl (разведение 100 мл 0,5N HCl до 1000 мл деионизированной водой);

2. Раствор пепсин/гуаровая камедь (2195 ед/мл пепсина и 0,5% гуаровой камеди (масса/объем) в 0,05 N HCl) - растворение 0,5 г пепсина и 0,5 г гуаровой камеди в 100 мл 0,05N HCl;

3. Исходный раствор (510,7 ед/мл в H₂O) - растворение 100 мг инвертазы в 42,10 мл H₂O;

4. 0,5M Раствор ацетата натрия (0,5M NaAc в H₂O) - растворение 4,10 г ацетата натрия в 100 мл H₂O;

5. 66% раствор этилового спирта (66% EtOH) (объем/объем) - смесь 347 мл этилового спирта с 153 мл деионизированной воды в 1-квартовом сосуде с широким горлышком для образца и крышкой; это раствор, достаточный для одного образца; и

6. Ферментный раствор (рецептура для одного образца - 136 мг/мл панкреатина, 13,4 ед/мл AMG и 25,43 ед/мл инвертазы):

I. Отвешивание 1,0 г панкреатина в 50 мл центрифужную пробирку;

ii. Добавление 6,67 мл H₂O и смешивание вихревым миксером в течение 10 минут для полного растворения (для получения раствора, используемого со множеством образцов, могут понадобиться магнитная мешалка или стеклянные шарики);

iii. Центрифугирование при 2000 оборотов в минуту в течение 10 минут; и

iv. Для каждого исследуемого образца перемещение 6 мл супернатанта в другую 50 мл центрифужную пробирку, добавление 296 мкл AMG и 330 мкл инвертазы исходного раствора.

Получение образца для твердого образца:

1. Образец помещают в лабораторный микронайзер Waring и дробят до однородного смешивания образца (как правило, достаточно от 30 до 60 секунд).

2. Затем 3 унции/100 г навески из микронайзера криогенно дробят в криогенной дробильной установке/мельнице Spex CertiPrep 6850. Криогенная дробильная установка/Мельница Spex CertiPrep 6850 представляет собой дробилку ударного действия, охлаждаемую жидким азотом. Образец, ставший хрупким за счет воздействия холода, тонкодисперсно измельчают ударом по концевым пробкам пробирки. Образец должен занимать от около одной трети до около половины высоты пробирки для измельчения (#6801).

3. Криогенная дробильная установка/Мельница 6850 может быть запрограммирована при использовании клавиатуры. Режим управления и условия: Цикл 1 - время измельчения 1,5 мин; Скорость (частота ударов) 10 циклов в секунду; и время предварительного охлаждения 4 мин (то есть время перед началом измельчения).

4. По окончании цикла измельчения опустошают пробирку в подходящий контейнер с крышкой.

Процедура переваривания:

1. Отвешивают количество образца, эквивалентное 0,50 г доступных углеводов (доступные углеводы=общие углеводы минус волокна минус сахарные спирты, иные, чем мальтит), в 40 мл стеклянные пробирки с навинчивающейся крышкой, добавляют 5 мл H₂O, 10 мл свежеприготовленного раствора пепсин/гуаровая камедь и 5 стеклянных шариков. Пустой образец, состоящий из 0,5 г воды, также пропускают с каждой партией образцов.

2. Проводят энергичное вихревое смешивание укупоренной пробирки и помещают ее горизонтально (175 встряхиваний/мин); встряхивают в течение 30 минут для гидролиза белка пепсином.

3. Добавляют в пробирку 5,0 мл 0,5M NaAc (уравновешенного при температуре 37°C).

4. Смешивают, затем добавляют 5 мл ферментного раствора. Смешивают с инверсией. pH этой смеси для переваривания должен составлять около 5.

5. Сразу же помещают исходный образец горизонтально на водяную баню-шейкер при температуре 37°C для продолжения ферментативной реакции. Встряхивают в течение 20 минут. Через 20 минут (±10 секунд) удаляют пробирку с образцом из шейкера.

6. Сразу же переливают содержимое пробирки в сосуд с широким горлышком для образца, содержащий 500 мл 66% EtOH для прекращения реакций. Промывают пробирку несколькими каплями раствора EtOH из сосуда с широким горлышком для образца, укупоривает его, затем смешивают, переворачивая. Сразу же фильтруют часть содержимого сосуда с широким горлышком для образца через бумагу для быстрой фильтрации в 40 мл пробирки с навинчивающейся крышкой, укупоривают и хранят до проведения анализа ВЭИХ.

Затем переваренные образцы анализируют при использовании ВЭИХ на содержание сахара и сахарных спиртов, как описано ниже:

1. Устройство - хроматографическая система Dionex, состоящая из:

высокоэффективного насоса;

модуля жидкостной хроматографии;

импульсного электромеханического детектора;

модуля дегазированного элюента; и

рабочей хроматографической станции.

2. Реагенты и стандарты

Деионизированная вода, 18M Ω-см сопротивление;

Раствор гидроксида натрия, 50% масса/масса, низкое содержание углеводов; и

Чистые стандарты галактозы, глюкозы, фруктозы, сахарозы, лактозы и мальтита.

3. Условия:

Колонки: аналитическая CarboPacTM PA1 (4×250 мм) и предколонка AminoTrap (4×50 мм);

Режим работы: Давление: 1200-1500 фунтов на квадратный дюйм; Объем инжекции: 10 мкл; Элюент: 21 мМ гидроксида натрия (может быть отрегулирован для достижения наилучшего отделения каждой колонкой; Примечание: CarboPac PA1 должна быть промыта 200 мМ NaOH между сериями для предотвращения засорения колонки углеводами); Скорость потока: 1 мл/мин; и Определение: импульсная амперометрия, одноразовый золотой рабочий электрод и стандартные параметры для углеводов.

4. Получение растворов:

a) Элюент: растворение 1,6725 г раствора NaOH (50% масса/масса, низкое содержание углеводов) в 1,0 л деионизированной воды (18 MΩ-см сопротивляемость);

b) Раствор для промывки колонки: 200 мМ NaOH: растворение 16 г раствора NaOH (50% масса/масса, низкое содержание углеводов) в 1,0 л деионизированной воды (18MΩ-см сопротивляемость);

5. Получение стандартов:

Аккуратно отвешивают около 0,1000 г каждого из указанных выше 6 стандартов (то есть чистые стандарты галактозы, глюкозы, фруктозы, сахарозы, лактозы и мальтита) в 100 мл мерную колбу с получением 1000 частей на миллион смешанного стандарта с деионизированной водой (18 MΩ-см сопротивляемость). Разводят этот раствор с получением следующих рабочих стандартов: a) 1 мл разведенный до 1000 мл, включающий 6,6 мл этанолового спирта (крепость 195) с получением 1 часть на миллион стандарта; b) 2 мл разведенные до 100 мл, включающие 6,6 мл этанолового спирта (крепость 195) с получением 20 частей на миллион стандарта; c) 5 мл разведенные до 100 мл включающие 6,6 мл этанолового спирта (крепость 195) с получением 50 частей на миллион стандарта; и d) 10 мл разведенные до 100 мл включающие 6,6 мл этанолового спирта (крепость 195) с получением 100 частей на миллион стандарта.

6. Получение и инжекция образца:

Готовый раствор для переваривания с процедуры переваривания разводят 1:10 в деонизированной воде, затем фильтруют через 0,2-микронный шприцевой фильтр AnotopiO Plus в пробирку автоматического пробозаборника. Затем образец раствора (10 мкл) инжектируют в хроматограф.

7. Градиент хроматографических условий:

Время (мин)	Растворитель (%)	Комментарии
200 мМ NaOH	21 мМ NaOH
-20	100	0	Восстановление колонки
-9	0	100	Повторное уравновешивание колонки
0	0	100	Инжекция образца
36	0	100	Окончание

8. Параметры электромеханического детектора: Применение предварительно контрольного электрода Ag/AgCl с предварительно установленной длиной волны:

Время	Потенциал	Интеграция
0,0	+0,10
0,20	+0,10	Начало
0,40	+0,10	Конец
0,41	-2,00
0,42	-2,00
0,43	-0,60
0,44	-0,10
0,55	-0,10

Раствор для консервации колонки: 21 мМ гидроксида натрия (NaOH)

9. Количественное определение сахаров и мальтита:

Смешанные стандарты 1, 20, 50, и 100 частей на миллион инжектируют в устройство ВЭИХ и строят калибровочную кривую при использовании подходящего программного обеспечения для хроматографической системы. Если концентрация одного или более аналита в образце превышает таковую наивысшего стандарта, калибровочные кривые должны быть расширены и включать стандарты с более высокими концентрациями по сравнению с таковыми для большинства концентрированных образцов. Затем в устройство ВЭИХ инжектируют пустые образцы и исследуемые образцы и по калибровочным кривым, используя пики площадей, рассчитывают концентрации галактозы, глюкозы, фруктозы, сахарозы, лактозы и мальтита. Концентрации калибровых кривых умножают на 10 для учета 10-кратного разведения образцов и пустого образца на стадии 6, как указанно выше, и указывают в % для каждого аналита в конечном переваренном образце.

Для получения скорректированных показателей (%) пустого образца показатели концентрации (%) для каждого аналита в пустом образце вычитают из таковых для каждого аналита в каждом образце.

Примеры хроматограмм смешанных стандартов (Изображение A) и типичных неизвестных или исследуемых образцов (Изображение B) приведены на Фиг.3.

Расчеты:

Определение расчетного значения показателя гликемического индекса выполняют с использованием метода множественной линейной регрессии (MLR), метода частных наименьших квадратов (PLS) или метода нейронной сети для сопоставления полученных кривых. Переваренную смесь анализируют при использовании указанной выше процедуры ВЭИХ с получением скорректированных количественных показателей пустого образца по содержание глюкозы, фруктозы, галактозы, лактозы, сахарозы и мальта в конечном переваренном образце. Эти показатели вместе с общим % белка и % жира исходного образца, определенные при использовании анализа или расчета показателей ингредиентов, вводят в JMP Statistical Software spreadsheet (программное обеспечения для построения таблиц и графиков), которое затем рассчитывает показатели ГИ исходного образца, исходя из уравнения для расчета или метода расчета, в установленном порядке для построения графика конкретной кривой.

Уравнение расчета или методы расчета получены, исходя из данных по установкам для калибровки, для которых известны клинические или in vivo показатели ГИ. Установка для калибровки включает пищевые продукты и серии чистых стандартов, для которых известны клинические показатели ГИ. Эти стандарты, использованные для калибровки способа по Примеру 2, для показателей ГИ составляют от 19 до 100 и обрабатываются точно таким же способом, как образцы других пищевых продуктов при калибровке. После того, как они проанализированы, в установке для калибровки могут быть добавлены дополнительные образцы и/или стандарты, и параметры модели могут быть пересчитаны, если для образцов и/или стандартов известны in vivo показатели ГИ; такие дополнения должны усиливать калибровку, делая установку для калибровки более репрезентативной по образцам пищевых продуктов, для которых определен ГИ. Следовательно, уравнения для расчета или методы расчета могут быть обновлены для включения новых доступных или улучшенных данных in vivo. Все калибровочные образцы и стандарты сначала анализируют при использовании процедуры, как указано выше, и затем используют программное обеспечение JMP Statistical Software с подходящими уравнениями для расчета данных, которые наилучшим образом подходят для взаимосвязи между клиническими показателями ГИ и расчетными вариантами при использовании MLR, PLS или способа нейронной сети.

Способ по изобретению включает калибровку по всем сахарам плюс мальтит. Однако если для образцов, которые могут встретиться, известно, что они не содержат некоторые компоненты, они могут быть удалены из калибровки (например, мальтит, галактоза). Обнаруживаемое количество сахарозы в переваренном образце, как правило, по существу составляет ноль, поскольку считается, что инвертаза превращает любую присутствующую сахарозу в глюкозу и фруктозу. Однако если образцы содержат какое-либо вещество, которое может ингибировать активность инвертазы, возможность оценивать количественно оставшуюся сахарозу может быть использована для развития данных калибровочных установок, которые учитывают ингибирующее воздействие при расчете in vitro показателей ГИ. Только мальтит является сахарным спиртом, о котором в научной литературе сообщается, что он оказывает значительное воздействие на концентрацию сахара, содержащегося крови, при содержании его в норме в пищевых продуктах. Поскольку ВЭИХ с подходящей колонкой позволяет определить основную часть большинства сахаров и сахарных спиртов (но только не мальтит), в анализ на стадии калибровки могут быть включены больше сахаров и больше сахарных спиртов, если требуется.

Неизвестные образцы рассчитывают, вводя % белка в образце, % жира в образце, скорректированные показатели концентрации пустого образца для % глюкозы в переваренном образце, % фруктозы в переваренном образце, % лактозы в переваренном образце, % сахарозы в переваренном образце, % галактозы в переваренном образце и % мальтита в переваренном образце в подходящую программу программного обеспечения по статистической обработке данных (например, JMP Statistical Software), которая затем автоматически рассчитывает показатель ГИ.

Пример 2. Множество коммерчески доступных пищевых продуктов и других пищевых образцов было исследовано с использованием обоих, in vivo и in vitro, протоколов исследований. Наибольшее (25 из всего 34) in vivo показателей гликемического индекса определяли с использованием in vivo исследований, проведенных в частной лаборатории, имеющей большой опыт в таком исследовании; оставшиеся такие показатели in vivo гликемического индекса брали из научной литературы. Те же самые образцы также исследовали с использованием in vitro способа по настоящему изобретению по Примеру 1. Затем эти данные использовали для расчета параметров модели для in vitro исследования гликемического индекса по настоящему изобретению с использованием MLR, PLS и способа нейронной сети, доступных от JMP Statistical Software.

После подачи первой заявки было установлено, что раствор HCl, используемый для получения раствора пепсин/гуаровая камедь, был 0,5 N, а не 0,05 N, как приведено в описании приоритетной заявки. Поскольку раствор пепсин/гуаровая камедь используют для получения ферментного раствора для переваривания, pH во время ферментативной переваривания составлял около 1,1 по сравнению с желательным около 5 описанным. Этот более низкий показатель pH не оптимален для ферментативной реакции переваривания. Таким образом, поскольку pH слишком низкий, отличающиеся уровни различных сахаров были выделены относительно уровней жира и белка в образцах. Однако, поскольку все образцы были обработаны одинаково (то есть при том же самом pH во время переваривания), относительные показатели рассчитанных показателей гликемического индекса остаются верными. Конечно, параметры модели и/или коэффициенты, полученные при использовании этой совокупности данных, будут подходить для применения, только если при ферментативном переваривании используют более низкий pH, который также используют и для новых неизвестных образцов. Примеры 3 и 4, приведенные ниже, проводят при использовании должного раствора; следовательно, реакции ферментативного переваривания проводят при более оптимальном pH.

При использовании способа MLR получают следующие параметры модели:

Термин	Показатель	Стандартное отклонение	Коэффициент t	Проб>[t]
Интерсепт	63,080214	6,498483	9,71	<0,0001
Белок (%)	-0,974313	0,141985	-6,86	<0,0001
Жир (%)	-0,67422	0,087795	-7,68	<0,0001
Глюкоза (%)	364,97478	75,57708	4,83	<0,0001
Фруктоза (%)	-452,5341	75,17166	-6,02	<0,0001
Лактоза (%)	-191,8138	84,17182	-2,28	0,0311
Галактоза (%)	-437,3615	90,44204	-4,84	<0,0001
Мальтит (%)	-298,0102	92,58933	-3,22	0,0034

Следовательно, уравнение, используемое для оценки гликемического индекса in vitro, при использовании способа MLR будет следующим:

ГИ=63,080214-0, 974313 белок (%)-0, 67442 жир (%)+367,97478 глюкоза (%)-452,5341 фруктоза (%)-191,8138 лактоза (%)-437,3615 галактоза (%)-298,0102 мальтит (%).

Соответствующие статистические параметры для этой модели следующие:

Обобщенные результаты критериев:

R²	0,948355
R² Adj	0,934451
Среднеквадратичное отклонение	6,094049
Средний отклик	46,52941
Данные наблюдения (или сумма Wgts)	34

Вариационный анализ:

Источник	DF	Сумма площадей	Средняя площади	Коэффициент F
Модель	7	177730,897	2532,99	68,2057
Ошибка	26	965,573	37,14	Проб>F
Общая корреляция	33	18696,471		<0,0001

При использовании способа PLS с пятью скрытыми переменными получают следующие параметры модели:

Термин	Показатель
Интерсепт	62,745005
Белок (%)	-0,986004
Жир (%)	-0,670993
Глюкоза (%)	369,91833
Фруктоза (%)	-446,4468
Лактоза (%)	-195,07
Галактоза (%)	-425,7489
Мальтит (%)	-291,9779

Следовательно, уравнение, используемое для оценки гликемического индекса in vitro, при использовании способа PLS будет следующим:

ГИ=62,745005-0,986004 белок (%)-0,670993 жир (%)+369,91833 глюкоза (%)-446,4468 фруктоза (%)-195,07 лактоза (%)-425,7489 галактоза (%)-291,9779 мальтит (%).

Соответствующие статистические параметры для этой модели следующие:

Обобщенные результаты критериев:

R²	0,939819
R² Adj	0,937938
Среднеквадратичное отклонение	5,929726
Средний отклик	46,52941
Данные наблюдения (или сумма Wgts)	34

При использовании способа нейронной сети получают следующие параметры массы модели:

Нейронная сеть Таблица I:

Параметр массы	Показатель
Н1:Интерсепт	0,6715187765
Н1:Белок (%)	0,3364859726
Н1:Жир (%)	0,2031260198
Н1:Глюкоза (%)	-0,697405591
Н1:Фруктоза (%)	0,0085016679
Н1:Лактоза (%)	-0,162454793
Н1:Галактоза (%)	0,0632785954
Н1:Мальтит (%)	-0,053195992
G1:Интерсепт	3,994861093
G1:Н1	-6,220038739

Способ нейронной сети не обеспечивает простого уравнения расчета. Конечно, этот способ обеспечивает серии параметров массы и топология сети, которая затем может быть использована для получения расчетных результатов при использовании подходящего программного обеспечения (в данном случае JMP Statistical Software). Критерии, полученные при использовании этого способа, проиллюстрированы графически на Фиг.5A. Соответствующие параметры для этой модели следующие:

	Вычисления
Скрытые точки	1
Штрафной коэффициент чрезмерно близкой подгонки	0,01
Количество ходов	200
Макс. итерация	50
Критерий конвергенции	0,00001

Результаты:

SSE	4,1349837524
Штрафной коэффициент	0,3981397476
Итого	4,5331235
N	65

200	Наилучшая конвергенция
0	Наихудшая конвергенция по сравнению с наилучшей конвергенцией
0	Совпадающие с прямой
0	Без улучшения
0	С макс. итерацией

Y	SSE	Пересчитанный SSE	RMSE	Пересчитанный RMSE	R²
ГИ	1540,3848224	4,1349837524	4,94475002	0,25619263	0,9354

Затем полученные в результате параметры модели используют для расчета показателей in vitro гликемического индекса при использовании каждого из способов аппроксимации данных. Результаты по следующим коммерчески доступным продуктам используют для расчета корреляции параметров. Полученные в результате показатели in vitro гликемического индекса, определенные при использовании аппроксимации данных каждого из способов, сравнивают с показателями in vivo гликемического индекса:

Образец	In vivo ГИ*	In vitro ГИ
PLS	MLR	Нейронная сеть
Походная смесь 1	16	13	13	19
Походная смесь 2	19	13	13	19
Походная смесь 3	20	21	21	21
Походная смесь 4	18	15	15	19
Походная смесь 5	25	16	16	20
Походная смесь 6	26	19	19	21
Походная смесь 7	35	37	37	30
Печенье с фруктовой начинкой 1	77	73	73	75
Печенье с фруктовой начинкой 2	63	66	66	67
Козинаки из арахиса	38	34	34	28
Соленый крекер	88	79	79	83
Масляный крекер	67	66	66	64
Шоколадное печенье	50	58	58	55
Крекеры с крошкой	59	65	65	64
Крекер из цельной пшеницы	71	70	70	73
Печенье с шоколадной крошкой	45	52	52	45
Зерновая смесь	61	52	52	55
Смесь деревенский сыр	51	52	53	52
Картофельные хлопья 1	81	85	85	89
Картофельные хлопья 2	89	83	84	88
Энергетический батончик 1	31	36	36	34
Энергетический батончик 2	36	42	42	39
Энергетический батончик 3	27	38	38	35
Энергетический батончик 4	40	39	40	37
Кока-кола	63**	59	59	58
Цельное молоко	40**	39	40	40
Осветленный не подслащенный яблочный сок	44**	49	49	46
Глюкоза	100**	99	99	96
Сахароза	68**	64	64	65
Фруктоза	19**	21	21	23
Лактоза	46**	44	45	46
Мальтит	35^†	35	34	35
Галактоза	20^††	21	20	20
Показатели in vivo, определенные экспериментально при участии частной лаборатории по исследованию, если не указанно иное. *Показатели in vivo, взятые из: «International table of glycemic index and glycemic load values,» Am. J. Clin. Nutr., 76, 5-56 (2002). ^†Показатели in vivo, взятые из: Livesy, Nutr. Res. Rev., 16(2), 163-91 (2003). ^††Показатели in vivo, взятые из: Jentjens et al., Eur. J. App.l Physiol. 88, 459-465 (2003).

Диаграмма разброса данных, полученных построением графика кривой по данным нейронной сети, приведена на Фиг.4A. При использовании этого способа полученный показатель R² составляет 0,97. Стандартное отклонение способа in vitro (исходя из двойного определения всех 34 образцов) составляет ±1,08 ГИ единиц или ±2,33 относительных процента. Следовательно, этот способ продемонстрировал очень высокую точность и высокий расчетный показатель.

Пример 3. После того как была подана основная патентная заявка, работа продолжилась, и были добавлены дополнительные точки данных и сделаны определенные модификации способа для обеспечения еще большей точного и достоверности способа. Как указанно выше в Примере 2, pH во время стадии ферментативного переваривания Примера 2 слишком низкий. Должный показатель pH для стадии ферментативного переваривания должен составлять около 5; образцы, другие, чем в этой модификации, были обработаны таким же образом, что и в Примере 2. Следовательно, 31 образец, используемый в Примере 2, были использованы повторно для получения данных при более оптимальном рН ферментативного переваривания. Дополнительно, 34 новых образца было добавлено к повторным образцам из Примера, таким образом, общее количество образцов составило 65. Здесь представлен способ in vitro по настоящему изобретению (по состоянию на текущий момент этой частично продолжающейся заявки), который основывается на образцах, переваренных ферментами при более оптимальном показателе pH. Конечно, специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение, следует понимать, что точность и достоверность этого способа также повысилась за счет ставших доступными дополнительных in vivo данных для калибровочных образцов и/или стандартов, которые вводятся в модель in vitro во время процедуры калибровки.

При использовании способа MLR получают следующие параметры модели:

Термин	Показатель	Стандартное отклонение	Коэффициент t	Проб>[t]
Интерсепт	26,779686	2,179648	12,29	<0,0001
Белок (%)	-0,967251	44,81633	-8,92	<0,0001
Жир (%)	-0,385715	0,073903	-5,22	<0,0001
Глюкоза (%)	611,60013	30,00233	20,39	<0,0001
Лактоза (%)	301,95014	44,81633	6,74	<0,0001
Мальтит (%)	169,03383	54,85795	3,08	0,0032
(Глюкоза (%) - 0,05091)* (Белок (%)- 10,0429)	-18,16062	5,456618	-3,33	0,0015

Следовательно, уравнение, используемое для оценки гликемического индекса in vitro при использовании способа MLR и расширенной совокупности данных, будет следующим:

ГИ=26,779686-0,967251 белок (%)-0,385715 жир (%)+611,60013 глюкоза (%)+301,95014 лактоза (%)+169,03383 мальтит (%)-18,16062 [глюкоза (%)-0,05718]*[белок (%)-8,24967].

Соответствующие статистические параметры для этой модели следующие:

Обобщенные результаты критериев:

R²	0,940178
R² Adj	0,93399
Среднеквадратичное отклонение	4,958869
Средний отклик	50,4
Данные наблюдения (или сумма Wgts)	65

Вариационный анализ:

Источник	DF	Сумма площадей	Средняя площадь	Коэффициент F
Модель	7	22415,358	2532,99	151,9250
Отклонение	26	1426,242	24,59	Проб>F
Общая корреляция	33	23841,6000		<0,0001

При использовании способа PLS с пятью скрытыми переменными получают следующие параметры модели:

Термин	Показатель
Интерсепт	26,264529
Белок (%)	-1,048186
Жир (%)	-0,248138
Глюкоза (%)	621,7824
Фруктоза (%)	-52,7993
Лактоза (%)	233,67679
Галактоза (%)	-61,21071
Мальтит (%)	84,689245

ГИ=26,264529-1,048186 белок (%)-0,248138 жир (%)+621,7824 глюкоза (%)-52,7993 фруктоза (%)+233,67679 лактоза (%)-61,21071 галактоза (%)+84,689245 мальтит (%).

Соответствующие статистические параметры для этой модели следующие:

Обобщенные результаты критериев:

R²	0,930041
R² Adj	0,9289831
Среднеквадратичное отклонение	5,145383
Средний отклик	50,4
Данные наблюдения (или сумма Wgts)	65

При использовании способа нейронной сети получают следующие параметры массы модели:

Нейронная сеть Таблица I:

Параметр массы	Показатель
Н1:Интерсепт	0,6715187765
Н1:Белок (%)	0,3364859726
Н1:Жир (%)	0,2031260198
Н1:Глюкоза (%)	-0,697405591
Н1:Фруктоза (%)	0,0085016679
Н1:Лактоза (%)	-0,162454793
Н1:Галактоза (%)	0,0632785954
Н1:Мальтит (%)	-0,053195992
G1:Интерсепт	3,994861093
G1:Н1	-6,220038739

Как указано в Примере 2, способ нейронной сети не обеспечивает простого уравнения расчета. Конечно, этот способ обеспечивает серии параметров массы и топологию сети, которая затем может быть использована для получения расчетных результатов при использовании подходящего программного обеспечения (в данном случае JMP Statistical Software). Критерии, полученные при использовании этого способа, проиллюстрированы графически на Фиг.4A. Соответствующие параметры для этой модели следующие:

	Вычисления
Скрытые точки	1
Штрафной коэффициент чрезмерно близкой подгонки	0,01
Количество ходов	200
Макс. итерация	50
Критерий конвергенции	0,00001

Результаты:

SSE	4,1349837524
Штрафной коэффициент	0,3981397476
Итого	4,5331235
N	65

200	Наилучшая конвергенция
0	Наихудшая конвергенция по сравнению с наилучшей конвергенцией
0	Совпадающие с прямой
0	Без улучшения
0	С макс. итерацией

Y	SSE	Пересчитанный SSE	RMSE	R²
ГИ	1540,3848224	4,1349837524	4,94475002	0,9354

Затем полученные в результате параметры модели используют для расчета показателей in vitro гликемического индекса при использовании каждого из способов аппроксимации данных по Примеру 2. Для расчета корреляции параметров используют результаты по следующим коммерчески доступным продуктам на около 33 больше, чем в Примере 2. Полученные в результате показатели in vitro гликемического индекса, определенные при использовании аппроксимации данных каждой модели или способов с расширенной совокупностью данных, сравнивают с показателями in vivo гликемического индекса:

Образец	In vivo ГИ*	In vitro ГИ
PLS	MLR	Нейронная сеть (NN)
Походная смесь 1	16	18	20	21
Походная смесь 2	19	17	20	20
Походная смесь 3	20	27	24	25
Походная смесь 4	18	21	21	22
Походная смесь 5	25	21	22	22
Походная смесь 6	26	22	23	23
Походная смесь 7	35	38	38	35
Арахис	14**	6	10	16
Печенье с фруктовой начинкой 1	77	69	71	70
Печенье с фруктовой начинкой 2	63	64	67	65
Козинаки из арахиса	38	32	31	29
Соленый крекер***	74**	69	67	69
Масляный крекер	67	69	67	67
Шоколадное печенье	50	50	50	47
Крекеры с крошкой	59	68	68	67
Крекер из цельной пшеницы	71	68	66	67
Печенье с шоколадной крошкой	45	49	47	44
Готовый завтрак 1	63^‡‡	58	59	57
Готовый завтрак 2	47^‡‡	50	49	49
Готовый завтрак 3	61**	61	63	61
Готовый завтрак 4	81**	76	78	78
Готовый завтрак 5	74**	68	68	69
Овсяная каша быстрого приготовления зерновое ассорти	55^‡‡	67	64	67
Мороженое полножирное ваниль	61**	61	63	61
Смесь деревенский сыр	51	42	45	51
Картофельные хлопья^‡‡‡	85	76	76	78
Запеченный картофель	60**	61	61	60
Энергетический батончик 1	31	29	32	29
Энергетический батончик 2	36	36	35	34
Энергетический батончик 3	27	35	33	33
Энергетический батончик 4	40	35	34	33
Кока-кола****	58**	51	53	51
Цельное молоко	40**	39	40	39
Яблочный сок	44**	44	44	44
Апельсиновый сок 1	50**	53	54	53
Апельсиновый сок 2	50**	51	53	51
Коктейль с клюквенным соком	60**	57	60	58
Булочка для гамбургера из цельной пшеницы	62^‡‡	73	70	74
Булочка для хот-дога	71**	71	71	72
Белый хлеб	71**	70	71	71
Хлеб из цельной пшеницы	62**	61	61	60
Крендельки	83**	77	75	79
Попкорн (микроволновка, ароматизатор сливочное масло)	72	75	71	73
Сдоба с изюмом и льняными отрубями	52^‡‡	53	55	52
Рис коричневый длиннозерный	55**	62	62	61
Рис белый длиннозерный	69**	68	70	69
Рисовый и кукурузный снэк	81^‡‡	80	81	82
Паста из цельной пшеницы	57^‡‡	63	60	62
Виноград	46**	49	49	48
Апельсин	48**	45	45	44
Консервированные персики	38**	45	45	45
Банан	47**	44	43	43
Яблоко	38**	42	41	42
Груша	38**	33	30	33
Кукуруза (консервированная зерно восковой спелости)	46**	46	45	44
Морковь (свежая молодая)	47**	43	41	41
Вегетарианский чили	36^‡‡	38	40	36
Соус для пасты томаты и базилик	33^‡‡	43	42	42
Соус для пасты Fagiola	52^‡‡	64	66	64
Глюкоза	100**	92	99	95
Сахароза	61^†	57	60	58
Фруктоза	19**	21	18	26
Лактоза	46**	49	47	49
Мальтит	35^‡	35	35	35
Галактоза	20^‡‡	20	18	20
* Показатели in vivo, определенные экспериментально при участии частной лаборатории по исследованию, если не указанно иное. Показатели in vivo, взятые из: «International table of glycemic index and glycemic load values», Am. J. Clin. Nutr., 76, 5-56 (2002). * этот показатель in vivo для соленого крекера отличается от используемого в Примере 2. Данный является более точным. **** этот показатель in vivo основывается на среднем по двум определениям, для Coca-Cola отличается от используемого в Примере 2, которые основывались только на одном определении. Данный является более точным. ^‡ Показатель in vivo взят из: «International table of glycemic index and glycemic load values,» Am. J. Clin. Nutr., 76, 5-56 (2002) (сильно отклоняющиеся значения исключены). Следовательно, этот показатель мало отличается от такового, используемого в Примере 2. ^‡‡ Показатель in vivo взят из данных производителя. ^‡‡‡ этот показатель in vivo для картофельных хлопьев представляет собой среднее для картофельных хлопьев 1 и для картофельных хлопьев в Примере 2. Два образца картофельных хлопьев Примера 2 были определены очень близко к исходным. ^†Показатели in vivo, взятые из: Livesy, Nutr. Res. Rev., 16(2), 163-91 (2003). ^††Показатели in vivo, взятые из: Jentjens et al., Eur. J. App.l Physiol. 88, 459-465 (2003).

Диаграмма разброса данных, полученная построением графика кривой по данным MLR, приведена на Фиг.5A. При использовании этого способа полученный показатель R² составляет 0,94. Стандартное отклонение способа in vitro (исходя из двойного определения всех 65 образцов) составляет ±4 ГИ единицы или ±6 относительных процентов. Следовательно, этот способ продемонстрировал очень высокую точность и высокий расчетный показатель.

В дальнейшем способ in vitro может быть использован для расчета показателя in vitro ГИ для неизвестного пищевого продукта или ингредиента пищевого продукта простым проведением способа по настоящему изобретению для получения образца и анализа с использованием данных и уравнения расчета, заданного из калибровочных данных. Конечно, как продемонстрировало сравнение с Примерами 2 и 3, результаты калибровки и данные, рассчитанные по уравнению, зависят от фактических условий, в которых анализируют совокупность калибровочных данных и неизвестные образцы (в частности, в отношении стадии ферментативного переваривания). Однако при условии использования одинаковой процедуры для всех образцов, отклонения в процедуре анализа не оказывают значительно влияния на расчет способом по настоящему изобретению, даже когда уравнения расчета сильно отличаются. Авторы настоящего изобретения считают, что это демонстрирует надежность способа in vitro. Поскольку размер совокупности калибровочных данных увеличился, как по количеству образцов, так и/или по точности используемых показателей ГИ, ожидается, что точность и достоверность способа по настоящему изобретению повысится.

Как указанно выше, Garsetti et al. приводит диаграмму разброса с показателем R², составляющим 0,25 для способа in vitro Englyst, указывая таким образом, что этот способ имеет более низкий расчетный показатель. Для дополнительного сравнения легко доступную глюкозу (RAG, выраженный как граммы выделившейся глюкозы за 20 минут/100 г пищевого продукта), как получено при использовании метода расчета, используемого в способе Englyst (то есть исходя только из глюкозы, выделившейся через 20 минут переваривания), по данным Примеров 2 и 3 были по отдельности коррелированны с показателями in vivo ГИ, используя расчеты и параметры способа in vitro Englyst (то есть используя только глюкозу, выделившуюся через 20 минут), как детально описано в Englyst et al., Brit. J. Nutr., 75, 327-337 (1996) (Фигура 4B) и Englyst et al., Am. J. Clin. Nutr., 69, 448-454 (1999) (Фигура 4C). Такой разброс диаграммы показан на Фигурах 4B и 4C с использованием данных Примера 2 и на Фигурах 5B и 5C с использованием данных Примера 4. На Фигурах 4B и 5B in vivo ГИ наносят на график по отношению к результатам RAG/(% доступных углеводов) для данных Примера 2 и Примера 3, соответственно; на Фигурах 4C и 5C in vivo ГИ наносят на график по отношению к результатам RAG для данных Примера 2 и Примера 3, соответственно. Когда такие расчеты проводят, используя данные Примера 2, показатели R² способа Englyst et al. повышены на около 0,41 и на около 0,68 на Фигурах 4B и 4C, соответственно; используя данные Примера 3, показатели R² способа Englyst et al. повышены на около 0,56 и на около 0,58 на Фигурах 5B и 5C, соответственно. Хотя лучше по сравнению с диаграммой разброса Garsetti et al., расчетный показатель способа все еще низкий.

Авторы настоящего изобретения считают, что продемонстрированные показатели R² от около 0,94 до около 0,97 (в зависимости от конкретного используемого способа построения графика кривой и условий, в которых получают данные) способа по настоящему изобретению впервые позволяют использовать способ in vitro для точного и достоверного определения показателей гликемического индекса для широкого ряда пищевых продуктов и/или ингредиентов пищевого продукта. Этот способ может быть использован для легкого, быстрого и недорогого получения точных показателей гликемического индекса, который выигрывает при сравнении по точности при гораздо меньших временных затратах и без участия людей, что требуется для проведения исследования in vivo. Кроме того, точность и достоверность этого способа также повысилась за счет ставших доступными дополнительных in vivo данных для калибровочных образцов и/или стандартов, которые вводятся в модель in vitro во время процедуры калибровки. Это преимущество должно повысить используемость гликемического индекса и связанных с ним показателей (например, показателей гликемической нагрузки, определяемых умножением гликемического индекса на количество углеводов в граммах, обеспечиваемых пищевым продуктом, и делением всего на 100) в питании человека.

Пример 4 . Образцы, используемые в Примере 2 (при использовании меньшего, чем оптимальный, показателя рН на стадии ферментативной реакции), повторно используют в Примере 3, используя более оптимальный показатель pH. Данные Примера 3 в части повторной совокупности данных Примера 2 (то есть исключая дополнительные образцы, добавленные в Примере 3) используют для получения новой совокупности параметров для построения графиков различных кривых. Этот Пример, который основывается на 31 из 34 образцов Примера 2, эффективно иллюстрирует анализ in vitro Примера 2 при исследовании серии образцов при более оптимальном показателе pH. Это позволяет провести более прямое сравнение коэффициентов корреляции или параметров Примера 2 и Примера 3, где для каждой совокупности данных варьируется только количество образцов.

При использовании способа MLR получают следующие параметры модели:

Термин	Показатель	Стандартное отклонение	Коэффициент t	Проб>[t]
Интерсепт	30,502796	3,388751	9,00	<0,0001
Белок (%)	-0,787639	0,137003	-5,75	<0,0001
Жир (%)	-0,515649	0,088565	-5,82	<0,0001
Глюкоза (%)	573,03525	51,23366	11,18	<0,0001
Лактоза (%)	275,61246	45,69519	6,03	<0,0001
Мальтит (%)	147,62386	51,90435	2,84	0,0090
(Глюкоза (%) - 0,05091)* (Белок (%)- 10,0429)	-20,39966	6,583621	-3,10	0,0049

Следовательно, уравнение, используемое для оценки гликемического индекса in vitro при использовании способа MLR, будет следующим:

ГИ=30,502796-0,787639 белок (%)-0,515649 жир (%)+573,03525 глюкоза (%)+275, 61246 лактоза (%)+147,62386 мальтит (%)-20,39966 [глюкоза (%)-0,05091]*[белок (%)-10,0429].

Соответствующие статистические параметры для этой модели следующие:

Обобщенные результаты критериев:

R²	0,968035
R² Adj	0,960043
Среднеквадратичное отклонение	4,393218
Средний отклик	45,03226
Данные наблюдения (или сумма Wgts)	31

Вариационный анализ:

Источник	DF	Сумма площадей	Средняя площадь	Коэффициент F
Модель	6	14027,759	2337,96	121,1355
Отклонение	24	463,209	19,31	Проб>F
Общая корреляция	30	14490,968		<0,0001

При использовании способа PLS с пятью скрытыми переменными получают следующие параметры модели:

Термин	Показатель
Интерсепт	48,443999
Белок (%)	-1,003763
Жир (%)	-0,492915
Глюкоза (%)	443,60721
Фруктоза (%)	-265,4383
Лактоза (%)	-33,78516
Галактоза (%)	-277,1671
Мальтит (%)	-142,2773

Следовательно, уравнение, используемое для оценки гликемического индекса in vitro при использовании способа PLS, будет следующим:

ГИ=48,443999-1,003763 белок (%)-0,492915 жир (%)+443.60721 глюкоза (%)-265,4383 фруктоза (%)-33, 78516 лактоза (%)-277,1671 галактоза (%)-142,2773 мальтит (%).

Соответствующие статистические параметры для этой модели следующие:

Обобщенные результаты критериев:

R²	0,964188
R² Adj	0,962953
Среднеквадратичное отклонение	4,230216
Средний отклик	45,03226
Данные наблюдения (или сумма Wgts)	31

При использовании способа нейронной сети получают следующие параметры массы модели:

Нейронная сеть Таблица I:

Параметр массы	Показатель
Н1:Интерсепт	0,8572040599
Н1:Белок (%)	0,3767226601
Н1:Жир (%)	0,4495966298
Н1:Глюкоза (%)	-0,651892945
Н1:Фруктоза (%)	0,2134796555
Н1:Лактоза (%)	-0,042105783
Н1:Галактоза (%)	0,2610403756
Н1:Мальтит (%)	0,0659243194
G1:Интерсепт	3,2202762866
G1:Н1	-4,803405337

Как указанно в Примерах 2 и 3, способ нейронной сети не обеспечивает простого уравнения расчета. Конечно, этот способ обеспечивает серии параметров массы и топологию сети, которая затем может быть использована для получения расчетных результатов при использовании подходящего программного обеспечения (в данном случае JMP Statistical Software). Соответствующие параметры для этой модели следующие:

	Вычисления
Скрытые точки	1
Штрафной коэффициент чрезмерно близкой подгонки	0,01
Количество ходов	200
Макс. итерация	50
Критерий конвергенции	0,00001

Результаты:

SSE	1,027472638
Штрафной коэффициент	0,2469635769
Итого	1,2744362149
N	31

200	Наилучшая конвергенция
0	Наихудшая конвергенция по сравнению с наилучшей конвергенцией
0	Совпадающие с прямой
0	Без улучшения
0	С макс. итерацией

Y	SSE	Масштабированный SSE	RMSE	R²
ГИ	496,30242843	1,027472638	4,13689217	0,9658

Затем полученные в результате параметры модели используют для расчета показателей in vitro гликемического индекса при использовании аппроксимации данных каждого из способов. Результаты по следующим коммерчески доступным продуктам используют для расчета корреляции параметров. Полученные в результате показатели in vitro гликемического индекса, определенные при использовании аппроксимации данных каждого из способов, сравнивают с показателями in vivo гликемического индекса:

Образец	In vivo ГИ**	In vitro ГИ
PLS	MLR	Нейронная сеть
Походная смесь 1	16	19	19	21
Походная смесь 2	19	18	19	21
Походная смесь 3	20	19	22	21
Походная смесь 4	18	19	20	21
Походная смесь 5	25	20	21	22
Походная смесь 6	26	20	21	22
Походная смесь 7	35	37	38	33
Арахис	14**	6	10	16
Печенье с фруктовой начинкой 1	77	71	73	72
Печенье с фруктовой начинкой 2	63	65	69	66
Козинаки из арахиса	38	33	30	29
Соленый крекер	74	73	69	74
Масляный крекер	67	68	67	66
Шоколадное печенье	50	50	47	45
Крекеры с крошкой	59	70	69	70
Крекер из цельной пшеницы	71	72	67	73
Печенье с шоколадной крошкой	45	50	47	45
Смесь деревенский сыр	51	48	47	47
Картофельные хлопья	85	81	79	84
Энергетический батончик 1	31	31	35	31
Энергетический батончик 2	36	37	37	36
Энергетический батончик 3	27	35	35	34
Энергетический батончик 4	40	35	36	35
Кока-кола	58	53	55	53
Цельное молоко	40	41	40	41
Осветленный не подслащенный яблочный сок	44	50	46	48
Глюкоза	100	95	102	96
Сахароза	61	58	62	59
Фруктоза	19	21	20	25
Лактоза	46	45	47	47
Мальтит	35	34	35	35
Галактоза	20	20	20	20
Показатели in vivo, определенные экспериментально при участии частной лаборатории по исследованию, если не указанно иное. *Показатели in vivo, взятые из Примера 3, где они были получены, как объяснено здесь.

Диаграмма разброса данных, полученная построением графика кривой по данным нейронной сети, как показано на Фиг.6. Показатель R², полученный при использовании этого способа, составляет 0,96. Следовательно, этот способ демонстрирует высокую достоверность и высокий расчетный показатель. Результаты Примеров 3 и 4, основанные на отличающемся количестве образцов, но подвергшиеся обработке при одинаковых условиях, как правило, согласуются.

Как показывают эти Примеры (в частности Примеры 3 и 4), при увеличении числа образцов показатели различных коэффициентов и другие параметры, используемые при различных процедурах построения графиков кривых, могут быть улучшены для достижения наилучших критериев по совокупности данных. Дополнительные образцы, добавленные к совокупности данных, могут быть применены к широкому ряду пищевых продуктов и более репрезентативны по пищевым продуктам.

1. Осуществляемый in vitro способ определения гликемического индекса исследуемого пищевого продукта, включающий:
(1) определение содержания белка и содержания жира в исследуемом пищевом продукте;
(2) приведение исследуемого пищевого продукта в гомогенное и тонкодисперсное состояние для получения образца пищевого продукта, пригодного для исследования;
(3) переваривание указанного образца в гомогенном и тонкодисперсном состоянии в количестве, достаточном для обеспечения стандартного количества доступных углеводов, смесью пищеварительных ферментов за фиксированный период времени для получения переваренного образца;
(4) обработку всего переваренного образца сразу после указанного фиксированного периода времени для прекращения ферментативных реакций;
(5) определение количества глюкозы и по меньшей мере двух сахаров или сахарных спиртов, выбранных из группы, состоящей из фруктозы, галактозы, лактозы, сахарозы и мальтита, в переваренном образце стадии (4); и
(6) рассчитывание гликемического индекса исследуемого пищевого продукта, исходя из данных, полученных на стадиях (1) и (5), с использованием уравнения или метода расчета, полученного многовариантным анализом калибровочных данных для калибровки образцов, причем калибровочные данные относятся к тому же типу и получены тем же способом, что и данные для исследуемого пищевого продукта, полученные на стадиях (1) и (5), причем калибровочные образцы имеют известные in vivo показатели гликемического индекса.

2. Способ по п.1, в котором определяют количества всех указанных сахаров и сахарных спиртов на стадии (5) и используют для расчета гликемического индекса на стадии (6).

3. Способ по п.1, в котором исследуемому пищевому продукту придают гомогенное и тонкодисперсное состояние посредством измельчения исследуемого пищевого продукта при температуре ниже чем около минус 40°С.

4. Способ по п.2, в котором исследуемому пищевому продукту придают гомогенное и тонкодисперсное состояние посредством измельчения исследуемого пищевого продукта при температуре около минус 78°С или ниже.

5. Способ по п.1, в котором исследуемому пищевому продукту придают гомогенное и тонкодисперсное состояние посредством измельчения исследуемого пищевого продукта при температуре жидкого азота или близкой к ней.

6. Способ по п.2, в котором исследуемому пищевому продукту придают гомогенное и тонкодисперсное состояние посредством измельчения исследуемого пищевого продукта при температуре жидкого азота или близкой к ней.

7. Способ по п.1, в котором количество глюкозы и по меньшей мере двух сахаров или сахарных спиртов, выбранных из группы, состоящей из фруктозы, галактозы, лактозы, сахарозы и мальтита, в переваренном образце со стадии (4) определяют при использовании высокоэффективной ионной хроматографии.

8. Способ по п.2, в котором количество глюкозы и по меньшей мере двух сахаров или сахарных спиртов в переваренном образце со стадии (4) определяют при использовании высокоэффективной ионной хроматографии.

9. Способ по п.1, в котором исследуемому пищевому продукту придают гомогенное и тонкодисперсное состояние измельчением исследуемого пищевого продукта при температуре ниже чем около минус 40°С, причем количество глюкозы и по меньшей мере двух сахаров или сахарных спиртов, выбранных из группы, состоящей из фруктозы, галактозы, лактозы, сахарозы и мальтита, в переваренном образце со стадии (4) определяют при использовании высокоэффективной ионной хроматографии.

10. Способ по п.2, в котором исследуемому пищевому продукту придают гомогенное и тонкодисперсное состояние посредством измельчения исследуемого пищевого продукта и при температуре ниже чем около минус 40°С, причем количество глюкозы, фруктозы, галактозы, лактозы, сахарозы и мальтита в переваренном образце со стадии (4) определяют при использовании высокоэффективной ионной хроматографии.

11. Осуществляемый in vitro способ определения гликемического индекса исследуемого пищевого продукта, включающий:
(1) определение содержания белка и содержания жира в исследуемом пищевом продукте;
(2) приведение пищевого продукта в гомогенное и тонкодисперсное состояние посредством измельчения исследуемого пищевого продукта при температуре жидкого азота или близко к ней для получения образца пищевого продукта, пригодного для исследования;
(3) переваривание указанного образца в гомогенном и тонкодисперсном состоянии в количестве, достаточном для обеспечения стандартного количества доступных углеводов, смесью пищеварительных ферментов за фиксированный период времени для получения переваренного образца;
(4) обработку всего переваренного образца сразу после указанного фиксированного периода времени для прекращения ферментативных реакций;
(5) определение количества глюкозы и по меньшей мере двух сахаров или сахарных спиртов, выбранных из группы, состоящей из фруктозы, галактозы, лактозы, сахарозы и мальтита, в переваренном образце стадии (4); и
(6) рассчитывание гликемического индекса исследуемого пищевого продукта, исходя из данных, полученных на стадиях (1) и (5), для исследуемого пищевого продукта с использованием уравнения или метода расчета, полученного многовариантным анализом калибровочных данных для калибровки образцов, причем калибровочные данные относятся к тому же типу и получены тем же способом, что и данные для исследуемого пищевого продукта, полученные на стадиях (1) и (5), причем калибровочные образцы имеют известные in vivo показатели гликемического индекса.

12. Способ по п.11, в котором при многовариантном анализе используют метод сопоставления кривых, выбранный из группы, состоящей из метода множественной линейной регрессии, метода частных наименьших квадратов и метода нейронной сети.

13. Способ по п.12, в котором метод сопоставления кривых представляет собой метод множественной линейной регрессии.

14. Способ по п.12, в котором метод сопоставления кривых представляет собой метод частных наименьших квадратов.

15. Способ по п.12, в котором метод сопоставления кривых представляет собой метод нейронной сети.

16. Осуществляемый in vitro способ определения гликемического индекса исследуемого пищевого продукта, включающий:
(1) определение содержания белка и содержания жира в исследуемом пищевом продукте;
(2) измельчение исследуемого пищевого продукта при температуре жидкого азота или близко к ней для придания образцу исследуемого пищевого продукта гомогенного и тонкодисперсного состояния;
(3) переваривание образца пищевого продукта в гомогенном и тонкодисперсном состоянии в количестве, достаточном для обеспечения стандартного количества доступных углеводов, смесью пищеварительных ферментов за фиксированный период времени для получения переваренного образца;
(4) обработка всего переваренного образца сразу после указанного фиксированного периода времени для прекращения ферментативных реакций;
(5) определение количества глюкозы, фруктозы, галактозы, лактозы, сахарозы и мальтита в переваренном образце стадии (4) при использовании высокоэффективной ионной хроматографии; и
(6) рассчитывание гликемического индекса исследуемого пищевого продукта, исходя из данных, полученных на стадиях (1) и (5), с использованием уравнения расчета или метода расчета, полученного многовариантным анализом калибровочных данных для калибровки образцов, причем калибровочные данные относятся к тому же типу и получены тем же способом, что и данные для исследуемого пищевого продукта, полученные на стадиях (1) и (5), причем калибровочные образцы имеют известные in vivo показатели гликемического индекса.

17. Способ по п.16, в котором при многовариантном анализе используют метод сопоставления кривых, выбранный из группы, состоящей из метода множественной линейной регрессии, метода частных наименьших квадратов и метода нейронной сети.

18. Способ по п.16, в котором метод сопоставления кривых является методом множественной линейной регрессией.

19. Способ по п.16, в котором метод сопоставления кривых является методом частных наименьших квадратов.

20. Способ по п.16, в котором метод сопоставления кривых является методом нейронной сети.

Изобретение относится к способу анализа олигосахаридов, составляющих гепарины с низкой молекулярной массой и гепарины с очень низкой молекулярной массой, в плазме крови.

Способ прогнозирования стенозов трахеи после длительной интубации и трахеостомии // 2412445

Изобретение относится к медицине и касается способа прогнозирования стенозов трахеи после длительной интубации и трахеостомии. .

Способ диагностики нарушения толерантности к глюкозе и сахарного диабета // 2408287

Изобретение относится к медицине, а именно к пульмонологии и эндокринологии и предназначено для ранней верификации сахарного диабета 2-го типа. .

Способ оценки риска развития метаболического синдрома у больных хроническим холециститом // 2403868

Изобретение относится к медицине, а именно к гастроэнтерологии и кардиологии, может быть использовано в лечебных учреждениях для оценки степени тяжести метаболических нарушений и риска развития метаболического синдрома у больных, страдающих хроническим холециститом.

Анализ сахаридных вакцин без взаимовлияния // 2371725

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии и касается способа анализа сахаридных вакцин без взаимовлияния. .

Композиция для диагностики диабета типа 2 и нарушенной переносимости глюкозы и способы ее применения // 2348040

Способ определения суммарного количества альдоз в смешанной слюне // 2339948

Изобретение относится к области биохимии и медицине. .

Способ прогнозирования и оценки состояния здоровья организма человека // 2339045

Изобретение относится к медицине, в частности к способам прогнозирования и оценки состояния организма человека. .

Способ выбора тактики проведения лечебных мероприятий у больных с метаболическим синдромом на фоне артериальной гипертензии // 2337612

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и может быть использовано при выборе тактики проведения лечебных мероприятий у больных с метаболическим синдромом (МС).

Способ диагностики метаболического синдрома // 2336807

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и может быть использовано для определения метаболического синдрома. .

Способ прогнозирования жизнеугрожающих желудочковых аритмий у больных сахарным диабетом 2 типа, страдающих хронической сердечной недостаточностью // 2477477

Изобретение относится к способу прогнозирования жизнеугрожающих желудочковых аритмий у больных сахарным диабетом 2 типа, страдающих хронической сердечной недостаточностью

Способ определения гликемического индекса потребляемой человеком пищи // 2596506

Изобретение относится к области измерений для диагностических целей, в частности к измерениям, связанным с оценкой влияния пищевых нагрузок на организм человека. Способ определения гликемического индекса на основании результатов измерения концентрации глюкозы в крови человека включает определение промежутка времени Δt от начала роста концентрации глюкозы, вызванного приемом пищи, до достижения максимального значения концентрации глюкозы и определение максимального приращения концентрации глюкозы в крови ΔGmax за данный промежуток времени. При этом гликемический индекс пищи определяют как отношение максимального приращения концентрации глюкозы в крови ΔGmax к максимальному приращению концентрации глюкозы в крови, которая поступила бы в организм человека при приеме чистой глюкозы, количество которой равно количеству углеводов, содержащихся в потребленной пище, и которое определяют как величину, пропорциональную произведению ΔGmax на Δt. Способ позволяет определить гликемический индекс сразу после потребления многокомпонентной реальной пищи. Изобретение существенно упрощает процедуру определения гликемического индекса реальной пищи и позволяет создавать на его основе простые персональные устройства для контроля над углеводным обменом. 3 з.п. ф-лы, 3 табл., 4 ил., 3 пр.

Способ раннего выявления метаболических проявлений побочного действия кортикостероидов при нефротическом синдроме у детей // 2633591

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, и предназначено для оценки ранних проявлений неблагоприятного побочного действия кортикостероидных препаратов на метаболические процессы в организме ребенка при терапии нефротического синдрома. Выполняют биохимический анализ крови с определением уровня глюкозы (Агл) и амилазы (Аам) в сыворотке крови ребенка. Вычисляют индекс массы тела (Аимт). Рассчитывают коэффициент модификации Мимт – индекса массы тела, Мгл – глюкозы и Мам – амилазы по формулам: Затем рассчитывают на их основании индекс метаболических реакций (ИМР) по формуле: При значениях ИМР ≥ 16,5 ед. судят о неблагоприятных побочных реакциях кортикостероидных препаратов на метаболические процессы в организме ребенка, рекомендуют соответствующую фармакологическую коррекцию. Изобретение позволяет контролировать безопасность фармакотерапии при изменении дозы кортикостероидов либо на фоне корригирующей терапии. 9 табл., 3 пр.