Способ получения высокоочищенного кристаллического инсулина любого происхождения

Способ получения высокоочищенного кристаллического инсулина любого происхождения включает проведение, по меньшей мере, одной колоночной обращено-фазовой жидкостной хроматографической очистки инсулина-сырца в водно-органических элюатах с ионными модификаторами на неполярных сорбентах, причем перед колоночной очисткой дополнительно проводят предварительную очистку путем перекристаллизации инсулина-сырца, после которой осуществляют фильтрацию растворенного кристаллизованного инсулина-сырца в апирогенной воде, подкисленной 1,5 М хлороводородной кислотой до рН 1,5-4,0, сначала через органический, а затем стерильный фильтры, после чего доводят объем отфильтрованного раствора с помощью хлороводородной кислоты до заданного и направляют очищенный раствор на колоночную очистку, проводимую со скоростью потока 1-3 см/мин^-1, при этом в качестве подвижной фазы для разделения используют смесь, содержащую ортофосфорную кислоту (85%) 0,045М, сульфат натрия 0,010 М и находящиеся в соотношении 60-70%:40-30% (по объему) апирогенную воду и этанол, а в качестве подвижной фазы для промывки используют смесь апирогенной воды и этанола, взятые в соотношении 40-60%:60-40% (по объему) соответственно, затем полученный после хроматографической очистки элюат помещают в стерильный, охлажденный кристаллизатор, поддерживая рН на уровне 3,3-4,9 и, тщательно перемешивая, охлаждают до температуры 2-15°С, при этом полученный кристаллический инсулин высушивают с этиловым спиртом. В качестве органического фильтра используют целлюлозный фильтр. Изобретение обеспечивает упрощение и сокращение технологического процесса за счет проведения полной очистки инсулина-сырца в одну стадию во время высокоэффективной жидкостной хроматографии. 3 з.п. ф-лы, 3 пр.

 

Предлагаемое изобретение относится к фармацевтической промышленности, биотехнологии, биохимии и медицине, в частности к способам получения высокоочищенного кристаллического рекомбинантного инсулина различного происхождения, в том числе свиного, человеческого генно-инженерного, полусинтетического, применяемого для лечения сахарного диабета.

Инсулин - белковый гормон животных и человека, вырабатываемый поджелудочной железой. Понижает содержание сахара в крови, задерживая распад гликогена в печени и увеличивая использование глюкозы мышечными и другими клетками. Недостаток инсулина приводит к сахарному диабету (см., например, Новая иллюстрированная энциклопедия. Кн. 7. Жа - Н76 Ит. - М.: Большая Российская энциклопедия. 2004.- 256 с.: ил., стр.199). Из-за ограниченности сырьевой базы потребности в инсулине не могут быть покрыты инсулином только животного происхождения. Кроме того, при лечении сахарного диабета существует необходимость в использовании различных препаратов инсулина. В связи с этим разработка эффективных способов получения инсулина из рекомбинантных штаммов микроорганизмов является актуальной задачей. Одной из важнейших проблем является очистка инсулина.

Требования, предъявляемые к качеству инсулина, очень высокие. Так, например, содержание проинсулина, определяемое методом радиоиммунологического анализа (РИА), не должно превышать 1,0 ppm. (0,0001%), содержание неидентифицированных примесей, определяемое методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), не должно превышать 1,0%, содержание дезамидо-А21-инсулина не более 1,0% (ВЭЖХ).

Известны способы получения высокоочищенного инсулина, базирующиеся на использовании ионообменной и гельпроникающей хроматографической очистки инсулина. Однако известные способы не позволяют получить инсулин с содержанием основного вещества более 97% (ВЭЖХ) и с содержанием проинсулина менее 1 рpm. (РИА). При этом выход не превышает 60%.

Кроме того, в известных изобретениях очистка, как правило, включает в себя проведение, по меньшей мере, двух стадий, например, высокоэффективная жидкостная хроматография, а затем гель-фильтрация или ионообменная хроматография, высокоэффективная хроматография и гель-фильтрация.

Из уровня техники известен способ очистки инсулина, осуществляемый путем высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ), при котором к раствору-гидролизату инсулина, полученного в результате ферментативного расщепления рекомбинантного предшественника, добавляют трифторуксусную кислоту, служащую для ионного спаривания и снижения рН до уровня 3,0) и ацетонитрил до концентрации 20% об. При этом ВЭЖХ-колонну, упакованную сорбентом Кромасил С8, уравновешивают водным раствором ацетонитрила (30 об.), содержащим 0,25% пентафторпропионовой кислоты. Раствор инсулина наносят на колонну при температуре 30°С. Затем инсулин десорбируют подвижной фазой, содержащей 0,25% пентафторпропионовой кислоты, в градиенте концентрации ацетонитрила. Основную фракцию элюированного инсулина собирают и анализируют (см., например, Nilsson J., Jonasson P., Samuelson E., Stahl S., Uhlen M. «Integrated production of human insulin and its C-peptide», Journal of biotechnolodgy, 1996, v.48, p.241-250).

Недостатки известного способа обусловлены низкой производительностью процесса, в частности выход целевого белка составляет всего 54%. Кроме того, для осуществления способа используют сильнотоксичные и дорогостоящие растворители, такие как ацетонитрил.

Известен способ очистки инсулина, включающий получение раствора инсулина или его предшественника, анионообменную хроматографию, обессоливание, причем на стадии анионообменной хроматографии раствор, содержащий инсулин или его предшественник, хроматографируют при рН 4,5-5,8 на катионообменнике на основе сополимера метакрилатного мономера с кросс-агентом, элюируют белки, связавшиеся с катионообменником, в градиенте соли и фракции, содержащие целевой продукт, обессоливают, а анионообменную хроматографию проводят при рН 9,0-10,5, при этом в качестве анионообменника используют сорбент на основе сополимера метакрилатного мономера с кросс-агентом, имеющего четвертичные аминогруппы (см. патент РФ на изобретение №2081122 «Способ выделения и очистки инсулина или его биотехнологических предшественников», дата подачи 16.06.1994 г., опубликовано 10.06.1997 г.).

Недостатки известного способа связаны со сложностью, а именно многоступенчатостью технологического процесса, а также его дороговизной.

Кроме того, известен способ получения кристаллического инсулина, осуществляемый путем сорбции инсулированного сырья, очищенного от жиров и пигментов при рН 2,0-4,0 на сульфокатионите, обработки сорбента уксусно-аммонийным буферным раствором с последующей десорбцией и кристаллизацией, при этом сорбцию проводят на микродисперсии сульфокатионита с величиной частиц 20-60 мкм, смешанной с инертным силикатным наполнителем с величиной частиц 40-120 мкм при объемном соотношении микродисперсии и наполнителя (см. Авторское свидетельство №1007675 «Способ получения кристаллического инсулина», дата подачи 04.08.1980, опубликовано 30.03.1983 г.).

К недостаткам данного способа можно отнести невысокий выход инсулина после очистки - 64-70%, а также большая антигенность - содержание проинсулина составляет 0,5% по сравнению с требуемыми 0,001%.

Из уровня техники известен способ очистки инсулина с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием полимерного сорбента, например, PLRP-S, при этом хроматографическую колонну уравновешивают подвижной фазой, содержащей 0,05 М ацетата аммония, 0.1М глицина (рН 9,0). Нанесенный образец инсулина десорбируют подвижной фазой, содержащей 0,05 М ацетата аммония, 0,1 М глицина (рН 9,0), в градиенте пропанола-1 или пропанола-2. Основную фракцию инсулина собирают и анализируют (см. патент USA 6,710,167 «Procedure of the chromatographic purification of insulins», дата подачи 24.08.1999 г.).

Недостатки известного способа обусловлены низкой производительностью процесса и низкой степенью очистки инсулина от иммунореактивных полипептидов, а также необходимостью использования высоких значений рН.

Известен способ получения генно-инженерного инсулина человека, заключающийся в том, что культивируют клетки штамма-продуцента E.coli ДН5а/pVK100 разрушают бактериальные клетки ультразвуковой дезинтеграцией, отделяют тельца включения, содержащие гибридный белок, от водорастворимых примесей при помощи центрифугирования, затем растворяют тельца включения в буфере, содержащем 8 М мочевину, 1 мМ дитиотреитол, 0,1 М трис-HCl, рн 8,0, в течение 12-16 часов. Нерастворившиеся примеси удаляют центрфугированием. После чего увеличивают концентрацию дититреитола до 10 мМ и восстанавливают дисульфидные связи при температуре 37°С в течение часа. Раствор разбавляют в пять раз холодной водой, доводят рН до 4,5 и выдерживают 2 часа при температуре 4°С для формирования осадка. Осадок, содержащий гибридный белок, отделяют центрифугированием и ренатурируют, затем быстро растворяют в холодной воде при рН 10-12, после чего разводят 10 мМ глициновым буфером рН 10,8 и выдерживают при температуре 4°С в течение 8-10 часов. После ультрафильтрации расвтор подвергают гельфильтрации на колонке с сефадексом g-50 и элюируют 10 мМ глициновым буфером. Собирают фракции, содержащие гибридный белок, проводят ультрафильтрацию и лиофильно высушивают. Полученный гибридный белок растворяют в 0,08 М трис-HCl буфере, рН 7,5 до концентрации 10 мг/мл и расщепляют одновременно трипсином и карбоксипептидазой Б (при этом соотношение карбоксипаптидаза Б:трипсин:гибридный белок составляет 0,3:1:10) при температуре 37°С в течение 30 минут.Добавляют изопропанол до 40%. Смесь подвергают хроматографической очистке на колонне с DEAE-сефадексом А-25 и элюируют 0,05М трис-HCl буфером. РН 7,5 с 40% изопропанола с линейным градиентом хлористого натрия от 0 до 0,1 м. После удаления изопропанола концентрацию хлористого натрия увеличивают до 25%, сдвигают рН до 32,0 и собирают осадок инсулина (см. Chen J.-Q., Zhang Н.-Т., Hu М.-Н., Tang J.-G., «Production of human insulin in an E. Coli system with met-lys-human proinsulin as the expressed precursor» Applied Biochemistry and Biotechnology, 1995, v.55, p.5-15).

Применение на начальных стадиях гель-фильтрации требует значительных объемов сорбента и большое количество ферментов, которые используются при расщеплении гибридного белка.

Известен способ получения рекомбинантного инсулина человека, включающий культивирование штамма-продуцента Escherichia coli, разрушение клеток дезинтеграцией, отделение телец включения, содержащих гибридный белок, их растворение в буфере, содержащем мочевину и дитиотреитол, ренатурацию и очистку ренатурированного гибридного белка, его расщепление трипсином и карбоксипептидазой Б с последующей очисткой и получением целевого продукта, причем в качестве штамма-продуцента используют штамм Escherichia coli JM109/pPINS07, очистку ренатурированного гибридного белка осуществляют путем осаждения примесных соединений в 40% изопропаноле с последующей хроматографией на КМ-сефарозе, расщепление гибридного белка трипсином и карбоксипептидазой Б осуществляют последовательно, при этом продукты трипсинолиза хроматографируют на СП-сефарозе, уравновешенной 0,03-0,1 М аммоний-ацетатным буфером, рН 5,0-6,0, содержащим 6 М мочевины, с элюцией фракций линейным градиентом хлористого натрия 0-0,5 М в стартовом буфере, а полученную после расщепления карбоксипептидазой Б фракцию инсулина очищают методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на обращенных фазах с последующей гель-фильтрацией (см. патент РФ на изобретение №2141531 «Способ получения рекомбинантного инсулина человека», дата подачи 26.05.1999 г., опубликовано 20.11.1999 г.).

Известен способ очистки свиного инсулина и инсулина крупного рогатого скота путем колоночной препаративной хроматографии низкого давлении, включающий пропускание водного раствора инсулина-сырца через ионит с последующей элюцией инсулина и осаждением его из элюата, при этом в качестве ионита используют продукт сополимеризации метакриловой, акриловой кислот и диметакрилата этиленгликоля, имеющий степень набухания К_наб 4,5-4,8 и полную обменную емкость 9,2-9,8 мг экв/г, а процесс осуществляют путем пропускания водного раствора инсулина-сырца с рН 3,0-3,5 через указанный ионит, предварительно уравновешенный 10-16%-ным водным раствором изопропанола с рН 3,0-3.5, затем ионит промывают 10-16%-ным водным раствором изопропилового спирта с рН 3,0-3,5 и проводят элюцию инсулина 20-25%-ным водным раствором изопропилового спирта с рН 3,4-3,9, содержащим 0,05-0,15 М ацетата аммония, из полученного элюата целевой продукт выделяют осаждением (см. патент РФ на изобретение №2057542 «Способ очистки свиного инсулина и инсулина крупного рогатого скота», дата подачи 17.02.1994 г., дата опубликовано 10.07.1996 г.).

Наиболее близким техническим решением к заявляемому изобретению является способ получения высокоочищенного монокомпонентного инсулина, содержащего не менее 98,5% основного вещества, не более 0,5% дезамидо-А21-инсулина, не более 1,0% неидентифицированных примесей и не более 1,0 млн^-1, проинсулина при помощи жидкостной колоночной хроматографической очистки инсулина-сырца при температуре 5-30°С в водно-органических элюентах с ионными модификаторами на неполярных сорбентах, отличающийся тем, что инсулин-сырец с общим количеством 15-50 г на 1 л сорбента в хроматографической колонке растворяют в элюенте А со значением рН 1,5-4,5, содержащем ионные модификаторы с концентрацией 0,001-0,3 моль/л и органический растворитель с концентрацией 10-30% об. вводят с линейной скоростью потока 0,25-1,5 см/мин в хроматографическую колонку с высотой слоя сорбента 10-60 см предварительно уравновешенную элюентом А и заполненную неполярным сорбентом со средним размером пор 100-500 Å, размером частиц 10-100 мкм, элюируют сорбированный инсулин с хроматографической колонки с линейной скоростью потока 0,5-3,0 см/мин, используя ступенчатый или непрерывный градиент концентрации органического растворителя и получают высокоочищенный инсулин-полупродукт, который затем выделяют в кристаллическом виде и растворяют в элюенте В со значением рН 6,5-9,5, содержащем ионные модификаторы с концентрацией 0,001-0,3 моль/л и органический растворитель с концентрацией 10-30% об. вводят с линейной скоростью потока 0,25-1,5 см/мин в хроматографическую колонку с высотой слоя сорбента 10-60 см, предварительно уравновешенную элюентом В и заполненную неполярным сорбентом со средним размером пор 100-500 Å, размером частиц 10-100 мкм, элюируют сорбированный инсулин с хроматографической колонки с линейной скоростью потока 0,5-3,0 см/мин, используя ступенчатый или непрерывный градиент концентрации органического растворителя, и получают раствор высокоочищенного монокомпонентного инсулина (см. патент РФ на изобретение №2186581 «Способ получения высокоочищенного монокомпонентного инсулина», дата подачи 28.03.2000 г., опубликовано 10.08.2002 г.).

Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, заключается в упрощении и сокращении технологического процесса промышленного получения высокоочищенного инсулина за счет проведения полной очистки инсулина-сырца любого происхождения в одну стадию во время высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Указанный результат достигается тем, что способ получения высокоочищенного кристаллического инсулина любого происхождения, включающий проведение, по меньшей мере, одной колоночной обращено-фазовой жидкостной хроматографической очистки инсулина-сырца в водно-органических элюатах с ионными модификаторами на неполярных сорбентах, согласно изобретению перед колоночной очисткой дополнительно проводят предварительную очистку путем перекристаллизации инсулина-сырца, после которой осуществляют фильтрацию растворенного кристаллизованного инсулина-сырца в апирогенной воде, подкисленной 1,5 М хлороводородной кислотой до рН 1,5-4,0, сначала через органический, а затем стерильный фильтры, после чего доводят объем отфильтрованного раствора с помощью хлороводородной кислоты до заданного и направляют очищенный раствор на колоночную очистку, проводимую со скоростью потока 1-3 см/мин^-1, при этом в качестве подвижной фазы для разделения используют смесь, содержащую ортофосфорную кислоту (85%) 0,045М, сульфат натрия 0,010 М и находящихся в соотношении 60-70%:40-30% (по объему) апирогенную воду и этанол, а в качестве подвижной фазы для промывки используют смесь апирогенной воды и этанола, взятых в соотношении 40-60%:60-40% (по объему) соответственно, затем полученный после хроматографической очистки элюат помещают в стерильный, охлажденный кристаллизатор, поддерживая рН на уровне 3,3-4,9 и тщательно перемешивая охлаждают до температуры 2-15°С, при этом полученный кристаллический инсулин высушивают с этиловым спиртом.

В качестве органического фильтра используют целлюлозный фильтр. В качестве стерильного фильтра используют, например, фильтр MilliporeSterivex - HV.

Стерильный фильтр используют с размером пор 0,22 мкм.

Кристаллизацию инсулина проводят любым известным методом в присутствии ионов цинка и буферного раствора уксусной или лимонной кислоты, например, по методу Романса Фишера.

Заявляемое изобретение состоит из следующих этапов, протекающих в изолированной системе хроматографической колонны:

Предварительная очистки путем перекристаллизации.

Берут 100 г неочищенного инсулина-сырца и растворяют его в 10 л апирогенной воды с добавлением 100 г лимонной кислоты, при этом величину рН доводят до значения 2,0-4,0, используя или хлороводородную кислоту, или гидроксид аммиака. Полученный слегка опалесцентный раствор очищают с помощью фильтрации через органический фильтр, в качестве которого применяют целлюлозный фильтр. После этого в фильтрат добавляют смесь, состоящую из 12% ацетона и 1,6% пятипроцентного водного раствора хлорида цинка (ZnCl₂). Кристаллизация осуществляется благодаря охлаждению до температуры 10-20°С и доведения уровня рН до значений 5,0-6,5. Затем взвесь полученных кристаллов тщательно перемешивают в течение 2-6 часов, отстаивают в течение 8-15 часов. Кристаллы отделяют и хранят при температуре 15-30°С.

После получения кристаллов неочищенного инсулина-сырца проводят его очистку фильтрованием через целлюлозные и стерильные фильтры.

Для этого берут 80 г кристаллизованного неочищенного сырья, либо инсулина Na-соли, либо Zn-комплекса инсулина и растворяют в 200 мл апирогенной воды. Затем объем доводят апирогенной водой до 600 мл, тщательно перемешивают и полученную суспензию подкисляют 1,5 М хлороводородной кислотой до уровня рН 1,5-4,0. После полного растворения кристаллов раствор фильтруют, пропуская через целлюлозные фильтры.

Полученный чистый раствор еще раз фильтруют, используя стерильные фильтры MilliporeSterivex - HV с размером пор 0,22 мкм. В полученный фильтрат добавляют 0,01 М хлороводородной кислоты до общего объема 800 мл.

Срок годности раствора после фильтрации не более 10-15 часов при температуре 10°С.

Выход продукта на данном этапе составляет 100% (Ед/Ед).

Следующий этап выполняют с использованием обратнофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Очистку проводят при следующих условиях:

Стационарная фаза: YMC18, 15 µm, 300 Å либо Diasogel C18, 15 µm.

Для разделения используют подвижную фазу, содержащую апирогенную воду (60-70% по объему), этанол (40-30% по объему), ортофосфорную кислоту (85%) 0,045 М, сульфат натрия 0,010 М. При этом рН 2,7-4,0 поддерживают гирооксидом натрия.

Для промывки системы используют апирогенную воду и этанол, взятые соответственно в соотношении 40-60%: 60-40% (по объему). Температура проведения очистки - 19-25°С, скорость потока - 1-3 см/мин^-1, давление - 1,2-2,5 МРа. Объем загрузки инсулина составляет 40-60 г в 400 мл раствора. Параметры хроматографической колонки: диаметр - 20 см, длина - 45-50 см. Коэффициент удерживания для инсулина - 4-8, оптимальная длина волны - 214 нм. Детекцию белков проводят при длине волны 200-254 нм.

Срок годности подвижной фазы равен 40 суткам при температуре хранения не ниже 27°С под атмосферой фильтруемого азота.

Выход на данном этапе - 60-90% (Ед/Ед) и зависит от качества используемого неочищенного сырья.

Общее время проведения полной очистки в хроматографической колонке составляет 240 минут.

Полученный элюат, содержащий необходимый продукт, помещают в стерильный и охлажденный кристаллизатор. рН элюата поддерживают в пределах 3,3-4,9. Раствор элюата охлаждают до температуры 2-15°С и тщательно перемешивают.

Кристаллизацию осуществляют через 0,5 часа после достижения необходимой температуры. После получасового охлаждения кристаллов при заданной температуре удаляют оставшийся раствор, при этом удаленные остатки раствора обезвреживают путем фильтрации в охлаждающей емкости, выполненной из нержавеющей стали.

Полученные кристаллы хранят в герметичных картриджах при температуре 2-8°С в течение не более 5 суток.

Выход конечного продукта составляет 97-98%.

Технических решений, совпадающих с совокупностью существенных признаков заявляемого изобретения, не выявлено, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения такому условию патентоспособности, как «новизна».

Заявляемые существенные признаки, предопределяющие получение указанного технического результата, явным образом не следуют из уровня техники, что позволяет сделать вывод о соответствии предлагаемого изобретения такому условию патентоспособности, как «изобретательский уровень».

Условие патентоспособности «промышленная применимость» подтверждено на примерах конкретного применения.

Пример 1

По предлагаемому способу 40,0 г человеческого инсулина сырца, полученного путем генной инженерии (цинк комплекс содержащий 9,1% влаги и 79% чистого активного вещества в пересчете на сухое вещество) растворяют в 300 мл 0,01 1М хлороводородной кислоты и поддерживают рН в пределах от 2,6 до 2,9 с помощью добавления 1,5 М хлороводородной кислоты. Слегка опалесцирующий раствор фильтруют через целлюлозный фильтр. Фильтрат доводят до 400 мл с помощью 0,01 хлороводородной кислоты. Полученный прозрачный раствор подвергают стерилизующей фильтрации 0,22 µm и пропускают через хроматографическую систему очистки, при этом соблюдают следующие условия проведения процесса:

Колонка с осевой динамической компрессией, диаметр 20 см, эффективная длина 49 см.

Стационарная фазаУМС ODS Sillica C18, 300Å, 15 µm.

Подвижная фаза для распределения: 32,5% по объему этилового спирта, 67,5% по объему воды апирогенной, фосфорная кислота 0,015 М, сульфат натрия 0,010 М, рН 3,5 поддерживают с помощью капель 5М раствора гидроксида натрия.

Подвижная фаза для полного исключения: 50% по объему этилового спирта, 50% по объему воды апирогенной.

Скорость потока: 500 мл мин^-1.

Давление: 14 бар при распределении и 15 бар при полном исключении органических примесей.

Температура: 20°С.

Образец с содержанием 28,72 г чистого инсулина в 400 мл раствора вводят в колонку и запускают изократическое элюирование. Основная фракция, содержащая чистый инсулин, элюирует в течение 120-150 мин. Объем фракции, содержащей чистый инсулин составляет 30 л. Исключение органических примесей 50% этиловым спиртом начинают на 260 минуте и заканчивают в течение 60 мин.

Затем рН элюата доводят до значения 4,6, после чего раствор охлаждают до температуры 12°С. Кристаллизация происходит еще в течение 8 мин и завершается через 12 часов. Кристаллический инсулин в виде сульфатной соли осаждается в течение 2 часов после остановки мешалки. Супернатант отделяют с помощью насоса, полученный осадок кристаллического инсулина высушивают с этиловым спиртом. При этом вес влажного инсулина составляет 30,03 г и содержит 25,12 г чистого вещества в пересчете на сухой вес. Кристаллический, очищенный инсулин в виде сульфатной соли кристаллизуют хорошо известным путем из раствора лимонной кислоты в присутствии ионов Zn²⁺ при рН 5,8. Выход составляет 26,61 г человеческого инсулина с содержанием 24,07 г активного средства. Потери в течение всего процесса составляют 16,2% [Ед/Ед]. Качество полученного вещества соответствует требованиям фармакопеи Евросоюза, США и России.

Пример 2

2,0 г кристаллов свиного инсулина-сырца, полученного традиционным экстракционным путем по схеме Романса и Фишера (цинк комплекс, содержащий 8,5% влаги и 89% чистого активного средства в пересчете на сухое вещество) растворяют в 10 мл 0,01М хлороводородной кислоты и поддерживают рН в пределах от 2,6 до 2,9 с помощью добавления 1,5 М хлороводородной кислоты. Слегка опалесцирующий раствор центрифугируют при 3500 g в течение 15 мин. Объем супернатанта доводят до 20 мл с помощью 0,01 М хлороводородной кислоты. Полученный прозрачный раствор подвергают стерилизующей фильтрации 0,22 µm и приводят хроматографическую очистку, соблюдая следующие условия:

Колонка с осевой динамической компрессией, диаметр 5 см, эффективная длина 49,5 см.

Стационарная фаза YMC ODS Sillica С 18, 300Å, 15 µm.

Подвижная фаза для распределения: 35% по объему этилового спирта, 65% по объему воды апирогенной, фосфорная кислота 0,015 М, сульфат натрия 0,01 М, рН 3,5 поддерживают с помощью капель 5М раствора гидроксида натрия.

Подвижная фаза для полного исключения: 50% по объему этилового спирта, 50% по объему воды апирогенной.

Скорость потока: 30 мл/мин^-1.

Давление: 12 бар при распределении и 13 бар при полном исключении органических примесей.

Температура: 20°С.

Образец с содержанием 1,629 г чистого инсулина, растворенного в 20 мл раствора, вводят в колонку и запускают изократическое элюирование. Основная фракция, содержащая чистый инсулин, элюирует в течение 125-150 мин. Объем фракции, содержащей чистый инсулин, составляет 748 мл. Исключение органических примесей 50% этиловым спиртом начинают на 210 минуте и заканчивают в течение часа (60 мин).

Затем рН элюата доводят до 4,6 и полученный раствор охлаждают до температуры 14°С. Кристаллизация происходит в течение 2 мин и завершается через 12 часов. Кристаллический инсулин в виде сульфатной соли оседает в течение 2 часов после остановки мешалки. Супернатант отделяют с помощью насоса и полученный осадок кристаллического инсулина высушивают с этиловым спиртом. Вес влажного инсулина составляет 1,96 г. Кристаллический очищенный инсулин в виде сульфатной соли кристаллизуют известным путем из раствора лимонной кислоты в присутствии ионов Zn²⁺ при рН 5,8. Выход составляет 1,620 г свиного инсулина с содержанием 1,523 г активного средства. Потери в течение всего процесса составляют 6,5% [Ед/Ед]. Качество полученного вещества соответствует требованиям фармакопеи Евросоюза (Ph. Eur., Pharmacopoeia Europeana).

Пример 3

Для проведения процесса берут 2,3 г кристаллов инсулина-сырца крупного рогатого скота, полученного традиционным экстракционным путем по схеме Романса и Фишера (цинк комплекс, содержающий 8,6% влаги и 88% чистого активного средства в пересчете на сухое вещество), растворяют в 10 мл 0,01М хлороводородной кислоты и поддерживают рН в пределах 2,6-2,9 с помощью добавления 1,5 М хлороводородной кислоты. Слегка опалесцирующий раствор центрифугируют при 3500 g в течение 20 мин. Объем супернатанта доводят до 20 мл с помощью 0,01 хлороводородной кислоты. Полученный прозрачный раствор подвергают стерилизующей фильтрации 0,22 µm и проводят хроматографическую очистку при следующих условиях:

Колонка с осевой динамической компрессией, диаметр 5 см, эффективная длина 49,5 см.

Стационарная фаза YMC ODS Sillica C18, 300Å, 15 µm.

Подвижная фаза для распределения: 31% по объему этилового спирта, 69% по объему воды апирогенной, фосфорная кислота 0,015 М, сульфат натрия 0,01 М, рН 3,5 с помощью капель 5М раствора гидроксида натрия.

Подвижная фаза для полного исключения: 50% по объему этилового спирта, 50% по объему воды апирогенной.

Скорость потока: 30 мл/мин^-1.

Давление: 11 бар при распределении и 13 бар при полном исключении органических примесей.

Температура: 20°С.

Образец с содержанием 1,850 г чистого инсулина, растворенного в 20 мл раствора, вводят в колонку и запускают изократическое элюирование. Основня фракция, содержащая чистый инсулин, элюирует в течение 130-155 мин. Объем фракции, содержащей чистый инсулин, составляет 751 мл. Исключение органических примесей 50%-ным этиловым спиртом начинают на 210 минуте и ведут в течение одного часа (60 мин). Затем рН элюата доводят до значения 4,7 и раствор охлаждают до температуры 15°С. Кристаллизация происходит в течение еще 1 минуты и завершается через 12 часов. Кристаллический инсулин в виде сульфатной соли оседает в течение 2 часов после остановки мешалки. Супернатант отделяют с помощью насоса, а затем осадок кристаллического инсулина высушивают с этиловым спиртом. Вес влажного инсулина составляет 2,256 г. Кристаллический очищенный инсулин в виде сульфатной соли кристаллизируют хорошо известным путем из раствора лимонной кислоты в присутствии ионов Zn²⁺ при рН 5,7-5,8. Выход составляет 1,747 г говяжьего инсулина с содержанием 1,628 г активного вещества. Потери в течение всего процесса составляют 12% [Ед/Ед]. Качество соответствует требованиям фармакопеи Евросоюза (Ph. Eur., Pharmacopoeia Europeana).

Заявляемое изобретение позволяет:

- в отличие от известных способов, основанных на использовании многоступенчатого процесса очистки (включающей иногда до семи стадий), получить высокоочищенный кристаллический инсулин различного происхождения в одностадийном процессе высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с высокой степенью очистки и выходом вещества, составляющим 97-99%;

- значительно сократить расход подвижной фазы (примерно в 10 раз) по сравнению с аналогами;

- использовать экологически чистые компоненты подвижной фазы в отличие от опасных, применяемых в известных технических решениях.

Теоретически возможные остатки этилового спирта в конечном продукте безопасны для пациента по сравнению с другими известными способами очистки;

- упростить и сократить технологический процесс промышленного получения инсулина различного происхождения, благодаря чему кристаллический инсулин выделяют непосредственно из элюата, т.е. по окончании прохода через хроматографическую колонну;

- процесс позволяет высокоэффективно очищать инсулин различного происхождения.

1. Способ получения высокоочищенного кристаллического инсулина любого происхождения, включающий проведение, по меньшей мере, одной колоночной обращенно-фазовой жидкостной хроматографической очистки инсулина-сырца в водно-органических элюатах с ионными модификаторами на неполярных сорбентах, причем одну из очисток проводят при рН 1,5-4,0, отличающийся тем, что перед колоночной очисткой дополнительно проводят предварительную очистку путем перекристаллизации инсулина-сырца, после которой осуществляют фильтрацию растворенного кристаллизованного инсулина-сырца в апирогенной воде, подкисленной 1,5 М хлороводородной кислотой до рН 1,5-4,0, сначала через органический, а затем стерильный фильтры, после чего доводят объем отфильтрованного раствора с помощью хлороводородной кислоты до заданного и направляют очищенный раствор на колоночную очистку, проводимую со скоростью потока 1-3 см/мин^-1, при этом в качестве подвижной фазы для разделения используют смесь, содержащую ортофосфорную кислоту (85%) 0,045 М, сульфат натрия 0,010 М и находящиеся в соотношении 60-70%:40-30% (по объему) апирогенную воду и этанол, а в качестве подвижной фазы для промывки используют смесь апирогенной воды и этанола, взятых в соотношении 40-60%:60-40% (по объему) соответственно, затем полученный после хроматографической очистки элюат помещают в стерильный, охлажденный кристаллизатор, поддерживая рН на уровне 3,3-4,9, и тщательно перемешивая охлаждают до температуры 2-15°С, при этом полученный кристаллический инсулин высушивают с этиловым спиртом.

2. Способ получения высокоочищенного кристаллического инсулина любого происхождения по п.1, отличающийся тем, что в качестве органического фильтра используют целлюлозный фильтр.

3. Способ получения высокоочищенного кристаллического инсулина любого происхождения по п.1, отличающийся тем, что в качестве стерильного фильтра используют фильтр MilliporeSterivex - HV.

4. Способ получения высокоочищенного кристаллического инсулина любого происхождения по п.1, отличающийся тем, что используют стерильный фильтр с размером пор 0,22 мкм.