Способ получения иммортализованной клетки человека, стабильно трансфицированная иммортализованная клетка человека, способ рекомбинантной продукции целевого белка человека, применение вектора трансфекции

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу получения иммортализованной клетки человека, стабильно трансфицированной последовательностью нуклеиновой кислоты, стабильно трансфицированной иммортализованной клетке человека, полученной данным способом, способу рекомбинантной продукции целевого белка человека и применению вектора трансфекции. Способ получения иммортализованной клетки человека включает трансфекцию иммортализованной клетки-хозяина человека в бессывороточных условиях вектором трансфекции, содержащим ген, кодирующий целевой белок человека, промотор и сигнал полиаденилирования (полиА) гормона роста быка, где указанный промотор и сигнал полиА связаны с 5'- и 3'-концом гена, кодирующего целевой белок человека соответственно и начало репликации. Указанный вектор трансфекции дополнительно несет, по меньшей мере, один ген маркера селекции. Отбирают стабильно трансфицированные клетки. Предложенное изобретение позволяет получить стабильно трансфицированные иммортализованные клетки человека для получения рекомбинантных белков человека. 4 н. и 12 з.п. ф-лы, 16 ил., 2 табл., 5 пр.

 

Данное изобретение относится к улучшенному способу получения в бессывороточных условиях иммортализованной клеточной линии человека, стабильно трансфицированной в бессывороточных условиях специфическим вектором, несущим ген, кодирующий белок, который представляет интерес. Кроме того, данное изобретение относится к продуцирующей клеточной линии, полученной указанным способом, способу получения указанного белка, представляющего интерес, с использованием указанной продуцирующей клеточной линии, и самому специфическому вектору, несущему ген, представляющий интерес.

Уровень техники

Рекомбинантное получение белков человека в целом выполняется путем культивирования стабильно трансфицированных линий эукариотических клеток, предпочтительно млекопитающих, и выделения белка из культурального бульона. В тех случаях когда рекомбинантные белки предназначены для фармацевтических применений, в течение длительного времени существовала практика применения клеточных линий, не принадлежащих человеку, с целью исключения риска сохранения при совместной очистке инфекционных агентов, которые могут накапливаться и экспрессироваться клетками человека. В продукции некоторых белков человека, таких как фактор VIII свертывания крови, обнаружено, что использование клеточных линий, не принадлежащих человеку, приводит к определенным недостаткам, например неудовлетворительным уровням секреции экспрессированного белка в среду. Полагают, что это может происходить вследствие незначительности отличий разных типов клеток млекопитающих, касающихся внутриклеточных путей трансляции белка и их модификации, которые также обладают эффектом на биологическую активность экспрессируемого полипептида. Кроме того, существенно, что терапевтические белки, очищенные из систем экспрессии, не принадлежащих человеку, загружены клеточными компонентами, которые могут приводить к усилению аллергических реакций у пациентов. Также затруднение состоит в том, что в белках человека, рекомбинантно продуцированных в системах экспрессии, не принадлежащих человеку, обнаружен паттерн гликозилирования, не характерный для человека. Полагают, что это повышает вероятность антигенных реакций у пациента. Кроме того, биологическая стабильность и эффективность белков крови, таких как факторы свертывания крови, существенно зависят от паттерна их N-гликозилирования. Особенно важны периферические и концевые моносахариды, поскольку они детектируются специфическими рецепторами клеток, которые ответственны за их деградацию. Факторы свертывания крови, например, в качестве концевых моносахаридов несут остатки сиаловой кислоты. Модификация композиции сиаловых кислот в антеннах гликопротеинов может привести к гетерогенным паттернам гликозилирования. Таким образом, возникновение модификации серьезнейшим образом сказывается на биологической стабильности и эффективности. Следовательно, важным моментом в получении рекомбинантных факторов свертывания крови является оценка влияния гликозилирования продуцирующих клеточных линий, не принадлежащих человеку, по сравнению с клеточными линиями человека. С другой стороны, стали доступными общие способы экспрессии высокого уровня белка желаемого гена, включающие иммортализованные стабильно трансфицированные клеточные линии, экспрессирующие вирусные белки, активирующие транскрипцию (например, патент США 5712119). Эти клеточные линии могут быть трансформированы векторной конструкцией, в которой подходящий вирусный промотор транскрипции функционально связан с последовательностью ДНК, кодирующей ген, представляющий интерес; белки из клеточных линий, активирующие транскрипцию, активируют вирусный промотор транскрипции и, следовательно, инициируют экспрессию гена, представляющего интерес.

Таким же важным, как клеточная линия, является вектор, используемый для введения рекомбинантного гена в иммобилизованную продуцирующую клеточную линию. Для трансляции белков млекопитающих применяется широкое разнообразие векторов (например, Witsch-Baumgartner, M. et al. Am. J. Genet (2000). 66, 402-412 клонированная кДНК DHCR7 в экспрессионном векторе pCI-neo млекопитающих и экспрессированная в клетках HEK 293; McGarvey, T. W. et al. Oncogene (2001) 20, 1041-1051 клонированный ген TERE1 в экспрессионном векторе pTARGET млекопитающих и экспрессированный в переходно-клеточных карциномах мочевого пузыря человека; и Lin Lin et al. J Biol Chem (2002) 277 (44) 41872-8 клонированный ген AchR в векторе экспрессии клеток млекопитающих pEF6/myc-His и экспрессированный в клетках 293). Недавно разработанный очень мощный вектор, который, как доказано, способен вызвать сверхэкспрессию рекомбинантных белков, - это так называемый вектор пкДНК™3.1 фирмы Invitrogen. Li J. et al., Life Sci. 2004 Apr 16; 74(22):2693-705 успешно сверхэкспрессировали деацетилазы гистонов с помощью пкДНК3.1 в клетках HEK 293. Клетки стабильно трансфицировали и культивировали в присутствии сыворотки. Yuan-Gen Fu. et al., World J Gastroenterol 2003 продуцировали рекомбинантную каспазу Caspase-3 с помощью основанного на пкДНК3.1(+) эукариотического вектора в клеточной линии рака желудка SGC7901, временно трансфицированной указанным вектором, и культивировали в присутствии сыворотки. Ma H. et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 2000 Dec; 41(13):4232-9 исследовали отсутствие стабильных белков и отсутствие ферментативной активности, проявляемой белками Lp82 и белками, связанными с Lp82, субклонированными в векторе пкДНК3.1 с применением COS-7 в качестве клеточной линии. Клетки были временно трансфицированы и культивировались в присутствии сыворотки в среде. Сверхэкспрессия тиоредоксина предотвращает NO-индуцированное уменьшение активности NO-синтазы в эндотелиальных клетках легких. Zhang J. et al., Am J Physiol. 1998 Aug; 275(2 Pt 1): L288-93 описали сверхэкспрессию гена тиоредоксина в культивируемых эндотелиальных клетках легочной артерии свиньи путем временной трансфекции этих клеток вектором пкДНК3.1. Трансфицированные клетки культивировали в среде с добавлением сыворотки. Shinki T. et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 1997 Nov 25; 94(24):12920-5 сравнили кДНК полного размера митохондриальной цитохромоксидазы Р450 смешанной функции из почек крысы, 25-гидроксивитамин D3-1альфа-гидроксилазы с витамин D-дефицитной кДНК почек крысы, субклонировали ее в вектор экспрессии млекопитающих пкДНК3.1(+) и временно трансфицировали вектор в трансформированные клетки почек обезьяны COS-7. Трансфицированные клетки культивировали в среде с добавлением сыворотки. Zhang et al., Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2004, 36(10):707-712 описывают трансфекцию эмбриональных клеток почек 293 человека пкДНК, содержащей ген, кодирующий слитый белок гуманизированного одноцепочечного Fv-антитела 520C9 и интерлейкина-2 человека. После трех дней культивирования клеток в бессывороточной среде SFM II брали супернатант. Полученный слитый белок обладал связывающей специфичностью p185 (многообещающей мишенью для иммунотерапии рака груди) и сохранял важную иммуностимуляторную активность IL-2. Chen, J.Z. et al., Int J Biochem Cell Biol. 2004 Aug; 36(8):1554-61 сверхэкспрессировали белки Bim, которые являются существенными факторами апоптоза, с использованием клеток HEK 293, трансфицированных пкДНК-Bim альфа3.

Дальнейшей мерой по повышению безопасности рекомбинантных белков для фармацевтических применений является применение в процессе культивирования бессывороточной среды, поскольку применение сыворотки представляет собой риск с точки зрения безопасности как источник нежелательных загрязнений. Такое бессывороточное культивирование имеет недостаток, состоящий в том, что выход производственного процесса в целом значительно снижается. Другой проблемой безопасности является использование сыворотки при трансфекции клеток-хозяев как обычного способа на практике, поскольку применение сыворотки в процедуре трансфекции может вызвать включение нежелательного биологического материала в клетки, который позже загрязняет продукт, экспрессируемый клетками в ходе процесса продукции. Хотя некоторые доступные способы продукции рекомбинантных белков (включая таковые, указанные выше) позволяют бессывороточное культивирование, стабильная бессывороточная трансфекция клеток человека неизвестна. На 19^th ESACT Meeting, Хэрроугэйт (Harrogate), 5-8 июня 2005 года бессывороточную трансфекцию клеток CHO предложили Kuchenbecker et al. Таким образом, желательно разработать эффективный и безопасный способ получения рекомбинантных белков человека.

Сущность изобретения

Неожиданно было обнаружено, что незагрязненный белок человека (т.е. препарат белка, свободного от нежелательных белковых побочных продуктов) может быть получен с гена, представляющего интерес, с хорошим выходом на иммортализованных клеточных линиях человека, стабильно трансфицированных в бессывороточных условиях. Более детально данное изобретение представляет:

(1) способ получения иммортализованной клеточной линии человека, стабильно трансфицированной последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей ген, кодирующий целевой белок человека или его производное, или его мутант, промотор и сигнал полиаденилирования (полиА) гормона роста быка, где указанные промотор и сигнал полиА связаны с 5'- и 3'-концом гена, кодирующего указанный целевой белок человека соответственно, где способ включает трансфекцию иммортализованной линии человеческих клеток-хозяев в бессывороточных условиях трансфицирующим вектором, содержащим указанную последовательность нуклеиновой кислоты и начало репликации;

(2) изложенный выше способ по (1), в котором вектор трансфекции происходит из вектора пкДНК3.1, имеющего последовательность SEQ ID NO:4 или 5;

(3) изложенный выше способ по (1) или (2), в котором клеточная линия человека представляет собой клетки почек эмбриона человека, выбранные из клеток 293 (ATCC CRL-1573; DSM ACC 305), клеток Freestyle 293 (в дальнейшем - клетки 293F; Invitrogen R79007) и клетки 293T (ATCC CRL 11268; DSM ACC 2494);

(4) изложенный выше способ по (1)-(3), в котором белок человека представляет собой фактор свертывания крови IX (например, кодированный п.о. 939-2324 SEQ ID NO:l), альфа-1-антитрипсин (в дальнейшем «A1AT»; например, кодируемый п.о. 913-2259 SEQ ID NO:2), фактор свертывания крови VIII (включая фактор VIII дикого типа, как показано в SEQ ID NO:8, или мутантный фактор VIII с делецией B-домена, кодируемый п.о. 783-5162 SEQ ID NO:3), фактор VII/VIIa (включая формы a и b, которые кодируются SEQ ID No:13 и 14), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF, включая формы G-CSF a, b и c, показанные в SEQ ID No:15, 16 и 17 соответственно) или фактор фон Виллебранда (vWF);

(5) вектор трансфекции, содержащий начало репликации и ген, кодирующий белок человека, определенный в (1) и (2) выше, предпочтительно указанный вектор трансфекции является вектором пкДНК3.1, содержащим ген белка человека, определенный выше в (4);

(6) иммортализованную клеточную линию человека, которая может быть получена способом, определенным выше в (1)-(5), предпочтительно указанную клеточную линию человека, определенную выше в (3) или (4); и

(7) способ рекомбинантного получения целевого белка человека, или его производного, или его мутанта, который включает культивирование иммортализованной клеточной линии человека, определенной выше в (6), предпочтительно в бессывороточных условиях.

Описание чертежей

Фиг.1: Белок дикого типа фактора свертывания крови IX (FIX) человека. Схематическое изображение гена FIX с нетранслируемым 5' участком (5' UTR) и его 3' UTR участком. Показано восемь доменов непроцессированного белка из 461 аминокислот: S: сигнальный пептид; P: пропептид; домен G1a: домен -карбоксиглютамила; домен H: гидрофобная последовательность; домен EGF: домен, подобный домену эпидермального фактора роста; L: связующая последовательность; AP: активационный пептид; Каталитический домен. Полностью сформированный белок FIX имеет длину в 415 аминокислот и приблизительный молекулярный вес 55 кДа.

Фиг.2: Вектор пкДНК3.1-FIX. Вектор кольцевой ДНК содержит 6960 пар оснований (п.о.), точная последовательность которых дана в SEQ ID NO:1. На схематическом изображении показаны промотор CMV (CMV), ген FIX человека (hFIX), начало репликации fl (fl), ген гигромицина (Hyg) под контролем промотора SV40 (SV40), участок полиA (SV40 полиA), начало репликации pUC и ген резистентности к ампициллину (Amp), так же как и многочисленные сайты рестрикции. Этот вектор является производным от ресеквенированного вектора пкДНК3.1-пкДНК3.1Hygro(+)-zz с SEQ ID NO:5.

Фиг.3: Вектор пкДНК3.1-A1AT. Вектор кольцевой ДНК содержит 6914 п.о., его точная последовательность приведена в SEQ ID NO:2. На схематическом изображении показаны промотор энхансерной последовательности CMV, A1AT кДНК, сигнал полиаденилирования (полиА) гормона роста быка, включая последовательность терминирования транскрипции для усиления стабильности мРНК, начало репликации fl (fl), ген гигромицина (Hyg) под контролем промотора SV40 (SV40), участок полиА SV40 (SV40 полиA), начало репликации pUC и ген резистентности к ампициллину (Amp), так же как и многочисленные сайты рестрикции. Этот вектор получен от вектора пкДНК3.1Hygro(+)-zz с SEQ ID NO:5.

Фиг.4: Временная трансфекция различных эмбриональных клеток почек человека векторами, кодирующими альфа-1-антитрипсин. Показано сравнение клеточных линий при исследовании временной трансфекции. Количество (%) альфа-1-антитрипсина (A1AT), экспрессированное на 10⁶ клеток, показано для клеток 293, 293T и 293F. Количество A1AT, экспрессируемое в клетках 293F, временно трансфицированных пкДНК3.1-A1AT, было принято за 100%.

Фиг.5: Временная трансфекция клеточной линии 293F различными векторами, кодирующими альфа-1-антитрипсин. Показано сравнение концентраций A1AT, экспрессированных различными векторами с применением временно трансфицированной клеточной линии Freestyle 293F. Уровень экспрессии A1AT пкДНК3.1-A1AT был принят за 100%. Также были протестированы различные другие векторы, несущие ген A1AT: внутренний (in-house) вектор pTG1-A1AT (in-house вектор для продуцирования рекомбинантного A1AT человека, как показано на Фиг.10), pCMV Script® A1AT (Stratagene) и pcl neo-A1AT (Promega) сравнивали с пкДНК3.1-A1AT (пкДНК3.1). Ни один из других векторов не приближался к высокому уровню экспрессии, наблюдавшемуся с пкДНК3.1-A1AT.

Фиг.6: Полиакриламидный гель-электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) и вестерн-блот супернатанта культуры клеток. Аликвоты супернатанта клеток Freestyle 293F, временно трансфицированных пкДНК3.1-A1AT (дорожки 1-3 и 6-8) или с контрольной плазмидой, экспрессирующей зеленый флуоресцентный белок (GFP) (дорожки 4 и 8), анализировали с помощью SDS-PAGE и вестерн-блота. Дорожка 1 содержит маркер молекулярного веса, а дорожка 5 - пустая. Полоса A1AT обозначена стрелкой. Также видна полоса 27 кДа, соответствующая GFP на дорожках 4 и 8.

Фиг.7 показывает вектор пкДНК3.1-F.VIII. Вектор содержит 9975 п.о., чья точная последовательность показана в SEQ ID NO:3. Белок фактора VIII, кодируемый п.о. 783-5162, представляет собой мутант фактора VIII с делецией B-домена, как описано в WO 01/70968. Опять-таки этот вектор происходит от вектора пкДНК3.1Hygro(+)-zz с SEQ ID NO:5.

Фиг.8: Сравнение среднего количества продуцированного фактора VIII трех лучших стабильно трансфицированных клонов, клеток 293 и 293F, трансфицированных пкДНК3.1-FVIII и in-house-вектором pTGF8-2hyg-s, точная последовательность которого приведена в SEQ ID NO:7.

Фиг.9 показывает вектор pTG1-A1AT. Вектор содержит 5610 п.о., точная последовательность которых показана в SEQ ID NO:6.

Фиг.10 показывает вектор pCR2.1d2-GCSFb. Вектор содержит 4542 п.о., точная последовательность которых показана в SEQ ID NO:21.

Фиг.11 показывает вектор pДНК3.1-GCSFb. Вектор содержит 6237 п.о., точная последовательность которых показана в SEQ ID NO:22.

Фиг.12 показывает вектор pCINeo-GCSFb. Вектор содержит 6101 п.о., точная последовательность которых показана в SEQ ID NO:23.

Фиг.13 показывает вектор pCMVScript-GCSFb. Вектор содержит 4920 п.о., точная последовательность которых показана в SEQ ID NO:24.

Фиг.14 показывает вектор pTG2-GCSFb-hyg-as. Вектор содержит 6917 п.о., точная последовательность которых показана в SEQ ID NO:25.

Фиг.15 приводит сравнение количества rhG-CSF, продуцированного различными конструкциями экспрессии в соответствии с Примером 9.

Фиг.16 показывает вестерн-блот rhG-CSF, продуцированного в соответствии с Примером 9.

Подробное описание изобретения

Данное изобретение представляет улучшенный способ трансфекции и получения рекомбинантных белков человека в иммортализованных клеточных линиях человека полностью в бессывороточных и безбелковых условиях. Это позволяет бессывороточную трансфекцию и получение белков человека. Способ может включать одну или более стадию (стадий) очистки, включая процедуры инактивации вируса, что уменьшает риск заражения рекомбинантного белка патогенами человека. Поскольку рекомбинантные белки человека, продуцированные в клеточных линиях человека, обладают паттерном гликозилирования человека, они также менее подвержены деградации по сравнению с белками человека, у которых отсутствует их естественный паттерн гликозилирования. В целом способ по данному изобретению представляет различные преимущества по сравнению с ранее существовавшим уровнем в данной области техники.

В частности, способ по варианту воплощения (7) данного изобретения представляет эффективную систему получения безопасных и высокоактивных рекомбинантных факторов свертывания крови человека, например факторов IX и FVIII, для терапевтических применений при гемофилии B и A у человека. Способ пригоден для экспрессии белков дикого типа, но может также быть использован для мутантных форм таких белков, например фактора VIII, особенно стабильных в отношении протеолитической инактивации, и, таким образом, позволяет применять жесткие протоколы вирусной инактивации.

Предпочтительный вариант способа по варианту воплощения (7) данного изобретения включает бессывороточное культивирование иммортализованной клеточной линии, несущей вектор, имеющий промотор, связанный с 5'-концом последовательности ДНК, кодирующей указанный белок крови человека. 3'-конец последовательности ДНК, кодирующей указанный белок крови человека, функционально связан с полиА сигналом гормона роста быка. В соответствии с данным изобретением иммортализованная клеточная линия человека стабильно трансфицирована вектором. Чтобы выявить стабильную трансфекцию, вектор может также содержать, помимо гена белка крови человека, по меньшей мере, один ген для выбора маркерной системы, которая функционально связана с промотором.

Пригодные промоторы включают вирусные промоторы, промоторы гена "домашнего хозяйства" (housekeeping), тканеспецифические промоторы и т.д. В случае если промотор является вирусным промотором, клеточная линия не содержит соответствующего белка-активатора вирусной транскрипции для указанного промотора. Однако клетка может содержать белок-активатор вирусной транскрипции, такой как T-антиген, который является комплементом к другому вирусному промотору, который функционально не связан с геном, кодирующим белок крови человека. Предпочтительно промотор представляет собой промотор SV40, промотор CMV, промотор EF-1альфа, промотор HSV TK и т.д., наиболее предпочтительным промотором является промотор CMV, т.е. конститутивный основной промежуточный ранний промотор цитомегаловируса.

Выражения «трансфекция» или «трансфицированный» относятся к введению нуклеиновой кислоты в клетку в условиях, позволяющих экспрессию белка. В целом нуклеиновая кислота представляет собой последовательность ДНК, в частности вектор или плазмиду, несущие ген, представляющий интерес, под подходящим промотором, чья экспрессия контролируется указанным промотором. Однако термин «трансфекция» включает в себя также трансфекцию РНК. Специалисты в данной области техники знакомы с различными способами трансфекции, такими как использующие молекулы-носители, подобные катионным липидам, таким как DOTAP (Roche), DOSPER (Roche), Fugene (Roche), Transfectam® (Promega), TransFast™ (Promega) и Tfx™ (Promega), липофектамин (Invitrogene) и 293fectin™ (Invitrogene) или фосфат кальция и DEAE декстран. Они также знакомы с технологиями прямой трансфекции. Они включают в себя электропробой мембраны, бомбардировку частицами-носителями, покрытыми нуклеиновой кислотой (gene gun) и микроинъекцию. Наконец, специалисты в данной области техники также знакомы с трансфекцией нуклеиновой кислотой с использованием вирусных векторов. Выражения «временно трансфицированный» или «временная трансфекция» относятся к временной, т.е. непостоянной экспрессии гена, представляющего интерес, благодаря эписомной природе интродуцированной нуклеиновой кислоты. Именно благодаря своей природе трансфекция РНК или цитолитическим вирусом могут быть использованы только для временной экспрессии. Эписомные нуклеиновые кислоты, включая в себя ДНК (плазмиды или векторы), подвергаются деградации клетками в течение двух-четырех дней, и, следовательно, экспрессия представляющего интерес гена после этого прекращается.

Формулировки «стабильно трансфицированный» или «стабильная трансфекция» относятся к постоянной экспрессии представляющего интерес гена благодаря интеграции трансфицированной ДНК в геном клетки. Большинство, если не все, клеток обладают потенциалом для включения эписомной ДНК в свой геном, хотя и на очень низком уровне. Однако применяются сложные стратегии увеличения числа отобранных клеток, которые интегрировали трансфицированную ДНК. Для этого вектор должен содержать, по меньшей мере, один ген маркера селекции, такой как, например, гигромицин.

Термины «стабильная трансфекция» или «стабильно трансфицированный» в данном документе также используются для обозначения клеток, несущих плазмиды, которые могут реплицироваться автономно и таким образом использоваться для долговременной экспрессии чужеродных генов. Одна из систем переноса генов, особенно пригодных для «стабильной трансфекции» клеток, основана на рекомбинантных ретровирусах. Поскольку интеграция провирусной ДНК является обязательной стадией в ходе ретровирусного цикла репликации, инфицирование клеток рекомбинантным ретровирусом приводит к получению очень большой фракции клеток, которые интегрировали представляющий интерес ген и, таким образом, стабильно трансфицированы.

Термин «культивированный» обозначает поддержание клеток/клеточных линий in vitro в контейнерах со средой, поддерживающей их пролиферацию и экспрессию гена. Таким образом, культивирование приводит к аккумулированию экспрессированных секретируемых белков в культуральной среде. Среда обычно содержит добавки, стабилизирующие pH, так же как и аминокислоты, липиды, микроэлементы, витамины и другие компоненты, улучшающие рост. Формулировки «бессывороточное», «бессывороточная трансфекция» или «бессывороточное культивирование» обозначают трансфекцию и культивирование клеток в среде, содержащей подходящие добавки, за исключением какого-либо вида сыворотки. Добавки выбирают из аминокислот, липидов, микроэлементов, витаминов и других компонентов, усиливающих рост. Часто условия «бессывороточной» культуры даже более строги, и, если не добавлены экзогенные белки или они уже включены в среду, среда именуется «безбелковой». Термин «иммортализованная клеточная линия человека» обозначает клетки человека, которые не являются первичными клетками, взятыми непосредственно из организма. В частности, он обозначает постоянно существующую клеточную культуру, которая пролиферирует неопределенно долго при наличии соответствующей свежей среды и пространства и, таким образом, избегает предела Хейфлика.

Термин «концентрирование» обозначает концентрирование продуцированного рекомбинантного белка из культуральной среды. По сути это также приводит к концентрированию белка. Специалисты в данной области техники знакомы с технологиями концентрирования, такими как фильтрация, включая ультрафильтрацию, центрифугирование, преципитацию и т.д. Концентрирование необязательно приводит к получению чистого белка, и выделенный белок еще может содержать небелковые и белковые загрязнения. Часто требуются дополнительные стадии очистки.

Термин «очистка» относится к стадиям, применяемым к выделенному белку, с целью получения существенно очищенного (по меньшей мере, 60% чистоты, предпочтительно, по меньшей мере, 75% чистоты, более предпочтительно более 90% чистоты, а наиболее предпочтительно более 99,9% чистоты) рекомбинантного белка человека. Чистота может быть измерена подходящим способом. Специалисты в данной области техники знакомы с технологиями, применимыми для очистки рекомбинантного белка, такими как иммуноаффинная хроматография, аффинная хроматография, преципитация белка, буферный обмен, ионообменная хроматография, гидрофобная хроматография, эксклюзионная гель-хроматография, электрофорез. Кроме того, очистка может включать стадию вирусной инактивации, такую как теплообработка и/или обработка детергентом-растворителем (SD) в твердом или жидком состоянии, в присутствие или в отсутствие химических веществ, включая в себя ингибиторы протеаз. Далее очистка может включать в себя одну или более стадий устранения прионов, такую как преципитация белка, фильтрация, стадии хроматографии, в частности стадии аффинной хроматографии (см., например, "Partitioning of TSE infectivity during ethanol fractionation of human plasma", Gregori, L. et al., Biologicals 32 1-10; 2 (2004); и "Removal of TSE agents from blood products", Foster, P.R., Vax Sanguinis 87 (Suppl. 2), S7-S10 (2004)). После вирусной инактивации может потребоваться любая дополнительная, выбранная из перечисленных выше, стадия очистки для удаления химических веществ, используемых для вирусной инактивации.

Термин «вектор» означает какую-либо генетическую конструкцию, такую как плазмида, фаг, космида и т.д., которая способна к репликации при ассоциации с соответствующими контролирующими элементами, в которую фрагменты ДНК могут быть встроены или клонированы. Вектор содержит уникальные сайты рестрикции и может быть способен к автономной репликации в клетке-хозяине. Термин включает носители при клонировании и экспрессии. «Вектор» может также нести один или более дополнительных регуляторных элементов, указанные регуляторные элементы предпочтительно выбирают из сайтов сплайсинга, сайтов рекомбинации, сайтов полиА, энхансеров, сайта мультиклонирования и последовательности прокариотических плазмид.

Термин «функционально связанный» означает конфигурацию вектора, в которой промотор располагается в векторе таким образом, что это может стимулировать транскрипцию последовательности ДНК, кодирующей белок, представляющий интерес, в частности белок крови человека.

Термин «зрелый» означает молекулярную структуру данного белка, уже прошедшего процессинг, т.е. белка, у которого отсутствует сигнал секреции на N-конце.

Термин «промотор» означает участок регуляторной последовательности ДНК, связываемый РНК-полимеразой и факторами транскрипции в период инициации транскрипции.

Термин «энхансер» означает цис-действующую последовательность, которая усиливает действие эукариотического промотора и может функционировать в любой ориентации или в любом положении (позади или впереди) по отношению к промотору.

Термин «сигнал полиаденилирования (полиА)» означает специализированную терминирующую последовательность. Она сигнализирует о присоединении «хвоста» аденинов к концу мРНК, что делает возможным экспорт мРНК в цитоплазму. При достижении цитоплазмы хвост полиА мРНК сохраняется в ходе трансляции белка и стабилизирует мРНК в ходе экспрессии белка.

Термин «кодирует» или «кодирующий» означает свойство последовательности нуклеиновой кислоты проходить транскрипцию (в случае ДНК) или трансляцию (в случае мРНК) в полипептид (белок) in vitro или in vivo при помещении под контроль соответствующей регуляторной последовательности.

Для цели данного применения термин «экспрессировать», «экспрессирующий» или «экспрессия» означает транскрипцию и трансляцию гена, кодирующего белок.

«Белки человека» по данному изобретению включают в себя, но не ограничиваются ими, белки человека, полипептиды, их мутации и модификации. В частности, белки человека включают в себя рекомбинантные белки плазмы, например факторы свертывания крови (такие, как фактор VIII, фактор VII/VIIa, фактор V, фактор IX, фактор XI, фактор фон Виллебранда и т.д.), факторы роста (такие, как эритропоэтин и т.д.), колониестимулирующие факторы (CSF) (такие, как гранулоцитстимулирующий фактор (G-CSF), макрофаг CSF (M-CSF), гранулоцит-макрофаг CSF (GM-CSF)), цитокины (такие, как интерлейкины, включая интерлейкин-3 и т.д.), ингибиторы протеаз (такие, как альфа-1-антитрипсин (A1AT), химотрипсин и т.д.), транспортные белки (такие, как гормоны и т.д.), белки, действующие как ингибиторы и регуляторы, и им подобные. Кроме того, термин включает в себя мутации и модификации этих белков или полипептидов, особенно мутации или модификации, обеспечивающие лучшую стабильность рекомбинантного белка, увеличение времени полужизни или лучшее восстановление, и включают в себя мутантов с делециями, замещениями или вставками, а также химические мутации функциональных групп соответственно. Особенно предпочтительны белки, которые могут быть продуцированы способом по изобретению по данной заявке, каковыми являются фактор VIII человека (включая в себя фактор с делецией В-домена или дикого типа), фактор IX человека, G-CSF человека, A1AT человека, фактор VII/VIIa человека и фактор фон Виллебранда.

Рекомбинантная продукция фактора VIII и IX известна в данной области техники (EP-A-160457; WO-A-86/01961, Патенты США 4770999, 5521070 и 5521070). В случае фактора VIII рекомбинантная экспрессия субъединиц для продукции комплексов, демонстрирующих свертывающую активность, известна в данной области техники (например, в EP-A-150735, EP-A-232112, EP-A-0500734, WO-91/07490, WO-95/13300, патенты США 5045455 и 5789203). Более того, описана экспрессия усеченных версий кДНК, частично или полностью лишенных последовательности, кодирующей сильно гликозилированный B-домен (например, в WO-86/06101, WO-87/04187, WO-87/07144, WO-88/00381, EP-A-251843, EP-A-253455, EP-A-254076, патентах США 4868112 и 4980456, EP-A-294910, EP-A-265778, EP-A-303540 и WO-91/09122). Конкретный мутантный фактор VIII, в котором B-домен между положениями Arg(аргинин)740 и Glu(глютамин)1649 замещен богатым аргинином пептидом-линкером, имеющим, по меньшей мере, 3 остатка Arg и содержащим 10-25 аминокислотных остатков (в котором кодирование указанного фактора VIII близко к последовательности зрелого фактора VIII дикого типа, показано в SEQ ID NO:9), описан в WO 01/70968, которая включена в данное изобретение во всей ее полноте. В частности, богатый аргинином (Arg) пептид-линкер имеет 14-20 аминокислотных остатков, притом что линкер, содержащий:

аминокислотную последовательность SFSQNSRH (SEQ ID NO:10), и/или

аминокислотную последовательность QAYRYRRG (SEQ ID NO:11), и/или

аминокислотную последовательность SFSQNSRHQAYRYRRG (SEQ ID NO:12), особенно предпочтителен. Такой белок, появляющийся в результате мутации B-домена фактора VIII, кодируется нуклеотидами (nt) 783-5162 SEQ ID NO:3.

G-CSF является линия-специфической небольшой молекулой в крови человека, которая стимулирует продукцию костным мозгом определенного типа белых кровяных клеток, известных как нейтрофилы. Нейтрофилы играют центральную роль в иммунной системе организма и защите от инфекции. G-CSF (особенно последовательности кДНК их a, b и c-форм даны в SEQ ID NO:15, 16 и 17 соответственно; белок b-формы G-CSF (в дальнейшем - белок «G-CSFb») показан в SEQ ID NO:27) в естественных условиях продуцируется моноцитами, фибробластами и эндотелиальными клетками. В норме концентрация в крови составляет около 40 пг/мл у здоровых людей. В плазме пациентов уровень G-CSF может снижаться более чем в десять раз. G-CSF также продуцируется в таких раковых клеточных линиях, как клетки 5637, которые секретируют около 70 нг/мл. Для терапии рекомбинантный G-CSF человека продуцируется в E.coli как N-конец метилированная негликозилированная форма Amgen Inc. (Filgrastim/Neupogen®), который также доступен как полиэтиленгликолированный (PEGylated) продукт (Pegfilgrastim/Neulasta®). Другое лекарство продуцируют в клетках CHO на фирме Chugai Pharmaceuticals Co, что дает гликозилированный продукт (Lenograstim/Granocyte®). G-CSF используется в качестве лекарства при лечении нейтропении - наследственной или вызванной химиотерапией (рака), ВИЧ или трансплантацией костного мозга. В этих случаях обычная доза составляет 5 мкг/кг в день.

Конкретная последовательность кДНК A1AT, пригодная по изобретению в соответствии с данной заявкой, дана в п.о. 973-2259 SEQ ID NO:2. Конкретно, последовательности кДНК фактора VII/VIIa даны в SEQ ID NО:13 и 14, соответствующих их формам a и b. Конкретная кДНК фактора фон Виллебранда (vWF) дана в SEQ ID NO:18.

Система селекционных маркеров включает в себя резистентность к гигромицину, устойчивость к пуромицину, резистентность к неомицину, резистентность к аденозиндеаминазе (ADA), резистентность к аминогликозидфосфотрансферазе (neo, G418, APH), резистентность к блеомицину (флео, блео, зеоцин), резистентность к цитозиндеаминазе (CDA, CD), резистентность к цитозиндеаминазе (CDA, CD), резистентность к дигидрофолатредуктазе (DHFR), устойчивость к гистидинолдегидрогеназе (hisD), резистентность к гигромицин-B-фосфотрансферазе (HPH), резистентность к пуромицин-N-ацетилтрансферазе (PAC, puro), резистентность к тимидинкиназе (TK) и резистентность к ксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазе (XGPRT, gpt). Особенно предпочтителен ген резистентности к гигромицину. Также ген селекционного маркера может быть функционально связан с полиА сигналом, таким как производный от гормона роста быка (BGH) или сигнал полиаденилирования SV40.

Трансфицированные клетки постоянно подвергаются в культуральной среде воздействию белка системы селекционного маркера, такого как гигромицин, в ходе фазы селекции, что приводит к выживанию только тех клеток, которые несут вектор. Специалистам в данной области техники известны альтернативные селекционные маркеры, пригодные для формирования стабильно трансфицированных клеток, так же как концентрации избранных селективных агентов, которые необходимо применить.

Особенно предпочтительный вектор по данному изобретению несет промотор CMV, ген гигромицина, последовательность полиA и ген, представляющий интерес, а также предпочтительно вектор пкДНК3.1 (Invitrogen), имеющий последовательность SEQ ID NO:4, в которой ресеквенирование указанного вектора, как было обнаружено фактически, имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO:5.

Иммортализованные клеточные линии, пригодные для способа по данному изобретению, выбраны из группы клеток почек, мочевого пузыря, печени, легких, сердечной мышцы, гладких мышц, яичников или желудочно-кишечного тракта. Эти клетки могут нести в геноме аденовирусные последовательности ДНК, в частности первые 4344 нуклеотида последовательностей Ad5. Предпочтительными являются фетальные клетки почек человека (HEK), выбранные из группы, включающей в себя клетки 293 (ATCC CRL-1573; DSM ACC 305; ECACC ref.: 85120602), клетки 293T (DSM ACC 2494; ECACC: tsa201, ref. 96121229) и клетки Freestyle 293 (клетки 293F; Invitrogen R79007). Наиболее предпочтительными являются клетки 293F. Эти иммортализованные клеточные линии, несущие вектор, культивировали в условиях, позволяющих экспрессию рекомбинантного гена. В целом это - стандартные условия культивирования, известные специалистам в данной области техники, однако в случае клеток, несущих ген фактора IX человека, в среду необходимо включить витамин K.

Конкретный вариант воплощения данного изобретения состоит в бессывороточной продукции рекомбинантного белка в бессывороточной культуре стабильно иммортализованных клеток, которые также трансфицированы в бессывороточных условиях. Для этого какую-либо из описанных выше иммортализованных клеточных линий человека, предпочтительно клеточную линию 293F, трансфицируют и культивируют в бессывороточных условиях. Клетки стабильно трансфицируются в суспензионной культуре в отсутствие сыворотки, а затем адаптируются к росту адгезивных клеток для отбора отдельных клеточных клонов. По получении индивидуальных клонов их выращивают в адгезионном состоянии. После отбора лучших продуцентных клонов клетки переносят в суспензионную культуру. В течение всей процедуры получения стабильной клеточной линии и дальнейшего выращивания для продукции белка клетки выращивают в бессывороточной среде, и они никогда не вступают в соприкосновение с сывороткой или человеческими или животными белками. Рекомбинантный белок крови, такой как любой из факторов свертывания крови или ингибитор протеаз, такой как A1AT, или факторов роста (такого, как G-CSF и GM-CSF), выделяют из культурального бульона, за чем следуют стандартные стадии очистки. Более детально конкретный вариант воплощения бессывороточной продукции рекомбинантного белка крови человека, в частности фактора VIII или фактора IX человека, или A1AT, или G-CSFb, включает в себя следующие стадии:

(1) трансфекция иммортализованных клеток человека, предпочтительно клеток 293F, в суспензионной культуре без сыворотки. Клетки культивировали в одноразовых стерильных поликарбонатных конических колбах Эрленмейера. Клетки трансфицировали при плотности, например, 1×10⁶ жизнеспособных клеток на мл с трансфицирующим агентом, предпочтительно катионным трансфицирующим агентом, более предпочтительно липофектамин 2000 CD реагентом (Invitrogen) или реагентом для трансфекции кальций-фосфатным способом; трансфицируемый вектор кодирует белок крови человека, предпочтительно вектор представляет собой пкДНК3.1-FIX, пкДНК3.1-FVIII, пкДНК3.1-A1AT или пкДНК3.1-GCSFb;

(2) через 24-120 ч, предпочтительно 36-96, более предпочтительно 48 ч после трансфекции подходящее число клеток (10³-10¹⁰; предпочтительно 10⁵-10⁸, наиболее предпочтительно 10⁶ клеток) переносили в плоскодонную культуральную чашку для осаждения и установления роста в адгезионных условиях. Предпочтительно культуральная чашка представляет собой 10-см чашку, а клетки культивируются в бессывороточной и безбелковой средах, предпочтительно Freestyle 293 Expression medium (12338-018, Invitrogen) или в бессывороточной in-house среде (Octapharma Stockholm);

(3) селекционное давление начинается на 2-50 ч, предпочтительно 48 ч после переноса в плоскодонную культуральную чашку. В среду добавляли подходящий селекционный агент, выбранный из группы, включающей в себя селекционные маркеры, например гигромицин, неомицин, G418 и зеоцин. Предпочтительным селекционным агентом является гигромицин в концентрации 10-300 мкг/мл, предпочтительно 50-200 мкг/мл, наиболее предпочтительно 50 мкг/мл. Селекционное давление поддерживали, по меньшей мере, в течение 10-20 дней, предпочтительно в течение 14 дней, соответственно, среду с добавлением гигромицина заменяли через день. В таких условиях селекции выживали только стабильно трансфицированные клетки и формировали адгезионные клеточные клоны, которые можно было собирать индивидуально. Дополнительно может быть использован адгезионный фактор, чтобы прикрепить клетки к поверхности чашки и предотвратить перемещение клеток из одного клеточного клона в другой. Этими адгезионными факторами могут быть f.e. поли-D-лизин, синтетические добавки к среде без белков человека или животных или другие вещества. В качестве альтернативы для сбора клонов могут быть использованы клонзапирающие кольца;

(4) индивидуальные клеточные клоны собирают и переносят в отдельные культуральные контейнеры для бессывороточного роста клеток (пропорционального роста), причем селекционное давление устраняется. Пригодны любые культуральные контейнеры, однако предпочтительно, чтобы сначала индивидуальные клоны были перенесены в 96-луночные планшеты с достаточным количеством среды, а затем в 48-, 24-, 12- и 6-луночные планшеты, а затем центрифужные пробирки. На стадии центрифужных пробирок клетки культивировали в бессывороточной среде при мягком встряхивании, чтобы перевести клетки в суспензионный рост. Когда клетки переносятся в 6-луночные планшеты или центрифужные пробирки, необязательно, отбираются лучшие клоны в соответствии с некоторыми критериями селекции, т.е. скоростью роста клеток, более быстро растущие клетки предпочтительны, и количеством рекомбинантного белка, который они продуцируют. Однако указанный отбор может также проводиться и на какой-либо более поздней стадии;

(5) клетки, полученные из культуры в центрифужных пробирках, помещали в культуральные сосуды Эрленмейера с достаточным количеством бессывороточной среды. Дополнительными селекционными критериями для пропорционально растущих в суспензии в бессывороточной и безбелковой среде клеточных клонов являются следующие: жизнеспособность, клеточная морфология, отсутствие агрегации, переносимость к центрифугированию и отсутствие остатков погибших клеток.

Способ по данному изобретению действует особенно эффективно, если вектор представляет собой пкДНК3.1-hygro(+)-zz. Предпочтительно, чтобы ген, кодирующий белок человека, в частности FIX, FVIII, A1AT или G-CSFb человека, был встроен таким образом, чтобы он был под контролем промотора CMV, как показано на Фиг.2, 3, 7 и 11 соответственно. Предпочтительно, встраивают последовательности дикого типа указанных генов, так чтобы рекомбинантно экспрессируемый белок не имел мутаций и был структурно идентичен белку дикого типа, выделенному из плазмы крови. Схематическое изображение фактора IX дикого типа человека показано на Фиг.1. SEQ ID NO:1, 2, 3 и 22 представляют последовательности нуклеиновых кислот для пкДНК3.1-FIX, пкДНК3.1-A1AT, пкДНК3.1-FVIII и пкДНК3.1-GCSFb соответственно. Соответствующие белки кодируются нуклеотидами 939-2224, 913-2259, 679-5055 и 970-1584 соответственно.

Данное изобретение, таким образом, представляет способ продукции рекомбинантного фактора IX, A1AT, фактора VIII и G-CSFb человека, клонированных в пкДНК3.1™, дающих пкДНК3.1-FIX, пкДНК3.1-A1AT, пкДНК3.1-FVIII и пкДНК3.1-GCSFb соответственно, которые интегрируются в геном иммортализованных клеток человека, предпочтительно эмбриональных клеток почек человека, таких как клетки 293 (ATCC CRL-1573; DSM ACC 305; ECACC ref.: 85120602), клетки Freestyle 293 (клетки 293F; Invitrogen R79007) или клетки 293T (DSM ACC 2494; ECACC: tsa201, ref. 96121229).

Такие клетки, несущие либо пкДНК3.1-FIX, либо пкДНК3.1-A1AT, либо пкДНК3.1-FVIII, либо пкДНК3.1-GCSFb, культивируют в среде при стандартных условиях, делающих возможным экспрессию гена, или, с другой стороны, они культивируются в бессывороточных условиях с целью минимизировать риск загрязнения патогенами человека. Может быть включена одна или более стадий устранения прионов, такая как преципитация белка, фильтрация, стадии хроматографии, в частности стадии аффинной хроматографии. В качестве альтернативы/дополнительно может быть использована нокаутная по прионам клеточная линия в качестве экспрессирующей. Это может быть достигнуто путем полного геномного нокаута или с помощью антисмысловой технологии. В случае продукции фактора IX человека клетки предпочтительно культивируют в присутствии витамина K. Белок крови человека выделяют из супернатанта культуры и подвергают последующим стадиям очистки, известным в данной области техники, чтобы добиться максимального выхода чистого, стабильного и высокоактивного продукта, который выбирают с помощью иммуноаффинной хроматографии, анионно-обменной хроматографии, эксклюзионной гель-хроматографии и т.д. и их комбинаций. Они могут быть легко адаптированы к специфическим требованиям, необходимым при выделении рекомбинантных фактора IX, G-CSFb или A1AT. Количество и активность очищенного белка в ходе и после очистки может контролироваться с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) и/или одностадийного теста активированного частичного тромбопластинового времени (aPTT).

Чтобы преодолеть проблемы возможных инфекционных загрязнений образцов очищенного белка или продукта, непосредственно полученного из супернатанта клеточной культуры, содержащего интересующий секретированный рекомбинантный белок, супернатант культуры должен быть обработан в соответствии с процедурами вирусной инактивации, включая тепловую обработку и/или обработку SD (в сухом или жидком состоянии, с добавлением химических веществ, включая в себя ингибиторы протеаз, или без такового). Специалистам в данной области техники известны процедуры очистки. Например, выделение и очистка, а также выход высокоочищенного вирус-инактивированного фактора VIII из плазмы крови с помощью анионно-обменной хроматографии описаны (в WO 93/15105). Кроме того, сообщено еще о нескольких процессах продукции высокоочищенных неинфицированных факторов свертывания из плазмы крови или других биологических источников. Вирусы, обладающие липидной оболочкой, эффективно инактивируются путем обработки потенциально инфицированного материала гидрофобной фазой, образующей двухфазную систему, из которой затем удаляют водонерастворимую часть. Доказано, что дополнительное преимущество дает совмещение обработки гидрофобной фазой одновременно или последовательно с обработкой неионными биосовместимыми детергентами и диалкил- или триалкилфосфатами (WO 96/36369, EP 0131740, US 6007979). Вирусы, не обладающие липидной оболочкой, требуют протоколов инактивации, состоящих из обработки неионными детергентами, за которой следует стадия нагревания (60-65°С) в течение нескольких часов (WO 94/17834). После вирусной инактивации могут потребоваться дополнительные стадии очистки для удаления химических веществ. В целом данное изобретение представляет эффективный способ продукции белка, основанный на клеточной линии человека и проверенных способах очистки белка, а также инактивации потенциально опасных инфекционных агентов. Создана безопасная и легкая в использовании система продукции рекомбинантных белков, например фактора свертывания крови IX или VIII, A1AT и G-CSFb. Активность рекомбинантно продуцированных белков может быть проверена с помощью стандартных тестов. В случае фактора IX человека это - например, тест активированного частичного тромбопластинового времени с использованием активации Dapptin TC (Kaolin/Sulfatid-Phospholipid кат. № 5035090, Technoclone GmbH) и ручного коагулометра. Наконец, полученные таким образом рекомбинантные белки, такие как белок крови, описанный выше в данном документе, в частности фактор IX человека, могут быть использованы в фармацевтической композиции.

Данное изобретение далее описано в нижеследующих примерах. Указанные примеры, однако, не должны истолковываться как ограничения данного изобретения.

Примеры

Материалы и способы

Клеточные линии человека для экспрессии белка: Предпочтительными клеточными линиями являются HEK293 (ECACC Ref. 85120602), FreeStyle 293 (293F; Invitrogen R79007) и 293T (tsA201, ECACC Ref. 96121229), которые представляют собой трансформированную клеточную линию эмбриональных почечных клеток человека, стабильно экспрессирующую температурно-чувствительный Т-антиген SV40. Эти эпителиоподобные клеточные линии использовали в разнообразных функциональных испытаниях экспрессии, и сообщалось, что они продуцируют рекомбинантные белки на высоком уровне. Клеточная линия 293F (Invitrogen), которая происходит от клеточной линии 293, использовалась в нижеследующих Примерах предпочтительно. Материнская клеточная линия 293 является постоянной линией, полученной из первичной эмбриональной почки человека, трансформированной усеченной ДНК аденовируса типа 5 человека (Graham et al., 1977; Harrison et al., 1977). Клеточная линия 293F является вариантом клеточной линии 293, которая адаптирована к суспензионному росту в экспрессионной среде (12338-018, Invitrogen) Freestyle™ 293 (293F). Клеточная линия 293F была получена от Роберта Хорлика (Pharmacopeia). Клеточная линия 293F исходно была изготовлена из кратковременно пассированных культур Master Cell Bank, происходящих от исходных клеток 293F, которые были повторно клонированы путем серийных разведений. Клетки постоянно выращивали в бессывороточной среде Freestyle 293 Expression medium или в бессывороточной среде (Octapharma Stockholm) с хорошей жизнеспособностью и хорошей морфологией в течение более чем одного года, в ходе работ по данному изобретению. Для эффективной продукции фактора IX человека среда могла быть модифицирована добавлением витамина K. Эти клеточные линии способны культивироваться в бессывороточной и/или безбелковой среде, содержащей подходящие добавки.

Определение и измерение целевых белков

Определение концентрации фактора IX человека с помощью ELISA: Уровень рекомбинантного фактора IX человека в супернатанте определяли с помощью ELISA, используя античеловеческие антитела к фактору IX (FIX), развитые в козе (GAFIX-AP, Affinity Biologicals), как иммобилизованные антитела в соответствии со стандартной процедурой. Все инкубации проводили во влажной камере при комнатной температуре (RT). Использовали два стандарта: Octanyne (FIX, полученный из плазмы, Octapharma) и BeneFIX (рекомбинантный FIX, Genetics Institute). Детектирующим антителом был анти-человеческий FIX, конъюгированный с пероксидазой, развитый в козе (GAFIX-APHRP, Affinity Biologicals). В каждую лунку добавляли ABTS (кат. № 1682008, Roche Diagnostics) в качестве субстрата, а колориметрическую реакцию определяли на длине волны 405 нм через 15 минут. Результаты рассчитывали с помощью линейной регрессии стандартной концентрации против стандартного поглощения.

Выявление активности фактора IX свертывания крови человека: Свертывающая активность рекомбинантного фактора IX человека в супернатанте определяли следующим образом. Свертывающую активность определяли, основываясь на анализе активированного частичного тромбопластинового времени с помощью активации Dapptin TC (Kaolin/Sulfatid-Phospholipid, кат. № 5035090, Technoclone GmbH) и ручного коагулометра (Amelung KC 4A micro, Amelung GmbH). Для исследования 50 мкл супернатанта от трансфицированных клеток, 50 мкл плазмы, дефицитной по FIX (Progen), и 50 мкл Dapptin TC инкубировали в течение 2 минут при 37°С.

Свертывание запускали добавлением 50 мкл CaCl₂ (кат. № 84687-22F, Instrumentation Laboratory). Время свертывания образца сравнивали с Octanyne и/или BeneFIX.

Определение BDDrhFVIII с помощью COAMATIC: анализ фактора VIII (FVIII) (Chromoqenix): Коммерческий хромогенный набор для анализа COAMATIC:FVIII (Chromogenix, каталожный № 82 25 85) содержит FIX, FX и хромоген, который преобразуется в желтый водорастворимый краситель при расщеплении FXa. FVIII-содержащие образцы дополняют эту систему: FVIII активирует FIX путем образования с ним комплекса, этот комплекс активирует преобразование FX путем протеолитического расщепления в FXa. FXa преобразует хромоген в краситель, который затем определяют фотометрически на длине волны 405 нм. Этот тест предназначен для определения FVIII в плазме пациентов. Для того чтобы сделать этот тест применимым к измерению фактора VIII, в разбавленной культуральной среде была установлена следующая процедура. В качестве контрольных стандартов использовали рекомбинантный полного размера фактор VIII свертывания крови человека (NIBSC, заказ № 57814F) и нормальную контрольную плазму (Instrumentation Laboratory Company).

Приготовление образца: образцы разбавляли разбавляющим буфером, поставляемым вместе с реагентами COAMATIC, до предполагаемой финальной активности FVIII между 2 и 20 мIU/мл и сравнивали со стандартной кривой Всемирной организации здравоохранения (WHO) № 6.

Способ: на 96-луночном планшете, помещенном на термоблок, стандарты и образцы измеряли в триплетах.

Схема работы (на лунку):

Реагент	Объем	Инкубация (37°С)
Разбавленные стандарты и образцы	50 мкл	4 мин
Реагент на фактор (37°С)	50 мкл	Помещение в 96-луночное фотометрическое устройство, инкубация в течение 2 мин при 37°С в инкубаторе
S-2765+I-2581 (37°С)	50 мкл	Помещение в 96-луночное фотометрическое устройство, инкубация в течение 2 мин при 37°С в инкубаторе
20% уксусная кислота	50 мкл	Помещение в 96-луночное фотометрическое устройство, встряхивание в течение 15 сек в 96-луночном фотометрическом устройстве
		Немедленное определение поглощения на длине волны 405 нм

Определение активности A1AT по тесту активности эластазы: После трансфекции A1AT кДНК, A1AT экспрессировался и секретировался в среду клеточной культуры. После удаления клеток центрифугированием (5 минут, 1000 об/мин) активность A1AT измеряли в культуральном супернатанте. В этом тесте активность A1AT определяли по его ингибиторному эффекту на эластазу. Эластаза отщепляет pNA от субстрата N-сукцинил-(Ala)₃-pNA. Выделение pNA измеряли фотометрически на длине волны 405 нм. Путем сравнения стандартных образцов с определенной активностью A1AT определяли активность соответствующих образцов. Как доказано в других экспериментах, тест правомерен на бессывороточной среде Freestyle. Чтобы подтвердить тот факт, что среда Freestyle не влияет на тест, строили две стандартные кривые: стандартную плазму человека разбавляли буфером T+ или средой Freestyle.

Разбавление образцов: Все образцы тестировали неразбавленными, разбавленными 1:10 и 1:50 в среде Freestyle и сравнивали со стандартными разбавлениями плазмы человека. Способ: 50 мкл каждого разбавления стандарта и разбавленного образца соответственно переносили пипеткой в лунки 96-луночного микротитровального планшета. После добавления 150 мкл рабочего раствора эластазы в каждую лунку 96-луночный планшет встряхивали в течение 1 минуты на аппарате для прочтения планшетов ELISA и инкубировали в течение 30 минут при 37°С. 100 мкл рабочего раствора субстрата микропипеткой добавляли в каждую лунку. Поглощение на длине волны 405 нм измеряли немедленно после добавления раствора субстрата и через 7 минут инкубации при 37°С в темноте. Первое значение представляет фоновое поглощение в отсутствие реакции, катализированной эластазой, и вычитается из второго значения, которое представляет поглощение после того, как эластаза отщепляет pNA от субстрата. Используя результат после вычитания, активность A1AT в образцах рассчитывали в соответствии со стандартной кривой.

Определение активности G-CSF с помощью ELISA: Уровни рекомбинантного G-CSF человека в супернатантах клеточной культуры определяли с помощью ELISA, используя анти-человеческое антитело к G-CSF, развитое в мыши (MAB-214, R&D System), в качестве иммобилизованного антитела в соответствии со стандартной процедурой. Все инкубации проводили во влажной камере при комнатной температуре. Использовали стандарт G-CSF (рекомбинантный hG-CSF, E.coli, 214-CS-025, R&D Systems). Детектирующее антитело представляло собой биотинилированный анти-человеческий G-CSF, развитый в козе (BAF-214, R&D Systems). Стрептавидин был конъюгирован с пероксидазой хрена (DY998, R&D Systems), связанной с детектирующим антителом. QuantaBlu™ Fluorogenic Peroxidase Substrate (15169, Pierce) добавляли в каждую лунку в качестве субстрата, флуориметрическую реакцию выявляли при экстинкции 320 нм/испускании 420 нм через 60 мин. Результаты рассчитывали с помощью линейной регрессии концентрации стандарта против относительных единиц флуоресценции стандарта (RFU).

Пример 1: Клонирование целевых белков

A. Клонирование фактора IX человека: Из вектора pTG36, как описано в WO 01/70968, путем двойной рестрикции с помощью HindIII и NotI вырезали фрагмент величиной 1,4 тысяч оснований (kb), содержащий открытую рамку считывания фактора IX свертывания крови человека. Этот фрагмент лигировали с фрагментом, величиной в 5,6 kb, вектора пкДНК3.1Hygro(+)-zz (полученного из V870-20, Invitrogen), подвергнутого двойной рестрикции с помощью HindIII и NotI, с получением вектора пкДНК3.1-FIX, показанного на Фиг.2. Последовательность ДНК пкДНК3.1-FIX показана в SEQ ID NO:1. Три дополнительные нуклеотидные вставки в скелете вектора обнаружены в векторе пкДНК3.1Hygro(+)-zz (см. SEQ ID NO:5) по сравнению с последовательностью, опубликованной Invitrogen (как показано в SEQ ID NO:4). Вектор пкДНК3.1-FIX содержит кассету гена устойчивости к гигромицину, что делает возможным применение способа селекции стабильно трансфицированных клеточных клонов (см. Фиг.2, 3 и 7). Вектор позволяет получить стабильно экспрессирующие клеточные линии, устойчивые к гигромицину, трансфекцией с помощью фосфата кальция или иными способами с последующей селекцией.

B. Клонирование фактора VIII человека: 4380 п.о. FVIIIкДНК, содержащей открытую рамку считывания фактора VIII свертывания крови человека с делецией B-домена выделяли из вектора pTGF8-2hyg-s (SEQ ID NO:7; продукция которого описана в WO 01/70968) рестрикцией NotI+XhoI и лигированием с пкДНК3.1Hygro(+)-zz, которая была линеаризована с помощью XhoI+PspOMI, что давало вектор пкДНК3.1-FVIII, показанный на Фиг.7.

C. Клонирование A1AT человека: мРНК A1AT выделяли непосредственно из клеток HepG-2 (DSMZ# ACC 180) с помощью набора mRNA Miniprep Kit (Sigma, кат.# MRN-10). На следующей стадии мРНК иммобилизовывали на олиго (dT) гранулах. Затем мРНК транскрибировали в двухцепочечную кДНК обратной транскриптазой вируса миелобластоза птиц (AMV RT, Promega, кат.# M5101) с последующей полимеразной цепной реакцией с обратной транскрипцией (RT-PCR). кДНК A1AT амплифицировали с помощью ПЦР-реакции. Продукт ПЦР загружали на агарозный гель. Соответствующую полосу ДНК выделяли и затем очищали с помощью набора Qiaquik Gel Extraction Kit (Qiagen, кат.# 28704). Затем фрагмент A1AT субклонировали в коммерческий вектор (TOPO® Invitrogen, кат.# K4650-01). Для клонирования pCMV-Script: PCR II TOPO-A1AT подвергали рестрикции с помощью EcoRI, фрагмент A1AT 1370 п.о. лигировали с pCMV-Script, линеаризованным с помощью EcoRI.

Для клонирования pCI-neo-A1AT PCR II TOPO-A1AT подвергали рестрикции с помощью EcoRI, фрагмент A1AT 1370 п.о. лигировали с pCI-neo, линеаризованным с помощью EcoRI.

Для клонирования пкДНК3.1-FVIII выделяли 1370 п.о. A1AT с помощью PCR II TOPO-A1AT, подвергали рестрикции с помощью XhoI+HindIII и лигировали с пкДНК3.1, линеаризованным с помощью XhoI+HindIII. Полученный вектор показан на Фиг.3.

Для клонирования pTG1-A1AT подвергали рестрикции PCRII TOPO-A1AT с помощью HindIII и NotI. Фрагмент 1370 п.о. A1AT лигировали с pTGl (no PRE), линеаризованным с помощью HindIII и NotI. Полученный вектор показан на Фиг.9.

D. Клонирование кДНК G-CSF человека: Суммарную РНК выделяли непосредственно из естественных клеток 5637 карциномы мочевого пузыря человека с помощью набора RNeasy mini kit (QIAGEN, каталожный № 74104). Затем выделенную суммарную РНК инкубировали с ДНКазой I для устранения возможной примеси ДНК клеток 5637. Чтобы получить суммарную РНК, свободную от ДНКазы, реакционную смесь обрабатывали набором RNeasy clean-up kit (QIAGEN, кат. № 74204). RT-PCR проводили на суммарной РНК в качестве матрицы с олиго(dT) 12-18 праймером (Invitrogen, кат. № 18418-012) и Superscript™ II РНКазы Н-обратной транскриптазы (Invitrogen, кат. № 18064-022) в присутствии ингибитора РНКазы (Roche, кат. № 799-017) с тем, чтобы синтезировать пул двухцепочечной (ds) кДНК из клеток 5637. Затем кДНК G-CSF амплифицировали с помощью ПЦР. кДНК G-CSF выделяли из агарозного геля с помощью набора QIA быстрой экстракции из геля (QIAGEN, кат. № 28704) и секвенировали с обоими следующими ПЦР-праймерами G-CSF:

G-CSF прямой: 5'-ATG GCT GGA CCT GCC ACC CAG AG -3'(SEQ ID NO:19);

G-CSF обратный: 5'-TCA GGG CTG GGC AAG GTG GCG TAG-3'(SEQ ID NO:20).

Анализ последовательности ДНК, синтезированной из клеток 5637, подтвердил, что она является формой GCSF-b (имеющей последовательность, показанную в SEQ ID NO:26).

кДНК формы GCSF-b, выделенную, как описано выше, затем непосредственно лигировали в коммерческий вектор pCR2.1 (Invitrogen). Образовавшаяся плазмида обозначена как pCR2.1d2-GCSFb и показана на Фиг.10.

PCR2.1d2-GCSFb подвергали рестрикции с помощью HindIII и NotI, фрагмент 705 п.о. кДНК GCSFb выделяли и лигировали в вектор пкДНК3.1Hygro(+)-zz, который был линеаризован с помощью HindIII и NotI. Полученный вектор пДНК3.1-GCSFb показан на Фиг.11.

PCR2.1d2-GCSFb подвергали рестрикции с помощью EcoRI, фрагмент 629 п.о. кДНК GCSFb выделяли и лигировали в вектор pCINeo, который линеаризовали с помощью EcoRI. Полученный вектор pCINeo-GCSFb показан на Фиг.12.

PCR2.1d2-GCSFb подвергали рестрикции с помощью BamHI и XhoI, фрагмент 693 п.о. кДНК GCSFb выделяли и лигировали в вектор pCMVScript, который был линеаризован с помощью BamHI и XhoI. Полученный вектор pCMVScript-GCSFb показан на Фиг.13.

PCR2.1d2-GCSFb подвергали рестрикции с помощью HindIII и NotI, фрагмент 705 п.о. кДНК GCSFb выделяли и лигировали в вектор pTG2-hyg-as, который линеаризовали с помощью HindIII и NotI. Полученный pTG2-GCSFb-hyg-as вектор показан на Фиг.14.

Пример 2: Экспрессия целевых белков в различных клеточных линиях и различных векторах: При оптимизации данного способа продукции рекомбинантного белка проверяли способность различных клеточных линий, все из которых несут вектор, включающий в себя рекомбинантный ген Альфа-1-антитрипсина (A1AT), к высокому уровню экспрессии. Было обнаружено, что CHO, BHK и другие клеточные линии, по данным анализа временной трансфекции, продуцируют меньше рекомбинантного белка по сравнению с клеточной линией 293T. Поэтому проверены и другие клеточные линии, производные от эмбриональных почек человека. Результаты показаны на Фиг.4-6.

Пример 3: Временная трансфекция клеток 293T и 293 в среде, содержащей сыворотку, как сравнение с клетками 293F, которые трансфицированы и культивированы в бессывороточных условиях: 0,1-0,2×10⁶ жизнеспособных клеток 293T или клеток 293 помещали в 6-луночный планшет. На следующий день клетки трансфицировали с помощью кальций-фосфатного способа (Biotechniques 6:7 632-638 (1988)): 4 мкг плазмид ДНК разбавляли в 0,1×буфере TE (до 200 мкл трансфекционной смеси), осторожно смешивали и добавляли к трансфицируемому образцу 20 мкл 2,5 M CaCl₂ и 100 мкл 2×HBS. Трансфицируемый образец инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре. Через 6 ч инкубационную среду заменяли и клетки инкубировали в течение 48 ч.

Пример 4: Бессывороточная трансфекция и экспрессия целевых белков в клетках 293F в бессывороточной среде: 28 мл суспензионной культуры готовили с плотностью клеток 10⁶ жизнеспособных клеток 293F (в тот же день эксперимента по трансфекции). Комплекс липид-ДНК готовили путем разбавления 30 мкг плазмид ДНК в Opti-MEM® I (Invitrogen) до суммарного объема 1 мл, а 40 мкл 293fectin® разбавляли в Opti-MEM® I до суммарного объема 1 мл. Через 5 мин инкубации при комнатной температуре разбавленную ДНК добавляли к 293fectin® с получением суммарного объема 2 мл. Трансфицированные образцы инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре в темноте. 2 мл трансфекционной смеси добавляли к 28 мл суспензионной культуры 293F (финальная плотность клеток 1×10⁶ клеток/мл). Трансфицированные клетки 293F инкубировали при 37°С в увлажненной воздушной атмосфере с 8% CО₂ на орбитальном встряхивателе, вращающемся со скоростью 125 об/мин в течение 72 ч.

A: Трансфекция и экспрессия A1AT: Результаты этих экспериментов по сравнению клеток 293F с клетками 293 и 293T показаны на Фиг.4. Во всех экспериментах определенное количество клеток (10⁶ клеток) трансфицировали пкДНК3.1-A1AT. Сравнивали количества A1AT, экспрессированного в этих различных клеточных линиях. Количество A1AT, экспрессированное клетками 293F, принято за 100%. Как можно видеть из Фиг.4, клетки 293 и 293T продуцировали только 12-13% количества A1AT по сравнению с клетками 293F.

Далее было протестировано, влияют ли различия скелета векторов на количество рекомбинантного белка, продуцированного клетками 293F. Последовательность, кодирующая альфа-1-антитрипсин (A1AT) человека, была встроена в pTG (in-house векторы), pCMV Script® (StrataGEN), pcl neo (Promega), так же как и в вектор пкДНК3.1™.

Уровень экспрессии A1AT вектором пкДНК3.1-A1AT был принят за 100%. Ни один из других векторов не приблизился к высокому уровню экспрессии, наблюдавшемуся при использовании пкДНК™3.1-A1AT. С помощью ELISA было обнаружено, что пкДНК3.1-A1AT продуцирует наибольшее количество A1AT (см. Фиг.5). Внутренний (in-house) вектор экспрессировал только 20%, а другие коммерческие векторы давали 15-30% по сравнению с количеством A1AT, экспрессированным пкДНК3.1. Поэтому пкДНК3.1 был выбран для всех последующих экспериментов.

В целом различные клеточные линии были временно трансфицированы пкДНК3.1™, несущим ген A1AT. Было показано, что бессывороточная клеточная линия 293F экспрессирует в 7 раз больше A1AT на 10⁶ клеток, чем клетки 293T и 293. Поэтому клеточная линия freestyle 293F была выбрана для экспериментов по стабильной трансфекции.

Результаты экспериментов по временной трансфекции показаны на Фиг.6. Верхняя часть (A) показывает анализ SDS-PAGE супернатантов 6 различных испытаний трансфекции с использованием различных векторов трансфекции. Исходя из аналитических чертежей можно сделать вывод, что α1-антитрипсин, присутствующий в анализируемых супернатантах клеточных культур, имеет хорошее качество, что следует из того, что соотношение активности к антигену составляет 1 (данные не показаны). Обоснованность результатов тестов вытекает из того факта, что негативный контроль не показывает активности ни α1-антитрипсина, ни антигена.

Анализ молекулярного веса с помощью SDS-PAGE показывает хорошо сравнимые картины для трех образцов, содержащих α1-антитрипсин. В негативном контроле, помимо отсутствия полосы, представляющей α1-антитрипсин, видна, как и ожидалось, дополнительная полоса с молекулярным весом 27 кДа.

Белок может быть идентифицирован с помощью вестерн-блот анализа (с помощью первых анти-человеческих антител к α1-антитрипсину человека) в ожидаемом диапазоне молекулярных весов в восстанавливающих условиях. Продукты расщепления не видны.

Черные стрелки указывают наиболее заметную полосу, которая соответствует рекомбинантному белку альфа-1-антитрипсину 52 кДа. Также видна полоса, соответствующая белку GFP 27 кДа на дорожках 4 и 8, который временно экспрессируется как контроль в клеточной линии клеток freestyle 293F. Дополнительные полосы на дорожках 1, 2, 3 и 5, 6 и 7 представляют белки клеток-хозяев (клеток freestyle 293F). Нижняя часть (B) показывает анализ вестерн-блота. Результаты идентичны, за исключением того, что благодаря более высокой строгости условий анализа результаты выглядят чище и видна только полоса, соответствующая A1AT.

B: Трансфекция и экспрессия FVIII: На Фиг.8 показано среднее количество фактора VIII в трех лучших стабильно трансфицированных клонах. Среднее количество фактора VIII в трех лучших клонах, экспрессирующих вектор пкДНК-FVIII, принято за 100% продуктивность. Сравнение с in-house вектором pTGF8-2hyg-s показывает почти трехкратно более высокую продукцию фактора VIII с вектором пкДНК3.1-FVIII в клетках 293F.

C: Трансфекция и экспрессия FIX: В стабильно трансфицированных клетках 293F с использованием экспрессирующих фактор IX вектора пкДНК3.1-FIX и вектора pTGF36, основанного на pUC 19/X (см. WO 01/70968), почти трехкратно более высокая продуктивность могла проявиться при использовании вектора пкДНК3.1 в клетках 293F, как это явствует из нижеследующей таблицы 1.

Таблица 1
Продуктивность FIX в клетках 293 и 293F после стабильной трансфекции векторами пкДНК3.1 и pTG2
	Продуктивность FIX в % [мIU/106 клеток, день]
Субстратная клеточная линия/вектор	пкДНК3.1-FIX	pTG2-FIX
293 (+сыворотка)	100%	-
293F (-сыворотка)	100%	60%

Пример 5: Продукция G-CSFb

A. Трансфекция клеток 293F в бессывороточной среде, временная трансфекция: 28 мл суспензионной культуры клеток 293F с плотностью клеток 1,1×10⁶ жизнеспособных клеток 293F на мл приготавливали в день эксперимента по трансфекции. Комплекс липид-ДНК приготавливали путем разбавления 30 мкг плазмид ДНК (пкДНК3.1-G-CSFb) в Opti-MEM® I (Invitrogen) до суммарного объема 1 мл и 30 мкл Lipofectamine 2000 CD разбавляли в Opti-MEM® I до суммарного объема 1 мл. После 5 мин инкубации при комнатной температуре разбавленную ДНК добавляли к Lipofectamine 2000 CD с получением суммарного объема в 2 мл. Трансфекционные образцы инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре в темноте. 2 мл трансфекционной смеси добавляли к 28 мл суспензионной культуры 293F (финальная плотность клеток 1×10⁶ клеток на мл). Трансфицированные клетки 293F инкубировали при 37°С в увлажненной воздушной атмосфере с 8% CO₂ на орбитальном встряхивателе, вращающемся со скоростью 125 об/мин в течение 72 ч.

B. Стабильная трансфекция: Через 72 ч после временной трансфекции, как выше описано в А., подходящее количество клеток (10⁵ и 10⁶ клеток) переносили в плоскодонную чашку для осаждения и получения адгезионного роста. Селекционное давление начинали через 2-50 ч, предпочтительно через 48 ч после переноса в плоскодонную чашку. Предпочтительным селективным агентом был гигромицин в концентрации 75 мкг/мл. Давление поддерживали в течение, по меньшей мере, 10-20 дней, предпочтительно в течение 14 дней, причем среду с добавленным в нее гигромицином заменяли каждые 2-3 дня.

C. Селекция лучших клонов, продуцирующих G-CSF, с помощью анализирующего и собирающего робота ClonePixFL (Genetix): клетки Freestyle 293F, стабильно трансфицированные, как выше описано в B., были посеяны на полутвердую среду, содержащую метилцеллюлозу, а также соответствующий антибиотик и меченые антитела для выявления наиболее продуктивных клонов по флуоресценции, для отбора клонов приблизительно через два дня. Большое количество (тысячи) клонов анализировали с помощью ClonePixFL (Genetix) по количеству клеток и секреции G-CSF, чтобы затем отобрать только несколько сотен клонов, наилучшим образом продуцирующих G-CSF. В отличие от других известных способов, в которых непродуцирующие клоны и смешанные клоны также захватываются случайным образом, применение ClonePixFL позволяет отбор быстро растущих клонов, которые только и обладают высокой продуктивностью, происходящих из единственной клетки. Отобранные клетки росли в микротитровальных планшетах, а затем в центрифужных пробирках, бутылках для клеточной культуры и ферментерах в бессывороточных условиях до завершения процедуры.

В данном случае, как и в остальных, процедура стабильной трансфекции проводилась в бессывороточных условиях. Кроме того, в ходе всего последующего размножения и процедуры культивирования клеток клетки не имеют какого-либо контакта с сывороткой или белками животного происхождения. В ходе размножения лучшие клоны отбирали по признакам резистентности, высокой скорости роста, жизнеспособности и продукции активного G-CSF, определяемого с помощью ELISA. После этой селекционной фазы отобранные клоны культивировали в бессывороточных условиях без добавки антибиотиков. Клетки 293F культивировали без сыворотки в течение всей процедуры, среду заменяли через день. Наращивание клеток выполняли в полностью бессывороточных условиях в колбах Эрленмейера во встряхивателях Kühner до больших объемов в волновом реакторе (Wave Biotech Europe). В ходе этой селекции число клонов снова уменьшается до всего нескольких наилучшим образом продуцирующих клонов. Правильная последовательность кДНК, содержание мРНК и поведение во время ферментации являются критериями идентификации лучшего клона (клонов) для субклонирования. Для этого клетки отобранного клона (клонов) помещали в планшет, анализировали и отбирали с помощью ClonePixFL, а затем размножали и отбирали, как описано ранее. Субклонирование является существенной стадией в том, чтобы снова отобрать клоны с лучшей продукцией и устранить возможные генетические вариации в отобранной на планшет субпопуляции клона. После субклонирования отобранный клон (клоны) хранится опять-таки в бессывороточных условиях. Экспрессированный рекомбинантный белок G-CSF человека биохимически характеризовали более детально.

D. Определение концентрации G-CSF человека с помощью ELISA: Количество полученного таким образом rhG-CSF, экспрессированного клеточными линиями FeeStyle 293F, определяли с помощью ELISA и сравнивали выход белка, полученного от клеток, трансфицированных различными векторами (см. Фиг.15). Как и ожидалось на основании экспериментов по экспрессии FIX и A1AT, описанных в Примерах 2 и 3, и здесь комбинация вектора пкДНК3.1-GCSFb с клеточной линией 293F показала наивысшую продуктивность и поэтому была использована для продукции рекомбинантного G-CSFb человека.

E. Вестерн-блот rhG-CSF в восстанавливающем SDS PAGE: 10 мкл G-CSF, полученного в супернатантах клеток HEK293 и HEK293F, анализировали на 15% SDS PAGE и вестерн-блоте. Детектирование G-CSF выполняли с помощью BAF214-bio/SA-HRP/DAB (см. Фиг.16). Стрелками показана мономерная полоса rhG-CSF с точной молекулярной массой.

Список последовательностей, текст в свободной форме

SEQ ID NО:1: пкДНК3.1-FIX,

Молекула: 6960 п.о. ДНК, кольцевая

Тип	Начало	Конец	Название/Описание
УЧАСТОК	209	863	CMV промотор
УЧАСТОК	895	911	MCS"
ГЕН	939	2324	hFIX
ГЕН	2328	2339	SV40'/SV40 полиА+интрон
УЧАСТОК	2340	2370	'MCS
УЧАСТОК	2381	2595	BGH pA
УЧАСТОК	2658	3071	fl начало репликации
УЧАСТОК	3136	3460	SV40 промотор
ГЕН	3478	4501	HygR
УЧАСТОК	4514	4886	SV40 pA
УЧАСТОК	5819	5146	C PUC начало репликации
ГЕН	6824	5964	C AmpR (комплементарная цепь)

SEQ ID NO:2: пкДНК3.1-A1AT

Молекула: 6914 п.о. ДНК, кольцевая

Тип	Начало	Конец	Название/Описание
УЧАСТОК	209	863	CMV промотор
ГЕН	913	2259	A1AT
ГЕН	2328	2339	SV40'/SV40 полиА+интрон
УЧАСТОК	2335	2549	BGH pA
УЧАСТОК	2612	3025	fl начало репликации
УЧАСТОК	3090	3414	SV40 промотор
ГЕН	3432	4455	HygR
УЧАСТОК	4468	4840	SV40 pA
УЧАСТОК	5773	5100	C PUC начало репликации
ГЕН	6778	5918	C AmpR(комплементарная цепь)

SEO ID NO:3: пкДНК3.1-FVIII

Молекула: 9975 п.о. ДНК, кольцевая

Тип	Начало	Конец	Название/Описание
УЧАСТОК	1	655	CMV промотор
ГЕН	783	3082	Домены Al и A2 FVIII человека
ГЕН	3083	3104	Остаток B-домена и дополнительные нуклеотиды
ГЕН	3105	5162	Домены A3, C1, C2 фактора FVIII человека
УЧАСТОК	5188	5402	BGH pA
УЧАСТОК	5465	5878	f1 начало репликации
УЧАСТОК	5943	6267	SV40 промотор
ГЕН	6285	7308	HygR
УЧАСТОК	7321	7693	SV40 pA
УЧАСТОК	8626	7953	C PUC начало репликации
ГЕН	9631	8771	C AmpR (комплементарная цепь)

SEQ ID NO:4: последовательность пкДНК3.1, опубликованная Invitrogen

Молекула: 5597 п.о. ДНК, кольцевая

Тип	Начало	Конец	Название/Описание
УЧАСТОК	209	863	CMV промотор
УЧАСТОК	895	1010	MCS
УЧАСТОК	1021	1235	BGH pA
УЧАСТОК	1298	1711	fl начало репликации
УЧАСТОК	1776	2100	SV40 промотор
ГЕН	2118	3141	HygR
УЧАСТОК	3154	3526	SV40 pA
УЧАСТОК	4456	3786	C PUC начало репликации
ГЕН	5461	4601	C AmpR (комплементарная цепь)

SEQ ID NO:5: пкДНК3.1Hygro(+)-zz, имеющая 3 дополнительных нуклеотида «GGT» в положении 4380 по сравнению с SEQ ID NO:4

Молекула: 5600 п.о. ДНК, кольцевая

Тип	Начало	Конец	Название/Описание
УЧАСТОК	209	863	CMV промотор
УЧАСТОК	895	1010	MCS
УЧАСТОК	1021	1235	BGH pA
УЧАСТОК	1298	1711	fl начало репликации
УЧАСТОК	1776	2100	SV40 промотор
ГЕН	2118	3141	HygR
УЧАСТОК	3154	3526	SV40 pA
УЧАСТОК	4459	3786	C PUC начало репликации
ГЕН	5464	4604	C AmpR (комплементарная цепь)

SEQ ID NO:6: вектор pTG1-A1AT

SEQ ID NO:7: вектор pFGF8-hyg-s

Молекула: 10705 п.о. ДНК, кольцевая

Тип	Начало	Конец	Название/Описание
УЧАСТОК	1	586	CMV промотор
ГЕН	676	2975	Домены A1 и A2 hFVIII
ГЕН	2976	2997	Шарнирный участок B-домена и дополнительные нуклеотиды
ГЕН	2998	5055	Домены A3, C1, C2 hFVIII
УЧАСТОК	5067	5916	полиA интрон и полиA сайт из SV40
ГЕН	5928	7910	Резистентность к гигромицину
УЧАСТОК	8346	8423	Элемент, чувствительный к прогестерону
ГЕН	8681	9469	Резистентность к ампициллину

SEQ ID NO:8: кДНК дикого типа фактора VIII человека

SEQ ID NO:9: фактор VIII дикого типа человека

SEQ ID NO:10-12: линкерные пептиды

SEQ ID NO:13: кДНК формы а hFVII

SEQ ID NO:14: кДНК формы b hFVII

SEQ ID NO:15: кДНК формы а GCSF человека, CDS:41-661

SEQ ID NO:16: кДНК формы b GCSF человека, CDS:41-652

SEQ ID NO:17: кДНК формы с GCSF человека, CDS:229-828

SEQ ID NO:18: кДНК hvWF

SEQ ID NO:19 и 20: прямой и обратный праймеры G-CSF

SEQ ID NO:21: вектор PCR2.1d2-GCSFb

Молекула: 4542 п.о. ДНК; кольцевая

Начало	Конец	Характеристика/Название
293	907	GCSFb
1159	1596	f1 начало репликации
1930	2724	KanR
2742	3602	AmpR
3747	4420	pUC начало репликации

SEQ ID NO:22: вектор пкДНК3.1-hyg(+)-GCSFb

Молекула: 6237 п.о. ДНК, кольцевая

Начало	Конец	Характеристика/Название
209	863	CMV промотор
970	1584	GCSFb
1658	1872	BGH pA
1935	2348	f1 начало репликации
2413	2737	SV40 промотор
2755	3778	HygR
3791	4163	SV40 pA
5096	4423	С PUC начало репликации
6101	5241	C AmpR

SEQ ID NO:23: вектор pCINeo-GCSFb

Молекула: 6101 п.о. ДНК, кольцевая

Начало	Конец	Характеристика/Название
1	1022	CMV промотор/интрон
1106	1720	GCSFb
1796	2017	SV40 полиA
2112	2567	f1 начало репликации
2629	3047	SV40 энхансер/промотор
3092	3886	NeoR
3950	3998	ПолиA
4409	5269	AmpR

SEQ ID NO:24: вектор pCMVScript_GCSFb,

Молекула: 4920 п.о. ДНК, кольцевая

Начало	Конец	Характеристика/Название
1	602	GMV промотор
728	1342	GCSFb
1453	1836	SV40 полиA
1974	2280	fl начало репликации
2449	2787	SV40 промотор
2822	3613	NeoR
3614	4063	HSV-TK полиA

SEQ ID NO:25: pTG2-GCSFb-hyg-as

Молекула: 6917 п.о. ДНК, кольцевая

Начало	Конец	Характеристика/Название
5	591	CMV промотор
722	1336	GCSFb
1383	2228	SV40 интрон+pA
2767	2255	C HSV TK полиA
3782	2745	C HygR
4044	3796	C HSV TK промотор
4916	5704	AmpR

SEQ ID NO:26: кДНК формы b GCSF человека

SEQ ID NO:27: форма b белка GCSF человека

1. Способ получения иммортализованной клетки человека, стабильно трансфицированной последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей ген, кодирующий целевой белок человека, промотор и сигнал полиаденилирования (полиА) гормона роста быка, где указанный промотор и сигнал полиА связаны с 5'- и 3'-концом гена, кодирующего указанный целевой белок человека соответственно, где способ включает
трансфекцию иммортализованной клетки-хозяина человека в бессывороточных условиях вектором трансфекции, содержащим указанную последовательность нуклеиновой кислоты и начало репликации, где указанный вектор трансфекции дополнительно несет, по меньшей мере, один ген маркера селекции, и
отбор стабильно трансфицированных клеток.

2. Способ по п.1, в котором целевой белок человека представляет собой белок плазмы человека, выбранный из факторов свертывания крови, таких как фактор IX, фактор VIII (дикого типа и с делецией В-домена), фактор VII/VIIa и фактор фон Виллебранда (vWF), факторов роста, таких как эритропоэтин, колониестимулирующих факторов (CSF), таких как гранулоцитстимулирующий фактор (G-CSF), макрофаг CSF (M-CSF) и гранулоцит-макрофаг CSF (GM-CSF), цитокины, такие как интерлейкины, ингибиторы протеаз, такие как альфа-1-антитрипсин (А1АТ) и химотрипсин, транспортные белки, такие как гормоны, белки с ингибиторным или регуляторным действием и их производные и мутанты, предпочтительно белок человека выбран из фактора IX, фактора VIII, включая фактор VIII дикого типа и фактор VIII с делецией В-домена, фактора VII/VIIa, G-CSF, vWF и А1АТ, наиболее предпочтительно белок человека представляет собой фактор IX свертывания крови, кодируемый п.о. 939-2324 SEQ ID NO:1, А1АТ человека, кодируемый п.о. 973-2259 SEQ ID NO:2, фактор VIII дикого типа, показанный в SEQ ID NO:9, фактор VIII человека с делецией В-домена, кодируемый п.о. 783-5162 SEQ ID NO:3, фактор VII/VIIa, кодируемый SEQ ID NO:13 и 14, G-CSF, кодируемый SEQ ID NO:15, 16 и 17, или vWF, кодируемый SEQ ID NO:18.

3. Способ по п.1 или 2, в котором в векторе трансфекции
(i) промотор выбран из вирусных промоторов, промоторов генов «домашнего хозяйства» и тканеспецифических промоторов, предпочтительно промотор представляет собой промотор CMV с интроном А или без такового, промотор SV40, промотор EF-1 альфа, промотор HSV ТК и т.д., наиболее предпочтительным промотором является промотор CMV; и/или
(ii) начало репликации обеспечивает репликацию и амплификацию плазмиды в бактериях;
(iii) по меньшей мере, один ген маркера селекции предпочтительно выбран из генов резистентности к гигромицину, резистентности к неомицину, резистентности к аминогликозидфосфотрансферазе (neo, G418, АРН), резистентности к блеомицину (флео, блео, зеоцину) и резистентности к ксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазе (XGPRT, gpt), и/или находится под контролем промотора, как определено в (i) выше; и/или
(iv) вектор дополнительно несет один или более иных регуляторных элементов, предпочтительно выбранных из сайтов сплайсинга, сайтов рекомбинации, сайтов полиА, энхансеров, сайтов мультиклонирования и прокариотических последовательностей плазмид.

4. Способ по п.3, в котором вектор трансфекции несет промотор CMV, ген гигромицина, последовательность полиА и представляющий интерес ген, и, предпочтительно, происходящий из вектора пкДНК3.1, имеющего последовательность SEQ ID NO:4 или 5.

5. Способ по п.1 или 2, в котором иммортализованная клетка человека (i) способна быть трансфицирована и культивироваться в бессывороточных условиях; и/или
(ii) интегрирует аденовирусные последовательности в свой геном; и/или
(iii) выбрана из группы клеток почек, мочевого пузыря, печени, легких, сердечной мышцы, гладкой мышцы, яичников и желудочно-кишечного тракта, предпочтительно - клеточной линии почек человека; и/или
(iv) не способна экспрессировать прионный белок человека.

6. Способ по п.5, в котором клетки почек представляют собой фетальные клетки почек человека, предпочтительно - фетальные клетки почек человека, выбранные из клеток 293 (АТСС CRL-1573; DSM АСС 305), клеток 293Т (DSM АСС 2494), клеток FreeStyle 293 (клетки 293F; Invitrogen R79007), предпочтительно клетки 293F (фирма Invitrogen R79007).

7. Способ по п.6, в котором клетка представляет собой 293F, а вектор трансфекции происходит от пкДНК3.1, вектор предпочтительно кодирует фактор IX свертывания крови человека, представленный п.о. 939-2324 SEQ ID NO:1, А1АТ человека кодируется п.о. 973-2259 SEQ ID NO:2, фактор VIII дикого типа человека, представленный в SEQ ID NO:9, или фактор VIII человека с делецией В-домена, показанный в SEQ ID NO:3, FVII/FVIIa, G-CSF, включая G-CSFb, показанный в SEQ ID NO:27, или фактор фон Виллебранда.

8. Способ по п.1 или 2, в котором бессывороточная трансфекция проводится в суспензионной культуре без сыворотки с катионным трансфекционным агентом или фосфатом кальция, предпочтительно - с липофектамином 2000 CD (Invitrogen).

9. Способ по п.1 или 2, в котором стабильно трансфицированные клетки отбирают предпочтительно по продуктивности, активности и качеству продуцированного рекомбинантного белка.

10. Стабильно трансфицированная иммортализованная клетка человека для получения рекомбинантных белков человека, получаемая способом по пп.1-9.

11. Клетка по п.10, получаемая способом по пп.4-9, предпочтительно клетка представляет собой 293F, а вектор трансфекции происходит от пкДНК3.1.

12. Способ рекомбинантной продукции целевого белка человека, который включает культивирование иммортализованной клетки человека, определенной в п.10 или 11, стадии концентрирования рекомбинантного белка человека из культурального бульона, и/или очистки белка, и/или удаления прионов.

13. Способ по п.12, в котором целевой белок человека представляет собой фактор IX свертывания крови человека, показанный п.о. 939-2324 SEQ ID NO:1, А1АТ человека, кодируемый п.о. 973-2259 SEQ ID NO:2, фактор VIII дикого типа человека, показанный в SEQ ID NO:9, или фактор VIII человека с делецией В-домена, показанный в SEQ ID NO:3, FVII/FVIIa, G-CSF, включая G-CSFb, показанную в SEQ ID NO:27, или фактор фон Виллебранда.

14. Способ по п.12 или 13, в котором продукция белка человека осуществляется в бессывороточных условиях.

15. Применение вектора трансфекции, содержащего начало репликации и последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую ген, кодирующий целевой белок человека, как определено в пп.1-4, в способе по п.1.

16. Применение по п.15, где вектор представляет собой вектор пкДНК3.1, содержащий ген, кодирующий целевой белок, выбранный из группы, состоящей из белка фактора IX свертывания крови человека, А1АТ человека, фактора VIII свертывания крови человека, включая его дикий тип и мутанты с делецией В-домена, G-CSF, включая его формы a, b и с, FVII/VIIa, включая его формы а и b, и vWF, где предпочтительно указанный вектор трансфекции имеет последовательность нуклеиновой кислоты, показанную в SEQ ID NO:1, 2, 3 или 22.