Питательная среда для культивирования дифтерийных микробов
Владельцы патента RU 2455351:
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Ростовский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГБОУ ВПО РостГМУ Минздравсоцразвития России) (RU)
Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской микробиологии, и может быть использовано для культивирования дифтерийных микробов в искусственных питательных средах при бактериологической диагностике дифтерии. Питательная среда содержит твердую и жидкую фазы. Твердая фаза питательной среды содержит гидролизат панкреатический рыбной муки, стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, натрий хлористый, экстракт дрожжевой, глюкозу, агар, теллурит калия - 2% раствор и дистиллированную воду при заданных соотношениях компонентов. Жидкая фаза содержит гидролизат панкреатический рыбной муки, пептон ферментативный, натрий хлористый, экстракт дрожжевой, глюкозу, сыворотку крови крупного рогатого скота и дистиллированную воду в заданном соотношении. Изобретение позволяет повысить чувствительность среды, показатель прорастания микроорганизмов и скорость роста дифтерийных микробов. 3 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской микробиологии, и может быть использовано при бактериологической диагностике дифтерии.
Заболеваемость дифтерией в современных условиях носит спорадический характер (Маркина С.С, Максимова Н.М., Черкасова В.В., Кошкина Н.А. Эпидемиологическая ситуация по дифтерии в России в настоящее время//Вакцинация. - 2006, №3, с.7-9). Однако возбудитель дифтерии продолжает циркулировать среди населения благодаря существованию бактерионосительства токсигенных штаммов дифтерийных микробов, что создает угрозу возникновения новых эпидемий дифтерии (Костюкова Н.Н. Возбудитель дифтерии и условно-патогенные коринебактерии // Клиническая лабораторная диагностика. - 2001, №6, с.25-31). В сложившейся ситуации диагноз «дифтерия» может быть выставлен без бактериологического подтверждения, что свидетельствует о недостатках в бактериологической диагностике дифтерии (Максимова Н.М., Маркина С.С., Яцковский К.А и др. Дифтерия в России в 2005-2009 годах // Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. - 2010, №3, с.31-36) и связано со сложностью культивирования дифтерийных микробов на существующих питательных средах.
В настоящее время для культивирования дифтерийных микробов используют различные питательные среды, содержащие в своем составе гидролизаты белкового сырья, стимуляторы роста и ингибиторы роста посторонней микрофлоры (Методические указания 4.2.698 - 98 «Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции» МЗ РФ. - Москва, 1998 г., с.20-25). Однако ростовые свойства известных питательных сред оставляют желать лучшего. Так при культивировании дифтерийных микробов на сушествующих плотных питательных средах единичные колонии возбудителя появляются только лишь через 24 часа, а достаточное количество колоний, необходимое для дальнейшего проведения бактериологической диагностики образуется только через 48 и более часов (Методические указания 4.2.698 - 98 «Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции» МЗ РФ. - Москва, 1998 г., с.6, 9-12).
Поэтому разработка новых питательных сред для культивирования дифтерийных микробов, обладающих улучшенными ростовыми свойствами, остается актуальной проблемой современной микробиологии.
Проведенными исследованиями по патентной и научно-медицинской литературе найдены различные питательные среды для культивирования дифтерийных микробов.
Так, в работе Мазуровой И.К., Бочковой В.А., Сальниковой Г.П. (Методические рекомендации «Бактериологические исследования при дифтерийной инфекции», Москва. - 1980.- с.67) описана питательная среда Бучина, применяемая для культивирования дифтерийных микробов. Она содержит на 100 мл питательной агаровой основы 5 мл дефибринированной крови.
Недостатком данной питательной среды является ее недостаточные ростовые свойства. Так, при посеве взвеси дифтерийных микробов, содержащей 100 микробных клеток, через 48 часов после посева вырастает не более 5 колоний.
В работе Мазуровой И.К., Мельникова В.Г., Комбаровой С.Ю., Борисовой О.Ю. (Методические указания МУ 4.2.698 - 98 «Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции». - МЗ РФ. - Москва, 1998 г. - с.22) описана питательная среда для культивирования дифтерийных микробов -кровяной теллуритовый агар. Питательная среда содержит на 100 мл питательной агаровой основы 7 мл дефибринированной или 10 мл гемолизированной крови человека или животных, а также 2 мл 2% раствора теллурита калия.
Недостатком этой среды является ее недостаточные ростовые свойства. Так, при посеве взвеси дифтерийных микробов, содержащей 100 микробных клеток, через 24 часа вырастает не более 10-15 колоний.
Патентом РФ №2412991 (2011 г., БИПМ №6) защищена "Питательная двухфазная среда для культивирования микроорганизмов", содержащая жидкую фазу, состав которой определяется биологическими особенностями конкретного микроорганизма, и твердую фазу, содержащую коагулированную сыворотку и агарозу, при заданном соотношении компонентов.
Недостатком этой двухфазной среды является ее ограниченная область применения: ее невозможно использовать для культивирования дифтерийных микробов, так как для их культивирования необходимо наличие в ее составе не коагулированной, а нативной сыворотки (Методические указания МУ 4.2.698 - 98 «Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции». - МЗ РФ - Москва, 1998 г. - с.23-24).
Наиболее близким техническим решением, принятым нами за прототип, является "Питательная среда для выделения дифтерийного микроба", защищенная патентом РФ №2041947 (1995 г., БИ №23). Указанная питательная среда - прототип, представляет собой твердую фазу. Среда содержит питательную основу - гидролизат панкреатический рыбной муки с добавлением гидролизата ферментативного черного альбумина, натрий хлористый, агар, теллурит калия - 2% раствор и воду дистиллированную, при следующем соотношении компонентов:
| гидролизат панкреатический рыбной муки, г | 20,0-25,0 |
| гидролизат ферментативный черного альбумина, г | 8,0-12,0 |
| натрий хлористый, г | 4,0-6,0 |
| агар, г | 10,0-15,0 |
| теллурит калия - 2% раствор, мл | 5,0-20,0 |
| вода дистиллированная, л | до 1 |
Авторами прототипа описаны следующие показатели ростовых свойств питательной среды для выделения дифтерийных микробов: чувствительность среды - 10-7, показатель прорастания микроорганизмов - 104,2%, скорость роста дифтерийных микробов - 19 часов.
Недостатком данной питательной среды - прототипа являются невысокие показатели ростовых свойств среды, а именно чувствительности среды, показателя прорастания и скорости роста дифтерийных микробов.
В соответствии с Методическими указаниями (МУК 4.2.2316 - 08) «Методы контроля бактериологических питательных сред». - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2008. - с.37, 41):
"Чувствительность среды - это максимальное разведение культуры, обеспечивающее визуально обнаруживаемый рост колоний искомого штамма в течение определенного времени и температуры на всех засеянных чашках (пробирках) с питательной средой"; показатель прорастания микроорганизмов (%) - это "отношение среднего числа колоний, образовавшихся на испытуемой среде, к среднему числу колоний на контрольной среде"; "скорость роста (часы) определяют по минимальному времени инкубации посевов, за которое при соответствующем разведении обеспечивается отчетливый (не менее 100 жизнеспособных клеток) видимый невооруженным глазом рост культуры (помутнение, наличие пленки, осадка, роста по уклону и др.) во всех засеянных пробирках".
Задачей предлагаемого изобретения является создание питательной среды для культивирования дифтерийных микробов с улучшенными ростовыми свойствами.
Техническим результатом, проявляющимся при использовании данной питательной среды, является повышение чувствительности среды, показателя прорастания и скорости роста дифтерийных микробов.
Технический результат достигается тем, что в питательную среду для культивирования дифтерийных микробов, представляющую собой твердую фазу, в состав которой входят гидролизат панкреатический рыбной муки, натрий хлористый, агар, теллурит калия - 2% раствор и вода дистиллированная, дополнительно введена жидкая фаза.
Жидкая фаза содержит гидролизат панкреатический рыбной муки, пептон ферментативный, натрий хлористый, экстракт дрожжевой, глюкозу, сыворотку крови крупного рогатого скота и воду дистиллированную. Соотношение компонентов жидкой фазы на каждый литр воды дистиллированной следующее:
| гидролизат панкреатический рыбной муки, г | 8,0-9,0 |
| пептон ферментативный, г | 8,0-9,0 |
| натрий хлористый, г | 4,0-4,5 |
| экстракт дрожжевой, г | 3,0-5,0 |
| глюкоза, г | 3,0-5,0 |
| сыворотка крови крупного рогатого скота, мл | 80,0-100,0 |
Твердая фаза питательной среды для культивирования дифтерийных микробов дополнительно содержит стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, экстракт дрожжевой и глюкозу. Соотношение компонентов твердой фазы на каждый литр воды дистиллированной следующее:
| гидролизат панкреатический рыбной муки, г | 20,0-25,0 |
| стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, г | 10,0-12,0 |
| натрий хлористый, г | 4,0-4,5 |
| экстракт дрожжевой, г | 3,0-5,0 |
| глюкоза, г | 3,0-5,0 |
| агар, г | 10,0-12,0 |
| теллурит калия - 2% раствор, мл | 13,0-15,0 |
Заявляемая питательная среда для культивирования дифтерийных микробов готовится следующим образом.
Для приготовления жидкой фазы заявляемой питательной среды для культивирования дифтерийных микробов берут в необходимых соотношениях: гидролизат панкреатический рыбной муки, например, производства Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» (ФБУН ГНЦ ПМБ), п.Оболенск, Московская обл. (ТУ 480-00001927-27-93), пептон ферментативный, например, производства ФБУН ГНЦ ПМБ, п.Оболенск, Московская обл. (ГОСТ 13805-76), натрий хлористый, например, производства ООО «Агат-Мед», г.Москва (ГОСТ 4233-77), экстракт дрожжевой, например, производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited» (Индия), глюкозу, например, производства ООО «Вита Реактив», г.Дзержинск (ГОСТ 975-88), сыворотку крови крупного рогатого скота, например, производства ООО «Биолот», г.Санкт-Петербург и воду дистиллированную, например, производства ООО МЦ «Эллара», г.Покров (ГОСТ 6709-72).
Указанные компоненты, кроме сыворотки крови крупного рогатого скота, смешивают в эмалированной посуде в 1 л воды дистиллированной, кипятят в течение 2 минут, фильтруют через бумажный фильтр. Затем приготовленную основу помещают в стерилизатор, например "Стерилизатор паровой ГК-100-3" производства фирмы «Тюмень Медико», выдерживают при температуре плюс 121°С и давлении 1,0 атм в течение 15 минут, охлаждают до температуры плюс 45°С, добавляют необходимый объем сыворотки крови крупного рогатого скота, смешивают.
Для приготовления твердой фазы заявляемой питательной среды для культивирования дифтерийных микробов берут в необходимых соотношениях: гидролизат панкреатический рыбной муки, например, производства ФБУН ГНЦ ПМБ, п.Оболенск, Московская обл. (ТУ 480-00001927-27-93), стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, например, производства ФБУН ГНЦ ПМБ, п.Оболенск, Московская обл. (ТУ 480-00001927-28-93), натрий хлористый, например, производства ООО «Агат-Мед», г.Москва (ГОСТ 4233-77), экстракт дрожжевой, например, производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited» (Индия), глюкозу, например, производства ООО «Вита Реактив», г.Дзержинск (ГОСТ 975-88), агар, например, производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited», (Индия), теллурит калия - 2% раствор, например, производства ЗАО «Мосхимфармпрепараты им. Н.А.Семашко», г.Москва и воду дистиллированную, например, производства ООО МЦ «Эллара», г.Покров (ГОСТ 6709-72).
Указанные компоненты, кроме теллурита калия - 2% раствора, смешивают в эмалированной посуде в 1 л воды дистиллированной, кипятят до полного растворения ингредиентов в течение 2 минут, помещают в стерилизатор, например "Стерилизатор паровой ГК-100-3", производства фирмы «Тюмень Медико», выдерживают при температуре плюс 121°С и давлении 1,0 атм в течение 15 минут, охлаждают до температуры плюс 45°С, добавляют необходимый объем теллурита калия - 2% раствор, смешивают и разливают по 30 мл во флаконы объемом 100 мл. Флаконы закупоривают и оставляют в наклонном положении под углом 30° до застывания.
Флаконы с твердой фазой питательной среды с соблюдением правил асептики, стерильно, над факелом открывают, вносят в них по 10 мл жидкой фазы питательной среды и закрывают. Готовую питательную среду хранят в холодильном шкафу при температуре плюс 4°С.
Практическая реализуемость использования предлагаемой питательной среды для культивирования дифтерийных микробов иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Для приготовления твердой фазы заявляемой питательной среды для культивирования дифтерийных микробов были взяты гидролизат панкреатический рыбной муки (ТУ 480-00001927-27-93, производства ФБУН ГНЦ ПМБ, п.Оболенск, Московская обл.), стимулятор роста гемофильных микроорганизмов (ТУ 480-00001927-28-93, производства ФБУН ГНЦ ПМБ, п.Оболенск, Московская обл.), натрий хлористый (ГОСТ 4233-77, производства ООО «Агат-Мед», г.Москва), экстракт дрожжевой (производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited» (Индия)), глюкоза (ГОСТ 975-88, производства ООО «Вита Реактив», г.Дзержинск), агар (производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited» (Индия)), теллурит калия - 2% раствор (производства ЗАО «Мосхимфармпрепараты им. Н.А. Семашко», г.Москва), при следующем соотношении компонентов на 100 мл воды дистиллированной (ГОСТ 6709-72, производства ООО МЦ «Эллара», г.Покров):
| гидролизат панкреатический рыбной муки, г | 2,0 |
| стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, г | 1,0 |
| натрий хлористый, г | 0,4 |
| экстракт дрожжевой, г | 0,3 |
| глюкоза, г | 0,3 |
| агар, г | 1,0 |
| теллурит калия - 2% раствор, мл | 1,3 |
Гидролизат панкреатический рыбной муки, стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, натрий хлористый, экстракт дрожжевой, глюкозу и агар смешивали в эмалированной посуде в 100 мл воды дистиллированной, кипятили до полного растворения ингредиентов в течение 2 минут, помещали в "Стерилизатор паровой ГК-100-3" производства фирмы «Тюмень Медико», выдерживали при температуре плюс 121°С и давлении 1,0 атм в течение 15 минут, охлаждали до температуры плюс 45°С, добавляли 1,3 мл теллурита калия - 2% раствор. Разливали по 30 мл во флаконы объемом 100 мл. Флаконы закупоривали и оставляли в наклонном положении под углом 30° до застывания.
Для приготовления жидкой фазы заявляемой питательной среды для культивирования дифтерийных микробов были взяты гидролизат панкреатический рыбной муки (ТУ 480-00001927-27-93, производства ФБУН ГНЦ ПМБ, п.Оболенск, Московская обл.), пептон ферментативный (ГОСТ 13805-76, производства ФБУН ГНЦ ПМБ, п.Оболенск, Московская обл.), натрий хлористый (ГОСТ 4233-77, производства ООО «Агат-Мед», г.Москва), экстракт дрожжевой (производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited» (Индия)), глюкоза (ГОСТ 975-88, производства ООО «Вита Реактив», г.Дзержинск), сыворотка крови крупного рогатого скота (производства ООО «Биолот», г.Санкт-Петербург) при следующем соотношении компонентов на 100 мл воды дистиллированной (ГОСТ 6709-72, производства ООО МЦ «Эллара», г.Покров):
| гидролизат панкреатический рыбной муки, г | 0,8 |
| пептон ферментативный, г | 0,8 |
| натрий хлористый, г | 0,4 |
| экстракт дрожжевой, г | 0,3 |
| глюкоза, г | 0,3 |
| сыворотка крови крупного рогатого скота, мл | 8,0 |
Гидролизат панкреатический рыбной муки, пептон ферментативный, натрий хлористый, экстракт дрожжевой и глюкозу смешивали в эмалированной посуде в 100 мл воды дистиллированной, кипятили в течение 2 минут, фильтровали через бумажный фильтр. Затем помещали в "Стерилизатор паровой ГК-100-3" производства фирмы «Тюмень Медико», выдерживали при температуре плюс 121°С и давлении 1,0 атм в течение 15 минут, охлаждали до температуры плюс 45°С, добавляли 8,0 мл сыворотки крови крупного рогатого скота, смешивали.
Флаконы с твердой фазой питательной среды с соблюдением правил асептики, стерильно, над факелом открывали, вносили в них по 10 мл жидкой фазы питательной среды и закрывали. Готовую питательную среду хранили в холодильном шкафу при температуре плюс 4°С.
Для определения ростовых свойств предлагаемой питательной среды для культивирования дифтерийных микробов в соответствии с МУК 4.2.2316-08 («Методы контроля бактериологических питательных сред», 2008, с.25-27) использовали взвесь дифтерийных микробов штаммов: С.diphtheriae gravis tox+, BH, серотип 2, полученный из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов (ГКПМ) Федерального государственного бюджетного учреждения «Государственный научно-медицинский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ФГБУ ГИСК им. Л.А.Тарасевича Минздравсоцразвития России), и свежевыделенный штамм С.diphtheriae gravis tox+.
Определение чувствительности, показателя прорастания и скорости роста дифтерийных микробов на предлагаемой питательной среде выполняли в соответствии с МУК 4.2.2316-08 («Методы контроля бактериологических питательных сред», 2008, с.37, 41).
Были получены следующие результаты: чувствительность среды - 10-8, показатель прорастания дифтерийных микробов - 269,3%, скорость роста дифтерийных микробов - 13,5 часов.
Пример 2. Для приготовления твердой фазы заявляемой питательной среды для культивирования дифтерийных микробов были взяты гидролизат панкреатический рыбной муки (ТУ 480-00001927-27-93, производства ФБУН ГНЦ ПМБ, п.Оболенск, Московская обл.), стимулятор роста гемофильных микроорганизмов (ТУ 480-00001927-28-93, производства ФБУН ГНЦ ПМБ, п.Оболенск, Московская обл.), натрий хлористый (ГОСТ 4233-77, производства ООО «Агат-Мед», г.Москва), экстракт дрожжевой (производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited» (Индия)), глюкоза (ГОСТ 975-88, производства ООО «Вита Реактив», г.Дзержинск), агар (производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited» (Индия)), теллурит калия - 2% раствор (производства ЗАО «Мосхимфармпрепараты им. Н.А. Семашко», г.Москва), при следующем соотношении компонентов на 100 мл воды дистиллированной (ГОСТ 6709-72, производства ООО МЦ «Эллара», г.Покров):
| гидролизат панкреатический рыбной муки, г | 2,3 |
| стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, г | 1,1 |
| натрий хлористый, г | 0,4 |
| экстракт дрожжевой, г | 0,4 |
| глюкоза, г | 0,4 |
| агар, г | 1,1 |
| теллурит калия - 2% раствор, мл | 1,4 |
Гидролизат панкреатический рыбной муки, стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, натрий хлористый, экстракт дрожжевой, глюкозу и агар, смешивали в эмалированной посуде в 100 мл воды дистиллированной, кипятили до полного растворения ингредиентов в течение 2 минут, помещали в "Стерилизатор паровой ГК-100-3" производства фирмы «Тюмень Медико», выдерживали при температуре плюс 121°С и давлении 1,0 атм в течение 15 минут, охлаждали до температуры плюс 45°С, добавляли 1,4 мл теллурита калия - 2% раствор. Разливали по 30 мл во флаконы объемом 100 мл. Флаконы закупоривали и оставляли в наклонном положении под углом 30° до застывания.
Для приготовления жидкой фазы заявляемой питательной среды для культивирования дифтерийных микробов были взяты гидролизат панкреатический рыбной муки (ТУ 480-00001927-27-93, производства ФБУН ГНЦ ПМБ, п.Оболенск, Московская обл.), пептон ферментативный (ГОСТ 13805-76, производства ФБУН ГНЦ ПМБ, п.Оболенск, Московская обл.), натрий хлористый (ГОСТ 4233-77, производства ООО «Агат-Мед», г.Москва), экстракт дрожжевой (производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited» (Индия)), глюкоза (ГОСТ 975-88, производства ООО «Вита Реактив», г.Дзержинск), сыворотка крови крупного рогатого скота (производства ООО «Биолот», г.Санкт-Петербург) при следующем соотношении компонентов на 100 мл воды дистиллированной (ГОСТ 6709-22, производства ООО МЦ «Эллара», г.Покров):
| гидролизат панкреатический рыбной муки, г | 0,8 |
| пептон ферментативный, г | 0,8 |
| натрий хлористый, г | 0,4 |
| экстракт дрожжевой, г | 0,4 |
| глюкоза, г | 0,4 |
| сыворотка крови крупного рогатого скота, мл | 9,0 |
Гидролизат панкреатический рыбной муки, пептон ферментативный, натрий хлористый, экстракт дрожжевой и глюкозу смешивали в эмалированной посуде в 100 мл воды дистиллированной, кипятили в течение 2 минут, фильтровали через бумажный фильтр. Затем помещали в "Стерилизатор паровой ГК-100-3" производства фирмы «Тюмень Медико», выдерживали при температуре плюс 121°С и давлении 1,0 атм в течение 15 минут, охлаждали до температуры плюс 45°С, добавляли 9,0 мл сыворотки крови крупного рогатого скота, смешивали.
Флаконы с твердой фазой питательной среды с соблюдением правил асептики, стерильно, над факелом открывали, вносили в них по 10 мл жидкой фазы питательной среды и закрывали. Готовую питательную среду хранили в холодильном шкафу при температуре плюс 4°С.
Для определения ростовых свойств предлагаемой питательной среды для культивирования дифтерийных микробов в соответствии с МУК 4.2.2316-08 («Методы контроля бактериологических питательных сред», 2008, с.25-27) использовали взвесь дифтерийных микробов штаммов: С.diphtheriae gravis tox+, ВН, серотип 2, полученный из ГКПМ ФГБУ ГИСК им. Л.А.Тарасевича Минздравсоцразвития России, и свежевыделенный штамм С.diphtheriae gravis tox+.
Определение чувствительности, показателя прорастания и скорости роста дифтерийных микробов на предлагаемой питательной среде выполняли в соответствии с МУК 4.2.2316-08 («Методы контроля бактериологических питательных сред», 2008, с.37, 41).
Были получены следующие результаты: чувствительность среды - 10-8, показатель прорастания дифтерийных микробов - 201,6%, скорость роста дифтерийных микробов - 14,5 часов.
Пример 3. Для приготовления твердой фазы заявляемой питательной среды для культивирования дифтерийных микробов были взяты гидролизат панкреатический рыбной муки (ТУ 480-00001927-27-93, производства ФБУН ГНЦ ПМБ, п.Оболенск, Московская обл.), стимулятор роста гемофильных микроорганизмов (ТУ 480-00001927-28-93, производства ФБУН ГНЦ ПМБ, п.Оболенск, Московская обл.), натрий хлористый (ГОСТ 4233-77, производства ООО «Агат-Мед», г.Москва), экстракт дрожжевой (производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited» (Индия)), глюкоза (ГОСТ 975-88, производства ООО «Вита Реактив», г.Дзержинск), агар (производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited» (Индия)), теллурит калия - 2% раствор (производства ЗАО «Мосхимфармпрепараты им. Н.А. Семашко», г.Москва), при следующем соотношении компонентов на 100 мл воды дистиллированной (ГОСТ 6709-72, производства ООО МЦ «Эллара», г.Покров):
| гидролизат панкреатический рыбной муки, г | 2,5 |
| стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, г | 1,2 |
| натрий хлористый, г | 0,45 |
| экстракт дрожжевой, г | 0,5 |
| глюкоза, г | 0,5 |
| агар, г | 1,2 |
| теллурит калия - 2% раствор, мл | 1,5 |
Гидролизат панкреатический рыбной муки, стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, натрий хлористый, экстракт дрожжевой, глюкозу и агар, смешивали в эмалированной посуде в 100 мл воды дистиллированной, кипятили до полного растворения ингредиентов в течение 2 минут, помещали в "Стерилизатор паровой ГК-100-3" производства фирмы «Тюмень Медико», выдерживали при температуре плюс 121°С и давлении 1,0 атм в течение 15 минут, охлаждали до температуры плюс 45°С, добавляли 1,5 мл теллурита калия - 2% раствор. Разливали по 30 мл во флаконы объемом 100 мл. Флаконы закупоривали и оставляли в наклонном положении под углом 30° до застывания.
Для приготовления жидкой фазы заявляемой питательной среды для культивирования дифтерийных микробов были взяты гидролизат панкреатический рыбной муки (ТУ 480-00001927-27-93, производства ФБУН ГНЦ ПМБ, п.Оболенск, Московская обл.), пептон ферментативный (ГОСТ 13805-76, производства ФБУН ГНЦ ПМБ, п.Оболенск, Московская обл.), натрий хлористый (ГОСТ 4233-77, производства ООО «Агат-Мед», г.Москва), экстракт дрожжевой (производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited» (Индия)), глюкоза (ГОСТ 975-88, производства ООО «Вита Реактив», г.Дзержинск), сыворотка крови крупного рогатого скота (производства ООО «Биолот», г.Санкт-Петербург) при следующем соотношении компонентов на 100 мл воды дистиллированной (ГОСТ 6709-22, производства ООО МЦ «Эллара», г.Покров):
| гидролизат панкреатический рыбной муки, г | 0,9 |
| пептон ферментативный, г | 0,9 |
| натрий хлористый, г | 0,45 |
| экстракт дрожжевой, г | 0,5 |
| глюкоза, г | 0,5 |
| сыворотка крови крупного рогатого скота, мл | 10,0 |
Гидролизат панкреатический рыбной муки, пептон ферментативный, натрий хлористый, экстракт дрожжевой и глюкозу смешивали в эмалированной посуде в 100 мл воды дистиллированной, кипятили в течение 2 минут, фильтровали через бумажный фильтр. Затем помещали в "Стерилизатор паровой ГК-100-3" производства фирмы «Тюмень Медико», выдерживали при температуре плюс 121°С и давлении 1,0 атм в течение 15 минут, охлаждали до температуры плюс 45°С, добавляли 10,0 мл сыворотки крови крупного рогатого скота, смешивали.
Флаконы с твердой фазой питательной среды с соблюдением правил асептики, стерильно, над факелом открывали, вносили в них по 10 мл жидкой фазы питательной среды и закрывали. Готовую питательную среду хранили в холодильном шкафу при температуре плюс 4°С.
Для определения ростовых свойств предлагаемой питательной среды для культивирования дифтерийных микробов в соответствии с МУК 4.2.2316-08 («Методы контроля бактериологических питательных сред», 2008, с.25-27) использовали взвесь дифтерийных микробов штаммов: С.diphtheriae gravis tox+, ВН, серотип 2, полученный из ГКПМ ФГБУ ГИСК им. Л.А.Тарасевича Минздравсоцразвития России, и свежевыделенный штамм С.diphtheriae gravis tox+.
Определение чувствительности, показателя прорастания и скорости роста дифтерийных микробов на предлагаемой питательной среде выполняли в соответствии с МУК 4.2.2316-08 («Методы контроля бактериологических питательных сред», 2008, с.37, 41).
Были получены следующие результаты: чувствительность среды - 10-8, показатель прорастания дифтерийных микробов - 134,8%, скорость роста дифтерийных микробов - 17 часов.
Согласно МУК 4.2.2316-08 («Методы контроля бактериологических питательных сред», 2008, с.25-27, 37, 41) с использованием взвеси дифтерийных микробов штаммов: С.diphtheriae gravis tox+, BH, серотип 2, полученного из ГКПМ ФГБУ ГИСК им. Л.А.Тарасевича Минздравсоцразвития России, и свежевыделенного штамма С.diphtheriae gravis tox+ нами были проведены исследования ростовых свойств предлагаемой питательной среды для культивирования дифтерийных микробов при различных соотношениях входящих в нее компонентов.
Были получены следующие результаты: величина чувствительности среды во всех случаях составила 10-8, значение показателя прорастания микроорганизмов варьировало от 134,8 до 269,3%, величина скорости роста дифтерийных микробов - от 13,5 до 17 часов.
Таким образом, по сравнению с прототипом предлагаемая питательная среда для культивирования дифтерийных микробов позволяет повысить чувствительность среды в 10 раз, показатель прорастания микроорганизмов - более чем в 1,3 раза, скорость роста дифтерийных микробов - более чем на 2 часа.
Питательная среда для культивирования дифтерийных микробов, содержащая твердую фазу, в состав которой входят гидролизат панкреатический рыбной муки, натрий хлористый, агар, теллурит калия - 2%-ный раствор и вода дистиллированная, отличающаяся тем, что питательная среда дополнительно содержит жидкую фазу, включающую гидролизат панкреатический рыбной муки, пептон ферментативный, натрий хлористый, экстракт дрожжевой, глюкозу, сыворотку крови крупного рогатого скота и воду дистиллированную при следующем соотношении компонентов жидкой фазы на каждый литр воды дистиллированной, г:
| гидролизат панкреатический рыбной муки | 8,0-9,0 |
| пептон ферментативный | 8,0-9,0 |
| натрий хлористый | 4,0-4,5 |
| экстракт дрожжевой | 3,0-5,0 |
| глюкоза | 3,0-5,0 |
| сыворотка крови крупного рогатого скота | 80,0-100,0 мл, |
твердая фаза дополнительно содержит стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, экстракт дрожжевой и глюкозу при следующем соотношении компонентов твердой фазы на каждый литр воды дистиллированной, г:
| гидролизат панкреатический рыбной муки | 20,0-25,0 |
| стимулятор роста гемофильных микроорганизмов | 10,0-12,0 |
| натрий хлористый | 4,0-4,5 |
| экстракт дрожжевой | 3,0-5,0 |
| глюкоза | 3,0-5,0 |
| агар | 10,0-12,0 |
| теллурит калия - 2%-ный раствор | 13-15 мл |
