Днк-плазмиды, обладающие повышенной экспрессией и стабильностью
Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Раскрыта ДНК-плазмида для доставки и экспрессии представляющих интерес антигена, эпитопа, иммуногена, пептида или полипептида. ДНК-плазмида содержит кассету гена устойчивости к канамицину (KanaR), в которой модифицирован промотор KanaR. ДНК-плазмида обладает повышенной экспрессией и стабильностью. Также описаны композиция, содержащая такую ДНК-плазмиду, и способы стимуляции иммунного ответа у животного и индуцирования иммунного ответа у животного с использованием композиции, содержащей ДНК-плазмиду. Изобретение может быть использовано для получения эффективных ДНК-вакцин. 4 н. и 14 з.п. ф-лы, 21 ил., 3 табл., 2 пр.
Включение в описание изобретения сведений путем ссылки
Данная заявка включает в качестве ссылки предварительную заявку США №60/795324, поданную 27 апреля 2006. Все документы, цитируемые или упомянутые здесь ("цитируемые здесь документы"), и все документы, цитируемые или упомянутые в цитируемых здесь документах, вместе с инструкциями производителей, описаниями, спецификациями на продукт и технологическими картами для любых продуктов, упомянутых здесь или в любом документе, включенном здесь посредством ссылки, включены в данную заявку посредством ссылки и могут быть использованы для осуществления изобретения.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение, в целом, относится к ДНК-вакцинам и способам их применения. В особенности, настоящее изобретение относится к ДНК-плазмидам с повышенной экспрессией и стабильностью, пригодных для ДНК-вакцин.
Предшествующий уровень техники
ДНК-вакцины, иначе называемые генетическими, плазмидными или полинуклеотидными вакцинами, представляют относительно простую и экономичную возможность переноса генов для иммунизации против антигенов. Низкая токсичность ДНК-вакцин стимулирует их дальнейшую разработку и дополнительные стратегии по улучшению эффективности этого подхода в клинической практике (рассмотрено в Shaw & Strong, Front Biosci. 2006 Jan 1; 11:1189-98). ДНК-вакцинация может обойти главные недостатки традиционных вакцин и имеет потенциал вакцин будущего. Однако коммерческий продукт все еще не вышел на рынок. Одним возможным объяснением этому может быть техническая неудача в индуцировании эффективной иммунной реакции у людей, при этом безопасность также может быть основной проблемой (опубликовано в Glenting & Wessels, Microb Cell Fact. 2005 Sep 6; 4:26).
Плазмида pVR1020 или 1012 (VICAL Inc.; Luke C. et al., Journal of Infectious Diseases, 1997, 175, 91-97; Hartikka J. et al., Human Gene Therapy, 1996, 7, 1205-1217, см, напр., Патенты США №5846946; 6451769; 6586409 и 6875748) представляет собой ДНК-плазмидный вектор, применяемый для вставки полинуклеотидной последовательности. Плазмиду pVR1020 получают из pVR1012 и она содержит сигнальную последовательность tPA человека. Найдены дополнительные ДНК-плазмиды, описанные, например, в Патентах США №6852705; 6818628; 6586412; 6576243; 6558674; 6464984; 6451770; 6376473 и 6221362. Однако для ДНК-вакцинации у плазмид, основанных на pVR1012, имеются недостатки, такие как нестабильность плазмид и гетерогенность в числе копий.
Соответственно, существует потребность в эффективной ДНК-вакцине, в особенности, обеспечивающей экспрессию представляющего интерес антигена-мишени, эпитопа, иммуногена, пептида или полипептида в количестве, достаточном для установления защитной реакции.
Цитирование или идентификация любого документа в данной заявке не является признанием, что такой документ является прототипом настоящего изобретения.
Сущность изобретения
Изобретение основано, частично, на экспериментальном наблюдении, что вставка транспозона между промотором гена устойчивости к канамицину и сайтом инициации трансляции аннулирует устойчивость к канамицину и при этом неожиданно способствует повышающей репликации плазмидной ДНК. Другими словами, выход мутантной плазмиды (содержащей транспозон) был в три раза выше по сравнению с немутантной плазмидой. На основании чего предположили, что эффективность экспрессии гена устойчивости к канамицину ("KanaR") оказывает влияние на репликацию плазмидной ДНК в бактериях, т.е. сниженная экспрессия гена устойчивости к канамицину способствует повышению скорости репликации плазмидной ДНК. В особенности, высокая скорость экспрессии KanaR может представлять сильную метаболическую нагрузку, которая нарушает оптимальную скорость репликации плазмидной ДНК и/или транскрипция гена KanaR нарушает сайт инициации репликации (ориджин репликации, ORI).
Настоящее изобретение относится к ДНК-плазмиде, которая может содержать ген устойчивости к канамицину ("KanaR"), в которой ген устойчивости к канамицину имеет наименее эффективный промотор для экспрессии KanaR и/или менее эффективный стартовый кодон. В преимущественном воплощении промотор KanaR является промотором Р1. Получаемая ДНК-плазмида обеспечивает более высокие выходы плазмидной ДНК и более высокую стабильность плазмиды, предположительно благодаря пониженной экспрессии KanaR. Предпочтительно, ДНК-плазмида может быть pLL10 или pLL14.
Настоящее изобретение также относится к ДНК-плазмиде, которая может содержать ген устойчивости к канамицину, в котором транспозон вставлен между промотором KanaR и сайтом инициации трансляции, что приводит к пониженной экспрессии KanaR. Получаемая ДНК-плазмида обеспечивает более высокие выходы плазмидной ДНК и более высокую стабильность плазмиды, предположительно благодаря пониженной экспрессии KanaR.
Настоящее изобретение охватывает составы для доставки и экспрессии антигена, эпитопа, иммуногена, пептида или полипептида, представляющего интерес, при этом состав может включать любые ДНК-плазмиды, описываемые здесь, и фармацевтически или ветеринарно подходящий носитель, наполнитель или эксципиент. В преимущественном воплощении носитель, наполнитель или эксципиент могут способствовать трансфекции и/или повышать стабильность вектора или белка. Предпочтительно, антиген, эпитоп, иммуноген, пептид или полипептид, представляющий интерес, может быть получен из птичьего, бычьего, собачьего, лошадиного, кошачьего или свиного вируса или патогена.
Изобретение дополнительно обеспечивает способы стимуляции иммунного ответа у животных, которые могут включать введение эффективного количества составов, здесь описываемых, в клетки животного и экспрессирование антигена, эпитопа, иммуногена, пептида или полипептида, представляющего интерес, в клетках. Изобретение также обеспечивает способы стимуляции и поддержания иммунного ответа у животного, которые могут включать введение эффективного количества составов, здесь описываемых, в клетки животного и экспрессирование антигена, эпитопа, иммуногена, пептида или полипептида, представляющего интерес, в клетках. Предпочтительно, животным может быть птица, бык, собака, лошадь, кошка или свинья.
Изобретение также охватывает наборы для осуществления любого из вышеописанных способов, которые могут включать ДНК-плазмиду или здесь описываемые составы вместе с инструкциями для осуществления способов стимуляции или установления иммунного ответа у животного.
Следует отметить, что в данном описании, в частности в формуле изобретения и/или параграфах, такие термины как «включает», «включенный», «включающий» и им подобные, могут иметь значение, придаваемое таким терминам в патентном законодательстве США, например, они могут означать «включает в себя», «заключает в себе» и т.п.; а такие термины, как «состоящий в основном из» и «состоит в основном из», имеют значение, приписываемое им в патентном законодательстве США, например, они разрешают элементы, не указанные явным образом, но исключают элементы, входящие в предшествующий уровень техники или затрагивающие фундаментальную или новую особенность изобретения
Эти и другие воплощения изобретения раскрыты в или вытекают из и охвачены нижеследующим подробным описанием.
Краткое описание чертежей
Следующее подробное описание, представленное в виде примера, но не предназначенное для ограничения изобретения только описываемыми специфичными воплощениями, может быть лучше понято в сочетании с прилагаемыми чертежами, в которых:
Фиг.1 иллюстрирует три потенциальных промотора KanaR экспрессионной кассеты, как показано в Примере 1: P1 (SEQ ID NO:1), Р2 (SEQ ID NO:2) и Р3 (SEQ ID NO:3). Р2 и Р3 частично совпадают;
Фиг.2 иллюстрирует схему pVR1012, демонстрируя направление транскрипции KanaR и положение ориджин репликации, ORI;
Фиг.3 илюстрирует, как кассету KanaR плазмиды pVR1012 в Примере 1 клонируют в мутагенный вектор pALTER-1;
Фиг.4 иллюстрирует, как сайт рестрикции PacI в Примере 1 был введен в прямом направлении ORF KanaR, получая пазмиду pLL2, как сайт рестрикции SwaI был введен в обратном направлении, как сайт рестрикции RsrII был введен в прямом направлении, получая pLL4, и, в конечном итоге, стартовый кодон трансляции ATG был мутирован с TTG, получая pLL6;
Фиг.5 иллюстрирует, как мутированная кассета KanaR pLL4 в Примере 1 была клонирована в плазмиду pVR1012, получая pLL7;
Фиг.6 иллюстрирует, как терминаторная последовательность rrnB, идентифицированная в Примере 1, была клонирована в плазмиду pLL7 с использованием PCR из pSB062 и последующим расщеплением PacI RsrII с формированием pLL9;
Фиг.7 иллюстрирует клонирование терминаторной последовательности speA, идентифицированной в Примере 1, в плазмиду pLL7 путем отжига синтетических олигонуклеотидов и расщепления Pad RsrII с формированием pLL11;
Фиг.8 иллюстрирует, как мутированная последовательность инициации трансляции плазмиды pLL6 была клонирована в pLL9 посредством расщепления Msd Pad с формированием pLL10;
Фиг.9 иллюстрирует, как промоторные последовательности Р2/Р3 (SEQ ID NOS: 2-3) вместе с P1 (SEQ ID NO:1), P1 (SEQ ID NO:1) и P2/P3 (SEQ ID NOS: 2-3), которые были идентифицированы в Примере 1, были клонированы с использованием URS11-URS12 PCR, URS13-URS12 PCR и URS11-URS14 PCR соответственно;
Фиг.10 иллюстрирует, как промоторная последовательность Р2/Р3 (SEQ ID NOS: 2-3) вместе с P1 (SEQ ID NO:1) была клонирована в плазмиду pLL9 с формированием pLL13;
Фиг.11 иллюстрирует, как промоторная последовательность P1 (SEQ ID NO:1) была клонирована в плазмиду pLL9 с формированием pLL14;
Фиг.12 иллюстрирует, как промоторная последовательность Р2/Р3 (SEQ ID NOS: 2-3) была клонирована в плазмиду pLL9 с формированием pLL15;
Фиг.13 иллюстрирует, как промоторная последовательность P1 (SEQ ID NO:1) была клонирована в плазмиду pLL7 с формированием pLL16;
Фиг.14 иллюстрирует некоторые производные pVR1012, полученные с различными пригодными промоторами и терминаторами, идентифицированные в Примере 1. Конструкции pLL13, pLL14, pLL15 и pLL16 имеют делеции в 192 пар оснований между промотором CMV и промотором Капа P1 (SEQ ID NO:1);
Фиг.15 иллюстрирует схематическое изображение производных pVR1012, демонстрируя участок в 192 п.о., удаленный в конструкциях pLL13-pLL16 Примера 1;
Фиг.16 иллюстрирует два графика способности бактериальных колоний к устойчивости в отношении увеличенных концентраций канамицина (Капа), в соответствии с Примером 1, при 50 мкл и 100 мкл разведениях бактериальных суспензий, соответственно;
Фиг.17 иллюстрирует графики плазмидных выходов, полученных при выращивании в лабораторных условиях. Бактериальные колонии Примера 1 были выращены в жидкой среде LB с Kana 100 мкг/мл;
Фиг.18 иллюстрирует плазмидные выходы, выраженные как отношение к плазмидному выходу pLL14 (базисная линия = 100). Эксперимент 1 иллюстрирует 8-15 клонов на конструкцию, Эксперимент 2 иллюстрирует 6 клонов для pVR1012, 2 для pLL14 и 25 для pLL16 и Эксперимент 3 (25 клонов для pVR1012, рРВ662 и pLL14, и 20 для pLL9);
Фиг.19 иллюстрирует графики плазмидных выходов, полученные при выращивании в лабораторных условиях. Бактериальные колонии были выращены в среде EGLI. Плазмидные выходы выражали как отношение к парентеральному плазмидному выходу pVR1012 (базисная линия = 100) и
Фиг.20, 21 иллюстрирует индивидуальный плазмидный выход (указывающий на среднюю конструкцию pVR1012), показывающий гетерогенность клонов. (*: мутированная плазмида) и иллюстрирует графики плазмидных выходов трех разных клонов конструкции, адаптированных EGLI, согласно Примеру 1. Вариабельность выражается как индекс, где первый клон считается 100% эталоном.
Подробное описание изобретния
Изобретение основано, частично, на экспериментальном наблюдении, что вставка транспозона между промотором гена устойчивости к канамицину и сайтом инициации трансляции аннулирует устойчивость к канамицину и при этом неожиданно способствует ускорению репликации плазмидной ДНК. Другими словами, выход мутантной плазмиды (содержащей транспозон) был в три раза выше по сравнению с немутантной плазмидой. На основании чего предположили, что эффективность экспрессии гена устойчивости к канамицину ("KanaR") оказывает влияние на репликацию плазмидной ДНК в бактериях, т.е. сниженная экспрессия гена устойчивости к канамицину способствует повышению скорости репликации плазмидной ДНК. В особенности, относительно лимитирования питательными веществами высокая скорость экспрессии KanaR может представлять сильную метаболическую нагрузку, которая нарушает оптимальную скорость репликации плазмидной ДНК и/или транскрипция гена KanaR нарушает ориджин репликации (ORI).
Изобретение охватывает любую предполагаемую ДНК-плазмиду, в которой снижена экспрессия KanaR, что приводит к увеличению плазмидных выходов и более высокой стабильности плазмиды по сравнению, например, с плазмидой pVR1012 или ее производным, без сниженной экспрессии KanaR.
Настоящее изобретение относится к ДНК-плазмиде, которая может включать KanaR, в которой ген устойчивости к канамицину включает менее эффективный промотор для экспрессии KanaR и/или менее эффективный стартовый кодон. В преимущественном воплощении, промотор KanaR представляет собой промотор Р1 и стартовым кодоном является ATG. Получаемая ДНК-плазмида обеспечивает более высокие плазмидные выходы и более высокую стабильность плазмиды, предположительно благодаря сниженной экспрессии KanaR. Предпочтительно, ДНК-плазмидой может быть pLL10 или pLL14.
Настоящее изобретение также относится к ДНК-плазмиде, которая может включать ген устойчивости к канамицину, в котором транспозон вставлен между промотором KanaR и участком инициации трансляции, что обеспечивает сниженную экспрессию KanaR. Получаемая ДНК-плазмида обеспечивает более высокие плазмидные выходы и более высокую стабильность плазмиды, предположительно благодаря сниженной экспрессии KanaR.
Экспрессионным вектором является плазмидный вектор или вектор ДНК-плазмиды, в частности, экспрессионный вектор in vivo. В специфичном, не ограничивающем примере, ДНК-плазмидный вектор содержит элементы плазмид pVR1020 или 1012 (VICAL Inc.; Luke C. et al., Journal of Infectious Diseases, 1997, 175, 91-97; Hartikka J. et al., Human Gene Therapy, 1996, 7, 1205-1217, см, напр., Патенты США №5846946; 6451769; 6586409 и 6875748). Плазмиду pVR1020 получают из pVR1012 и она содержит сигнальную последовательность tPA человека. В одном воплощении человеческая сигнальная последовательность tPA включает от М(1) аминокислоты до S(23) аминокислоты в Genbank под номером HUMTPA14. В другом не ограничивающем примере плазмида, применяемая в качестве вектора для вставки полинуклеотидной последовательности, может содержать сигнальную пептидную последовательность лошадиного IGF1 от М(24) аминокислоты до А(48) аминокислоты в Genbank под номером U28070. Дополнительную информацию о ДНК-плазмидах, которые могут приниматься во внимание или использоваться в практике, можно найти, например, в Патентах США №6852705; 6818628; 6586412; 6576243; 6558674; 6464984; 6451770; 6376473 и 6221362.
В другом воплощении плазмидой может быть любая плазмида с геном устойчивости к канамицину, включая, но не ограничиваясь, векторы Clontech: Living Colors pAcGFP1, Living Colors pAcGFP1-C1, Living Colors pAcGFP1-N1, pAmCyan1-C1, pAmCyan1-N1, pAsRed2-C1, pAsRed2-N1, pCMV-DsRed-Express, pDsRed2-1, pDsRed2-C1, pDsRed2-N1, pDsRed-Express-1, pDsRed-Express-C1, pDsRed-Express-N1, pDsRed-Monomer-C1, pDsRed-Monomer-N1, pHcRed1-1, pHcRed1-C1, pHcRed1-N1/1, pIRES2-DsRed2, pIRES2-DsRed-Express, pLPS-AcGFP1-N Acceptor, Proteasome Sensor, pTimer, pZsGreen1-1, pZsGreen1-C1, pZsGreen1-N1, pZsYellow1-C1 и pZsYellow1-N1; векторы Invitrogen: pCR3, pCR3.1-Uni, pCR1000 и pZErO-2.1, и векторы Stratagene; pCMV-3Tag, pBK-CMV Phagemid, ZAP Express, pCMV-Script, pCMV-Tag, PCR-Script pMClneo и pMClneo Poly А. Можно сослаться на патенты США №6,942,975, 6,887,702, 6,849,442, 6,846,970, 6,825,012, 6,806,399, 6,803,230, 6,790,607, 6,696,278, 6,667,150, 6,624,344, 6,620,990, 6,610,909, 6,585,976, 6,573,437, 6,570,067, 6,562,584, 6,528,703, 6,503,748, 6,475,731, 6,410,317, 6,410,314, 6,387,654, 6,376,744, 6,350,934, 6,303,383, 6,297,054, 6,284,541, 6,258,999, 6,255,560, 6,248,937, 6,235,518, 6,174,708, 6,127,171, 6,121,511, 6,117,651, 6,054,635, 6,037,524, 6,018,103, 5,994,625, 5,981,191, 5,981,182, 5,977,439, 5,925,544, 5,910,488, 5,866,404, 5,851,808, 5,851,804, 5,830,727, 5,824,877, 5,792,935, 5,783,394, 5,750,871, 5,733,753, 5,733,744, 5,731,179, 5,723,746, 5,716,803, 5,712,112, 5,705,361, 5,654,180, 5,599,670, 5,591,577, 5,589,623, 5,569,834, 5,567,599, 5,565,347, 5,504,005, 5,463,174, 5,460,952, 5,436,138, 5,416,250, 5,416,011, 5,378,618, 5,256,568, 5,169,755, 5,137,829, 5,053,335, 5,004,863, 4,935,340, 4,920,054, 4,795,855, 4,782,022, 4,771,002, 4,626,510 и 4,567,146.
Настоящее изобретение также охватывает плазмиды с генами устойчивости к другим антибиотикам в дополнении к устойчивости к канамицину, таким как, но не ограничиваясь, ампициллин, хлорамфеникол, неомицин и тетрациклин.
В одном воплощении плазмидой может быть любая плазмида с геном устойчивости к ампициллину, включая, но не ограничиваясь, векторы Clontech: Living Colors pAcGFP1, pAmCyan, pAsRed2, pbetaga1-Basic, pbetagal-Control, pBI Tet, pBI-G Tet, pBI-L Tet, pCMVbeta, pCMV-Myc & pCMV-HA, pDsRed2, pDsRed-Express, pDsRed-Monomer Vector, pGFP, pGFPuv, pHcRed1, pIRES, pIRESbleo3, pIRESneo3, pIRESpuro3, pLP-IRESneo Acceptor, pLP-LNCX Acceptor, pLP-TRE2 Acceptor, pPUR, pRevTet-Off, pRevTet-Off-IN, pRevTet-On, pSEAP2-Basic, pSEAP2-Control, pTet-Off, pTet-On, pTet-tTS, pTimer, pTimer-1, pTK-Hyg, pTRE2, pTRE2hyg, pTRE2hyg2-6xHN, pTRE2hyg2-HA, pTRE2hyg2-Myc, pTRE2pur, pTRE2pur-6xHN, pTRE2pur-HA, pTRE2pur-Myc, pTRE-6xHN, pTRE-HA, pTRE-Myc, pTRE-Tight, pTRE-Tight-DsRed2, pZsGreen и pZsYellow; векторы Invitrogen: p2Bac, p2Bac/CAT/CAT, pAc5.1/V5-His, pAc5.1/V5-His/LacZ, pBAD-TOPO, pBlueBac, pBlueBac/His, pBlueBac/His/CAT, pBlueBac2, pBlueBac3, pBlueBac4, pBlueBac4/CAT, pcDNA1/Amp, pcDNA3/CAT, pcDNAII, pCMVSport1, pCMVSport2, pCMVSport2.2, pCMVSport4, pCR3, pCR3.1-Uni, pCRBac, pCRT7/CT-LacZ, pCRT7/CT-TOPO, pCRT7/NT-E3, pCRT7/NT-TOPO, pDW232, pFastBac1, pMEP4, pMT/LacZ, pMT/V5-His-TOPO, pPIC3, pPIC3K, pRBK, pSL301, pSPORT1-CAT, pYesTrp2-RalGDS и pYesTrp2-RalGDS, и векторы Stratagene: PCR-Script, pBC Phagemid, pMClneo и pMClneo Poly A, pBlueScript II Phagemid и SuperCos I. Ссылка может быть дана также на Патенты США №6,987,006, 6,972,322, 6,916,611, 6,887,702, 6,803,230, 6,790,607, 6,706,524, 6,696,278, 6,667,150, 6,569,678, 6,562,584, 6,544,782, 6,521,449, 6,503,748, 6,486,134, 6,410,317, 6,410,314, 6,387,654, 6,376,192, 6,291,238, 6,255,071, 6,221,630, 6,140,087, 6,127,171, 6,025,193, 6,025,192, 6,010,875, 5,981,279, 5,981,182, 5,955,363, 5,925,544, 5,919,676, 5,912,153, 5,894,060, 5,877,400, 5,866,404, 5,851,808, 5,834,191, 5,830,727, 5,830,690, 5,786,162, 5,776,773, 5,773,697, 5,766,940, 5,733,753, 5,731,193, 5,716,803, 5,705,361, 5,691,155, 5,602,300, 5,527,691, 5,504,005, 5,470,729, 5,436,138, 5,434,065, 5,432,082, 5,378,618, 5,290,691, 5,264,354, 5,256,568, 5,256,546, 5,160,489, 5,151,364, 5,147,789, 5,143,836, 5,126,252, 5,093,251, 5,081,022, 4,997,767, 4,988,622, 4,935,364, 4,920,054, 4,889,806, 4,879,230, 4,876,202, 4,845,031, 4,808,519, 4,766,072, 4,752,574, 4,703,012, 4,634,678,487,835, 4,349,629 и 4,340,674.
В другом воплощении плазмидой может быть любая плазмида с геном устойчивости к хлорамфениколу, включая, но не ограничиваясь, векторы Clontech: pDNR-LacZ Donor Reporter, pDNR-SEAP Donor Reporter, pLP-AcGFP1-C Acceptor, pLP-BacPAK9 Acceptor, pLP-BacPAK9-6xHN Acceptor, pLP-CMV-HA Acceptor, pLP-CMV-Myc Acceptor, pLP-CMVneo Acceptor, pLP-GADT7 AD Acceptor, pLP-GBKT7 DNA-Acceptor, pLP-IRESneo Acceptor, pLP-LNCX Acceptor, pLP-PROTet-6xHN Acceptor, pLP-RevTRE Acceptor, pLPS-AcGFPl-N Acceptor и pLP-TRE2 Acceptor; векторы Invitrogen: pLysS и pSPORT1-CAT, и векторы Stratagene: pBC Phagemid и PCR-Script. Ссылку можно дать на патенты США №6,916,611, 6,900,010, 6,887,702, 6,884,576, 6,846,671, 6,803,230, 6,696,278, 6,673,537, 6,667,150, 6,562,584, 6,548,246, 6,503,748, 6,436,694, 6,420,110, 6,410,317, 6,410,314, 6,391,640, 6,387,654, 6,376,192, 6,331,527, 6,309,883, 6,309,830, 6,291,211, 6,255,071, 6,252,140, 6,221,630, 6,146,871, 6,127,171, 6,107,093, 6,083,750, 6,031,151, 6,025,192, 6,001,564, 5,994,132, 5,994,066, 5,981,182, 5,955,363, 5,932,479, 5,928,891, 5,925,544, 5,925,523, 5,908,747, 5,866,404, 5,851,808, 5,821,093, 5,766,940, 5,733,753, 5,728,571, 5,716,803, 5,707,830, 5,639,644, 5,591,577, 5,470,729, 5,437,988, 5,434,065, 5,256,568, 5,256,546, 5,053,335, 5,004,863, 4,868,111, 4,839,284, 4,752,574 и 4,711,849.
В другом воплощении плазмидой может быть любая плазмида с геном устойчивости к неомоцину, включая, но не ограничиваясь, векторы Clontech: pRevTet-Off Vector, pRevTet-Off-IN Vector, pIRES Vector, pIRESbleo3 Vector, pIREShyg3 Vector, pIRESneo3 Vector, pIRESpuro3 Vector, pLP-IRESneo Acceptor Vector, pTet-Off Vector, pTet-On Vector, pIRES2-DsRed-Express Vector, pLXIN Retroviral Vector, pIRES2-DsRed2 Vector, Proteasome Sensor Vector, pLXSN Retroviral Vector, pCMV-DsRed-Express Vector, Living Colors pAcGFP1-C1 Vector, pAmCyan1-C1 Vector, pAsRed2-C1 Vector, pDsRed2-C1 Vector, pDsRed-Express-C1 Vector, pDsRed-Monomer-C1 Vector, pHcRed1-C1 Vector, pZsGreen1-C1 Vector, pZsYellow1-C1 Vector, Living Colors pAcGFP1 Vector, pDsRed2-1 Vector, pDsRed-Express-1 Vector, pHcRed1-1 Vector, pTimer Vector, pZsGreen1-1 Vector, pQCXIX Retroviral Vector, LRCX Retroviral Vector Set, pLNCX2 Retroviral Vector, pLP-LNCX Acceptor Vector, pQCXIN Retroviral Vector, Living Colors pAcGFP1-N1 Vector, pAmCyan1-N1 Vector, pAsRed2-N1 Vector, pDsRed2-N1 Vector, pDsRed-Express-N1 Vector, pDsRed-Monomer-N1 Vector, pHcRed1-N1/1 Vector, pLPS-AcGFP1-N Acceptor Vector, pZsGreen1-N1 Vector, pZsYellow1-N1 Vector и VP16 Minimal Domain Vector Set; векторы Invitrogen: pcDNA1/Neo, pcDNA3/CAT (замещенные на pcDNA3.1/CAT), pCR3 (замещенные на pCR3.1), pCR3.1-Uni и pRc/CMV, и векторы Stratagene: pCMV-3Tag Vectors, pCMV-Script Vector, SuperCos I Vector, ZAP Express Vector, pCMV-Tag Vectors, pMClneo и pMClneo Poly A Vectors, PCR-Script Cloning Kits, Vitality hrGFP Mammalian Expression Vector, pBK-CMV Phagemid Vector и Lambda ZAP-CMV Vector. Ссылку можно также дать на патенты США №7,026,525, 6,942,995, 6,905,818, 6,815,185, 6,806,399, 6,787,687, 6,747,189, 6,673,602, 6,673,537, 6,667,150, 6,624,344, 6,620,990, 6,440,444, 6,429,357, 6,391,633, 6,376,192, 6,316,253, 6,294,187, 6,291,211, 6,255,560, 6,252,140, 6,248,937, 6,232,526, 6,221,630, 6,210,930, 6,207,879, 6,194,636, 6,114,146, 6,096,717, 6,071,512, 5,998,144, 5,985,560, 5,969,211, 5,955,363, 5,955,319, 5,939,288, 5,902,577, 5,894,060, 5,891,634, 5,830,698, 5,807,742, 5,750,871, 5,733,779, 5,665,565, 5,639,663, 5,614,381, 5,583,278, 5,470,726, 5,463,174, 5,416,011, 5,352,605, 5,278,056, 5,256,568, 5,149,636, 5,017,478, 4,957,865, 4,935,340, 4,839,284, 4,792,520, 4,766,066, 4,752,574, 4,740,463, 4,663,285, 4,536,475, 4,513,086, 4,513,085, 4,503,155, 4,468,462, 4,460,688, 4,430,434 и 4,416,994.
В другом воплощении плазмидой может быть любая плазмида с геном устойчивости к тетрациклину, включая, но не ограничиваясь, векторы Clontech: pRevTet-Off Vector, pRevTet-On Vector, pRevTet-Off-IN Vector, Creator-Compatible PROTet 6xHN Bacterial Expression System, PROTet 6xHN Bacterial Expression System, pTRE-Tight Vector, pTet-Off Vector, pTet-On Vector, Tet-Off Gene Expression System, Tet-On Gene Expression System, Adeno-X Tet-Off Expression System 1, Adeno-X Tet-On Expression System 1, Adeno-X Viral DNA (расщепленный PI-Sce I/I-Ceu I), Creator-Compatible RevTet-Off Retroviral Gene Expression System, Creator-Compatible RevTet-On Retroviral Gene Expression System, pLP-RevTRE Acceptor Vector, pRevTRE Vector, RevTet-Off System, RevTet-On System, pBI Tet Vector, pBI-G Tet Vector, pBI-L Tet Vector, pTet-tTS Vector, pLP-TRE2 Acceptor Vector, pTRE2 Vector, pTRE2hyg Vector, pTRE2pur Vector, Tet System Approved FBS, US-Sourced (гамма-облученные), pTRE-Tight-DsRed2 Vector и VP 16 Minimal Domain Vector Set, и векторы Invitrogen: pTet-tTak и pTet-Splice. Сослаться можно также на патенты США №6,924,101, 6,905,836, 6,777,229, 6,759,236, 6,699,702, 6,699,692, 6,696,278, 6,680,301, 6,673,537, 6,667,150, 6,642,052, 6,620,618, 6,613,528, 6,544,782, 6,541,003, 6,503,748, 6,482,636, 6,440,741, 6,436,694, 6,410,317, 6,392,121, 6,376,192, 6,309,883, 6,303,383, 6,265,562, 6,261,807, 6,221,630, 6,218,181, 6,136,536, 6,127,171, 6,080,575, 6,033,856, 6,022,731, 6,010,875, 5,958,680, 5,955,363, 5,891,718, 5,869,035, 5,866,410, 5,858,762, 5,851,796, 5,849,576, 5,840,521, 5,830,727, 5,830,690, 5,786,162, 5,766,940, 5,637,503, 5,593,860, 5,585,254, 5,527,691, 5,516,669, 5,508,176, 5,384,259, 5,378,618, 5,348,886, 5,290,691, 5,256,568, 5,256,546, 5,166,070, 5,158,891, 5,151,364, 5,147,789, 5,053,335, 4,983,522, 4,879,230, 4,876,202, 4,874,703, 4,778,761, 4,752,574, 4,703,012, 4,680,260, 4,663,285, 4,634,677, 4,631,259, 4,581,335, 4,374,200 и 4,349,629.
Термин «плазмида» охватывает любую единицу транскрипции ДНК (транскриптон), содержащую полинуклеотид изобретения и элементы, необходимые для его экспрессии in vivo в клетке или клетках желаемого хозяина или мишени; и в этой связи примечательно, что сверхскрученная или несверхскрученная кольцевая плазмида, а также плазмида линейной формы входят в объем изобретения.
Каждая плазмида включает или состоит преимущественно из, в дополнение к полинуклеотиду, кодирующему антиген, эпитоп или иммуноген, функционально слитой с гетерологичной пептидной последовательностью, вариант, аналог или фрагмент, функционально связанный с промотором, или находится под контролем промотора или зависим от промотора. В общем, преимущественным является применение сильного промотора, функционального в эукариотических клетках. Предпочтительным сильным промотором является ранний промотор цитомегаловируса (CMV-IE), взятый от человека или от мыши, или, при необходимости, от других животных, таких как крыса или морская свинка. Промотор CMV-IE может включать конкретную промоторную часть, которая может или не может быть связана с энхансерной частью. Ссылку можно дать на ЕР-А-260 148, ЕР-А-323 597, патенты США №5,168,062, 5,385,839 и 4,968,615, а также на заявку РСТ WO 87/03905. Промотором CMV-IE является предпочтительно CMV-IE человека (Boshart М. et al, Cell., 1985, 41, 521-530) или CMV-IE крысы.
В более общих понятиях, промотор имеет как вирусное, так и клеточное происхождение. Сильным вирусным промотором, кроме CMV-IE, который может быть пригодным для применения в рамках изобретения, является ранний или поздний промотор вируса SV40 или промотор LTR вируса саркомы Рауса. Сильным клеточным промотором, который может быть пригодным для применения в рамках изобретения, является промотор гена цитоскелета, такой как, напр., промотор десмина (Kwissa М. et al., Vaccine, 2000, 18, 2337-2344) или промотор актина (Miyazaki J. et al., Gene, 1989, 79, 269-277).
Функциональные субфрагменты этих промоторов, т.е. части этих промоторов, которые сохраняют адекватную промоторную активность, включены в настоящее изобретение, напр., усеченные промоторы CMV-IE, описанные в заявке РСТ WO 98/00166 или патенте США №6,156,567, могут практически использоваться в изобретении. Промотор в практическом использовании изобретения, следовательно, включает производные и субфрагменты полноразмерного промотора, которые сохраняют достаточную промоторную активность и вследствие чего функционируют как промотор, при этом, предпочтительно, промоторная активность практически аналогична активности истинного или полноразмерного промотора, из которого производное или субфрагмент получен, напр., активность усеченных промоторов, описанных в патенте США №6,156,567, сходна с активностью полноразмерных промоторов CMV-IE. Таким образом, CMV-IE промотор, в практическом применении изобретения, может включать или состоять преимущественно из или состоять из промоторной части полноразмерного промотора и/или энхансерной части полноразмерного промотора, а также из производных и субфрагментов.
Предпочтительно, плазмиды включают или состоят преимущественно из других элементов, контролирующих экспрессию. В особенности предпочтительным является включение стабилизирующей последовательности(ей), напр., интронной последовательности(ей), предпочтительно первого интрона hCMV-IE (заявка РСТ WO 89/01036), интрона II гена β-глобина кролика (van Ooyen et al., Science, 1979, 206, 337-344).
Относительно сигнала полиаденилирования (polyA) для плазмид и вирусных векторов, кроме поксвирусов, применение может в большей степени затрагивать сигнал poly(A) гена бычьего гормона роста (bGH) (см. Патент США №5,122,458), или сигнал poly(A) гена кроличьего β-глобина или сигнал poly(A) вируса SV40.
Изобретение обеспечивает экспрессию любого пептида-мишени или полипетида, предпочтительно антигена, эпитопа, иммуногена, пептида или полипептида, представляющего интерес, посредством ДНК-плазмиды настоящего изобретения. Изобретение предполагает экспрессию любого антигена, эпитопа, иммуногена, пептида или полипептида, представляющего интерес, в ДНК-плазмидах, описываемых здесь. ДНК-плазмиды могут экспрессировать один или более антигенов, эпитопов или иммуногенов, представляющих интерес.
В преимущественном воплощении, антиген, эпитоп, иммуноген, пептид или полипептид получают из птичьего, бычьего, собачьего, лошадиного, кошачьего или свиного вируса или патогена. В другом воплощении, антиген, эпитоп, иммуноген, пептид или полипептид может быть получен из вируса Западного Нила. В другом воплощении антиген, эпитоп, иммуноген, пептид или полипептид может быть получен из вируса или патогена человека.
Птичьи антигены, эпитопы или иммуногены изобретения могут быть получены из вируса болезни Марека (MDV) (напр., серотипов 1 и 2, предпочтительно 1), вируса псевдочумы птиц (NDV), вируса болезни Гамборо или вируса инфекционного бурсита птиц (IBDV), вируса инфекционного бронхита (IBV), вируса инфекционной анемии или вируса анемии цыплят (CAV), вируса инфекционного ларинготрахеита (ILTV), вируса энцефаломиелита или вируса энцефаломиелита птиц (AEV или вируса лейкоза птиц ALV), вируса геморрагического энтерита индюшек (HEV), пневмовируса (TRTV), вируса птичьего гриппа, вируса птичьего гидроперикардита, птичьих реовирусов, Escherichia coli, Mycoplasma gallinarum, Mycoplasma gallisepticum, Haemophilus avium, Pasteurella gallinarum, Pasteurella multocida gallicida и их смесей. Предпочтительно, для MDV иммуногеном предпочтительно является gB и/или gD, напр., gB и gD, для NDV иммуногеном является предпочтительно HN и/или F, напр., HN и F; для IBDV иммуногеном предпочтительно является VP2; для IBV иммуногеном является предпочтительно S (более предпочтительно S1) и/или М и/или N, напр., S (или S1) и М и/или N; для CAV иммуногеном является предпочтительно VP1 и/или VP2; для ILTV иммуногеном является предпочтительно gB и/или gD; для AEV иммуногеном предпочтительно является env и/или gag/pro, напр., env и gag/pro или gag/pro; для HEV иммуногеном является предпочтительно белок 100 К и/или гексон; для TRTV иммуногеном является предпочтительно F и/или G, и для птичьей чумы иммуногеном является предпочтительно НА и/или N и/или NP, напр., НА и N и/или NP.
Бычьи антигены, эпитопы или иммуногены согласно изобретению могут быть получены из вируса BHV-1, BRV, bPI-3 и/или BCV или бычьего патогена, выбранного из группы, включающей, но не ограничиваясь, бычий респираторно-синцитиальный вирус и вирус диареи крупного рогатого скота. Иммуногенами BRSV могут быть BRSV F или G или N, такие как BRSV F и/или G или N и/или G. BHV-1-иммуногенами могут быть gB и/или gC и/или gD. BVDV-иммуногенами могут быть белок ЕО (gp48) и/или белок Е2 (gp53). BVDV может быть типом 1 и/или типом 2. bPI-3-иммуногенами могут быть bPI-3 F и/или HN. См. также патенты США №6,451,770, 6,376,473, 6,224,878 относительно иммуногенов бычьих патогенов и молекул нуклеиновых кислот, кодирующих их, и конструкций, которые их экспрессируют.
Собачьи антигены, эпитопы или иммуногены согласно изобретению могут быть получены из вируса цистицеркоза, вируса собачьей чумы (CDV), вируса собачьего парагриппа 2 типа (CPI-2), собачьего герпесвируса 1 типа (CHV-1), вируса бешенства (рабдовирус), собачьего парвовируса (CPV), собачьего коронавируса (CCV), собачьего аденовируса, Borrelia burgdorferi, Leptospira и их смесей. Предпочтительно, для CDV иммуногеном является предпочтительно F и/или НА (см. также патенты США №6,309,647, 5,756,102 относительно иммуногенов CDV и конструкций); для CPV иммуногеном является предпочтительно VP2; для CCV иммуногеном является предпочтительно S и/или М; для CHV-1 иммуногеном является предпочтительно gB и/или gC и/или gD (см. также патенты США №5,688,920, 5,529,780, regarding иммуногенов CHV и конструкций); для вируса бешенства иммуногеном является предпочтительно G (см. также патент США №5,843,456 относительно комбинированных композиций против бешенства); для Borrelia burgdorferi иммуногеном является предпочтительно OspA (см. также патент США №6,368,603 относительно комбинированных композиций OspA).
Лошадиные антигены, эпитопы или иммуногены согласно изобретению могут быть получены из вируса EHV-1 и/или EHV-4 или другого лошадиного патогена, выбранного из группы, включающей, но не ограничиваясь, вирус конского гриппа (EIV), вирус восточного энцефалита (EEV), вирус западного энцефалита (WEV), вирус венесуэльского энцефалита (VEV), агент болезни Лайма, Borrelia burgdorferi, Clostridium tetani, вирус лошадиного артрита (EAV) и вирус бешенства. Антигенами, эпитопами или иммуногенами могут быть гликопротеины EHV, такие как gB, gD, gB+gD, gC и gE, для EIV иммуногеном является предпочтительно НА, NP и/или N; для вирусов энцефалита иммуногеном является предпочтительно С и/или Е1 и/или Е2; и для Clostridium tetani иммуногеном являются все части субъединицы С тетанического токсина. Ссылки можно дать на Патенты США №6,395,283, 6,248,333, 5,338,683, 6,183,750 или иммуногены лошадиных патогенов и молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие их, и конструкции, экспрессирующие их.
Кошачьи антигены, эпитопы или иммуногены согласно изобретение могут быть получены из кошачьего герпесвируса 1 типа (FHV-1), кошачьего кальцивируса (FCV), вируса бешенства (рабдовирус), кошачьего парвовируса (FPV), вируса кошачьего инфекционного перитонита (FIPV), вируса кошачьей лейкемии (FeLV), вируса кошачьего иммунодефицита (FIV), Chlamydia и их смесей. Предпочтительно, для FeLV иммуногеном является предпочтительно env и/или gag и/или pol, напр., gag/pol; для FPV иммуногеном является предпочтительно VP2; для FIPV иммуногеном является предпочтительно S и/или М и/или N, напр., S и М и/или N (см. также патенты США №6,348,196 и 5,858,373 и их иммуногены и конструкции); для FHV иммуногеном является предпочтительно gB и/или gC и/или gD, напр., gB и gC и/или gD (см. также патенты США №5,338,683, 6,183,750; для герпесвирусных иммуногенов и конструкций, экспрессирующих их); для FCV иммуногеном является предпочтительно С; для FIV иммуногеном является предпочтительно env и/или gag и/или pro, напр., gag/pro, env или env и gag/pro (см. также иммуногены и конструкции, рассматриваемые в Tartaglia et al., патентной заявке США №08/746,668, поданной 14 ноября 1996); для вируса бешенства иммуногеном является предпочтительно G.
Свиные антигены, эпитопы или иммуногены согласно изобретению могут быть получены из вирусу PRRS и/или свиного патогенна, выбранного из группы, включающей, но не ограничиваясь, вирус псевдобешенства, вируса гриппа свиней, свиного парвовируса, вируса инфекционного гастроэнтерита (коронавирус), свиного цирковируса, такого как свиной цирковирус 2 типа, ротавируса, свиного аденовируса 3 типа, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Bordetella bronchiseptica, Clostridium spp., Salmonella spp., Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Mycoplasma hyopneumoniae и Actinobacillus pleuropneumoniae. Антигены, эпитопы или иммуногены свиных патогенов могут включать gB псевдовируса бешенства, gC псевдовируса бешенства, gD псевдовируса бешенства, НА свиного гриппа, NA свиного гриппа, NP свиного гриппа, ORF4 вируса репродуктивно-респираторный синдром свиней, ORF7 вируса репродуктивно-респираторный синдром свиней, ORF5 PRRSV, ORF3 PRRSV, ORF6 PRRSV, открытые рамки считывания 5 (ORF5) и 6 (ORF6) PRRSV, открытые рамки считывания 5 (ORF5) и 3 (ORP3) и 6 (ORF6) PRRSV, El вируса холеры свиней, ген Е2 вируса холеры свиней, VP2 парвовируса, ORF1 свиного цирковируса 2 типа или ORF2 свиного цирковируса 2 типа. Ссылки приводятся на патенты США №6,517,843, 6,497,883, 6,391,314, 6,379,676, 6,217,883, 6,207,165 и публикацию патента США №2003003112 и WO 99/53047, WO 99/08706, WO 01/83737 и WO 00/47756 или иммуногены свиных патогенов, молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие их, и конструкции, экспрессирующие их.
ДНК-плазмиды настоящего изобретения могут экспрессировать один или более полинуклеотидов вируса Западного Нила ("WNV"), кодирующих Е, prM, М или комбинации или их полипротеины (напр., Е или Е и prM или Е и М или Е и prM и М или полипртеин Е-prM-М или полипротеин prM-Е или полипротеин М-Е или, по меньшей мере, их эпитоп). Согласно воплощению изобретения другой вектор или векторы в препарате включает, состоит преимущественно из или состоит из полинуклеотида, который кодирует, и при соответствующих условиях вектор экспрессирует один или более других протеинов вируса WN, напр. prM, М, prM-М или его эпитоп.
В настоящем изобретении термин «антиген» или «иммуноген» означает вещество, вызывающее специфический иммунный ответ у животного-хозяина. Антиген может включать целый организм, убитый, ослабленный или живой; субъединицу или часть организма; рекомбинантный вектор, содержащий вставку с иммуногенными свойствами; часть или фрагмент ДНК, способный вызывать иммунный ответ после презентации животному-хозяину; белок, полипептид, пептид, эпитоп, гаптен или любую их комбинацию. Альтернативно, иммуноген или антиген может включать токсин или антитоксин.
Термин "иммуногенный белок или пептид" в используемом здесь значении также включает пептиды и полипептиды, которые иммунологически активны в том смысле, что однажды введенные в хозяина они способны индуцировать иммунный ответ гуморального и/или клеточного типа, направленного против белка. Предпочтительно белковый фрагмент представляет собой фрагмент, который обладает практически такой же иммунологической активностью, что и общий белок. Таким образом, белковый фрагмент согласно изобретению включает или состоит преимущественно из или состоит из, по меньшей мере, одного эпитопа или антигенной детерминанты. Термин эпитоп относится к участку белка, способному индуцировать иммунную реакцию гуморального типа (В-клетки) и/или клеточного типа (Т-клетки).
Термин "иммуногенный белок или пептид" дополнительно предполагает делеции, присоединения и замены в последовательности, поскольку функции полипептида заключаются в продуцировании иммунологической реакции, как здесь определено. В этой связи особенно предпочтительные замены, в целом, будут консервативными по природе, т.е. такими заменами, которые происходят в семействе аминокислот. Например, аминокислоты обычно подразделяют на четыре семейства: (1) кислотные - аспартат и глутамат; (2) основные - лизин, аргинин, гистидн; (3) неполярные - аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные - глицин, аспарагин, глутамин, цистин, серии, треонин, тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда классифицируют как ароматические аминокислоты. Было корректно предсказано, что изолированная замена лейцина на изолейцин или валин или наоборот; аспартата на глутамат или наоборот; треонина на серии или наоборот; или аналогичная консервативная замена аминокислоты на структурно родственную аминокислоту не оказывает основной эффект на биологическую активность. Белки, имеющие практически такую же аминокислотную последовательность, что и исходная молекула, но обладающие минорными заменами в аминокислотной последовательности, которые практически не влияют на иммуногенность белка, находятся тем самым в рамках определения исходного полипептида.
Термин "эпитоп" относится к участку на антигене или гаптене, на который отвечают специфичные В-клетки и/или Т-клетки. Термин также используется взаимозаменяюще с "антигенной детерминантой" или "сайтом антигенной детерминанты". Антитела, которые распознают такой эпитоп, могут быть идентифицированы с помощью иммунологического анализа, показывая способность одного антитела блокировать связывание другого антитела с антигеном-мишенью.
"Иммунологический ответ" на композицию или вакцину представляет развитие в хозяине клеточного и/или антителоопосредованного иммунного ответа на композицию или вакцину, представяющую интерес. Обычно "иммунологический ответ" включает, но не ограничивается, один или более следующих эффектов: продукцию антител, В-клеток, Т-хелперов и/или цитотоксических Т-клеток, направленных специфично на антиген, или антигены, включенные в композицию или вакцину, представляющую интерес. Предпочтительно, хозяин будет проявлять как терапевтический, так и защитный иммунологический ответ, так что устойчивость к новой инфекции будет повышена и/или клиническая тяжесть заболевания снижена. Такая защита будет заключаться как в снижении, так и в отсутствии симптомов, проявляющихся у инфицированного хозяина, более быстром по времени периодом восстановления и/или снижении титра вируса в инфицированном хозяине.
Термины "иммуногенный" белок и полипептид в используемом здесь значении также относится к аминокислотной последовательности, которая вызывает иммунологический ответ, как описывалось выше. "Иммуногенный" белок или полипептид в используемом здесь значении включает полноразмерную последовательность белка, его аналоги или его иммуногенные фрагменты. Под "иммуногенным фрагментом" подразумевают фрагмент белка, который включает один или более эпитопов и, следовательно, вызывает иммунологический ответ, описанный выше. Такие фрагменты могут быть идентифицированы, используя любые способы картирования эпитопов, хорошо известных из уровня техники. См., напр., Epitope Mapping Protocols в Methods in Molecular Biology, Vol.66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, N.J. Например, линейные эпитопы могут быть определены, напр., посредством одновременного синтезирования большого количества пептидов на твердой подложке, причем пептидов, соответствующих части белковой молекулы, и взаимодействия пептидов с антителами, пока пептиды все еще прикреплены к подложкам. Такие способы известны из уровня техники и описываются, напр., в патенте США №4,708,871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715, все из которых включены здесь посредством ссылки в полном объеме. Аналогично, конформационные эпитопы без труда идентифицируют с помощью способов определения пространственной конформации аминокислот, таких как, напр., рентгеновская кристаллография и 2-мерный ядерно-магнитный резонанс. См., напр., Epitope Mapping Protocols, выше. Способы, в особенности применимые для протеинов Т. parva, в полной мере описаны в заявке PCT/US2004/022605, включенной здесь посредством ссылки в полном объеме.
Синтетические антигены также подпадают под определение, например, полиэпитопы, фланкированные эпитопы и другие рекомбинантные антигены. См., напр., Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781; Bergmann et al. (1996) J. Immunol. 157:3242-3249; Suhrbier, A. (1997) Immunol, and Cell Biol. 75:402-408; Gardner et al. (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, Jun. 28-Jul. 3, 1998. Иммуногенные фрагменты для целей настоящего изобретения обычно включают, по меньшей мере, около 3 аминокислот, предпочтительно, по меньшей мере, около 5 аминокислот, более предпочтительно, по меньшей мере, около 10-15 аминокислот и наиболее предпочтительно 25 или более аминокислот молекулы. Не существует особого верхнего предела для длины фрагмента, который должна включать почти полноразмерная белковая последовательность или даже слитой белок, содержащий, по меньшей мере, один эпитоп белка.
Соответственно, минимальная структура полинуклеотида, экспрессирующего эпитоп, включает или состоит преимущественно из или состоит из нуклеотидов, которые кодируют эпитоп или антигенную детерминанту белка или полипротеина, представляющего интерес. Полинуклеотид, кодирующий фрагмент полного белка или полипротеина, более предпочтительно, включает или состоит преимущественно из или состоит минимум из 21 нуклеотидов, предпочтительно, по меньшей мере, 42 нуклеотидов, и предпочтительно, по меньшей мере, 57, 87 или 150 последовательных или перекрывающихся нуклеотидов последовательности, кодирующей полный белок или полипротеин. Процедуры определения эпитопов, такие как составление библиотек перекрывающихся пептидов (Hemmer В. et al., Immunology Today, 1998, 19 (4), 163-168), Pepscan (Geysen et al, (1984) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81, 3998-4002; Geysen et al., (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 82, 178-182; Van der Zee R. et al., (1989) Eur. J. Immunol, 19, 43-47; Geysen H.M., (1990) Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health, 21, 523-533; Multipin.RTM. Peptide Synthesis Kits de Chiron) и алгоритмы (De Groot A. et al, (1999) Nature Biotechnology, 17, 533-561), и в заявке PCT/US2004/022605, все из которых включены здесь посредством ссылки в полном объеме, могут быть практически использованы в изобретении без проведения лишнего эксперимента. Другие документы, цитируемые и включенные здесь, также могут представлять способы определения эпитопов иммуногена или антигена и тем самым молекул нуклеиновых кислот, которые кодируют эти эпитопы.
"Полинуклеотид" является полимерной формой нуклеотидов любой длины, которые содержат дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды и аналоги в любой комбинации. Полинуклеотиды могут иметь трехмерную структуру и могут выполнять любую функцию, известную или неизвестную. Термин "полинуклеотид" включает двух-, одноцепочечные и трехспиральные молекулы. Если иное не определено или не требуется, любое воплощение изобретения, описываемое здесь, которое представляет полинуклеотид, охватывает как двухцепочечные формы, так и каждую из двух комплементарных форм, известную или предполагаемую для составления двухцепочечной формы либо ДНК, РНК, либо гибридной молекулы.
Следующие термины представляют собой неограничивающие примеры полинуклеотидов: ген или фрагмент гена, экзоны, интроны, мРНК, тРНК, рРНК, рибосомы, кДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, изолированная ДНК из любой последовательности, изолированная РНК из любой последовательности, нуклеиновые кислоты-зонды и праймеры. Полинуклеотид может включать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и нуклеотидные аналоги, урацил, другие сахара и связывающие группы, такие как фторрибоза и тиолат, и нуклеотидные разветвления. Последовательность нуклеотидов может быть дополнительно модифицирована после полимеризации, например, посредством конъюгации, мечеными компонентами. Другими типами модификаций, включенными в данное определение, являются кэпирования, замена одного или более природных нуклеотидов на аналог и внедрение средств для прикрепления полинуклеотида к белкам, ионам металлов, меченным компонентам, другим полинуклеотидам или к твердой подложке. Полинуклеотиды могут быть получены путем химического синтеза или из микроорганизмов.
Изобретение дополнительно включает комплементарную цепь к полинуклеотиду, кодирующему антиген, эпитоп, иммуноген, пептид или полипептид, представляющий интерес. Комплементарная цепь может быть полимерной и любой длины и может содержать дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды и аналоги в любой комбинации.
Термины "белок", "пептид", "полипептид" и "фрагмент полипептида" используются здесь взаимозаменяюще и относятся к полимерам аминокислотных остатков любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным, он может включать модифицированные аминокислоты или аминокислотные аналоги, и он может прерываться химическими фрагментами других аминокислот. Термины также охватывают аминокислотный полимер, который модифицирован естественным путем или посредством вмешательства; например, путем формирования дисульфидных связей, гликозилирования, липидизации, ацетилирования, фосфорилирования или посредством любой другой манипуляции или модификации, такой как конъюгирование с меченым или биологически активным компонентом.
"Изолированным" полинуклеотидом или полипептидом является такой, который практически свободен от материалов, с которыми он связан в его нативной среде. Под практически свободным подразумевают, что он, по меньшей мере, на 50%, предпочтительно, по меньшей мере, на 70%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 80% и даже более предпочтительно, по меньшей мере, на 90% свободен от этих материалов.
Реакции гибридизации могут выполняться при условиях различной "строгости". Условия, которые повышают строгость реакции гибридизации, хорошо известны. См. например, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al. 1989). Примеры релевантных условий включают (в порядке увеличения строгости): температуры инкубации 25°С, 37°С, 50°С и 68°С; концентрации буфера 10×SSC, 6×SSC, 1×SSC, 0,1×SSC (где SSC является 0,15 М NaCl и 15 мМ цитратный буфер) и их эквиваленты, использующиеся для других буферных систем; концентрации формамида 0%, 25%, 50% и 75%; время инкубации от 5 минут до 24 часов; 1, 2 или более этапов промывания; время промывки после инкубации 1, 2 или 15 минут; и растворы для промывки 6×SSC, 1×SSC, 0.1×SSC или деионизированная вода.
Изобретение дополнительно охватывает полинуклеотиды, кодирующие функционально эквивалентные варианты и производные полипептидов, представляющих интерес, и их функционально эквивалентные фрагменты, которые могут повышать, снижать или не влиять в значительной степени на свойства полипептидов, кодируемых ими. Эти функционально эквивалентные варианты, производные и фрагменты проявляют способность сохранять биологическую активность. Например, изменения в последовательности ДНК, которые не изменяют кодированную аинокислотную последовательность, а также те, которые приводят к образованию консервативных замен аминокислотных остатков, одной или нескольким аминокислотным делениям или дополнениям, и замене аминокислотных остатков аинокислотными аналогами, являются таковыми, которые не изменяют в значительной степени свойства кодированного колипептида. Консервативными аминокислотными заменами являются глицин/аланин; валин/изолейцин/лейцин; аспарагин/глутамин; аспарагиновая кислота/глутаминовая кислота; серин/треонин/метионин; лизин/аргинин; и фенилланин/тирозин/триптофан. В одном воплощении варианты имеют, по меньшей мере, 50%, по меньшей мере, 55%, по меньшей мере, 60%, по меньшей мере, 65%, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 86%, по меньшей мере, 87%, по меньшей мере, 88%, по меньшей мере, 89%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 91%, по меньшей мере, 92%, по меньшей мере, 93%, по меньшей мере, 94%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 96%, по меньшей мере, 97%, по меньшей мере, 98% или, по меньшей мере, 99% гомологии или идентичности с полинуклеотидом или полипептидом, представляющим интерес.
Для целей настоящего изобретения идентичность или гомологию последовательности определяют путем сравнения последовательностей при выравнивании с тем, чтобы довести до максимума перекрывание и идентичность при минимизации разрывов последовательностей. В частности, идентичность последовательностей может быть определена, используя любое количество математических алгоритмов. Неограничивающий пример математического алгоритма, использующегося для сравнения двух последовательностей, является алгоритмом Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990; 87: 2264-2268, модифицированным, как описано в Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993; 90:5873-5877.
Другим примером математического алгоритма, используемого для сравнения последовательностей, является алгоритм Myers & Miller, CABIOS 1988; 4:11-17. Такой алгоритм включен в программу ALIGN (версия 2.0), которая является частью пакета программ для выравнивания последовательностей и преобразования их в формат GCG. Когда применяют программу ALIGN для сравнения аминокислотных последовательностей, могут быть использованы таблица масс остатков РАМ 120, «gap length penalty)) 12 и «gap penalty» 4. Еще другим пригодным алгоритмом для идентификации участков локального сходства последовательностей и выравнивания является алгоритм FASTA, как описано в Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988; 85:2444-2448.
Предпочтительным для применения согласно настоящего изобретения является программное обеспечение WU-BLAST (Washington University BLAST) версии 2.0. Исполняемые программы WU-BLAST версии 2.0 для некоторых платформ UNIX могут быть загружены из ftp://blast.wustl.edu/blast/executables. Эта программа основана на WU-BLAST версии 1.4, которая в свою очередь основана на домене для общественного пользования NCBI-BLAST версии 1.4 (Altschul & Gish, 1996, Local alignment statistics, Doolittle ed., Methods in Enzymology 266: 460-480; Altschul et al., Journal of Molecular Biology 1990; 215: 403-410; Gish & States, 1993; Nature Genetics 3: 266-272; Karlin & Altschul, 1993;Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877; все из которых включены здесь посредством ссылки).
В целом, сравнение аминокислотных последовательностей выполняется путем выравнивания аминокислотной последовательности полипептида с известной структурой с аминокислотной последовательностью полипептида неизвестной структуры. Затем сравнивают аминокислоты в последовательностях и группы аминокислот, которые гомологичны, группируют друг с другом. Этот метод детектирует консервативные области полипептидов и подсчитывает аминокислотные вставки и делеции. Гомология между аминокислотными последовательностями может быть определена, используя коммерчески доступные алгоритмы (см. также описание гомологии выше). В дополнении к тому, если не упоминается иное, внимание обращается на программы BLAST, gapped BLAST, BLASTN, BLASTP и PSI-BLAST, обеспечиваемые National Center for Biotechnology Information. Эти программы широко используются в уровне техники для этих целей и могут выровнять гомологичные области из двух аминокислотных последовательностей.
Во всех поисковых программах способы выравнивания составляют одно целое с поисковыми базами данных. Промежутки могут убираться, при необходимости. Стандартный штраф (Q) на ограничение длины промежутка (gap of length) составляет Q=9 для белков и BLASTP, Q=10 для BLASTN, но может изменяться на любое целое число. Стандартный штраф на остаток для удлинения промежутка (R) составляет R=2 для белков и BLASTP, и R=10 для BLASTN, но может изменяться на любое целое число. Любая комбинация значений Q и R может использоваться для выравнивания последовательностей для повышения до максимума совпадений и идентичности при минимизировании gaps последовательностей. Стандартной матрицей сравнения аминокислот является BLOSUM62, но и другие матрицы сравнения аминокислот, такие как РАМ, также могут использоваться.
Альтернативно или дополнительно, термин "гомология" или "идентичность", например, относительно нуклеотидной или аминокислотной последовательности может показывать количественное измерение гомологии между двумя последовательностями. Процент гомологии последовательностей может вычисляться как (Nref-Ndif)·100/Nref, где Ndif - это общее количество неидентичных остатков в двух последовательностях при выравнивании, и где Nref - это количество остатков в одной из последовательностей. Таким образом, последовательность ДНК AGTCAGTC будет иметь 75% идентичность последовательностей с последовательностью ААТСААТС (Nref=8; Ndif=2).
Альтернативно или дополнительно, "гомология" или "идентичность", относительно последовательностей, может рассчитываться по отношению количества положений с идентичными нуклеотидами или аминокислотами к количеству нуклеотидов или аминокислот в более короткой из двух последовательностей. При этом выравнивание двух последовательностей может быть определено в соответствие с алгоритмом Wilbur and Lipman (Wilbur & Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 1983; 80:726, включенного здесь посредством ссылки), например, используя следующие параметры: наилучший выровненный сегмент (window size) - 20 нуклеотидов, длина сегмента (word length) - 4 нуклеотида и штраф на введение делеции (gap penalty) - 4. Автоматизированный анализ и интерпретация данных о последовательностях, включая выравнивание, могут быть осуществлены с использованием коммерчески доступных программ (напр., Intelligenetics™ Suite, Intelligenetics Inc. СА). Если указано, что РНК-последовательности аналогичны или имеют степень идентичности или гомологии последовательностей с ДНК-последовательностями, то тимидин (Т) в ДНК-последовательности рассматривается эквивалентным к урацилу (U) в РНК-последовательности. Таким образом, РНК-последовательности входят в изобретения и могут быть получены из ДНК-последовательностей, так как считается, что тимидин (Т) в ДНК-последовательности эквивалентен урацилу (U) в РНК-последовательностях.
При этом без проведения лишних экспериментов специалист в данной области может учитывать многие другие программы или ссылки при определении процента гомологии.
Изобретение дополнительно охватывает полинуклеотиды, представляющие интерес, содержащиеся в молекуле-векторе или экспрессионном векторе и функционально связанные с промоторным элементом и, при необходимости, с энхансером.
"Вектор" относится к рекомбинантной ДНК- или РНК-плазмиде или вирусу, который включает гетерологичный полинуклеотид, который доставляется в клетке-мишени, как in vitro, так и in vivo. Гетерологичный полинуклеотид может включать последовательность, представляющую интерес, для лечения, и может, при необходимости, быть в форме экспрессионной кассеты. В используемом здесь значении нет необходимости, чтобы вектор был способен к репликации в основной клетке-мишени или субъекте. Термин включает векторы для клонирования, а также включает вирусные векторы.
Термин "рекомбинантный" означает полинуклеотид полусинтетического или синтетического происхождения, который либо не встречается в природе, либо прикреплен к другому полинуклеотиду в порядке, не встречаемом в природе.
"Гетерологичный" означает полученный из генетически отличного субъекта от того субъекта, с которым проводят сравнение. Например, полинуклеотид, который может помещаться с помощью методов генной инженерии в плазмиду или вектор, полученный из другого источника, и является гетерологичным полинуклеотидом. Промотор, удаленный из его нативной кодирующей последовательности и функционально связанный с кодирующей последовательностью, отличающейся от нативной последовательности, является гетерологичным промотором.
Полинуклеотиды изобретения могут включать дополнительные последовательности, такие как дополнительные кодирующие последовательности в том же транспозоне, контролирующие элементы, такие как промоторы, участки связывания рибосом, сайты полиаденилирования, дополнительные транспозоны под контролем аналогичного или отличного промотора, последовательности, которые обеспечивают клонирование, экспрессию, гомологичную рекомбинацию и трансформацию клетки-хозяина, и любую такую конструкцию, которая может требоваться для обеспечения воплощений данного изобретения.
Элементы для экспрессии антигена, эпитопа, иммуногена, пептида или полипептида, представляющего интерес, предпочтительно присутствуют в векторе изобретения. В некотором смысле он включает, состоит преимущественно из или состоит из стартового кодона (ATG), стоп-кодона и промотора и, при необходимости, также последовательности полиаденилирования для некоторых векторов, таких как плазмида, и некоторых вирусных векторов, напр., вирусных векторов, отличающихся от поксвирусов. Если полинуклеотид кодирует фрагмент полипротеина, напр., пептид, то, предпочтительно, в векторе ATG помещают на 5' конец открытой рамки и стоп-кодон помещают на 3'. Могут присутствовать и другие элементы для контроля экспрессии, такие как энхансерные последовательности, стабилизирующие последовательности, такие как интронные и сигнальные последовательности, обеспечивающие секрецию белка.
Способами изготовления и/или введения вектора или рекомбинантов или плазмиды для экспрессии продуктов генов изобретения, либо in vivo либо in vitro, могут быть любые желаемые способы, напр., способ, который является или аналогичен способам, описанным в или описанным в цитируемых документах в: патентах США №4,603,112; 4,769,330; 4,394,448; 4,722,848; 4,745,051; 4,769,331; 4,945,050; 5,494,807; 5,514,375; 5,744,140; 5,744,141; 5,756,103; 5,762,938; 5,766,599; 5,990,091; 5,174,993; 5,505,941; 5,338,683; 5,494,807; 5,591,639; 5,589,466; 5,677,178; 5,591,439; 5,552,143; 5,580,859; 6,130,066; 6,004,777; 6,130,066; 6,497,883; 6,464,984; 6,451,770; 6,391,314; 6,387,376; 6,376,473; 6,368,603; 6,348,196; 6,306,400; 6,228,846; 6,221,362; 6,217,883; 6,207,166; 6,207,165; 6,159,477; 6,153,199; 6,090,393; 6,074,649; 6,045,803; 6,033,670; 6,485,729; 6,103,526; 6,224,882; 6,312,682; 6,348,450 и 6.312,683; патентной заявке США №920, 197, поданной 16 октября 1986; WO 90/01543; WO 91/11525; WO 94/16716; WO 96/39491; WO 98/33510; ЕР 265785; ЕР 0370573; Andreansky et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996;93:11313-11318; Ballay et al., EMBO J. 1993;4:3861-65; Feigner et al., J. Biol. Chem. 1994; 269:2550-2561; Frolov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93:11371-11377; Graham, Tibtech 1990; 8:85-87; Grunhaus et al., Sem. Virol. 1992; 3:237-52; Ju et al., Diabetologia 1998;41:736-739; Kitson et al., J. Virol. 1991; 65:3068-3075; McClements et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93:11414-11420; Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93:11341-11348; Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93:11349-11353; Pennock et al., Mol. Cell. Biol. 1984; 4:399-406; Richardson (Ed), Methods in Molecular Biology 1995; 39, "Baculovirus Expression Protocols," Humana Press Inc.; Smith et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 1983; 3:2156-2165; Robertson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93:11334-11340; Robinson et al., Sem. Immunol. 1997; 9:271; and Roizman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93:11307-11312. Цитируемые здесь и включенные сюда посредством ссылочных документов, в дополнении к обеспечиваемым векторам, пригодным для практического использования изобретения, могут также обеспечивать источники для пептидов или их фрагментов, которые экспрессируются векторами, или векторы в, или включенные в, композиции изобретения.
Настоящее изобретение также относится к препаратам, содержащим векторы, такие как экспрессионные векторы, напр., к терапевтическим композициям. Препараты могут включать, состоять преимущественно из или состоять из одного или более векторов, напр., экспрессионных векторов, таких как экспрессионнные векторы in vivo, содержащие, состоящие преимущественно из или состоящие из (и предпочтительно экспрессирующие) одного или более антигенов, эпитопов или иммуногенов, представляющих интерес. Предпочтительно, вектор включает и экспрессирует полинуклеотид, который включает, состоит преимущественно из или состоит из полинуклеотида, кодирующего (и предпочтительно экспрессирующего) антиген, эпитоп, иммуноген, пептид или полипептид, представляющий интерес, в фармацевтически или ветеринарно подходящем носителе, наполнителе или эксципиенте. Таким образом, согласно воплощению изобретения другой вектор или векторы в препарате включает, состоит преимущественно из или состоит из полинуклеотида, который кодирует, и при соответствующих условиях вектор экспрессирует один или более других белков антигена, эпитопа, иммуногена, пептида или полипептида, представляющего интерес, или их фрагменты.
Согласно другому воплощению вектор или векторы в препарате включает или состоит преимущественно из или состоит из полинуклеотида(ов), кодирующего один или более белков или его фрагмент(ы) антигена, эпитопа, иммуногена, пептида или полипептида, представляющего интерес, причем вектор или векторы экспрессирует полинуклеотид(ы). Препарат изобретения предпочтительно включает, состоит преимущественно из или состоит из, по меньшей мере, двух векторов, содержащих, состоящих преимущественно из или состоящих из и предпочтительно также экспрессирующих, предпочтительно in vivo при соответствующих условиях или подходящих условиях или в подходящей клетке-хозяине, полинуклеотиды из разных изолятов, кодирующие различные белки и/или для различных белков, но предпочтительно аналогичные белки. Препараты, содержащие один или более векторов, включающих, состоящих преимущественно из или состоящих из полинуклеотидов, кодирующих и предпочтительно экспрессирующих, предпочтительно in vivo, антиген или слитой белок, представляющий интерес, или его эпитоп. Изобретение также касается смесей векторов, которые содержат, состоят преимущественно из или состоят из, кодируют и экспрессируют, различные антигены, эпитопы или иммуногены, напр., антиген, эпитоп, иммуноген, пептид или полипептид из разных видов, таких как, но не ограничиваясь, птиц, собак, кошек, коров, лошадей, людей и свиней.
Согласно другому воплощению изобретения экспрессионные векторы представляют собой экспрессионные векторы, пригодные для экспрессии белков in vitro в подходящей клеточной системе. Экспрессированные белки могут быть собраны в или из культурального супернатанта после или не после секреции (если нет секреции, обычно происходит или осуществляется клеточный лизис), при необходимости концентрированы с помощью способов концентрации, таких как ультрафильтрация, и/или очищены с помощью способов очистки, таких как афинная, ионообменная или гель-хроматография.
"Клетка-хозяин" обозначает прокариотическую или эукариотическую клетку, которая генетически изменена или способна быть генетически измененной путем введения экзогенного полинуклеотида, такого как рекомбинантная плазмида или вектор. По отношению к генетически измененным клеткам термин относится как к первоначально измененной клетки, так и к ее прогену. Подходящие клетки-хозяева включают, но не ограничиваются, клетки почек детенышей хомяка (ВНК), клетки рака толстой кишки (Сасо-2), клетки COS7, клетки MCF-7, клетки MCF-10A, клетки почки собаки Madin-Darby (MDCK), клетки бычьей почки Madin-Darby (MDBK), клетки легких норки (Mv1Lu), клетки MRC-5, клетки U937 и клетки VERO, клетки яичника китайского хомячка (СНО) К1. Полинуклеотиды, содержащие желаемую последовательность, могут быть вставлены в подходящий вектор клонирования или экспрессии, и вектор, в свою очередь, может быть введен в подходящую клетку-хозяина для репликации и амплификации. Полинуклеотиды могут быть введены в клетку-хозяина любыми способами, известными из уровня техники. Векторы, содержащие представляющие интерес полинуклеотиды, могут быть введены в клетку-хозяина любыми путями, включая направленное поглощение, эндоцитоз, трансфекцию, нуклеофекцию, f-сближение, электропорацию, трансфекцию с применением хлорида кальция, хлорида рубидия, фосфата кальция, DEAE-декстрана или других веществ; баллистическую трансфекцию; липофекцию; и инфекцию (где вектор является инфекционным, например, ретровирусный вектор). Выбор вводимых векторов или полинуклеотидов будет зависеть от свойств клетки-хозяина.
В преимущественном воплощении изобретение обеспечивает введение терапевтически эффективного количества состава для доставки и экспрессии антигена, эпитопа, иммуногена, пептида или полипептида, представляющего интерес, в клетку-мишень. Определение терапевтически эффективного количества является рутинным исследованием для специалиста в данной области техники. В одном воплощении состав включает экспрессионный вектор, содержащий полинуклеотид, который экспрессирует антиген, эпитоп, иммуноген, пептид или полипептид, представляющий интерес, и фармацевтически или ветеринарно подходящий носитель, наполнитель или эксципиент. В преимущественном воплощении, фармацевтически или ветеринарно подходящий носитель, наполнитель или эксципиент способствует трансфекции и/или повышает стабилизацию вектора или белка.
Фармацевтически или ветеринарно подходящие носители или наполнители или эксципиенты хорошо известны для специалиста из уровня техники. Например, фармацевтически или ветеринарно подходящим носителем или наполнителем или эксципиентом может быть 0,9% раствор NaCl (напр., физиологический раствор) или фосфатный буфер. Другие фармацевтически или ветеринарно подходящие носители или наполнители или эксципиенты, которые могут применяться в способах данного изобретения, включают, но не ограничиваются, поли-(L-глутамат) или поливинилпирролидон. Фармацевтически или ветеринарно подходящие носители или наполнители или эксципиенты могут быть любым соединением или комбинацией соединений, способствующих введению вектора (или белка, экспрессирующегося из вектора изобретения in vitro); предпочтительно, носитель, наполнитель или эксципиент могут способствовать трансфекции и/или повышать стабильность вектора (или белка). Дозы и дозовые объемы обсуждены здесь в общем описании и могут также быть без труда определены специалистом в данной области техники в сочетании со знаниями из уровня техники, без проведения лишних экспериментов.
Катионные липиды, содержащие соль четвертичного аммония, которые предпочтительно, но не обязательно, являются пригодными для плазмид, представляют собой липиды, которые имеют следующую формулу:
в которой R1 является насыщенным или ненасыщенным прямолинейным алифатическим радикалом, имеющим 12-18 атомов углерода, R2 является другим алифатическим радикалом, содержащим 2 или 3 атомов углерода, и X - это аминная или гидрокисильная группа, напр., DMRIE. В другом воплощении катионный липид может быть связан с нейтральным липидом, напр., DOPE.
Среди катионных липидов предпочтение отдается DMRIE (N-(2-гидроксиэтил)-N,N-диметил-2,3-бис(тетрадецилокси)-1-пропанаммоний; WO 96/34109), предпочтительно связанному с нейтральным липидом, предпочтительно DOPE (диолеоил-фосфатидил-этаноламин; Behr J.P., 1994, Bioconjugate Chemistry, 5, 382-389), с формированием DMRIE-DOPE.
Предпочтительно, приготавливают смесь из плазмиды с адъювантом непосредственно перед и предпочтительно одновременно с введением препарата или незадолго перед введением препарата, например, незадолго до или перед введением, причем перед введением смеси плазмида-адъювант смесь выдерживают в течение времени, необходимого для образования комплексов, напр., в течение между около 10 и около 60 минутами до ведения, в частности, приблизительно в течение 30 минут до ведения.
Весовое соотношение между плазмидой и адъювантом DMRIE или DMRIE-DOPE может составлять около 50:около 1 или около 1:около 10, например, около 10:около 1 и около 1:около 5, и предпочтительно около 1: около 1 и около 1: около 2, напр., 1:1 и 1:2.
Иммуногенные композиции и вакцины согласно изобретению могут включать или состоять преимущественно из одного или более адъювантов. В рамках настоящего изобретения особо пригодными являются: (1) полимер акриловой или метакриловой кислоты, полимер малеинового ангидрида и производного алкилена, (2) иммуностимуляторная последовательность (ISS), в частности, олигодезоксирибонуклеотидная последовательность, содержащая один или несколько неметилированных мотивов CpG (Klinman et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1996, 93, 2879-2883; WO 98/16247), (3) эмульсия "масло в воде", в частности, эмульсия SPT, описанная на стр.147 "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach", издано M. Powell, M. Newman, Plenum Press, 1995 г., и эмульсия MF59, описанная на стр.183 той же публикации, (4) катионные липиды, содержащие соли четвертичного аммония, напр., DDA (5) цитокины, (6) гидроксид алюминия или фосфат алюминия, (7) сапонин или (8) другие адъюванты, обсуждаемые в любом документе, цитируемом или включенном посредством ссылки в данной заявке или (9) любые их комбинации или смеси.
Эмульсия "масло в воде" (3), которая особо пригодна для вирусных векторов, может быть приготовлена на основе: легкого жидкого парафина (типа, предусмотренного Европейской фармакопеей); изопреноидного масла, такого как сквалан, сквален; масла, образующегося при олигомеризации алкенов, в частности, изобутена или децена; сложных эфиров кислот или спиртов с линейной алкильной группой, особенно растительных масел, этилолеата, пропиленгликольдикаприлата/дикапрата, глицерилтрикаприлата/трикапрата, пропиленгликольдиолеата; сложных эфиров кислот или жирных спиртов с разветвленной цепью, в частности, сложных эфиров изостеариновой кислоты.
Для образования эмульсии масло применяется вместе с эмульгаторами. Эмульгаторами служат предпочтительно неионные поверхностно-активные вещества, в частности: сложные эфиры, с одной стороны, сорбитана, маннида (например, ангидроманнитололеата), глицерина, полиглицерина или пропиленгликоля и, с другой стороны, олеиновой, изостеариновой, рицинолевой, оксистеариновой кислот, причем указанные сложные эфиры при необходимости являются этоксилированными; или блок-сополимеры полиоксипропилен-полиоксиэтилен, в частности, Pluronic, а именно L121.
Из добавляемых полимеров типа (1) предпочтительными являются сшитые полимеры акриловой или метакриловой кислоты, в частности, сшитые полиалкиленовыми эфирами сахаров или многоатомных спиртов. Такие соединения известны под названием "карбомеры" (Pharmeuropa, т.8, №2, июнь 1996 г.). Специалист может также обратиться к патенту US-A-2909462, в котором описаны такие акриловые полимеры, сшитые полигидроксилированным соединением, содержащим, по меньшей мере, 3 гидроксильных группы, предпочтительно не более 8, при этом атомы водорода, по меньшей мере, в трех гидроксилах замещены алифатическими ненасыщенными радикалами, содержащими, по меньшей мере, 2 атома углерода. Предпочтительными радикалами являются радикалы с 2-4 атомами углерода, например, винилы, аллилы и другие ненасыщенные группы этиленового ряда. Ненасыщенные радикалы могут сами содержать другие заместители, такие как метил. Особо пригодными являются продукты, предлагаемые под названием Carbopol® (BF Goodrich, шт.Огайо, США). Они сшиты, в частности, аллильным производным сахарозы или аллилпентаэритритолом. Из них можно указать, в частности, на Carbopol® 974Р, 934Р и 971P.
Из сополимеров малеинового ангидрида и производного алкилена предпочтительными являются EMA® (Monsanto), которые представляют собой сополимеры малеинового ангидрида и этилена, линейные или сшитые, например, сшитые дивиниловым эфиром. Можно отослать к J.Fields и др., Nature, №186, стр.778-780, от 4 июня 1960 г.
В отношении своей структуры полимеры акриловой или метакриловой кислоты и ЕМА® образованы преимущественно структурными звеньями следующей формулы:
где
- R1 и R2, одинаковые или разные, означают Н или СН3,
- х=0 или 1, предпочтительно х=1,
- у=1 или 2, при этом х+у=2.
Для ЕМА® х=0, у=2 и для карбомеров х=у=1.
Эти полимеры растворены в воде или физиологическом растворе (NaCl при концентрации 20 г/л), показатель pH доведен до 7,3-7,4 едким натром для получения раствора адъюванта, в который будут введены экспрессионные векторы. Концентрация полимера в конечной вакцинной композиции может достигать 0,01-1,5% (вес/объем), в частности, 0,05-1%) (вес/объем), предпочтительно 0,1-0,4% (вес/объем).
Цитокин или цитокины (5) могут вводиться в композицию или вакцину в виде белка или подвергаться совместной экспрессии в хозяине вместе с иммуногеном или иммуногенами. Предпочтительной является коэкспрессия цитокина или цитокинов либо посредством того же вектора, что и вектор, экспрессирующий иммуноген, либо посредством собственного вектора.
Изобретение включает способ приготовления таких комплексных композиций; например, путем смешивания активных компонентов, предпочтительно вместе и с адъювантом, носителем, цитокином и/или разбавителем.
Цитокины, использующиеся в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), интерферон α(IFNα), интерферон β(IFNβ), интерферон γ(IFNγ), интерлейкин-1α(1L-1α), интерлейкин-1β (IL-1β), интерлейкин-2 (IL-2), интерлейкин-3 (IL-3), интерлейкин-4 (IL-4), интерлейкин-5 (IL-5), интерлейкин-6 (IL-6), интерлейкин-7 (IL-7), интерлейкин-8 (IL-8), интерлейкин-9 (IL-9), интерлейкин-10 (IL-10), интерлейкин-11 (IL-11), интерлейкин-12 (IL-12), фактор некроза опухоли α(TNFα), фактор некроза опухоли β(TNFβ) и трансформирующий фактор роста β(TGFβ). Необходимо понимать, что цитокины могут быть введены совместно с и/или последовательно с иммуногенной или вакцинной композицией настоящего изобретения. Так, например, вакцина рассматриваемой заявки может также содержать экзогенную молекулу нуклеиновой кислоты, которая экспрессирует in vivo подходящий цитокин, напр., цитокин, подобранный для того хозяина, которого вакцинируют или у которого вырабатывается иммунная реакция (например, собачий цитокин для препаратов для введения собакам).
Предпочтительно, фармацевтические и/или терапевтические композиции и/или составы согласно изобретению включают или состоят преимущественно из или состоят из эффективного количества, для индуцирования терапевтического ответа, одного или более экспрессионных векторов и/или полипептидов, как здесь описывается; при этом эффективное количество может быть определено из данного описания, включая документы, включенные в него, и уровень техники, без проведения дополнительных экспериментов.
В случае терапевтических и/или фармацевтических композиций, основанных на плазмидном векторе, доза может включать, состоять преимущественно из или состоять из, в общих чертах, от около 1 мкг до около 2000 мкг, предпочтительно от около 50 мкг до около 1000 мкг и более, предпочтительно от около 100 мкг до около 800 мкг плазмиды, экспрессирующей антиген, эпитоп, иммуноген, пептид или полипептид, представляющий интерес. Если терапевтические и/или фармацевтические композиции, основанные на плазмидном векторе, вводятся путем электропорации, доза плазмиды обычно составляет от около 0,1 мкг до около 1 мг, предпочтительно от около 1 мкг до около 100 мкг, предпочтительно от около 2 мкг до около 50 мкг. Дозовые объемы могут составлять от около 0,1 до около 2 мл, предпочтительно от около 0,2 до около 1 мл. Эти дозы и дозовые объемы являются подходящими для лечения видов млекопитающих-мишеней.
В преимущественном воплощении животное вакцинируют двумя дозами инактивированной вакцины с интервалом приблизительно в 3-4 недели посредством подкожного введения, хотя внутримышечное введение также допускается. Образцы крови собирают на первый и/или второй день после вакцинации и через около 2-4 недели после второй вакцинации для определения уровней специфичных антител с помощью способов, известных из уровня техники, например, реакции нейтрализации вирусов, торможения гемагглютинации, ELISA или простого радиального гемолиза (SRH).
Необходимо отметить, что для специалиста в данной области данное описание обеспечивается примерами и настоящее изобретение ими не ограничивается. Из приведенного здесь описания и знания уровня техники специалист может определить количество введений, способ введения и дозы, используемые в каждом протоколе инъецирования, без проведения дополнительных экспериментов.
Настоящее изобретение предполагает, по меньшей мере, одно введение животному эффективного количества терапевтической композиции, изготовленной согласно изобретению. Животным может быть самец, самка, беременная самка и новорожденный. Введение композиции может осуществляться различными путями, включая, но не ограничиваясь, внутримышечные (IM), кожные (ID) или подкожные (SC) инъекции или посредством интраназального или перорального введения. Терапевтическая композиция изобретения может также вводиться безыгольным инъектором (как, например, инъекторами Pigjet, Biojector или Vitajet (Bioject, Oregon, USA)). Другим способом введения плазмидных композиций является электропорация (см., напр. S. Tollefsen et al. Vaccine, 2002, 20, 3370-3378; S.Tollefsen et al. Scand. J.Immunol., 2003, 57, 229-238; S.Babiuk et al., Vaccine, 2002, 20, 3399-3408; Заявку PCT WO 99/01158). В другом воплощении терапевтическая композиция доставляется животному с помощью генной пушки или бомбардировки золотыми частицами. В преимущественном воплощении животным является позвоночное животное.
Одно воплощение изобретения представляет способ установления иммунного ответа против антигена, эпитопа, иммуногена, пептида или полипептида, представляющего интерес, у животного, включающий введение состава для доставки и экспрессии рекомбинантной вакцины в эффективном количестве для установления иммунного ответа. Еще другое воплощение изобретения представляет способ индуцирования иммунологического или защитного ответа у животного, содержащий введение животному эффективного количества состава для доставки и экспрессии антигена, эпитопа, иммуногена, пептида или полипептида, представляющего интерес, где состав включает рекомбинантную вакцину и фармацевтически или ветеринарно подходящий носитель, наполнитель или эксципиент.
Изобретение относится к способу установления, индуцирования или стимулирования иммунного ответа животного, предпочтительно млекопитающего или позвоночного.
Другое воплощение изобретения представляет собой набор для выполнения способа индуцирования имунологического или защитного ответа против антигена, эпитопа, иммуногена, пептида или полипептида, представляющего интерес, у животного, причем набор содержит рекомбинантную вакцину и инструкции для осуществления способ доставки в эффективном количестве для установления иммунного ответа у животного.
Далее изобретение подробнее описывается с помощью вариантов его осуществления, приводимых в качестве неограничивающих примеров.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Пример 1. Влияние эффективности экспрессии гена устойчивости к канамицину ("Kanar") на эффективность репликации плазмид у бактерий.
Следующий пример иллюстрирует влияние эффективности экспрессии гена устойчивости к канамицину ("KanaR") на эффективность репликации плазмид у бактерий.
Первое, анализируют элементы экспрессионной кассеты KanaR, а именно промотор(ы), сайт инициации трансляции и сайт терминации транскрипции. При анализе этих экспрессионных элементов эти элементы модифицируют и анализируют действие модифицированных элементов на выход продукции плазмиды. Были идентифицированы четыре потенциальных промотора. Р3 (SEQ ID NO:3) был идентифицирован из базы данных и литературных источников, структура которого описана в GenBank под №Х00928 (SEQ ID NO:4), но не определена традиционными программами. Р2 (SEQ ID NO:2) был определен с помощью биоинформатического анализа и был также найден в GenBank под №V00359 (SEQ ID NO: 5). P1 (SEQ ID NO:1) относился к дополнительному потенциальному промотору, принадлежащему к остову pVR1012. Р0 был другим потенциальным промотором, принадлежащим к остову pVR1012. Фиг.1 показывает, как Р2 (SEQ ID NO:2) и Р3 частично совпадают.
В pVR1012 не содержится сигнальной последовательности терминации транскрипции для KanaR. Это может иметь множество возможных последствий. Многие транскрипты KanaR могут быть чрезмерно длинными и разрушенными, поскольку они будут бесполезной метаболической нагрузкой. Кроме того, экспрессия KanaR может быть недостаточно оптимальной в pVR1012. Транскрипция KanaR может продолжаться через ориджин репликации, ORI, и интерферировать с инициацией репликации, как показано схематически на фиг.2. Таким образом, были идентифицированы два соответствующих терминаторов транскрипции: rrnBT1+T2, который может быть найден в GenBank под №U13872 (SEQ ID NO:6) и используется во многих коммерческих экспрессионных векторах, и speA, который имеет №М31770 (SEQ ID NO:7). Также стартовый кодон ATG pVR1012 был помещен с помощью TTG для снижения эффективности инициации трансляции. Таким образом, цель заключалась в определении действия каждой модифицированной экспрессионной кассеты на способность устойчивости к канамицину и выходы продукции плазмид.
Так, производные PVR1012 генерировали с промотором P1 (SEQ ID NO:1), Р2/Р3 (SEQ ID NOS: 2-3) или P1 (SEQ ID NO:1) с P2/P3 (SEQ ID NOS: 2-3), терминаторами транскрипции rrnBT1+T2 или speA, и стартовым ко доном TTG. Для введения таких ДНК-последовательностей, в обратном и прямом направлении от ORF KanaR, требовались единичные сайты рестрикции. Такие сайты были найдены в pVR1012, так что они были введены посредством сайтнаправленного мутагенеза. Сначала кассета KanaR была клонирована в мутагенный вектор pALTER-1, как показано на фиг.3. Фиг.4 демонстрирует, как сайт рестрикции Pad был введен в прямом направлении от ORF KanaR, получая тем самым pLL2, сайт рестрикции SwaI был введен в обратном направлении и сайт рестрикции RsrII был введен в прямом направлении, получая тем самым pLL4, и, в конце концов, стартовый кодон трансляции ATG был мутирован TTG, получая pLL6. Мутированную кассету KanaR pLL4 затем клонировали в pVR1012 с формированием pLL7, как показано на фиг.5. Терминаторную последовательность rrnB затем клонировали в pLL7 путем ПЦР из pSB062 и последовательного расщепления Pad RsrII с формированием pLL9, как показано на фиг.6. Фиг.7 демонстрирует клонирование терминаторной последовательности speA в pLL7 путем отжига синтетических олигонуклеотидов и расщепления RsrII PacI с формированием pLL11. Затем мутированную последовательность инициации трансляции pLL6 клонировали в pLL9 посредством расщепления Pad Msd с формированием pLL10, показано на фиг.8. В итоге фиг.9 иллюстрирует, как промоторные последовательности Р2/Р3 (SEQ ID NOS: 2-3) вместе с P1 (SEQ ID NO:1), P1 (SEQ ID NO:1) и P2/P3 (SEQ ID NOS: 2-3) были клонированы посредством ПЦР URS11-URS12, ПЦР URS13-URS12 и ПЦР URS11-URS14, соответственно. Фиг.10, 11 и 12 показывают, как их затем водили в pLL9 с формированием pLL13, 14 и 15 соответственно. Аналогично, Фиг.13 показывает, как Р1 (SEQ ID NO:1) был введен в pLL7 с формированием pLL16. Фиг.14 показывает некоторые получившиеся конструкции. Конструкции pLL13, pLL14, pLL15 и pLL16 содержали делецию в 192 п.о. между промотором CMV и промотором Капа P1 (SEQ ID NO:1), как проиллюстрировано на Фиг.15. Таблица 1 объединяет эти конструкции.
| Таблица 1 | |||||
| ПЛАЗМИДА | Ген KanaR | Вставка | Размер плазмиды (п.о.) | ||
| Промотор(ы) | Стартовый кодон | Терминатор | |||
| pVR1012 | Р0, Р1, Р2/3 | ATG | no | no | 4911 |
| pLL7 | Р0, Р1, Р2/3 | ATG | no | no | 4911 |
| pLL9 | Р0, Р1, Р2/3 | ATG | rrnB T1-Т2 | no | 5011 |
| pLL10 | Р0, Р1, Р2/3 | TTG | rrnB T1-Т2 | нет | 5011 |
| pLL11 | Р0, Р1, Р2/3 | ATG | speA | нет | 4846 |
| pLL13* | P1, Р2/3 | ATG | rrnB T1-Т2 | нет | 4811 |
| pLL14* | Р1 | ATG | rrnB T1-Т2 | нет | 4655 |
| pLL15* | Р2/3 | ATG | rrnB T1-Т2 | нет | 4661 |
| pLL16* | Р1 | ATG | нет | нет | 4555 |
| pPB662 | Р0, Р1, Р2/3 | ATG | нет | FIV env | 7456 |
| pLL19* | Р1 | ATG | rrnB T1-Т2 | FIV env | 7204 |
| * Конструкции, имеющие делеции в 192 п.о. между промотором CMV и промотором Р1 Kana |
Эффективность модификаций размеров транскриптов гена KanaR подтверждали с помощью проведения экспериментов нозерн-блоттинга. Они подтвердили гетерогенность транскриптов pVR1012 KanaR, как показано на пятне. Они также подтвердили наличие трех активных промоторов в pLL9, pLL10 и pLL11: одного главного короткого транскрипта из Р2/Р3 (SEQ ID NOS:2-3) и двух более слабых транскриптов из Р0 и Р1 (SEQ ID NO:1). Как предполагали, pLL13 генерировал два транскрипта и pLL14 и pLL15 только один.
Затем были протестированы некоторые параметры на производных pVR1012 для оценки их новых характеристик. Тестировали способность к устойчивости увеличенных концентраций канамицина путем первого заражения одной бактериальной колонии, содержащей каждую конструкцию, pVR1012-pLL15, в среде LB и выращивания в течение всей ночи при 37°С и 200 RPM. Бактерии в каждой суспензии подсчитывали с помощью спектрофотометрии (OD600 нм). Подходящими разведениями бактериальных суспензий, 50 или 100 мкл, покрывали среду LB, содержащую увеличенные концентрации канамицина. В итоге колонии подсчитывали, результаты чего показаны на фиг.16. Эти результаты показывают, что бактерии, содержащие большинство производных pVR1012, имели такую же способность к устойчивости увеличенной концентрации Капа без адаптации, так как рост не нарушался при концентрации 0-800 мкг/мл и был ингибирован при 200 мкг/мл. Бактерии, содержащие pLL10 и pLL14, имели значительно более низкую способность устойчивости к канамицину, при этом рост был на 90%-100% подавлен при концентрации 800 мкг/мл, но не при 200 мкг/мл. Так, было сделано заключение, что отсутствие промоторов Р2/Р3 (SEQ ID NOS: 2-3) или более низкие эффективности трансляции оказывали значительное влияние на ферментативную продукцию KanaR, показывая, что промоторы Р2/Р3 (SEQ ID NOS: 2-3) являются наиболее эффективными для экспрессии KanaR и ингибитор TTG понижает экспрессию KanaR. Однако эти мутации по-прежнему обеспечивают бактериальную устойчивость и рост в присутствии классических концентраций Капа.
Способность к адаптации в среде EGLI была протестирована на первой суспензии бактериальных клеток, содержащих каждую бактериальную конструкцию и 104 КОЕ в LB, и с последующем нанесением на планшеты с EGLI. 25-50 изолированных колоний, содержащих каждую конструкцию, затем наносили на новую планшету с EGLI. Выращенные колонии подсчитывали, результаты показаны в Таблице 2. Плазмидные остовы pLL10, pLL14 и pLL16 представляли чистый рост в среде, обедненной питательными веществами, бактерий, содержащих их. Кроме того, более низкая производственная способность канамицина связана с лучшей способностью к адаптации на обедненной среде в присутствии Капа 100 мкг/мл.
Плазмидные выходы, полученные в лабораторных условиях роста, были протестированы на первой выращенной одной колонии бактерий, содержащих каждую конструкцию в среде LB с 100 мкг/мл Капа в течение ночи при 37°С и 200 RPM. Количество бактерий в каждой суспензии оценивали спектрофотометрически, OD600. ДНК из каждой суспензии очищали, используя колонки Eppendorf, и рассчитывали спектрофотометрически, OD260, каждый раствор ДНК тестировали дважды. Затем высчитывали количество плазмидных копий в каждой суспензии, результаты чего можно увидеть на Фиг.17. Не наблюдали значительных отличий между разными конструкциями после выращивания в среде LB с Капа 100 мкг/мл. Стабильность плазмид дополнительно оценивали путем анализ расщепления трех препаратов плазмид, полученных из каждой конструкции.
Плазмидные выходы, полученные в лабораторных условиях роста, тестировали первой адаптированной EGLI на твердой среде. 15 и 25 колоний, Эксперимент А и В соответственно, содержащие каждую конструкцию выращивали в течение ночи в жидкой среде EGLI при 37°С и 200 RPM. Количество бактерий в каждой суспензии оценивали спектрофотометрически, OD600. DNA из каждой суспензии очищали, используя колонки Qiagen, и подсчитывали спектрофотометрически, OD260. Количество плазмидных копий в каждой суспензии затем устанавливали, результаты чего можно посмотреть на фиг.19.
Результаты показывают, что конструкции pLL14 и pLL16 являются наилучшими кандидатами в отношении плазмидных выходов в лабораторных условиях в среде EGLI. Кроме того, плазмидные выходы были значительно ниже, если конструкция содержала терминатор транскрипции и эффективный инициатор трансляции (ATG). Одновременно, плазмидные выходы были выше, если конструкции не содержали терминатор трансляции или содержали недостаточно оптимальный промотор P1 (SEQ ID NO:1) или недостаточно оптимальный инициатор трансляции (TTG). Плазмидные выходы были сравнимы в конструкциях pVR1012 и pLL10, показывая, что низкая эффективность трансляции компенсировала негативные эффекты терминатора транскрипции. На основании этих результатов можно сделать вывод, что чем ниже способность экспрессировать KanaR, тем выше плазмидные выходы. Обобщив результаты теста, стабильность плазмиды дополнительно оценивали с помощью анализа расщепления препаратов, содержащих каждую плазмиду, полученную из каждой конструкции. Таблица 2 показывает результаты этого анализа. Не определялись мутации после адаптации EGLI для pLL10, pLL14, pLL16 и pLL19, тогда как она была более 9% для каждой конструкции. Также было обнаружено, что имелась повышенная гомогенность плазмидных выходов в pLL14, pLL16 и pLL19 EGLI-адаптированных клонов. Фиг.20 иллюстрирует разницу между высокой гетерогенностью плазмидного выхода у конструкции pVR1012 и низкой гетерогенности у конструкции pLL14 или pLL19.
Плазмидные выходы, полученные путем ферментации, были протестированы первым произвольно выбранным одним клоном EGLI-адаптированного SCS1/pLL14 для ферментации. После ферментации бактерии центрифугировали и плазмиду экстрагировали из аликвоты и дважды определяли количество согласно способам, разработанным PGEA. Результаты показали, что скорость роста SCS1/pLL14 была значительно ниже, чем обычно наблюдается у производных pVR1012, таких как рРВ266 и рРВ662. Кроме того, специфичный плазмидный выход pLL14 составлял 3,1 мг плазмиды/г бактериальной пеллеты. Этот результат соответствует наилучшим результатам, полученным с производными pVR1012 после адаптации Капа и выбора клона, такого как рРВ266. Плазмидная стабильность затем оценивалась с помощью анализа расщепления плазмидных препаратов из каждого ферментированного клона с тремя разными образцами расщепления. Таблица 4 обеспечивает краткие сведения результатов анализа всех плазмид. Результаты показывают, что уровень экспрессии KanaR оказывает влияние на эффективность репликации плазмид. Чем ниже экспрессия, те выше скорости репликации в обедненной среде и при концентрации Капа 100 мкг/мл. Низкая экспрессия KanaR может быть получена путем удаления природного промотора (Р2/Р3 (SEQ ID NOS: 2-3)), обеспечивая отсутствие сигнала конца транскрипции и изменяя начало трансляции. Низкая экспрессия KanaR приводит к до 50% повышению плазмидных выходов по сравнению с паретеральной плазмидой pVR1012. Это также приводит к повышению плазмидной стабильности и гомогенности в производственных выходах плазмидных конструкций.
| Таблица 4 | |||||||
| Название плазмиды | Промотор | Терминатор транскрипции | Инициа тор трансляции | Анализ | |||
| Выращив на увеличен. [Kana]: MIC | Плазмидные выходы ("Erlen" рост в Egli/Kana 100) | Скорости мутирования | Плазмидные выходы (ферментор) | ||||
| pVR1012 | P1+P2/3 | нет | ATG | 1600-3200 | 48** and 51*** | 17 to 100 | |
| pLL9 | P1+P2/3 | rrnB Т1-Т2 | ATG | 1600-3200 | 19 | 23 | |
| pLL10 | P1+P2/3 | rrnB T1-T2 | TTG | 400-800 | 67 | 0 | ND |
| pLL11 | P1+P2/3 | SpeA | ATG | 1600-3200 | 26 | 9 | |
| pLL13* | P1+P2/3 | rrnB T1-T2 | ATG | 1600-3200 | 35 | 38 | |
| pLL14* | P1 | rrnB T1-T2 | ATG | 400-800 | 100 | 0 | 3,1 мг/г бактериальн. пеллет |
| pLL15* | Р2/3 | rrnB Т1-Т2 | АТС | 1600-3200 | 35 | 15 | ND |
| pLL16* | Р1 | нет | ATG | 98** | 0 | 1,9 мг/г бактериальн. пеллет | |
| PLL19* | Р1 | RrnB Т1-Т2 | ATG | - | 76*** | 0 | 2,9 мг/г бактериальн. пеллет |
| * Конструкции, имеющие делецию 192 п.о. между промотором CMV и промотором Капа Р1. ** Результаты, полученные в тесте количественного определения выхода второй плазмиды *** Результаты, полученные в тесте количественного определения выхода третьей плазмиды. |
Плазмиду pLL16 дополнительно исследовали на устойчивость к возрастающим концентрациям Капа и плазмидным выходам после ферментации. Также завершали конструкцию pLL17 и pLL18, в которой pLL17 имела промотор Р1, стартовый кодон TTG и терминатор rrnB Т1/2 и pLL18 имела Р1 промотор, стартовый кодон TTG и терминатор. Однако эти конструкции могут быть сложными для получения вследствие низкой способности KanaR. Эти конструкции анализировали с помощью ранее описанных тестов. Плазмидные выходы тестировали после адаптации Капа на выбранных конструкциях (напр., pLL14 до -18). Анализ РНК-транскриптов из гена KanaR всех конструкций осуществляли для подтверждения приведенной модели. Переворачивая кассету KanaR в pVR1012, можно подтвердить, что кассета KanaR не оказывает влияние на ориджин репликации.
Пример 2: Последовательности
DEFINITION 5' участок транспозона Тп2350 гена Km(r) из плазмиды R1.
ACCESSION Х00928 (SEQ ID NO:4)
1 gaattcccgc agattaacgc gcataacaag cggtttactc gttttggcct gcaatgtaac
61 ataatataca ttatgcgcac taaggtagag gcagcaagat tatgcggttt tgatcagaac
121 tcagttaacc atcccgggat tctgctctgg cccattcagc gcagtttttt actttggatg
181 aagttaaccc atgttatatt gcacaagata aaaatatatc atcatgaaca ataaaactgt 241 ctgcttacat aaacagtaat acaaggggtg ttatgagcca tattcaacgg gaaacgtctt 301 gctcgaggga attc
DEFINITION Транспозон Tn903.
ACCESSION V00359 J01839 (SEQ ID NO:5)
| 1 | ggctttgttg aataaatcag atttcgggta agtctccccc gtagcgggtt gtgttttcag |
| 61 | gcaatacgca cgctttcagg catacctgct ttcgtcattt tgttcagcgc tcgtaccagg |
| 121 | gccatagcct ccgcaacctg accatcgtag tcacgcagcg tcagtgaacc cccgaacagc |
| 181 | tgttttaccc ggtacatcgc cgtttccgct atcgagcgac ggttgtaatc tgttgtccat |
| 241 | ttccaccgcg cattactccc ggtcattcgc tgattagcca ctgcacggtt acggtctgca |
| 301 | tattcaccgg gccagtaacc cgcacctttt cggggaggga taagcgcgct gattttctta |
| 361 | cgccgcagtt catcgtgaca gagccgggtg tcgtaagcgc cgtctgccga tgctgccctg |
| 421 | atttttctgt gagtctgccg gataagaccc gggaaggctt ctgagtcggt cacattgttc |
| 481 | agcgacaggt cagcgcagat gatttcatgt gttttactgt caacggcgag atgcagctta |
| 541 | cgccagatac ggcggcgttc ctggccatgc tttttgactt tccattcgcc ttcaccaaag |
| 601 | accttcagcc cggtggaatc aatcaccaga tgcgcgattt caccccgggt gaacgttttg |
| 661 | aaactgatat taaccgactt tgcccgcctg ctgacacagc tgtaatccgg gcagcgcaac |
| 721 | ggaacattca tcagtgtaaa aatggaatca ataaagccct gcgcagcgcg cagggtcagc |
| 781 | ctgaatacgc gtttaatgac cagcacagtc gtgatggcaa ggtcagaata gcgctgaggt |
| 841 | ctgcctcgtg aagaaggtgt tgctgactca taccaggcct gaatcgcccc atcatccagc |
| 901 | cagaaagtga gggagccacg gttgatgaga gctttgttgt aggtggacca gttggtgatt |
| 961 | ttgaactttt gctttgccac ggaacggtct gcgttgtcgg gaagatgcgt gatctgatcc |
| 1021 | ttcaactcag caaaagttcg atttattcaa caaagccacg ttgtgtctca aaatctctga |
| 1081 | tgttacattg cacaagataa aaatatatca tcatgaacaa taaaactgtc tgcttacata |
| 1141 | aacagtaata caaggggtgt tatgagccat attcaacggg aaacgtcttg ctcgaggccg |
| 1201 | cgattaaatt ccaacatgga tgctgattta tatgggtata aatgggctcg cgataatgtc |
| 1261 | gggcaatcag gtgcgacaat ctatcgattg tatgggaagc ccgatgcgcc agagttgttt |
| 1321 | ctgaaacatg gcaaaggtag cgttgccaat gatgttacag atgagatggt cagactaaac |
| 1381 | tggctgacgg aatttatgcc tcttccgacc atcaagcatt ttatccgtac tcctgatgat |
| 1441 | gcatggttac tcaccactgc gatccccggg aaaacagcat tccaggtatt agaagaatat |
| 1501 | cctgattcag gtgaaaatat tgttgatgcg ctggcagtgt tcctgcgccg gttgcattcg |
| 1561 | attcctgttt gtaattgtcc ttttaacagc gatcgcgtat ttcgtctcgc tcaggcgcaa |
| 1621 | tcacgaatga ataacggttt ggttgatgcg agtgattttg atgacgagcg taatggctgg |
| 1681 | cctgttgaac aagtctggaa agaaatgcat aagcttttgc cattctcacc ggattcagtc |
| 1741 | gtcactcatg gtgatttctc acttgataac cttatttttg acgaggggaa attaataggt |
| 1801 | tgtattgatg ttggacgagt cggaatcgca gaccgatacc aggatcttgc catcctatgg |
| 1861 | aactgcctcg gtgagttttc tccttcatta cagaaacggc tttttcaaaa atatggtatt |
| 1921 | gataatcctg atatgaataa attgcagttt catttgatgc tcgatgagtt tttctaatca |
| 1981 | gaattggtta attggttgta acactggcag agcattacgc tgacttgacg ggacggcggc |
| 2041 | tttgttgaat aaatcgaact tttgctgagt tgaaggatca gatcacgcat cttcccgaca |
| 2101 | acgcagaccg ttccgtggca aagcaaaagt tcaaaatcac caactggtcc acctacaaca |
| 2161 | aagctctcat caaccgtggc tccctcactt tctggctgga tgatggggcg attcaggcct |
| 2221 | ggtatgagtc agcaacacct tcttcacgag gcagacctca gcgctattct gaccttgcca |
| 2281 | tcacgactgt gctggtcatt aaacgcgtat tcaggctgac cctgcgcgct gcgcagggct |
| 2341 | ttattgattc catttttaca ctgatgaatg ttccgttgcg ctgcccggat tacagctgtg |
| 2401 | tcagcaggcg ggcaaagtcg gttaatatca gtttcaaaac gttcacccgg ggtgaaatcg |
| 2461 | cgcatctggt gattgattcc accgggctga aggtctttgg tgaaggcgaa tggaaagtca |
| 2521 | aaaagcatgg ccaggaacgc cgccgtatct ggcgtaagct gcatctcgcc gttgacagta |
| 2581 | aaacacatga aatcatctgc gctgacctgt cgctgaacaa tgtgaccgac tcagaagcct |
| 2641 | tcccgggtct tatccggcag actcacagaa aaatcagggc agcatcggca gacggcgctt |
| 2701 | acgacacccg gctctgtcac gatgaactgc ggcgtaagaa aatcagcgcg cttatccctc |
| 2761 | cccgaaaagg tgcgggttac tggcccggtg aatatgcaga ccgtaaccgt gcagtggcta |
| 2821 | atcagcgaat gaccgggagt aatgcgcggt ggaaatggac aacagattac aaccgtcgct |
| 2881 | cgatagcgga aacggcgatg taccgggtaa aacagctgtt cgggggttca ctgacgctgc |
| 2941 | gtgactacga tggtcaggtt gcggaggcta tggccctggt acgagcgctg aacaaaatga |
| 3001 | cgaaagcagg tatgcctgaa agcgtgcgta ttgcctgaaa acacaacccg ctacggggga |
| 3061 | gacttacccg aaatctgatt tattcaacaa agcc |
DEFINITION клонирующий вектор pTrc99a, полная последовательность.
ACCESSION U13872 (SEQ ID NO:6)
| 1 | dtttgacagc ttatcatcga ctgcacggtg caccaatgct tctggcgtca ggcagccatc |
| 61 | ggaagctgtg gtatggctgt gcaggtcgta aatcactgca taattcgtgt cgctcaaggc |
| 121 | gcactcccgt tctggataat gttttttgcg ccgacatcat aacggttctg gcaaatattc |
| 181 | tgaaatgagc tgttgacaat taatcatccg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga |
| 241 | taacaatttc acacaggaaa cagaccatgg aattcgagct cggtacccgg ggatcctcta |
| 301 | gagtcgacct gcaggcatgc aagcttggct gttttggcgg atgagagaag attttcagcc |
| 361 | tgatacagat taaatcagaa cgcagaagcg gtctgataaa acagaatttg cctggcggca |
| 421 | gtagcgcggt ggtcccacct gaccccatgc cgaactcaga agtgaaacgc cgtagcgccg |
| 481 | atggtagtgt ggggtctccc catgcgagag tagggaactg ccaggcatca aataaaacga |
| 541 | aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc |
| 601 | ctgagtagga caaatccgcc gggagcggat ttgaacgttg cgaagcaacg gcccggaggg |
| 661 | tggcgggcag gacgcccgcc ataaactgcc aggcatcaaa ttaagcagaa ggccatcctg |
| 721 | acggatggcc tttttgcgtt tctacaaact ctttttgttt atttttctaa atacattcaa |
| 781 | atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga |
| 841 | agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc |
| 901 | ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg |
| 961 | gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc |
| 1021 | gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat |
| 1081 | tatcccgtgt tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg |
| 1141 | acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag |
| 1201 | aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa |
| 1261 | cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc |
| 1321 | gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca |
| 1381 | cgatgcctac agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc |
| 1441 | tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc |
| 1501 | tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg |
| 1561 | ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta |
| 1621 | tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag |
| 1681 | gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga |
| 1741 | ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc |
| 1801 | tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa |
| 1861 | agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa |
| 1921 | aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc |
| 1981 | cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt |
| 2041 | agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc |
| 2101 | tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac |
| 2161 | gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca |
| 2221 | gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg |
| 2281 | ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag |
| 2341 | gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt |
| 2401 | ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat |
| 2461 | ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc |
| 2521 | acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt |
| 2581 | gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag |
| 2641 | cggaagagcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca |
| 2701 | tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag tatacactcc |
| 2761 | gctatcgcta cgtgactggg tcatggctgc gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc |
| 2821 | gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg |
| 2881 | gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgaggc agcagatcaa |
| 2941 | ttcgcgcgcg aaggcgaagc ggcatgcatt tacgttgaca ccatcgaatg gtgcaaaacc |
| 3001 | tttcgcggta tggcatgata gcgcccggaa gagagtcaat tcagggtggt gaatgtgaaa |
| 3061 | ccagtaacgt tatacgatgt cgcagagtat gccggtgtct cttatcagac cgtttcccgc |
| 3121 | gtggtgaacc aggccagcca cgtttctgcg aaaacgcggg aaaaagtgga agcggcgatg |
| 3181 | gcggagctga attacattcc caaccgcgtg gcacaacaac tggcgggcaa acagtcgttg |
| 3241 | ctgattggcg ttgccacctc cagtctggcc ctgcacgcgc cgtcgcaaat tgtcgcggcg |
| 3301 | attaaatctc gcgccgatca actgggtgcc agcgtggtgg tgtcgatggt agaacgaagc |
| 3361 | ggcgtcgaag cctgtaaagc ggcggtgcac aatcttctcg cgcaacgcgt cagtgggctg |
| 3421 | atcattaact atccgctgga tgaccaggat gccattgctg tggaagctgc ctgcactaat |
| 3481 | gttccggcgt tatttcttga tgtctctgac cagacaccca tcaacagtat tattttctcc |
| 3541 | catgaagacg gtacgcgact gggcgtggag catctggtcg cattgggtca ccagcaaatc |
| 3601 | gcgctgttag cgggcccatt aagttctgtc tcggcgcgtc tgcgtctggc tggctggcat |
| 3661 | aaatatctca ctcgcaatca aattcagccg atagcggaac gggaaggcga ctggagtgcc |
| 3721 | atgtccggtt ttcaacaaac catgcaaatg ctgaatgagg gcatcgttcc cactgcgatg |
| 3781 | ctggttgcca acgatcagat ggcgctgggc gcaatgcgcg ccattaccga gtccgggctg |
| 3841 | cgcgttggtg cggatatctc ggtagtggga tacgacgata ccgaagacag ctcatgttat |
| 3901 | atcccgccgt taaccaccat caaacaggat tttcgcctgc tggggcaaac cagcgtggac |
| 3961 | cgcttgctgc aactctctca gggccaggcg gtgaagggca atcagctgtt gcccgtctca |
| 4021 | ctggtgaaaa gaaaaaccac cctggcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg |
| 4081 | gccgattcat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg |
| 4141 | caacgcaatt aatgtgagtt agcgcgaatt gatctg |
DEFINITION ген аргининдекарбоксилазы (speA) E.coli, полная cds, ген агмтиназы (speB) и ген метионинаденозилтрансферазы (metK), 5' конец.
ACCESSION M31770 (SEQ ID NO:7)
| 1 | tacccaaggt cgctggtggt gatttcgccg ccaactaaaa ccaatgccgg tttttacgta |
| 61 | ggtttcgcaa gcaacgcgtg ctttcggatc ctgttcgagg atcgcgtcta aaacggcatc |
| 121 | agaaatttgg tcagcaattt tgtcaggatg cccttcagag acggactcgg acgtaaaaag |
| 181 | gtgttttgcc atatttaata tcacctaaag agaatttggt tagctcaaac tgttgtgtgg |
| 241 | attttctgtg gtagcggatc ctaccacgac tctgcaggtt aaaaacactg gcagtctgag |
| 301 | tgttaatcgg tatggatgga ttaacatctg gatggctatt ttaggtcaat tcttcaccct |
| 361 | atttccactt ttttttgaat cgtgtctcat tctgttaaaa acgtggctgg aaatttttcc |
| 421 | tgacaatgcc ggcattctgc gtatttatct tttgcaattt tctgccattg tggggtataa |
| 481 | aacgcggcgc gcggcttaaa taaaaagcac acgacgtttc tttcgtgttg ccacttccag |
| 541 | ccgggttcaa atcagagttt tggcttgtgg gttcgtctta acaggcggcc gtggaggtga |
| 601 | tacgaaataa tgaaccgttg tctgctgctt aacctgtctc accgttctgg tgaagattcg |
| 661 | ttccccgcac tctgcatctc tgctttgcat acctgccgat gttataccca tctcggcgct |
| 721 | tctcaggatt caagagctgg ttacagttac tgaggactga acaagggcgc tcttgtaaaa |
| 781 | acaagagttt tctcgtggtt tcgccgaact ttcacactta cgttcggtta tgtgcttaat |
| 841 | aatgttatga aaaagaaacc ggttgcgcag ttggagcgtc agcattcact gctggaaaat |
| 901 | ccatgtgctt atgggttgtt atcgcagttc caggctgcga tagtcgttaa ctgttttaca |
| 961 | cttaataaaa taatttgagg ttcgctatgt ctgacgacat gtctatgggt ttgccttcgt |
| 1021 | cagcgggcga acacggtgta ctacgctcca tgcaggaggt tgcaatgagc tcccaggaag |
| 1081 | ccagcaagat gctgcgtact tacaatattg cctggtgggg caataactac tatgacgtta |
| 1141 | acgagctggg ccacattagc gtgtgcccgg acccggacgt cccggaagct cgcgtcgatc |
| 1201 | tcgcgcagtt agtgaaaact cgtgaagcac agggccagcg tctgcctgca ctgttctgtt |
| 1261 | tcccacagat cctgcagcac cgtttgcgtt ccattaacgc cgcgttcaaa cgtgcgaggg |
| 1321 | aatcctacgg ctataacggc gattacttcc ttgtttatcc gatcaaagtt aaccagcacc |
| 1381 | gccgcgtgat tgagtccctg attcattcgg gcgaaccgct gggtctggaa gccggttcca |
| 1441 | aagccgagtt gatggcagta ctggcacatg ctggcatgac ccgtagcgtc atcgtctgca |
| 1501 | acggttataa agaccgcgaa tatatccgcc tggcattaat tggcgagaag atggggcaca |
| 1561 | aggtctatct ggtcattgag aagatgtcag aaatcgccat tgtgctggat gaagcagaac |
| 1621 | gtctgaatgt cgttcctcgt ctgggcgtgc gtgcacgtct gcgttcgcag ggttcgggta |
| 1681 | aatggcagtc ctccggcggg gaaaaatcga agttcggcct ggctgcgact caggtactgc |
| 1741 | aactggttga aaccctgcgt gaagccgggc gtctcgacag cctgcaacta ctgcacttcc |
| 1801 | acctcggttc gcagatggcg aatattcgcg atatcgcgac aggcgttcgt gaatccgcgc |
| 1861 | gtttctatgt ggaactgcac aagctgggcg tcaatattca gtgcttcgac gtcggcggcg |
| 1921 | gtctgggcgt ggattatgaa ggtactcgtt cgcagtccga ctgttcggtg aactacggcc |
| 1981 | tcaatgaata cgccaacaac attatctggg cgattggcga tgcgtgtgaa gaaaacggtc |
| 2041 | tgccgcatcc gacggtaatc accgaatcgg gtcgtgcggt gactgcgcat cacaccgtgc |
| 2101 | tggtgtctaa tatcatcggc gtggaacgta acgaatacac ggtgccgacc gcgcctgcag |
| 2161 | aagatgcgcc gcgcgcgctg caaagcatgt gggaaacctg gcaggagatg cacgaaccgg |
| 2221 | gaactcgccg ttctctgcgt gaatggttac acgacagtca gatggatctg cacgacattc |
| 2281 | atatcggcta ctcttccggc atctttagcc tgcaagaacg tgcatgggct gagcagcttt |
| 2341 | atttgagcat gtgccatgaa gtgcaaaagc agctggatcc gcaaaaccgt gctcatcgtc |
| 2401 | cgattatcga cgagctgcag gaacgtatgg cggacaaaat gtacgtcaac ttctcgctgt |
| 2461 | tccagtcgat gccggacgca tgggggatcg accagttgtt cccggttctg ccgctggaag |
| 2521 | ggctggatca agtgccggaa cgtcgcgctg tgctgctgga tattacctgt gactctgacg |
| 2581 | gtgctatcga ccactatatt gatggtgacg gtattgccac gacaatgcca atgccggagt |
| 2641 | acgatccaga gaatccgccg atgctcggtt tctttatggt cggcgcatat caggagatcc |
| 2701 | tcggcaacat gcacaacctg ttcggtgata ccgaagcggt tgacgtgttc gtcttccctg |
| 2761 | acggtagcgt agaagtagaa ctgtctgacg aaggcgatac cgtggcggac atgctgcaat |
| 2821 | atgtacagct cgatccgaaa acgctgttaa cccagttccg cgatcaagtg aagaaaaccg |
| 2881 | atcttgatgc tgaactgcaa caacagttcc ttgaagagtt cgaggcaggt ttgtacggtt |
| 2941 | atacttatct tgaagatgag taagtcctgt gttacttgaa tccgcttaat ttagcggtga |
| 3001 | taatccgcca caatttattg tgacaaatcc aacccttcct cgtcgggcct aacgacgcgg |
| 3061 | aagggttttt ttatatcgac tttgtaatag gagtccatcc atgagcacct taggtcatca |
| 3121 | atacgataac tcactggttt ccaatgcctt tggtttttta cgcctgccga tgaacttcca |
| 3181 | gccgtatgac agcgatgcag actgggtgat tactggcgtg ccgttcgata tggcca |
Таким образом, имея описанные подробно предпочтительные воплощения настоящего изобретения, следует понимать, что изобретение, определенное вышеуказанными положениями, не ограничивается конкретными деталями в вышепредставленном описании, поскольку возможны его явные многочисленные вариации без отступления от сущности или объема настоящего изобретения
1. ДНК-плазмида для доставки и экспрессии представляющих интерес антигена, эпитопа, иммуногена, пептида или полипептида, содержащая ген устойчивости к канамицину (KanaR), которая содержит
(a) последовательность промотора, которая либо
(i) состоит из последовательности SEQ ID NO:1 (P1),
(ii) состоит из модифицированного естественного промотора KanaR из pVR1012, в котором последовательность SEQ ID NO:2 и 3 (Р2/3) была удалена из естественного промотора для получения указанного модифицированного естественного промотора, либо
(iii) состоит из последовательности SEQ ID NO:1, 2 и 3 (P1+P2/P3), либо
(iv) состоит из последовательности SEQ ID NO:2 и 3 (Р2/3); и
(b) инициаторный кодон TTG или ATG; и
где экспрессия KanaR снижается по сравнению с экспрессией KanaR, присущей промотору естественного промотора KanaR, присутствующему в pVR1012 ((Р0, P1 (SEQ ID NO:1), и Р2-Р3 (SEQ ID NO:2-3)).
2. Плазмида по п.1, которая дополнительно содержит терминатор транскрипции rrnB Т1-Т2 (нуклеотиды 532-575 и 707-734 SEQ ID NO:6).
3. Плазмида по п.1, в которой промотор KanaR состоит из P1 (SEQ ID NO:1), и в которой KanaR имеет инициаторный кодон ATG и не имеет терминатора транскрипции.
4. Плазмида по п.1, в которой промотор KanaR состоит из P1 (SEQ ID NO:1), и в которой KanaR имеет инициаторный кодон TTG и не имеет терминатора транскрипции.
5. Плазмида по п.1, в которой промотор KanaR состоит из P1 (SEQ ID NO:1), и в которой KanaR имеет инициаторный кодон TTG и терминатор транскрипции rrnB Т1-Т2, представленный нуклеотидами 532-575 и 707-734 из SEQ ID NO:6.
6. Плазмида по п.1, в которой промотор KanaR состоит из P1 (SEQ ID NO:1), и в которой KanaR имеет инициаторный кодон TTG и терминатор транскрипции rrnB Т1-Т2, представленный нуклеотидами 532-575 и 707-734 из SEQ ID NO:6, и в которой плазмида дополнительно содержит ген env кошачьего вируса иммунодефицита (FIV).
7. Плазмида по п.1, в которой промотор KanaR состоит из P1 (SEQ ID NO:1), и в которой KanaR имеет инициаторный кодон ATG и терминатор транскрипции Т1-Т2 (нуклеотиды 532-575 и 707-734 из SEQ ID NO:6), и в которой плазмида дополнительно содержит ген env кошачьего вируса иммунодефицита (FIV).
8. Плазмида по п.1, в которой промотор KanaR состоит из P1 (SEQ ID NO:1).
9. Плазмида по п.1, в которой промотор KanaR состоит из P1 (SEQ ID NO:1) и Р2-Р3 (SEQ ID NO:2-3).
10. Плазмида по п.1, в которой промотор KanaR состоит из Р2-Р3 (SEQ ID NO:2-3).
11. Плазмида по любому из пп.1, 3, 4 и 8-10, в которой KanaR не имеет терминатора транскрипции.
12. Плазмида по любому из пп.1, 2 и 5-10, в которой KanaR имеет терминатор транскрипции.
13. Композиция для доставки и экспрессии представляющих интерес антигена, эпитопа, иммуногена, пептида или полипептида, которая содержит:
(a) плазмиду по п.1, которая содержит кодирующую последовательность для представляющих интерес антигена, эпитопа, иммуногена, пептида или полипептида, которая функционально связана с последовательностью контроля экспрессии, и
(b) фармацевтически или ветеринарно приемлемый переносчик, носитель или наполнитель.
14. Композиция по п.13, в которой кодирующая последовательность получена из вируса или другого патогена, который инфицирует птиц, крупный рогатый скот, собак, лошадей, кошек или свиней, или является его синтетическим вариантом.
15. Способ стимуляции иммунного ответа у животного, включающий введение эффективного количества композиции по п.13 в клетки животного и экспрессию в клетках представляющих интерес антигена, эпитопа, иммуногена, пептида или полипептида.
16. Способ по п.15, в котором животным является птица, крупный рогатый скот, собака, лошадь, кошка или свинья.
17. Способ индуцирования иммунного ответа у животного, включающий введение эффективного количества композиции по п.13 в клетки животного и экспрессию в клетках представляющих интерес антигена, эпитопа, иммуногена, пептида или полипептида.
18. Способ по п.17, в котором животным является птица, крупный рогатый скот, собака, лошадь, кошка или свинья.
