Способ стерилизации и предимплантационного хранения биологических протезов из ксеногенной и аллогенной ткани для сердечно-сосудистой хирургии

Изобретение относится к области медицины, а именно к сердечнососудистой хирургии и трансплантации. Способ включает экспозицию биопротезов в растворе стерилизующего средства, в качестве которого используют раствор 2-3 -бис(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксида, взятый в концентрациях от 0,1 до 1,0%, при значениях pH от 5,0 до 8,0, и температуре от 16 до 40°C, при этом хранение до имплантации биопротезов из ксеногенной ткани осуществляется в том же стерилизующем средстве, а биопротезов из аллогенной ткани - в криосохраняющей смеси. Изобретение обеспечивает стерильность биопротезов из аллогенной и ксеногенной биоткани, сохраняет их упругопрочностные свойства и не провоцирует возникновение цитотоксичности биологической ткани, а также позволяет существенно сократить время подготовки биологических протезов к имплантации. 5 табл., 9 пр.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к сердечно-сосудистой хирургии, и может быть использовано при стерилизации и хранении биологических протезов клапанов сердца, сосудов и т.п. до момента имплантации.

Под биопротезами для сердечно-сосудистой хирургии понимаются искусственные клапаны сердца и сосуды, изготовленные целиком или частично из биологических тканей в соответствии с ГОСТ Р 52999.1 - 2008 «Протезы клапанов. Часть 1. Общие технические требования и методы испытаний» и международным стандартом ИСО 5840:2005 «Cardiovascular implants - Cardiac valve prostheses», NEQ.

Известен способ стерилизации и предимплантационного хранения биопротезов из ксеногенной ткани (Методические указания по стерилизации ксенобиопротезов раствором глутарового альдегида / Минздрав СССР, №28-6/26 от 19.09.1986 г.), при котором ксенопротезы, подвергнутые химической обработке с целью структурирования тканей, стерилизуют в 0,5% растворе глутарового альдегида. До момента имплантации изделия хранят в том же стерилизующем средстве.

Недостатком данного способа является длительность режима отмывки ксенобиопротезов от стерилизующего средства, что приводит к увеличению времени подготовки биопротезов к имплантации.

Известен способ стерилизации и предимплантационного хранения биопротезов из ксеногенной ткани (Бюллетень НЦССХ им. А. Н. Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания», том 5, №11, 2004 г.), при котором биопротезы, изготовленные из химически стабилизированной ксеногенной ткани, стерилизуют в 4% растворе формалина, до момента имплантации готовые изделия хранят в том же стерилизующем средстве.

Недостатком данного способа также является длительность режима отмывки ксенопротезов от стерилизующего средства, что приводит к увеличению времени подготовки биопротезов к имплантации.

Известен способ стерилизации и предимплантационного хранения биологических протезов клапанов сердца и сосудов в 0,01-2,0% растворе 2-бром-2-нитропропан-1,3-диола на фосфатном буфере (RU, патент №2357766 C2, МПК⁷ А61L 27/00, опубликован 10.06.2009 г.), при котором предварительно консервированные биологические протезы помещают в 0,01-2,0% раствор 2-бром-2-нитропропан-1,3-диола, приготовленного на фосфатном буфере, и хранят в этом растворе до момента имплантации.

К недостаткам данного способа следует отнести тот факт, что препарат 2-бром-2-нитропропан-1,3-диол не обладает спороцидным действием, вследствие чего не может обеспечить стерилизующий эффект.

Известен способ стерилизации биопротезов клапанов сердца и сосудов из аллогенной ткани в смеси антибиотиков (Бритиков Д. В. Оптимизация технологии изготовления криосохраненных аллографтов и первый опыт их клинического применения: дис. д-ра мед. наук. М., 2004), при котором девитализированные (RU, патент №2291675 С2, МПК⁷ A01N 1/02, опубл. 20.01.2007 г.) биопротезы и сосуды из аллогенной ткани помещают в смесь антибиотиков. До момента имплантации биопротезы хранят в криогенных условиях в криосохраняющей смеси.

Недостатком данного способа является то, что антибиотики неэффективны в отношении вирусов, спорообразующих и резистентных форм микроорганизмов, и обработка в смеси антибиотиков не гарантирует полное обеспложивание биопротезов из аллогенной ткани.

Техническим результатом данного изобретения является создание универсального способа стерилизации биологических протезов, изготовленных из ксеногенной и аллогенной ткани, и сокращение времени подготовки биопротезов, выполненных из ксеногенной ткани, к имплантации.

Способ осуществляют следующим образом. Стерилизующий раствор 2--3-бис(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксида применяют в виде готовой формы или получают разведением в инъекционной воде в концентрации 0,1-1,0% при pH 5,0-8,0.

Биопротез клапана сердца или сосуда, изготовленный из химически стабилизированной ксеногенной ткани, помещают для стерилизации и хранения до момента имплантации в раствор 2-3-бис(гидроксиметил)-хиноксалин-1,4-диоксида при температуре от 16 до 40°C. Перед имплантацией биопротез помещают в 500 мл стерильного 0,9% раствора хлорида натрия не менее чем на 30 секунд.

Биопротез клапана сердца или сосуда, изготовленный из аллогенной ткани, девитализируют и помещают для стерилизации в раствор 2-3-бис(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксида при температуре от 16 до 40°C. После экспозиции в стерилизующем растворе биопротез из аллогенной ткани промывают в 200 мл стерильного 0,9% раствора хлорида натрия, помещают в криосохраняющую смесь и хранят в криогенных условиях.

Технический результат данного изобретения достигается тем, что в способе стерилизации и предимплантационного хранения биологических протезов из ксеногенной и аллогенной ткани для сердечно-сосудистой хирургии, включающем экспозицию биопротезов в растворе стерилизующего средства, хранение до имплантации биопротезов из ксеногенной ткани в том же стерилизующем средстве, а биопротезов из аллогенной ткани в криосохраняющей смеси, в качестве стерилизующего средства используют раствор 2-3-бис(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксида, взятый в концентрациях от 0,1 до 1,0%, при значениях pH от 5,0 до 8,0 и температуре от 16 до 40°C.

Используемый раствор 2-3-бис(гидроксиметил)хиноксалин-1,4--диоксида зарегистрирован как лекарственный препарат, выпускается в виде готовых форм: 0,5% раствора для внутривенного введения и 1,0% раствора для внутриполостного введения и местного применения, имеет торговое название «Диоксидин» и относится к противомикробным средствам из группы производных хиноксалина. Диоксидин характеризуется бактерицидным типом действия, широким антибактериальным спектром: активен в отношении грамотрицательных и грамположительных аэробных условно-патогенных бактерий - возбудителей гнойной инфекции, а также в отношении некоторых облигатных патогенов; наиболее высокую активность проявляет в отношении широкого спектра облигатных анаэробов - спорообразующих и не образующих споры; используется для лечения различных форм гнойной инфекции и тяжелых септических состояний (Е.Н. Падейская. Инфекция и антимикробная терапия. 2001, №5, с.150-155). Препарат подробно изучен в экспериментальных и клинических исследованиях, но в то же время отсутствуют какие-либо литературные данные об активности диоксидина в отношении контролируемой микробной нагрузки биологической ткани. Изучение антимикробной активности диоксидина в отношении резистентных госпитальных штаммов, а также спорообразующих музейных культур, таких как В. cereus, адгезированных на поверхность биологической ткани, позволит судить о наличии стерилизующего эффекта и возможности использования препарата диоксидина в качестве стерилизующего средства.

Для оценки стерилизующего эффекта были проведены микробиологические испытания: образцы ксеногенной и аллогенной биоткани, контаминированные штаммами культур S. epidermidis, Е. coli, Ps. aeruginosa, В. cereus, С. albicans в критически значимых концентрациях, были помещены в растворы 2-3-бис(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксида. По окончании экспозиции оценивали бионагрузку (количество жизнеспособных микробных клеток соответствующих культур) исследуемых образцов биоткани (ГОСТ Р ИСО 11737-1-2000 «Оценка популяции микроорганизмов на продукции»). Результаты испытаний приведены в таблице 1.

Таблица 1.
Микробиологические исследования
Тест-микроорганиз- мы	Антимикробная активность 2-3-бис(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксида в различных концентрациях (%)
	менее 0,1	0,1	0,5	1,0
	Вид ткани	Вид ткани	Вид ткани	Вид ткани
ксен.	аллог	ксен.	аллог.	ксен.	аллог.	ксен.	аллог.
S. epidermidis	спл. рост*	спл. рост	р/н	р/н	р/н	р/н	р/н	р/н
Е. coli	спл. рост	спл. рост	р/н	р/н	р/н	р/н	р/н	р/н
Ps. aeruginosa	спл. рост	спл. рост	р/н	р/н	р/н	р/н	р/н	р/н
В. cereus	спл. рост	спл. рост	р/н	р/н	р/н	р/н	р/н	р/н
С. albicans	спл. рост	спл. рост	ед. клетки	р/н	р/н	р/н	р/н	р/н
Примечание: Спл. рост - сплошной рост культур тест-микроорганизмов; р/н (роста нет) - отсутствует рост культур тест-микроорганизмов; ед. клетки - наблюдается рост единичных клеток культуры соответствующего микроорганизма.

В результате исследования выявлено, что применение 2-3-бис(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксида в пределах 0,1-1,0% раствора обусловлено тем, что концентрация ниже 0,1% не оказывает стерилизующего эффекта, а использование концентрации раствора свыше 1% нетехнологично в виду малой растворимости 2-3-бис(гидроксиметил)-хиноксалин-1,4-диоксида в воде (Государственная Фармакопея XI. Растворимость).

Использование раствора 2-3-бис(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксида с pH 5,0-8,0 близко к физиологическим значениям, что позволяет сохранять неизменной структуру и прочностные характеристики биологической ткани. Значение pH раствора 2-3-бис(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксида обусловлено химическими свойствами субстанции гидроксиметилхиноксалиндиоксида и зависит от способа ее получения, поэтому у разных производителей субстанции препарата в спецификации значения pH могут варьировать от 5,0 до 8,0.

Проведение стерилизации биопротезов при температуре раствора 2-3-бис(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксида от 16 до 40°C обусловлено тем, что при температуре раствора ниже 16°C вследствие снижения растворимости возможно выпадение кристаллов 2-3-бис(гидроксиметил)-хиноксалин-1,4-диоксида (Инструкция по медицинскому применению диоксидина). Увеличение температуры стерилизующего раствора выше 40°C может оказывать повреждающее действие на структуру биологической ткани протезов.

Представленные данные свидетельствуют о том, что 0,1-1,0% раствор 2-3-бис(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксида проявляет высокую антимикробную активность, и предложенный метод обеспечивает стерилизующий эффект.

Для оценки возможности предимплантационного хранения биопротезов из ксеногенной ткани в 0,1-1,0% растворе 2-3-бис(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксида были проведены исследования по оценке стерильности биопротезов из ксеногенной ткани, хранившихся в соответствующих растворах 2-3-бис(гидроксиметил)-хиноксалин-1,4-диоксида в течение гарантийного срока хранения (ГОСТ 26997-2003 «Клапаны сердца искусственные. Общие технические условия»; ТУ 9444-002-01897446-2001, ТУ 9444-003-01897446-2001, ТУ 9444-004-01897446-2001). Данные исследования приведены в таблице 2.

Таблица 2.
Оценка стерильности биопротезов из ксеногенной ткани, хранившихся в растворах 2-3-бис(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксида в течение гарантийного срока хранения
Образцы биопротезов из ксеногенной ткани	2-3-бис(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксид в различных концентрациях (%)	Сроки хранения, мес.
	2	5	7	9	12
	0,1	стер.	стер.	стер.	стер.	стер.
	0,5	стер.	стер.	стер.	стер.	стер.
1,0	стер.	стер.	стер.	стер.	стер.
Примечание: стер. - стерильно.

Представленные данные свидетельствуют о том, что при хранении биопротезов из ксеногенной ткани в 0,1-1,0% растворе 2-3-бис(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксида в течение гарантийного срока хранения их стерильность сохраняется.

Для оценки влияния 0,1-1,0% раствора 2-3-бис(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксида на свойства химически стабилизированной биоткани были проведены сравнительные упругопрочностные исследования биопротезов из ксеногенной ткани, изготовленных из химически стабилизированной ксеногенной ткани и стерилизованных в 4% растворе формалина, и биопротезов из ксеногенной ткани, стерилизованных и хранящихся в растворе 2-3-бис(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксида (ГОСТ 9550-81 «Методы определения упругости при растяжении, сжатии и изгибе», ГОСТ 11262-80 «Метод испытания на растяжение»). Данные исследования приведены в таблице 3.

Для оценки влияния 0,1-1,0% раствора 2-3-бис(гидроксиметил)-хиноксалин-1,4-диоксида на свойства аллогенной биологической ткани сердечных клапанов были проведены сравнительные упругопрочностные исследования створок аортальных клапанов, стерилизованных растворами антибиотиков и стерилизованных раствором 2-3-бис(гидроксиметил)-хиноксалин-1,4-диоксида. Данные исследования приведены в таблице 4.

Таблица 4.
Упругопрочностные свойства аллогенной ткани
Вид аллогенной ткани	σпч, предел прочности осевой, МПа	σпч, предел прочности радиальный, МПа
Аортальные створки, стерилизация антибиотиками	3,85±0,76	0,75±0,10
Аортальные створки, стерилизация в растворе 2-3-бис(гидроксиметил) хиноксалин-1,4-диоксида	3,98±0,39	0,78±0,11

Представленные данные свидетельствуют о том, что предложенный способ стерилизации 0,1-1,0% раствором 2-3-бис(гидроксиметил)-хиноксалин-1,4-диоксида не снижает механической прочности биологической ткани протезов.

Для оценки влияния 0,1-1,0% раствора 2-3-бис(гидроксиметил)-хиноксалин-1,4-диоксида на свойства аллогенной и ксеногенной биологической ткани были проведены токсикологические исследования (ГОСТ Р ИСО 10993.5-99 «Исследование на цитотоксичность: методы in vitro»). Данные исследования приведены в таблице 5.

Таблица 5.
Токсикологические исследования аллогенной и ксеногенной ткани
Вид ткани	Способ стерилизации	Наименование показателя	Количество выживших клеток, %
допустимое значение	результат испытаний
ксеноген- ная ткань	4% р-р формалина	Цитотоксичность на суспензионной кратковременной культуре подвижных клеток	70-120	50±5
ксеноген- ная ткань	р-р 2-3-бис(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксида	70-120	85±5
аллогенная ткань	р-р 2-3-бис(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксида	Цитотоксичность на суспензионной кратковременной культуре подвижных клеток	70-120	85±5

Представленные данные подтверждают, что предложенный способ стерилизации и хранения в 0,1-1,0% растворе 2-3-бис(гидроксиметил)-хиноксалин-1,4-диоксида не провоцирует возникновение цитотоксичности аллогенной и ксеногенной биологической ткани.

Таким образом выявлено, что раствор 2-3-бис(гидроксиметил)-хиноксалин-1,4-диоксида обладает высокой бактерицидной и спороцидной активностью, не оказывает негативного воздействия на структуру и свойства биологического материала, что подтверждается полученными результатами. Ниже приведены конкретные примеры осуществления предлагаемого способа.

Пример 1.

Биопротез в виде пластины площадью 30 см и толщиной 0,4-0,5 мм, изготовленный из химически стабилизированного перикарда теленка, помещают для стерилизации и хранения до момента имплантации в 125 мл 1% раствора 2-3-бис(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксида при pH 5,0 и температуре раствора 16°С. Перед имплантацией биопротез помещают в 500 мл стерильного 0,9% раствора хлорида натрия на 40 секунд.

1% раствор 2-3-бис(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксида применяют в виде готовой формы, при необходимости корректируя значения pH.

Пример 2.

Биопротез в виде пластины площадью 20 см² и толщиной 0,2-0,4 мм, изготовленный из химически стабилизированного перикарда свиньи, помещают для стерилизации и хранения до момента имплантации в 100 мл 0,1% раствора 2-3-бис(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксида при pH 6,0 и температуре 23°C. Перед имплантацией биопротез помещают в 500 мл стерильного 0,9% раствора хлорида натрия на 35 секунд.

0,1% раствор 2-3-бис(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксида получают разведением в инъекционной воде готовой формы 1% раствора 2-3-бис(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксида, при необходимости корректируя значения pH.

Пример 3.

Биопротез в виде пластины площадью 25 см² и толщиной 0,2-0,4 мм, изготовленный из химически стабилизированной глиссоновой капсулы теленка, помещают для стерилизации и хранения до момента имплантации в 120 мл 0,1% раствора 2-3-бис(гидроксиметил)хиноксалин-1,4--диоксида при pH 7,0 и температуре 30°C. Перед имплантацией биопротез помещают в 500 мл стерильного 0,9% раствора хлорида натрия на 30 секунд.

0,1% раствор 2-3-бис(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксида получают разведением в инъекционной воде готовой формы 1% раствора 2-3-бис(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксида, при необходимости корректируя значения pH.

Пример 4.

Биопротез в виде биологического клапана с посадочным диаметром 22 мм и толщиной стенки легочного ствола 0,2-0,3 мм, изготовленный из химически стабилизированного легочного комплекса свиньи, помещают для стерилизации и хранения до момента имплантации в 200 мл 0,5% раствора 2-3-бис(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксида при pH 8,0 и температуре 35°C. Перед имплантацией биопротез помещают в 500 мл стерильного 0,9% раствора хлорида натрия на 45 секунд.

0,5% раствор 2-3-бис(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксида получают разведением в инъекционной воде готовой формы 1% раствора 2-3-бис(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксида, корректируя значения pH.

Пример 5.

Биопротез в виде участка аллогенной аорты с аортальным клапаном девитализируют и помещают для стерилизации в 200 мл 0,5% раствора 2-3-бис(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксида при pH 7,5 при температуре 20°C. После экспозиции в стерилизующем агенте аллогенный аортальный клапан промывают в 200 мл стерильного 0,9% раствора хлорида натрия и помещают в криосохраняющую смесь и хранят в криогенных условиях до имплантации.

0,5% раствор 2-3-бис(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксида получают разведением в инъекционной воде готовой формы 1% раствора 2-3-бис(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксида, при необходимости корректируя значения pH.

Пример 6.

Биопротез в виде участка аллогенной легочной артерии с легочным клапаном девитализируют и помещают для стерилизации в 200 мл 1,0% раствора 2-3-бис(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксида при pH 8,0 и температуре 25°C. После экспозиции в стерилизующем агенте аллогенный легочный клапан промывают в 200 мл стерильного 0,9% раствора хлорида натрия и помещают в криосохраняющую смесь и хранят в криогенных условиях до имплантации.

1% раствор 2-3-бис(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксида применяют в виде готовой формы, корректируя значения pH.

Пример 7.

Биопротез в виде аллогенного митрального клапана с хордальным аппаратом и головками сосочковых мышц девитализируют и помещают для стерилизации в 200 мл 1,0% раствора 2-3-бис(гидроксиметил)-хиноксалин-1,4-диоксида при pH 7,4 и температуре 20°C. После экспозиции в стерилизующем агенте аллогенный митральный клапан промывают в 200 мл стерильного 0,9% раствора хлорида натрия и помещают в криосохраняющую смесь и хранят в криогенных условиях до имплантации.

1% раствор 2-3-бис(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксида применяют в виде готовой формы, при необходимости корректируя значения pH.

Пример 8.

Биопротез в виде участка аллогенного венозного сосуда девитализируют и помещают для стерилизации в 200 мл 0,5% раствора 2-3-бис(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксида при pH 7,4 и температуре 20°C. После экспозиции в стерилизующем агенте аллогенный сосуд с венозным клапаном промывают в 200 мл стерильного 0,9% раствора хлорида натрия и помещают в криосохраняющую смесь и хранят в криогенных условиях до имплантации.

0,5% раствор 2-3-бис(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксида получают разведением в инъекционной воде готовой формы 1% раствора 2-3-бис(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксида, при необходимости корректируя значения pH.

Пример 9.

Биопротез в виде участка аллогенного артериального сосуда девитализируют и помещают для стерилизации в 200 мл 0,1% раствора 2-3-бис(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксида при pH 7,5 и температуре 20°C. После экспозиции в стерилизующем агенте аллогенный артериальный сосуд промывают в 200 мл стерильного 0,9% раствора хлорида натрия и помещают в криосохраняющую смесь и хранят в криогенных условиях до имплантации.

0,1% раствор 2-3-бис(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксида получают разведением в инъекционной воде готовой формы 1% раствора 2-3-бис(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксида, при необходимости корректируя значения pH.

Таким образом, изобретение обеспечивает достижение технического результата, а именно позволяет создать универсальный способ стерилизации биологических протезов, изготовленных как из ксеногенной, так и из аллогенной ткани, возможность осуществлять предимплантационное хранение протезов из ксеногенной ткани в том же стерилизующем средстве, а также сократить время подготовки биопротезов, выполненных из ксеногенной ткани, к имплантации.

Способ стерилизации и предимплантационного хранения биологических протезов из ксеногенной и аллогенной ткани для сердечно-сосудистой хирургии, включающий экспозицию биопротезов в растворе стерилизующего средства, хранение до имплантации биопротезов из ксеногенной ткани в том же стерилизующем средстве, а биопротезов из аллогенной ткани в криосохраняющей смеси, отличающийся тем, что в качестве стерилизующего средства используют раствор 2-3-бис(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксида, взятый в концентрациях от 0,1 до 1,0% при значениях pH от 5,0 до 8,0 и температуре от 16 до 40°C.