Способ получения хондроитина сульфата из тканей морских гидробионтов

Изобретение относится к биохимии и биотехнологии, в частности к способам получения хондроитина сульфата из тканей морских гидробионтов, таких как хрящевая ткань рыб. Способ предусматривает подготовку сырья к ферментативному гидролизу. Проводят щелочной гидролиз протеолитическими ферментными препаратами с нейтрализацией полученного раствора до рН 7. В полученный ферментативный гидролизат добавляют соль до значения не менее 0.1 моль/л. Проводят его последовательную ультрафильтрацию сначала на мембране с пределом задержания 50 кДа с отделением высокомолекулярной примеси, затем на мембране с пределом задержания 5 кДа с отделением низкомолекулярных веществ. Промывают удержанный на мембране раствор хондроитина сульфата на той же мембране дистиллированной водой до полного удаления солей. Осуществляют окончательную промывку дистиллированной водой на мембране с пределом задержания 50 кДа. Изобретение позволяет получить препарат хондроитина сульфата с массовой долей основного вещества 90-95%. 7 пр.

 

Изобретение относится к рыбной промышленности, в частности к способам получения хондроитина сульфата из тканей морских гидробионтов, таких как хрящевая ткань рыб, мышечно-мускульный мешок моллюсков и др., и может быть использовано в пищевой, косметической отраслях промышленности, в медицине.

Основные свойства хондроитина сульфата, имеющие определяющее значение для его успешного применения в различных областях, - высокая биодоступность, биологическая совместимость, низкая токсичность, способность к избирательному накоплению в ткани хряща (Kofuji К., Ito Т., Murata Y., Kawashima S. Effect of chondroitin sulfate on the biodegradation and drug release of chitosan gel beads in subcutaneous air pouches of mice // Biological and Pharmaceutical Bulletin. - 2002. - Vol.25, No. 2. - P. 268-271). Перечисленные свойства определяются химическим строением молекул хондроитина сульфата, а именно молекулярной массой, степенью и местом сульфатирования. (Michelacci Y. M., Dietrich С.Р. Structure of chondroitin sulphate from whale cartilage: distribution of 6- and 4-sulphated oligosaccharides in the polymer chains // International Journal of Biological Macromolecules. -1986. - Vol.8, No. 2. - P. 108-113. Toida Т., Amornrut C., Linhardt R. J. Structure and bioactivity of sulfated polysaccharides // Trends in Glycoscience and Glycotechnology.-2003.-Vol.15, No. 81.-P. 29-46).

Для получения хондроитина сульфата наиболее широко применяется известный способ, предусматривающий растворение хондроитина сульфата в щелочной среде, ферментативный гидролиз белков, отделение высокомолекулярной углеводной фракции осаждением от низкомолекулярных продуктов гидролиза белка, остающихся в растворе, промывку полученного осадка и сушку готового продукта (Takai М., Kono Н. Salmon-origin chondroitin sulfate: European Patent EP 1270599, МПК A61K 31/737. Заявл. 15.12.2000; № EP 20000981747; опубл. 02.01.2003).

Эта общепринятая технология реализуется различными авторами по-разному: изменяется последовательность, количество операций, температурные режимы, природа и концентрации используемых реагентов.

Наиболее близким техническим решением является способ получения хондроитина сульфата с применением ультрафильтрации (Khare А. В., Houliston S. A., Black Т. J. Isolating chondroitin sulfate: USPTO Application 20070166798. - Заявл. 14.02.2007; №11/674695; опубл. 07/19/2007).

Этот способ получения хондроитина сульфата включает сбор (подготовку) исходного сырья, включающего соединительную ткань, гидролиз исходного сырья протеолитическими ферментными препаратами для получения раствора гидролизата и нерастворенного вещества, обработку жидкого гидролизата реактивом, включающим гидроокись двухвалентного щелочноземельного металла с рН больше 10 для осаждения примеси белка из гидролизата, отделение, по крайней мере, части осадка от раствора гидролизата и обработку жидкого гидролизата с использованием мембраны с образованием фильтрата (пермеата) низкомолекулярных веществ и «задержанного» концентрата, в котором содержится высокомолекулярная фракция - хондроитина сульфат. В патенте предложено использовать мембраны с молекулярно-массовым пределом задерживания от 5 до 15 кДа (лучше от 8 до 10 кДа).

Продукт, полученный таким способом, является концентратом, который в числе прочих веществ содержит хондроитин сульфат. Таким образом, степень очистки целевого продукта недостаточно высока.

Заявляемый способ также основан на ультрафильтрационном разделении фракций гидролизата с различными молекулярными массами и использует свойство высокомолекулярных молекул хондроитина сульфата отделяться от низкомолекулярных продуктов гидролиза белков на ультрафильтрационных мембранах.

Технический результат настоящего способа заключается в повышении степени очистки целевого продукта путем использования способности молекул хондроитина сульфата сильно изменять гидродинамический радиус при изменении ионной силы раствора (концентрации электролита, например, NaCl), что позволяет достичь более высокой по сравнению с прототипом очистки целевого продукта путем последовательной ультрафильтрации полученного гидролизата на мембранах с разным порогом задерживания.

В качестве сырья для получения хондроитина сульфата может быть использовано содержащее хрящевые ткани сырье, полученное в результате переработки различных морских гидробионтов. При использовании мороженого сырья предварительно проводят его дефростацию.

Подготовленное сырье измельчают и загружают в реакционную емкость, в которой проводят щелочной, а затем и ферментативный гидролиз.

Гидролизат хрящевой ткани содержит различные продукты расщепления белков, соли, высокомолекулярные полисахариды (хондроитина сульфат).

Растворение щелочерастворимых веществ, включая белки и хондроитина сульфат, проводят при температуре от 25 до 50°С в течение 3 ч при постоянном перемешивании.

После окончания щелочного гидролиза смесь нейтрализуют до рН 7 и отделяют нерастворившийся осадок фильтрованием или центрифугированием.

Проведение щелочного гидролиза обеспечивает предварительное отделение нерастворившихся примесей и, как следствие, способствует увеличению выхода целевого продукта, повышению его чистоты.

В полученный раствор добавляют ферментный препарат (ФП) или предварительно приготовленный раствор ФП с протеолитической активностью, например ферментный препарат, полученный из гепатопанкреаса камчатского краба.

Ферментативный гидролиз белков проводят при оптимальных для данного ФП температуре инкубационной смеси и продолжительности обработки (при использовании ФП из гепатопанкреаса камчатского - температура от 45 до 55°С и продолжительность гидролиза от 4 до 8 ч), отделяют твердый осадок.

В полученный раствор добавляют соль, например хлорид натрия, доводя концентрацию соли до 0,1 моль.

Затем проводят ультрафильтрацию раствора через мембрану с молекулярно-массовым пределом задерживания менее 50 кДа для отделения оставшихся после гидролиза высокомолекулярных белков и взвешенных частиц.

Сконцентрированный раствор, содержащий хондроитина сульфат, промывают раствором соли, например хлорида натрия или другой соли с концентрацией 0,1 моль/л.

Для этого в полученный раствор добавляют хлорид натрия или другую соль для поддерживания ее концентрации в растворе до значения не менее 0,1 моль/л. Если после нейтрализации щелочи концентрация NaCl выше указанной, то дополнительное количество хлористого натрия не добавляют.

При концентрации NaCl в растворе выше 0,1 моль/л молекулы хондроитина сульфата сильно глобулированы, что не позволяет разделить компоненты гидролизата.

Используемая концентрация соли обеспечивает уменьшение гидродинамического радиуса молекул хондроитина сульфата и возможность их прохождения через мембрану с молекулярно-массовым пределом задерживания меньше 50 кДа, при этом на мембране задерживаются не гидролизованные белки, например коллаген.

Полученный раствор хондроитина сульфата, низкомолекулярных пептидов, аминокислот и солей подвергают ультрафильтрационному разделению на мембране с молекулярно-массовым пределом задерживания 5 кДа, обеспечивающей задержание молекул хондроитина сульфата и отделение молекул солей, аминокислот и низкомолекулярных пептидов.

Известно, что при снижении концентрации соли в растворе менее 0,001 моль/л, например NaCl, молекулы хондроитина сульфата разворачиваются, что приводит к увеличению их гидродинамического радиуса. Максимальный радиус наблюдается в дистиллированной воде.

Удержанный на мембране хондроитина сульфат промывают дистиллированной водой, в результате концентрация соли снижается и молекулы хондроитина сульфата, гидродинамический радиус которых при этом значительно увеличился, могут быть сконцентрированы на мембранах с молекулярно-массовым пределом задерживания 50 кДа.

На мембране с пределом задержания 50 кДа хондроитина сульфат окончательно промывают дистиллированной водой от оставшихся пептидов средней молекулярной массы и осуществляют концентрирование его раствора путем ультрафильтрации.

Высокомолекулярная фракция хондроитина сульфата концентрируется на мембране, а низкомолекулярные пептиды и аминокислоты проходят через нее.

Полученный концентрированный раствор хондроитина сульфата далее используется для выделения сухого препарата или в качестве раствора при приготовлении препаратов с хондроитина сульфатом.

Выделение сухого ходроитина сульфата осуществляется осаждением при добавлении избытка осадителя (например, этилового спирта) или высушиванием (сублимирование, распылительная сушка и др.).

Например, полученный раствор осаждают добавлением спирта в соотношении 1:2, выдерживают до полного осаждения хондроитина сульфата, отделяют осадок фильтрованием или центрифугированием, промывают спиртом, ацетоном, сушат в сублимационной сушилке, вакуумной или иной сушилке.

Получают препарат очищенного хондроитина сульфата с массовой долей основного вещества не менее 90%.

Целевой продукт - хондроитина сульфат представляет собой белый аморфный порошок без запаха, гигроскопичный, массовая доля воды не более 10%, массовая доля хондроитина сульфата составляет 90-95%

Определение массовой доли основного вещества проводили методом кислотного гидролиза в соляной кислоте (26% НСl, 100°С, 1 ч) и определения образовавшейся глюкуроновой кислоты методом Дише.

Идентификацию проводили методом инфракрасной спектроскопии. В качестве стандарта использовали препарат хондроитина 6-сульфат натриевую соль из хряща акулы (Каталог «Fluka», кат. №27043-1G-F).

Результаты сравнения показали, что образцы хондроитина сульфата, полученные по заявляемому способу, имеют практически схожие показатели с показателями стандартного образца, что подтверждает высокую степень очистки целевого продукта.

Использование ультрафильтрации возможно сразу при выделении препарата хондроитина сульфата после ферментативного гидролиза сырья или при очистке осажденного этанолом препарата, после его растворения в воде.

Примеры осуществления способа

Пример 1

Получение хондроитина сульфата из хрящей семги

1) Сырье - носовой хрящ семги извлекли из голов, очистили от остатков окружающих тканей, измельчили.

2) 400 г измельченного сырья загрузили в колбу с 1600 г раствора NaOH (0.2 моль/дм³), нагрели на кипящей водяной бане до 37°С и при этой температуре в течение 3 ч при постоянном перемешивании провели растворение щелочерастворимых веществ.

3) После окончания процесса смесь нейтрализовали до рН 7 при помощи 0.1 н. уксусной кислоты.

4) Отделили не растворившийся осадок на центрифуге при 5000 об^-1.

5) В гидролизат загрузили ферментный препарат гепатопанкреаса камчатского краба из расчета 3 г на 1 кг сырья. Ферментативный гидролиз проводили при температуре 50°С в течение 5 часов. Осадок отделили на центрифуге при 5000 об^-1.

Используемый ферментный препарат был получен из гепатопанкреса камчатского краба Paralithodes Camtschaticus по известной технологии (Сахаров, И.Ю. Способ получения коллагеназы. /И.Ю.Сахаров А.В.Джунковская, А.А.Артюков, В.В.Сова, О.Г.Саканделидзе, Э.П.Козловская. Институт иммунологии и Тихоокеанский институт биоорганической химии: а.с. SU 1343591 А1, МКИ4 А61К 35/56. - Заявл. 13.12.85; №3992368 /28-14. - 2 с.) и имел протеолитическую активность по казеинату натрия А=280 мкмоль тирозина*г^-1*мин^-1. (Субстрат: 1%-ный раствор казеината натрия. Фермент: 1 мг/мл раствор ФП. Условия инкубирования: 37°С, 10 мин.)

6) Провели ультрафильтрацию раствора через мембрану 50 кДа. Промыли сконцентрированный раствор раствором хлорида натрия с концентрацией 0,1 моль/л. (Для увеличения ионной силы в гидролизат добавили 9.36 г хлорида натрия.)

7) Затем полученный раствор хондроитина сульфата, низкомолекулярных пептидов, аминокислот и солей подвергли ультрафильтрационному разделению на мембране 5 кДа, обеспечивающей задерживание молекул хондроитина сульфата.

8) Промывка дистиллированной водой. Раствор хондроитина окончательно промыли на мембране 50 кДа от оставшихся пептидов средней молекулярной массы.

9) Окончательно раствор хондроитина сульфата сконцентрировали ультрафильтрацией.

10) Полученный раствор осадили добавлением спирта в соотношении 1:2, выдержали раствор в течение 20 часов.

11) Отделили осадок центрифугированием при 5000 об^-1, промыли 100 мл спирта.

12) Полученное вещество высушили в сублимационной сушилке.

Получили 6,15 г сухого хондроитина сульфата, массовая доля основного вещества, определенная по реакции с карбазолом (метод Дише), 91%.

Пример 2

Получение хондроитина сульфата из хрящей акулы

То же, что в примере 1, но в качестве сырья использовали хрящи акулы.

Получили 6,15 г сухого хондроитина сульфата, массовая доля основного вещества 93%.

Пример 3

Получение хондроитина сульфата из хрящей северного ската

То же, что в примере 1, но в качестве сырья использовали хрящи северного ската. Проводили предварительное обезжиривание сырья ацетоном. В пункте 5 ферментативный гидролиз проводили в две стадии по 3 часа с дополнительным введением ферментного препарата соответственной концентрации.

Получили 5,43 г сухого хондроитина сульфата, массовая доля основного вещества 92%.

Пример 4

Очистка хондроитина сульфата из хрящей семги

Хондроитина сульфат, полученный способом из примера 1, за исключением пунктов 6-9, снова растворили в 500 мл дистиллированной воды, добавили 2,93 г хлористого натрия, раствор перемешали в течение 60 мин. Затем провели ультрафильтрационную обработку раствора, как описано в примере 1 в п.6-9 и далее 10-12.

Получили 5,85 г сухого хондроитина сульфата, массовая доля основного вещества 94%.

Пример 5

Получение хондроитина сульфата из хрящей семги

То же, что в примере 1, но в качестве щелочи для проведения операции по п.2) вместо NaOH использовали гидроксид калия КОН (0,2 моль/дм³). При ультрафильтрации по п.6) вместо NaCl использовали 0,1 моль/дм³ раствор хлористого калия КСl.

Получили 6,10 г сухого хондроитина сульфата, массовая доля основного вещества 92%.

Пример 6

Получение хондроитина сульфата из хрящей семги

То же, что в примере 1, но вместо NaCl при ультрафильтрации по п.6) использовали 0,05 моль/дм³ раствор хлористого кальция.

Получили 6,15 г сухого хондроитина сульфата, массовая доля основного вещества 91%.

Пример 7

Получение хондроитина сульфата из хрящей семги

То же, что в примере 1, но вместо ферментного препарата из гепатопанкреаса камчатского краба использовали протосубтилин Г3Х из расчета 4,5 г на 1 кг сырья (активность протосубтилина Г3Х по отношению к рыбному белку была в 1,5 раза ниже, чем активность ФП из гепатопанкреаса камчатского краба).

Получили 6,35 г сухого хондроитина сульфата, массовая доля основного вещества 89%.

Изобретение позволяет получать препарат хондроитина сульфата с массовой долей основного вещества не менее 90% (90-95%), а также увеличить выход целевого продукта.

Способ получения хондроитина сульфата из тканей морских гидробионтов, предусматривающий подготовку сырья к ферментативному гидролизу, гидролиз протеолитическими ферментными препаратами с осаждением примеси белка и отделением осадка от раствора гидролизата, выделение целевого продукта посредством ультрафильтрации, отличающийся тем, что предварительно проводят щелочной гидролиз с нейтрализацией полученного раствора до рН 7 и отделением твердого осадка, в ферментативный гидролизат добавляют соль до значения не менее 0,1 моль/л, проводят ультрафильтрацию ферментативного гидролизата на мембране с пределом задержания 50 кДа и отделение высокомолекулярной примеси, полученный раствор при концентрации соли в нем не менее 0,1 моль/л подвергают ультрафильтрации на мембране с пределом задержания 5 кДа и отделяют низкомолекулярные вещества, удержанный на мембране хондроитина сульфат промывают на той же мембране дистиллированной водой до полного удаления солей, затем проводят промывку дистиллированной водой и концентрирование раствора хондроитина сульфата путем ультрафильтрации на мембране с пределом задержания 50 кДа.