Способ генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с противоопухолевой активностью

Изобретение раскрывает способ генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с активностью против клеток колоректального рака. Из периферической крови пациентов больных колоректальным раком выделяют прилипающую фракцию мононуклеарных клеток (МНК) и культивируют их в среде определенного состава для получения незрелых дендритных клеток (ДК). В процессе культивирования к последним добавляют опухолевый антиген (лизат аутологичных опухолевых клеток), а затем рчФНО-α для созревания незрелых ДК. Полученные зрелые антиген-активированные ДК культивируют с неприлипшей фракцией МНК в присутствии провоспалительных цитокинов рчИЛ-12 и рчИЛ-18. Использование способа генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с противоопухолевой активностью обеспечивает высокую цитотоксичность противоопухолевых клеток и, как следствие, эффективность иммунного ответа по Т-хелпер 1 типу на антигены колоректального рака. 1 табл.

 

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, а именно к способам генерации антиген-специфических клеток с цитостатической активностью против клеток колоректального рака.

В основе развития онкологического процесса лежит снижение эффективности иммунной защиты, в частности снижение функциональной активности клеток, участвующих в противоопухолевой защите (цитотоксических Т-лимфоцитов, натуральных киллерных и дендритных клеток и др.). Традиционное лечение колоректального рака основано на хирургическом методе лечения и радио-химиотерапии, направленное на элиминацию опухолевых клеток. Используемые методы лечения колоректального рака не устраняют причину развития опухоли и не влияют на патогенетические механизмы прогрессирования опухолевого роста. При этом известно, что опухолевые клетки обладают иммуносупрессивной активностью, что ведет к нарушению дифференцировки иммунокомпетентных клеток и их функционального состояния, а в итоге к несостоятельности противоопухолевого иммунного ответа (Yang L., Carbone D.P. Tumor-host immune interactions and dendritic cell dysfunction // Adv. Cancer Res.- 2004. - Vol.92.- P. 13-27). Развитие новых эффективных подходов лечения онкологических заболеваний опирается на использование собственных механизмов защиты организма и их возможной модуляции. В настоящее время активно исследуется возможность применения новых методов иммунокоррекции у онкологических больных, в частности, использования дендритных клеток для создания или модуляции специфического противоопухолевого иммунного ответа. Дендритные клетки (ДК) - гетерогенная по происхождению, морфологии и выполняемым функциям популяция иммунокомпетентных клеток, которые принимают участие практически во всех видах иммунных реакций. ДК являются основными антигенпрезентирующими клетками, что обусловливает их непосредственное и важнейшее участие в формировании эффективного специфического иммунного ответа, кроме того, ДК обладают способностью продуцировать провоспалительные цитокины (ФНО-альфа, ИФН-гамма, ИЛ-1, ИЛ-12 и др.), что приводит к активации функций других иммунокомпетентных клеток, участвующих в противоопухолевой защите.

По мере дифференцировки (созревания) изменяется функциональное состояние дендритных клеток. Так на стадии незрелых дендритных клеток они эффективно захватывают антигены, в основном, посредством эндоцитоза и микропиноцитоза, но при этом их способность стимулировать Т-клетки ограничена. На стадии терминальной дифференцировки (зрелости) дендритные клетки способны презентировать антиген Т-лимфоцитам и активировать их, продуцируя соответствующие гуморальные факторы. То есть ДК, обладая уникальными механизмами захвата/представления антигена наивным Т-клеткам и активируя их, определяют направленность и эффективность иммунных реакций в организме.

Эффективность использования ДК объясняется, во-первых, тем, что на сегодня достаточно хорошо изучены молекулярные механизмы участия ДК в формировании иммунного ответа и, во-вторых, протоколы получения ДК и модуляции с их помощью иммунного ответа, выглядят наиболее изученными и «прозрачными» с точки зрения контроля всех этапов этого метода клеточной терапии.

Описан способ (прототип), при котором незрелые ДК получали из моноцитов прилипающей фракции мононуклеарных клеток (МНК) периферической крови больных колоректальным раком путем культивирования в полной среде с добавлением рекомбинантного человеческого гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (рчГМ-КСФ) и интерлейкина-4 (рчИЛ-4) в течение 6 дней. Затем получали антиген-активированные дендритные клетки путем слияния (fusion) незрелых дендритных клеток и аллогенных опухолевых клеток с применением полиэтиленгликоля и в течение последующих 3 дней культивировали в присутствии рчГМ-КСФ и рчИЛ-4. Далее в течение 7 дней антиген-активированные дендритные клетки сокультивировали с Т-клетками в присутствии рекомбинантного человеческого ИЛ-2 (рчИЛ-2). Была показана стимуляция цитотоксической способности Т-клеток (цитотоксический тест) и увеличение количества ИФН-γ-продуцирующих клеток (Koido S., Hara E., Homma S., Torii A., Mitsunaga M., Yanagisawa S., Toyama Y., Kawahara H., Watanabe M., Yoshida S., Kobayashi S., Yanaga K., Fujise K., Tajiri H. Streptococcal preparation OK-432 promotes fusion efficiency and enhances induction of antigen-specific CTL by fusion of dendritic cells and colorectal cancer cells // J.Immunol. - 2007. - Vol.178. - P.613-622).

Недостатком данного подхода является длительный срок культивирования дендритных клеток (9 дней), для которого требуется использование большого количества рекомбинантных цитокинов (рчГМ-КСФ, рчИЛ-4 и рчИЛ-2), что ведет к значительному удорожанию технологии. Использованные аллогенные опухолевые клетки несут чужеродные антигены, на которые возможно и формируется ответ, при этом остается не известным, будут ли таким образом активированные клетки проявлять цитотоксическую активность против собственных опухолевых антигенов и клеток, соответственно. Кроме того, эффективность цитотоксичности клеток, достигнутая в прототипе, не превышают 40%.

Направленность развития протективного ответа зависит от многих факторов, в том числе от баланса про- и противовоспалительных цитокинов. Известно, что провоспалительный цитокин ИЛ-12 обладает широкой биологической активностью, стимулирует цитотоксические и НК-клетки, активирует дифференциацию CD4+ Т-лимфоцитов по 1 типу, индуцирует продукции NO макрофагами, тем самым потенцирует противоопухолевый иммунитет. Прововоспалительный цитокин ИЛ-18 является фактором, индуцирующим продукцию ИФН-γ Т- и НК-клетками, усиливая противоопухолевый цитотоксический ответ. Показано, что при совместном применении ИЛ-12 и ИЛ-18 наблюдается наиболее выраженная стимуляция продукции ИНФ-γ и перфорин-зависимой цитотоксичности НК-клеток, пролиферация Т-лимфоцитов, что позволяет максимально возможно стимулировать эффекторное звено иммунитета против опухоли (Baxevanis C.N., Gritzapis A.D., Papamichail M. In vivo antitumor activity of NKT cells activated by the combination of IL-12 and IL-18 // J. Immunol - 2003. - Vol.l71 (6). - P.2953-9).

Задачей настоящего изобретения является создание эффективного и экономичного способа генерации антиген-специфических цитотоксических клеток из клеток периферической крови больных колоректальным раком.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в следующем.

Мононуклеарные клетки неприлипающей фракции периферической крови больных колоректальным раком культивируют с антиген-активированными дендритными клетками, полученными из моноцитов прилипающей фракции МНК. Антигенную активацию ДК проводят с помощью аутологичных опухолевых клеток, а для созревания ДК используют рекомбинантный человеческий провоспалительный цитокин - фактор некроза опухоли (рчФНО-α). Таким образом, для эффективной модуляции противоопухолевой защиты необходимо повысить потенциал цитотоксической активности мононуклеарных антиген-специфических клеток использованием рекомбинантного человеческого интерлейкина (рчИЛ-12 и рчИЛ-18) при совместном культивировании зрелых антиген-активированных ДК и МНК.

Совместное культивирование неприлипающей фракции МНК и зрелых ДК проводят в присутствии рчИЛ-12 и рчИЛ-18.

Принципиальным отличием разработанного способа от прототипа является использование рчИЛ-12 и рчИЛ-18 при сокультивировании ДК и МНК, что повышает эффективность необходимых для стимуляции и поддержания направленной дифференцировки нативных Т-клеток в Т-хелперы 1 типа, а также применение протоколов активации и созревания ДК, включающих использование аутологичных опухолевых антигенов и рчФНО-α, что активирует ДК против собственных опухолевых антигенов, в результате цитотоксический ответ усиливается до 59,5% против 40% у прототипа. Стадия получения зрелых антиген-активированных ДК сокращается до 3-х суток.

Предлагаемое изобретение повышает эффективность генерации цитотоксических клеток, а также позволяет сократить сроки сокультивирования ДК и МНК, что в итоге приводит к снижению стоимости способа.

Техническим результатом изобретения является генерация in vitro антиген-специфических клонов Т-клеток с активностью Т-хелперов 1 типа, необходимых для формирования эффективного противоопухолевого ответа.

Изобретение осуществляется следующим образом.

Выделенные из периферической крови больных колоректальным раком прилипающая фракция мононуклеарных клеток культивируются в концентрации 1 млн/мл в полной среде, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глютамина, 10 мМ HEPES, 5×10^-5 мМ 2-меркаптоэтанола, 80 мкг/мл гентамицина, 100 мкг/мл ампициллина в атмосфере 5% CO₂ при 37°C с добавлением рчГМ-КСФ (50 нг/мл) и рчИЛ-4 (100 нг/мл). Через 48 часов культивирования к полученным незрелым ДК добавляется опухолевый антиген (лизат аутологичных опухолевых клеток) в дозе 100 мкг/мл, а еще через 24 часа для созревания незрелых дендритных клеток в течение последующих 24 часов вносится рчФНО-α в дозе 25 нг/мл.

Полученные дендритные клетки культивируются с неприлипшей фракцией мононуклеарных клеток в соотношении 1:10 с добавлением рчИЛ-12 в дозе 10 нг/мл и рчИЛ-18 в дозе 100 нг/мл.

Для определения модуляции цитотоксической активности Т-лимфоцитов с помощью полученных ДК оценивали гибель опухолевых клеток в цитотоксическом тесте. Для этого к мононуклеарным клеткам больного, которые предварительно сокультивировали с антиген-активированными ДК, добавляли аутологичные опухолевые клетки. Цитотоксичность оценивали по увеличению содержания внутриклеточного фермента лактатдегидрогеназы в кондиционной среде в результате гибели опухолевых клеток. Показано достоверное повышение значения цитотоксичности, что служит показателем активации противоопухолевых цитотоксических клеток, необходимых для уничтожения опухолевых клеток (табл.1).

Таблица 1. Цитотоксический ответ мононуклеарных клеток больных колоректальным раком, культивированных с антиген-активированными ДК и интерлейкином-12 и интерлейкином-18 in vitro (n=10).

Группы	Цитотоксичности (%)
МНК	6,4±2,1
МНК + рчИЛ-12 + рчИЛ-18	25,9±5,6*#
МНК + ДК (без антигена)	28,1±5,3*#
МНК + ДК (с антигеном)	39,6±5,6*#
МНК + ДК (с антигеном) + рчИЛ-12 + рчИЛ-18	59,9±7,8*
Примечание: МНК - интактные клетки неприлипающей фракции мононуклеарных клеток
МНК + рчИЛ-12 + рчИЛ-18 - интактные клетки неприлипающей фракции мононуклеарных клеток, культивированные в присутствии рчИЛ-12 и рчИЛ-18
МНК + ДК (без антигена) - МНК, культивированные с ДК, которым не представлялся опухолевый антиген
МНК + ДК (с антигеном) - МНК, культивированные с ДК, которым представлялся опухолевый антиген
МНК + ДК (с антигеном) + рчИЛ-12 + рчИЛ-18 - МНК, культивированные с ДК, которым представлялся опухолевый антиген с добавлением рчИЛ-12 и рчИЛ-18.
* - различия достоверны (р<0.05) по сравнению с группой МНК.
# - различия достоверны (р<0.05) по сравнению с группой МНК + ДК (с антигеном) + рчИЛ-12 + рчИЛ-18

Совместное культивирование ДК и МНК больных колоректальным раком в сочетании с рчИЛ-12 и рчИЛ-18 является эффективным способом генерации специфических цитотоксических клеток мононуклеарного происхождения, что проявляется в усилении их цитотоксического противоопухолевого ответа. Использование рекомбинантного человеческого ИЛ-12 и ИЛ-18 для усиления индукции ответа Т хелперов 1 типа статистически достоверно увеличивает цитотоксический потенциал мононуклеарных клеток in vitro. Таким образом, в результате проведенных исследований разработан способ генерации противоопухолевых цитотоксических клеток с помощью антиген-активированных аутологичных дендритных клеток и рчИЛ-12 и рчИЛ-18 in vitro.

Способ генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с противоопухолевой активностью, заключающийся в совместном культивировании неприлипающей фракции мононуклеарных клеток (МНК), выделенных из периферической крови больных колоректальным раком с дендритными клетками (ДК), активированными опухолевым антигеном, полученными из моноцитов прилипающей фракции МНК, отличающийся тем, что для совместного культивирования берут зрелые ДК, полученные добавлением к антиген-активированным с помощью аутологичных опухолевых клеток незрелым ДК провоспалительного цитокина ФНО-α, а совместное культивирование неприлипающей фракции МНК и зрелых антиген-активированных ДК проводят в присутствии рекомбинантного человеческого интерлейкина-12 и рекомбинантного человеческого интерлейкина-18.