Способ витрификации биологических объектов

Авторы патента:

Мотовилова Наталия Олеговна (RU)

Грязнов Алексей Юрьевич (RU)

C12N1/04 - консервирование или сохранение жизнеспособных микроорганизмов (иммобилизованные микроорганизмы C12N 11/00)

Владельцы патента RU 2460769:

Грязнов Алексей Юрьевич (RU)
Мотовилова Наталия Олеговна (RU)

Изобретение относится к области биологии и медицины, в частности к витрификации гамет и эмбрионов. Способ включает в себя витрификацию биологических объектов, предпочтительно гамет и эмбрионов, в гибкую поликарбонатную пипетку для денудации и переноса гамет и эмбрионов и кумулюсооцитарных комплексов диаметром 130-600 микрометров и размораживание. В пипетку набирают небольшой объем витрифицированного раствора без биологических объектов. Затем в пипетку набирают витрифицированный раствор с биологическими объектами, после чего осуществляют добавление витрифицированного раствора так, чтобы биологические объекты были размещены на расстоянии не менее чем 10 мм от дистального конца гибкой поликарбонатной пипетки. Затем осуществляют последующее запаивание пипетки с дистального конца ее и проверку герметичности шва посредством стриппетора, запаивают проксимальный конец пипетки. После чего погружают ее в жидкий азот не менее 20 сек и упаковывают в наружную соломину-кожух объемом не менее 0,25 мл со смещенным центром тяжести для вертикального ориентирования и запаиванием наружной соломины-кожуха. Размораживание осуществляют путем вскрытия наружной соломины-кожуха, извлечения из нее запаянной пипетки с объектами, помещения пипетки в водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия. Затем вскрывают пипетку с обеих запаянных концов и осуществляют выпускание витрифицированных биологических объектов в раствор для размораживания с помощью груши, надетой на широкую часть пипетки. Изобретение обеспечивает уменьшение себестоимости процесса витрификации и снижение расхода растворов для замораживания и размораживания биологических объектов. 6 ил.

Предложение относится к области биологии и медицины, в частности к витрификации гамет и эмбрионов.

В настоящее время известен способ, в котором носитель для витрификации состоит из внутренней соломины объемом 0,25 мл, один из концов которой заполнен витрификационным раствором с витрифицируемыми объектами, и внешней соломины-кожуха объемом 0,5 мл, запаиваемой с обоих концов металлическими шариками и погружаемой затем в жидкий азот.(Aseptic technology of vitrification of human pronuclear oocytes using open-pulled straws, V. Isachenko et al. Hum. Reprod. (February 2005) 20(2); 492-496.) Размораживание объектов в данной системе осуществляется после вскрытия внешней соломины и извлечения внутренней соломины немедленным помещением заполненного витрификационным раствором с объектами конца внутренней соломины в раствор для размораживания.

Наиболее близким к патентуемому образцу является способ замораживания, при котором объекты помещаются в гибкую поликарбонатную предварительно укороченную пипетку для переноса гамет и эмбрионов, после чего пипетка помещается в запаянную с одного конца наружную соломину-кожух, которая затем запаивается с другого конца и погружается в жидкий азот; размораживание в данной системе осуществляется погружением конца пипетки с объектами в раствор для размораживания после вскрытия внешней соломины ножницами. (MicroSecure Vitrification (µ-S-VTF) Procedure: Optimum simplicity, security, cost-savings and effectiveness combining FDA-approved products, Mitchel C.Schiewe, The Journal of Clinical Embryology, Volume 13, Issue 2, 33-40).

Недостатками прототипа являются: сниженная скорость охлаждения объектов, возможность примерзания внутренней пипетки с эмбрионами к одному из концов наружной соломины за счет того, что пипетка не запаивается, необходимость использования большого (около 5 мл) объема раствора для размораживания.

Технической задачей и технологическим результатом способа является уменьшение себестоимости процедуры витрификации в сочетании с повышением скорости охлаждения объектов для оптимизации условий замораживания и обеспечением стопроцентной извлекаемости и безопасности хранения объектов за счет асептичности носителя.

Поставленная задача решается за счет того, что замораживание витрифицируемых биологических объектов осуществляется в гибкую поликарбонатную пипетку для переноса гамет, эмбрионов и кумулюсооцитарных комплексов диаметром 130-600 мкм; сначала в пипетку набирают небольшой объем витрификационного раствора без биологических объектов, затем в пипетку набирают витрификационный раствор с биологическими объектами, после чего осуществляют добавление витрификационного раствора так, чтобы биологические объекты были размещены на расстоянии не менее чем 10 мм от дистального конца поликарбонатной пипетки, после чего производят запаивание с дистального конца пипетки и проверку герметичности шва посредством стриппетора, далее запаивают проксимальный конец пипетки и погружают ее в азот на время, равное не менее 20 сек, после чего пипетку с витрифицированными объектами упаковывают в соломину-кожух объемом не менее 0,25 мл, содержащую металлический стержень с одного из концов, который предварительно герметично запаивают для смещения центра тяжести носителя, после помещения пипетки в соломину последнюю запаивают.

Способ поясняется прилагаемым графическим материалом, где:

на фиг.1 представлена внешняя соломина с хлопковым фильтром без внутреннего металлического стержня;

на фиг.2 - внешняя соломина с металлическим стержнем внутри, смещенным внутренним хлопковым фильтром, запаянная с дистального конца;

на фиг.3 - витрифицируемый биологический объект, находящийся внутри гибкой поликарбонатной пипетки, надетой на стриппетор;

на фиг.4 - запаянная с обоих концов гибкая поликарбонатная пипетка с находящимися внутри объектами;

на фиг.5 - запаянная поликарбонатная пипетка с находящимися внутри объектами и внешняя соломина погружены в жидкий азот;

на фиг.6 - запаянная поликарбонатная пипетка с витрифицированными объектами помещена и запаяна в наружную соломину.

Для реализации способа используют:

1 - внешнюю соломину-кожух, содержащую

2 - хлопковый фильтр и

3 - металлический стержень, смещающий центр тяжести соломины, которую предварительно

4 - запаивают. С помощью

5 - стриппетора в

6 - гибкую поликарбонатную пипетку набирают

7 - витрифицируемые объекты, затем

8 - пипетку запаивают и погружают в

9 - жидкий азот. Далее пипетку упаковывают в наружную соломину, которую затем герметично запаивают.

Загрузка замораживаемых объектов в пипетку и ее запаивание ультразвуковым или термическим запаивателем осуществляются следующим образом: сначала в пипетку набирают небольшой объем витрификационного раствора без замораживаемых объектов, далее набирают витрификационный раствор с объектами, затем витрификационный раствор, при этом необходимо, чтобы объекты располагались не менее чем на расстоянии 10 мм от дистального конца пипетки, что контролируется визуально в стереомикроскопе, для предотвращения их возможного повреждения при запаивании; после заполнения пипетки дистальный ее конец (через который загружались объекты) запаивается, герметичность образовавшегося шва контролируется следующим образом - на поршень стриппетора, с которым соединена пипетка осуществляются надавливания и в это время визуально контролируется перемещение мениска раствора внутри пипетки или истечение его наружу через место шва, в случае если имеется движение мениска или истечение раствора через несостоятельный шов, необходимо перезапаять пипетку выше первоначального уровня. После запаивания дистального конца пипетки ее снимают со стриппетора и запаивают противоположный уже запаянному конец.

После этого пипетка сразу же погружается в жидкий азот не менее чем на 20 секунд, затем она перемещается в предварительно маркированную наружную соломину-кожух со смещенным центром тяжести, причем утяжеленный конец внешней соломины находится в жидком азоте, а противоположный конец находится над его поверхностью, через него осуществляется загрузка пипетки в соломину. После загрузки пипетки в наружную соломину последнюю запаивают ультразвуковым или термическим запаивателем, не вынимая из жидкого азота, причем так, чтобы верхний конец расположенной внутри пипетки с замораживаемыми объектами не был запаян вместе с наружной соломиной в одном шве.

Наружная соломина-кожух изготавливается из коммерчески доступной соломины для медленного замораживания гамет и эмбрионов объемом не менее 0,25 мл, содержащей с одного из концов хлопковую пробку. Металлический стержень, соответствующий по диаметру внутреннему диаметру соломины, длиной 1-1,5 см вводится в соломину со стороны конца, на котором находится хлопковая пробка, таким образом, чтобы стержень сместил пробку кнутри и наружным концом углублялся на не менее чем 5 мм внутрь соломины. После введения стержня производится запаивание соломины, чтобы герметизировать ее и препятствовать выпадению металлического стержня. Данный стержень смещает центр тяжести носителя и препятствует всплытию того конца его, ближе к которому находятся витрифицированные объекты, что является дополнительным фактором температурной стабильности хранения и защиты от девитрификации.

Размораживание объектов, хранящихся в представленном носителе, осуществляется следующим образом: наружная соломина-кожух вскрывается при помощи приспособления для очистки проводов от обмотки таким образом, чтобы была нарушена целостность внешней соломины и не нарушена целостность внутренней пипетки. При этом большая часть носителя находится в жидком азоте и возвышается над его поверхностью только минимально необходимая часть для вскрытия. Далее откушенный фрагмент наружной соломины снимается и внутренняя пипетка извлекается за широкий запаянный конец, после чего она немедленно помещается в водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия на 5-7 секунд. Затем пипетку обрабатывают 70% раствором этилового спирта и приступают к вскрытию с помощью острого лезвия либо стерильных острых ножниц. Частным случаем приспособления для вскрытия является бритвенное лезвие, фиксированное в хирургическом зажиме. Вскрытие осуществляется следующим образом: сначала отрезается запаянный конец пипетки с той ее стороны, где нет витрифицированных объектов, затем тотчас за местом запаивания отрезается конец, где находятся объекты. После вскрытия пипетки с обоих концов на широкий ее конец надевают грушу и, слегка надавливая на нее, выпускают объекты в раствор для размораживания. Далее порядок манипуляции с объектами соответствует инструкции к используемым растворам.

Таким образом, положительным результатом применения данного способа является уменьшение себестоимости носителя для витрификации и снижение расхода растворов для замораживания и размораживания, что в итоге выливается в уменьшение себестоимости всей процедуры. При этом обеспечивается стопроцентная извлекаемость объектов и высокая безопасность хранения за счет асептичности носителя.

Способ витрификации биологических объектов, включающий помещение витрифицируемых биологических объектов в гибкую поликарбонатную пипетку для переноса гамет, эмбрионов и кумулюсооцитарных комплексов диаметром 130-600 мкм и размораживание, отличающийся тем, что в пипетку набирают небольшой объем витрификационного раствора без биологических объектов, затем в пипетку набирают витрификационный раствор с биологическими объектами, после чего осуществляют добавление витрификационного раствора так, чтобы биологические объекты были размещены не менее чем 10 милиметров от дистального конца гибкой поликарбонатной пипетки, после чего производят запаивание дистального конца пипетки и проверку герметичности шва посредством стриппетора, далее осуществляют запаивание проксимального конца пипетки, затем пипетку погружают в жидкий азот на время, равное не менее 20 с, после чего ее упаковывают в соломину-кожух объемом не менее 0,25 мл, и содержащую для смещения центра тяжести носителя металлический стержень, размещенный у одного из концов соломины-кожуха, который предварительно герметично запаивают, после помещения пипетки в соломину-кожух последнюю запаивают, а размораживание объектов осуществляют путем вскрытия внешней соломины-кожуха на конце, противоположном тому, на котором находятся витрифицированные биологические объекты, так, чтобы не нарушить целостность внутренней гибкой поликарбонатной пипетки, пипетку вынимают и помещают в водяную баню 37°С, после чего ее последовательно вскрывают сначала с широкого, а затем с узкого конца, затем с помощью груши, надетой на широкий конец пипетки, витрифицированные биологические объекты выпускают в среду для размораживания.

Изобретение относится к медицине и фармацевтической промышленности и касается способа получения сухих биологически активных материалов сорбционно-контактным обезвоживанием.

Способ сорбционно-контактного обезвоживания высокодисперсных биологически активных материалов // 2454459

Жидкие бактериальные инокулянты с повышенным сроком годности и повышенной стабильностью на семенах // 2428467

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения инокулянта, содержащего десикант, и к способу обработки семян, полученным инокулянтом. .

Способ замораживания молочно-кислых бактерий // 2427624

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам замораживания молочнокислых бактерий. .

Способ получения композиции, содержащей высушенные бактерии, и ее применение // 2370525

Изобретение относится к биотехнологии. .

Способ хранения микобактерий лепры // 2360959

Изобретение относится к микробиологии. .

Сухой бактериальный состав, упакованный бактериальный состав, дозированный состав, способ стабилизации сухого бактериального состава и способ лечения млекопитающего // 2359027

Среда для сохранения жизнеспособности клинических изолятов патогенной treponema pallidum // 2344169

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано при мониторинге биологических и генетических свойств возбудителя сифилиса - Treponema pallidum (патогенной бледной трепонемы), а также с целью поддержания жизнеспособности «диких штаммов» патогенной бледной трепонемы и при разработке методов серодиагностики сифилиса с использованием корпускулярных антигенов.

Применение соединений, участвующих в биосинтезе нуклеиновых кислот в качестве криопротективных агентов // 2344168

Способ получения пищевого продукта (варианты) // 2323586

Изобретение относится к пищевой промышленности. .

Композиция для приготовления пищевого продукта с применением дрожжей // 2473678

Изобретение относится к области биотехнологии

Способ консервирования молочнокислых бактерий lactobacillus delbrueckii // 2475527

Изобретение относится к микробиологии, в частности к консервированию молочнокислых бактерий Lactobacillus delbrueckii

Управляемая активация системы продуцирования реутерина // 2492870

Группа изобретений относится к области медицины и предназначена для получения клеток культур Lactobacillus reuteri, содержащих реутерин, сохраняемый внутри клеток. Способ включает ферментацию указанных клеточных культур, добавление 1,2-пропандиола или глицерина к реутерин-продуцирующим системам клеток Lactobacillus reuteri в начале ферментации, добавление глицерина к клеточным культурам Lactobacillus reuteri во время получения и сохранение клеток Lactobacillus reuteri. Продукт, полученный заявленным способом, содержит сохраненные клетки Lactobacillus reuteri, при этом реутерин сохраняется в клетках. Заявленная группа изобретений позволяет получить большие количества Lactobacillus reuteri, нагруженных реутерином, которые могут быть использованы для целей профилактики и лечения заболеваний, в качестве пищевой добавки. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 9 ил., 6 пр.

Способ получения сухого полимикробного продукта для использования в пищевой промышленности // 2502795

Изобретение относится к биохимии. Создают микробный консорциум из штаммов дрожжей Pichia anomala 9a или Pichia anomala P1 и штамма лактобактерий Lactobacillus acidophilus La5, в соотношении 1:0,8 соответственно. Проводят твердофазное аэробное культивирование при температуре 28 - 30оС в течение 36 - 48 ч. Для культивирования используют твердый растительный субстрат, увлажненный жидким компонентом до 55 - 60% влажности. В качестве жидкого компонента используют молочную сыворотку, или послеспиртовую барду, или воду. Проводят конвективную сушку полученного полимикробного продукта при 38 - 40оС до остаточной влажности не более 12%. Изобретение позволяет получить сухой полимикробный продукт, содержащий повышенное количество жизнеспособных клеток бактерий штамма Lactobacillus acidophilus La5 - не менее 1·108 КОЕ/г и жизнеспособных клеток штаммов дрожжей Pichia anomala 9a или Pichia anomala P1 - не менее 1·109 КОЕ/г, и увеличить срок хранения продукта до 100 сут. 10 табл., 4 пр.

Способ криоконсервации клеток фототрофных микроорганизмов // 2508397

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам криоконсервации клеток фототрофных микроорганизмов. Способ предусматривает суспензирование биомассы клеток до концентрации 15-30 мас.% в растворе поливинилового спирта с концентрацией 6-9 мас.%, приготовленном на питательной среде, специфичной для выращивания конкретного фототрофного микроорганизма, замораживание и хранение аликвот полученной суспензии объемом 0,1-0,5 см3 при -80÷-70°C. Способ позволяет упростить процесс криоконсервации клеток фототрофных микроорганизмов, увеличить выживаемость клеток до 90-95%, обеспечить этот уровень выживаемости при хранении клеток в течение срока до полутора лет и использовать размороженные образцы клеток в качестве концентрированного посевного материала. 13 пр.

Способ получения препарата на основе вакцинного штамма чумного микроба // 2510825

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа получения препарата на основе вакцинного штамма чумного микроба. Представленное изобретение предусматривает изготовление посевной нативной культуры чумного микроба, концентрирование микробной суспензии, приготовление вакцинной взвеси и получение сухой формы препарата, при этом приготовление посевной культуры включает культивирование микробов в жидкой питательной среде в бутылях в течение 48 ч при температуре 26…28˚С и непрерывной аэрации не менее 10 л·мин-1 пассированной стабилизированной стартовой культурой, полученной в результате трех последовательных пассажей через организм морских свинок и смешанной в соотношении 2:1 со стабилизирующей глицерино-лактозо-полиглюкиновой жидкостью, при приготовлении вакцинной взвеси используют оптимизированную по компонентному составу защитную среду высушивания, а лиофилизацию проводят соблюдая определенный режим. Представленное решение позволяет получить продукт с повышенной активностью при сокращении продолжительности процесса его изготовления. 3 ил., 6 табл.

Сухая стекловидная композиция для стабилизации и защиты биологически активного материала и способ ее получения // 2535869

Группа изобретений относится к биотехнологии, а именно к сухой стекловидной композиции для стабилизации и защиты биологически активного материала в жестких условиях хранения и применения и к способу ее получения. Объединяют биологически активный материал, агент, формирующий матрицу, и по меньшей мере два стеклообразующих агента в водном растворителе с образованием вязкой суспензии. Быстро замораживают полученную суспензию в жидком азоте с образованием твердых замороженных частиц в форме гранул, капельных частиц или нитей. Дегазируют замороженные частицы под вакуумметрическим давлением от 0 до 2000 мТорр (266,6 Па) и при температуре ниже точки замерзания композиции в течение 1-30 мин. Далее частицы подвергают первичной сушке под давлением от 2000 до 10000 мТорр (от 266,6 до 1333 Па) и при температуре выше точки замерзания частиц. Осуществляют вторичную сушку частиц при полном вакууме и температуре от 20ºC до 70ºC в течение периода времени, достаточного для снижения активности воды полученной композиции до Aw 0,3 или ниже. Преимуществом группы изобретений является исключение кипения или избыточного вспенивания композиции при одновременном достижении значительного ускорения сушки и высокой допустимой нагрузки композиции. 2 н. и 9 з.п. ф-лы, 9 ил., 1 табл., 16 пр.

Способ длительного хранения прихотливых бактерий в консервированной цельной донорской крови путем замораживания // 2535984

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и касается способа длительного хранения прихотливых бактерий в консервированной крови. Способ включает замораживание в холодильнике при -20˚С культур прихотливых бактерий в консервированной донорской человеческой цельной крови, содержащей гемоконсервант ЦФДА-1. Культуры выращивают 18-24 часа на соответствующих питательных средах в стерильных пробирках из полипропилена. Способ обеспечивает выживаемость и возобновление культивирования при использовании доступных компонентов без дефицитных препаратов для лабораторий клинической микробиологии любого уровня. 1 табл.

Способ длительного хранения микроводорослей // 2541452

Способ длительного хранения микроводорослей относится к прикладной гидробиологии и альгологии. Предназначен для длительного хранения микроводорослей в научных и учебных учреждениях, а также может быть использован в биотехнологической промышленности для хранения штаммов музейных культур. В способе, состоящем из перевода микроводорослей в состояние ангидробиоза, сохранения микроводорослей в обезвоженном состоянии, выведении из ангидробиоза, дегидратацию микроводорослей проводят на стадии стационарного роста при температуре 30-60°С до остаточной влажности клеток 8-14%. Реактивацию сухих одноклеточных водорослей проводят при освещенности 2 кЛк путем увлажнения питательной средой, разбавленной дистиллированной водой в соотношении 1:1, температура которой составляет 30°С, а через 2 ч к реактивируемым культурам добавляют культуральные среды той же концентрации и температуры. Обезвоженные культуры содержат в герметичной упаковке, без доступа света и при температуре окружающей среды 15-20°С. Основное преимущество заявляемого способа длительного хранения микроводорослей заключается в простоте и надежности, а также в том, что предлагаемый метод оптимально приближён к естественным условиям, экономически выгоден и даёт возможность рекомендовать его для использования в биотехнологических, научных и учебных целях.

Теплоустойчивые пробиотические композиции и содержащие их продукты здорового питания // 2549098

Изобретение относится к продуктам здорового питания. Предложены гранулы пробиотиков, содержащие ядро, включающее пробиотические микроорганизмы и субстрат, в котором абсорбированы указанные микроорганизмы и по меньшей мере три слоя, включающих внутренний масляный слой, покрывающий указанное ядро, и первый внешний слой и второй внешний слой. При этом указанный первый внешний слой представляет собой слой энтеросолюбильного покрытия, содержащий pH-чувствительный полимер, выбранный из группы, включающей альгиновую кислоту, альгинат аммония, альгинат натрия, калия, магния или кальция. Указанный второй внешний слой представляет собой слой внешнего теплостойкого покрытия. Предложены способы изготовления гранул, а также пищевой продукт, содержащий вышеуказанные гранулы. Изобретение позволяет получить пробиотические гранулы, адаптированные выдерживать высокие температуры выпечки при тепловой обработке пищевых продуктов. 4 н. и 7 з.п. ф-лы, 1 ил., 5 табл., 13 пр.