Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus 13f8 - продуцент моноклональных антител, специфичных к капсульному f1 антигену yersinia pestis
Владельцы патента RU 2460788:
Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ) (RU)
Изобретение касается получения моноклональных антител (МКА) к капсульному F1 антигену Yersinia pestis. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus museums 13F8 получают путем иммунизации мышей линии BALB/c. Мышей иммунизируют 4-кратным введением рекомбинантного антигенного препарата F1 в дозе 100 мкг/мышь. На третьи сутки после последней иммунизации проводят гибридизацию спленоцитов иммунных мышей (1×108 клеток) с клетками мышиной миеломы РЗ-Х63 Ag/8-653 (1×107 клеток). В качестве агента для слияния применяют полиэтиленгликоль (Sigma, США). После гибридизации проводят селекцию, скрининг, клонирование и криоконсервацию гибридомы. Гибридома депонирована в ГК патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером Н-18. Полученный штамм гибридных культивируемых клеток, продуцирующий моноклональные антитела, специфичные к капсульному F1 антигену Y.pestis, пригоден для конструирования на их основе тест-систем для выявления возбудителя чумы. 7 ил., 4 табл., 8 пр.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения моноклональных антител (МКА) к капсульному F1 антигену Yersinia pestis.
Возбудитель чумы (Y.pestis) - один из наиболее вирулентных для человека микроорганизмов и единственный представитель бактерий, относящийся к возбудителям первого (наивысшего) класса опасности.
Имея неограниченный природный резервуар в грызунах, чума до сих пор остается непобежденным заболеванием, вспышки которого регулярно регистрируются в разных точках земного шара.
Ежегодно фиксируется около 2000 случаев заболевания чумой, и Всемирная Организация Здравоохранения недавно признала чуму как вновь циркулирующее заболевание [1].
Закономерность эпидемиологического процесса, с одной стороны, ее характером как природно-очаговой трансмиссивной инфекции со своеобразными особенностями течения эпизоотии среди различных видов грызунов, а с другой - факторами, способствующими проявлению антропонозного механизма передачи. В природных очагах чума проявляется в виде эпизоотии среди более чем 200 видов грызунов и зайцеобразных мировой фауны. Чума передается между ними трансмиссивным и, вероятно, алиментарным путем [2].
Чумной микроб неустойчив вне организма теплокровных животных и эктопаразитов и чувствителен к воздействию физических, химических и биологических факторов. Низкую температуру возбудитель чумы переносит значительно лучше, выдерживая троекратное замораживание и оттаивание.
При благоприятных температурных условиях, влажности и отсутствия микробов-конкурентов чумной микроб остается жизнеспособным в воде в течение месяца, молоке до 3 месяцев, в земле до 2 месяцев. В высохшей мокроте чумного больного микробы выживают в течение недели, во влажной - больше месяца (при низких температурах). В зараженных и голодающих блохах - до 396 дней [3].
Одним из наиболее лабильных свойств возбудителя чумы является синтез капсульного антигена F1. Данный признак находится в прямой зависимости от характера эпизоотийного процесса: по мере угасания эпизоотии происходит увеличение числа культур со сниженной способностью синтезировать капсульный антиген, вплоть до полной его утраты. Это коррелирует с нарастанием числа серопозитивных в отношении F1 животных [4].
Штамм Y.pestis EV линии НИИЭГ обладает повышенной субстратной специфичностью и при этом невысокой скоростью роста при оптимальной температуре для синтеза капсульного антигена - 37°C [5].
Классическая иммунодиагностика чумы построена на выявлении капсульного антигена F1 или анти-F1-антител.
Практическое здравоохранение остро нуждается в сертифицированных современных иммунодиагностических тест-системах для индикации возбудителей чумы. В связи с разработкой иммуночипов и мультипараметрических диагностических систем большое значение придается получению специфических иммунореагентов, прежде всего, моноклональных или монорецепторных поликлональных антител.
Специфичность иммунологических реакций находится в прямой зависимости от специфичности антитела, используемого для приготовления диагностического препарата. Диагностикумы, приготовленные на основе моноклональных антител (МКА), строго специфичны, поскольку направлены на выявление одного антигена.
Задача изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток, продуцирующих моноклональные антитела, специфичные к капсульному F1 антигену Y.pestis и пригодные для конструирования на их основе тест-систем для выявления возбудителя чумы.
Поставленная задача решается тем, что предложен новый штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus museums 13F8 - продуцент высокоспецифичных моноклональных антител к капсульному F1 антигену Y.pestis.
Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus museums 13F8 депонирован в государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур Федерального бюджетного учреждения науки Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ МПБ) коллекционный номер - Н18.
Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus museums 13F8 получают путем иммунизации мышей линии BALB/c. Мышей иммунизируют 4- кратным введением рекомбинантного антигенного препарата F1 в дозе 100 мкг/мышь. На третьи сутки после последней иммунизации проводят гибридизацию спленоцитов иммунных мышей (1×108 клеток) с клетками мышиной миеломы РЗ-Х63 Ag/8-653 (1×107 клеток). В качестве агента для слияния применяют полиэтиленгликоль (Sigma, США). После гибридизации проводят селекцию, скрининг, клонирование и криоконсервацию гибридомы.
Характеристика штамма гибридных клеток животных Mus museums 13F8.
Морфологическая характеристика. Культура гибридных клеток состоит из слабо прикрепленных к подложке округлых клеток размером с исходную миеломную клетку.
Культуральные свойства. Культивирование штамма гибридных клеток 13F8 ведут при температуре 37°C в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Средой культивирования является среда RPMI-1640, содержащая 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ/Lглутамина, 100 мкг/мл гентамицина.
Клетки культивируют в виде стационарной суспензии в пластиковых матрацах "Costar". Пассирование гибридных клеток 13F8 проводят 2 раза в неделю с кратностью разведения 1:2-1:3. Посевная концентрация клеток составляет 1×105 в 1 мл среды. Максимальная концентрация гибридных клеток при культивировании составляет 1×105 на 1 мл среды. Гибридный клон не теряет способности синтеза антител при 10 пассажах in vitro (срок наблюдения).
Культивирование гибридных клеток 13F8 в организме животного.
Мышей линии BALB/c 20-недельного возраста обрабатывают пристаном (Sigma, США) по 0,5 мл внутрибрюшинно и через 2-3 недели интраперитонеально вводят по 1×1010 гибридных клеток. Появление иммуноасцитов регистрируют на 7-15 сутки, отбор иммуноасцитической (ИАЖ) жидкости производят на 10-21 сутки. Синтез иммуноглобулина, продуцируемого гибридомой, определяют методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) [6].
Характеристика полезного продукта. Штамм гибридных клеток 13F8 продуцирует специфичные моноклональные антитела к капсульному F1 антигену Y.pestis, титр которых составляет в культуральной жидкости (КЖ) 1:640000, в ИАЖ 1:1000000. Моноклональные антитела из КЖ и ИАЖ выделяли путем аффинной хроматографии на колонке с белком G-сефарозой (Protein G Sepharose 4 Fast Flow). Чистоту полученных иммуноглобулиновых фракций оценивали в SDS-PAGE-электрофорезе в денатурирующих условиях. Концентрацию иммуноглобулинов определяли спектрофотометрически при длине волны 280 нм (спектрофотометр Smart Spec Plus, BIO RAD, США).
Продуктивность штамма гибридных клеток 13F8.
Продукция МКА в среде культивирования составляет 20-50 мкг/мл, в асцитической жидкости - 5-10 мг/мл. Продукция МКА в культуральной жидкости сохраняется на протяжении 10 пассажей (срок наблюдения) и 5 пассажей при культивировании в виде асцитных опухолей на мышах (срок наблюдения)
Контаминация штамма гибридных клеток 13F8.
Контаминанты гибридной линии, включая бактерии, дрожжи, грибы, не выявлены. Микоплазмы не определяли.
Криоконсервация. Среда замораживания содержит эмбриональной телячьей сыворотки - 90%, диметилсульфоксида - 10%.
Режим криоконсервации и отогрева. Гибридные клетки вносят в криопробирки, помещают в контейнер из пенопласта с толщиной стенок не менее 1 см и оставляют на 16-24 часа в кельвинаторе при температуре -70°C и затем опускают в жидкий азот.
Размораживание проводят быстро на водяной бане при температуре 37°C.
Ампулы содержат 1,0 мл криозащитной среды с концентрацией гибридных клеток 1×106. Жизнеспособность восстанавливаемых гибридом после криоконсервации составляет 75-85%.
Свойства полезного продукта. Штамм гибридных клеток 13F8 продуцирует моноклональные антитела, относящиеся к lgGl подклассу иммуноглобулинов мыши.
Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами.
Фиг.1 Дот-блот с МКА 13F8. Определение неспецифической активности в отношении микробных клеток других микроорганизмов.
Фиг.2 Дот-блот с МКА 13F8. Определение специфической активности к капсульному F1 антигену Y.pestis.
Фиг.3 SDS-PAGE электрофорез МКА 13F8.
Фиг.4 Определение подклассовой принадлежности МКА 13F8.
Фиг.5 Иммуноблотинг МКА 13F8 с капсульным F1 антигеном Y.pestis.
Фиг.6 Обнаружение капсульного Fl Y.pestis в реакции латекс-агглютинации.
Фиг.7 Выявление капсульного F1 антигена Y.pestis методом ИФА с использованием МКА 13F8.
Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют примеры его конкретного выполнения.
Пример 1. Получение штамма гибридных клеток 13F8.
Иммунизацация
Для иммунизации используют мышей линии BALB/c в возрасте 3-4 месяцев. Иммунизацию проводят по следующей схеме:
0 день - 100 мкг антигена в PBS эмульгированного в ПАФ (0.2 мл) подкожно;
21 день - 100 мкг антигена в PBS эмульгированного в НАФ (0.2 мл) подкожно;
51 день - 100 мкг антигена в PBS внутривенно;
58 день - 100 мкг антигена в PBS внутривенно;
Кровь у иммунных мышей отбирают на третий день после последней инъекции антигеном в концентрации 100 мкг согласно Animal protocol №Р 02-19 стр.7.
Титры специфических антител в сыворотках животных определяют с помощью непрямого твердофазного ИФА.
Гибридизация
Через 3 суток после последней внутривенной инъекции извлекают селезенку мыши и проводят гибридизацию 1×108 спленоцитов мыши с 1×107 клетками миеломной линии РЗ-Х63 Ag/8-653 в присутствии 1 мл полиэтиленгликоля (SIGMA, США) в течение 1 минуты.
Селекция
После отмывки полиэтиленгликоля клетки высевают на 96-луночные планшеты на слой перитонеальных макрофагов, взятых у мышей линии BALB/c. Селекцию гибридных клеток проводят на селективной среде с содержанием гипоксантина-аминоптерина-тимидина (HAT). Через 21 сутки из среды убирают аминоптерин. В последующем культивирование проводят на среде RPMI-1640 "Sigma" с 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ/L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина.
Скрининг гибридных клонов
Для отбора положительных гибридных клонов, продуцирующих МКА, используют непрямой твердофазный ИФА.
Для проведения непрямого варианта ИФА в лунки 96-луночного полистиролового планшета для иммуноферментного анализа вносят по 1 мкг/лунку капсульного F1 антигена Y.pestis и выдерживают при температуре 37°C в течение 1 часа или при 4°C в течение 18 часов. Три раза отмывают фосфатно-солевым буфером рН 7.4, содержащим 0,5% твин-20 (ФСБ-Т). Далее вносят в лунки по 160 мкл 0,5% раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА), проверенного на отсутствие пероксидазной активности, и инкубируют при температуре 37°C в течение 1 часа. Три раза отмывают ФСБ-Т, вносят в лунки супернатант культуральной жидкости в объеме 100 мкл и инкубируют при температуре 37°C в течение 1 часа. После этого лунки планшета трижды отмывают раствором ФСБ-Т и добавляют в лунки пероксидазный конъюгат к целой молекуле IgG мыши (Sigma, США) в рабочем разведении. Планшет инкубируют при температуре 37°C в течение 1 часа, затем 6 раз отмывают лунки раствором ФСБ-Т. После этого в лунки вносят по 100 мкл субстратиндикаторного раствора (10 мкл 30% Н2O2 и 8 мг ортофенилендиамина на 10 мл фосфатно-цитратного буфера рН 5,0). Положительную реакцию оценивают по появлению желто-коричневого окрашивания раствора. Реакцию останавливают добавлением в лунки по 50 мкл 4N серной кислоты. Учет результатов проводят на фотометре (фотометр Пикон, РФ) для ИФА при длине волны 492 нм.
Клонирование
Клонирование гибридных клеток 13Р8 проводят методом лимитирующих разведений в 96-луночных планшетах на слое перитонеальных макрофагов из расчета 1×104 клеток на лунку. Скрининг клонов проводят непрямым твердофазным ИФА, как описано выше.
Культивирование
Культивирование клонов гибридомы 13F8 ведут при температуре 37°C в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Средой культивирования является среда RPMI-1640, содержащая 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ/L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина.
Криоконсервация
Клоны гибридомы криоконсервируют на среде замораживания, состоящей из эмбриональной телячьей сыворотки - 90%, диметилсульфоксида - 10%. Клоны гибридомы хранят в сосудах Дюара с жидким азотом.
Пример 2. Определение неспецифической активности в отношении микробных клеток других микроорганизмов методом дот-блот анализа.
Для проведения данного исследования использовали панель из 37 микроорганизмов различных видов. В качестве положительного контроля использовали капсульный F1 антиген Y.pestis. На нитроцеллюлозную мембрану (GE Water & Process Technologies, США) с помощью прибора BIO-DOT (BIO RAD, США) сорбировали инактивированные микробные клетки в концентрациях 1×106 клеток/л. Штаммы микроорганизмов были получены из коллекции микроорганизмов ФГУН ГНЦ ПМБ. Далее мембраны блокировали раствором инертного белка и последовательно инкубировали с МКА 13F8 и пероксидазным конъюгатом к целой молекуле IgG мыши (Sigma, США). Визуализацию реакции проводили раствором субстратной смеси на основе диаминобензидина (0.05% диаминобензидина (Sigma, США), 0.015% H2O2, 0.01 М фосфатно-солевой буфер, рН 7.4). Реакцию останавливали промывкой дистиллированной водой.
Как показал проведенный анализ, МКА 13F8 специфически взаимодействовали с F1 антигеном Y.pestis и не давали перекрестных реакций с другими близкородственными иерсиниями. (фиг.1).
Проверка специфичности МКА 13F8.
Пример 3. Определение специфической активности к F1 антигену Y.pestis
Была проведена проверка специфической активности КЖ гибридом в отношении капсульного F1 антигена Y.pestis методом дот-блот анализа. На нитроцеллюлозный фильтр с помощью прибора Bio-Dot («Bio-Rad», США) сорбировали F1 антиген с начальной концентрацией 0,025 мкг/лунку и титровали двукратным шагом до конечной концентрации 0,0002 мкг/лунку. Далее мембрану блокировали раствором инертного белка и последовательно инкубировали с МКА 13F8 и пероксидазным конъюгатом к целой молекуле IgG мыши (Sigma, США). Визуализацию реакции проводили раствором субстратной смеси на основе диаминобензидина (0.05% диаминобензидина (Sigma, США), 0.015% H2O2; 0.01 М фосфатно-солевой буфер, рН 7.4). Реакцию останавливали промывкой дистиллированной водой.
В результате проведенного анализа было установлено, что МКА 13F8 выявляют до 7 нг/мл F1 антигена (фиг.2).
Пример 4. Выделение и очистка МКА 13F8
Выделение МКА 13F8 из асцитической жидкости проводят путем аффинной хроматографии на колонке с белком G-сефарозой (Protein G Sepharose 4 Fast Flow). Клеточные компоненты из культуральной и асцитической жидкостей удаляют центрифугированием (2000 g×20 мин), рН культуральной жидкости доводят до 8.6 при помощи 1 N раствора NaOH, асцитическую жидкость разводят 1:1 посадочным буфером (0.05 М трис, 0.15 М NaCl, 0.02% NaN3, рН 8.6). Колонку уравновешивают посадочным буфером и проводят нанесение образцов со скоростью 10 мл/час при комнатной температуре. После нанесения образцов колонку отмывают от несвязавшихся компонентов и проводят элюцию иммуноглобулинов 0.05 М глициновым буфером, 0.15 М NaCl, рН 2.3. Контроль выхода фракции иммуноглобулинов осуществляют при помощи УФ детектора ("Pharmacia LKB", Швеция).
Выделенные иммуноглобулины концентрируют осаждением при помощи сухого сульфата аммония (до 50% насыщения) и переводят в фосфатно-солевой буферный раствор методом гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-25 (PD-10, "Pharmacia LKB", Швеция) емкостью 10 мл. Чистоту полученных иммуноглобулиновых фракций оценивают в SDS-PAGE-электрофорезе в денатурирующих условиях.
В результате были получены очищенные препараты иммуноглобулинов (фиг.3).
Пример 5. Определение подклассовой принадлежности МКА 13F8
Подклассы полученных МКА 13F8 определяют с помощью набора для определения изотипов мышиных моноклональных антител (Roche Diagnostic Corporation, США). В культуральную жидкость объемом 500 мкл погружают иммунохроматографическую полоску для определения изотипов мышиных моноклональных антител не глубже чем на 1,5 см на 5 минут. После проявления контрольной полосы и полосы, соответствующей тестируемым Ig, определяют с помощью контрольной иммунохроматографической полоски (прилагается к набору для определения изотипов мышиных моноклональных антител) подкласс антител.
Определение подкласса полученных МКА 13F8 показало, что штамм гибридных клеток продуцирует моноклональные антитела, относящиеся к lgGl подклассу иммуноглобулинов мыши (фиг.4).
Пример 6. Иммуноблотинг МКА 13F8 с капсульным F1 антигеном Y.pestis
Для проверки специфичности МКА 13F8 с капсульным F1 антигеном Y.pestis проводят SDS-PAGE-электрофорез в 10% полиакриламидном геле (ПААГ) в течение 1 часа при 220 В, 20 мА. F1 из ПААГ переносят на нитроцеллюлозную мембрану (GE Water & Process Technologies, США) в течение 1 часа при силе тока 380 мА. После завершения переноса мембрану блокируют, погружая в 1% раствор БСА в ФСБ рН 7,4 на 1 час при комнатной температуре. Для промывок мембран используют ФСБ-Т рН 7,4. Блокированную и промытую мембрану инкубируют в растворе МКА гибридомы 13F8 в течение одного часа при температуре 37°C. Далее, после промывки буфером, мембрану инкубируют с пероксидазным конъюгатом к суммарной фракции Ig мыши (Sigma, США) в рабочем разведении при тех же условиях, промывают ФСБ-Т. Визуализацию реакции проводили раствором субстратной смеси на основе диаминобензидина (0.05% диаминобензидина (Sigma, США), 0.015% H2O2, 0.01 М фосфатно-солевой буфер - ФСБ, рН 7.4). Реакцию останавливают промывкой дистиллированной водой.
В результате проведенного анализа было установлено, что МКА 13F8 взаимодействуют с капсульным F1 антигеном Y.pestis (фиг 5).
Пример 7. Обнаружение капсульного F1 Y.pestis в реакции латекс-агглютинации
Для постановки реакции латекс-агглютинации (РЛА) используют полиакролеиновые латексные частицы диаметром 1 и 1,2 мкм (Институт биоорганической химии им. акад. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, Москва) и МКА 13F8. Иммобилизацию МКА 13F8 на латексных частицах проводят согласно протоколу производителя: к 50 мкл 10% латексной суспензии добавляют 100 мкл МКА 13F8 с концентрацией 1 мг/мл, доводят объем до 0,5 мл и инкубируют 2 часа при комнатной температуре и перемешивании. Для блокировки непрореагировавших групп добавляют 4 мл 1% раствора овальбумина (Sigma, США) в 0,1 М боратном буфере (ББ), pH 8,2. От несвязавшихся МКА 13F8 латексные частицы отмывают в ББ трехкратным 10-минутным центрифугированием при 1200 g. Осадок ресуспендируют в 5 мл ББ с 1% овальбумином.
Реакцию латекс-агглютинации проводят в 96-луночных планшетах с V-образным профилем лунок (фирма Пан Эко, Россия). В качестве контроля используют капсульный F1 антиген и клетки штамма Y.pestis EV НИИЭГ, выращенные при 37°C. Для контроля специфичности используют штаммы: Y.pestis EV НИИЭГ (выращенные при 28°C), Y. enterocolitica 287, Y.pseudotuberculosis III, S. enteritidis 1127, S.typhi H-901, Sal.paratyphi A-225, Sh.disenteriae 1362, E.coli ATCC 25922, E.coli 1282 ГИСК, L.pneumophila ATCC-33152, P.alcalifaciens 1068-50, P.aeruginosa ATCC27853.
В качестве отрицательного контроля используют 0,1 М боратный буфер, рН 8,2.
Разведения клеток штаммов микроорганизмов с шагом 2 готовят в объеме 25 мкл в 96-луночных планшетах в боратном буфере. После добавления во все лунки по 25 мкл латексных частиц с иммобилизованными МКА 13F8, планшет встряхивают и инкубируют 1,5-2,0 часа при комнатной температуре.
Учет результатов проводят визуально по четырех крестной системе на светлом фоне при хорошем освещении.
4+ - все частицы латекса агглютинированы, равномерно покрывают дно лунки, образуя «зонтик».
3+ - Агглютинированы почти все частицы латекса, что выражается в уменьшении диаметра «зонтика».
2+ - Агглютинирована половина латексных частиц.
1+ - Большинство частиц не агглютинировано и осело на дно лунки, но диаметр «пуговицы» пока еще отличается от «точки».
«-» - Признаков агглютинации нет, латексные частицы осели на дно лунки в виде «точки» ярко синего цвета в центре лунки.
Положительной считается реакция, оцениваемая не менее чем на 3+.
В результате проведенной реакции латекс-агглютинации было установлено, что латексные частицы с иммобилизованными МКА 13F8 выявляют F1 антиген в концентрации 0,0038 мкг/мл и клетки штамма Y.pestis EV НИИЭГ (при 37°C) в концентрации 3,6×105 клеток/мл и не выявляют гетерологичные культуры микроорганизмов в концентрации 5×108 клеток/мл и ниже (фиг.6, фиг.7, таблица 1, таблица 2, таблица 3).
Пример 7. Выявление капсульного F1 антигена Y. pestis методом ИФА с использованием МКА 13F8
МКА 13F8 в фосфатно-солевом буфере, рН 7,4 с начальной концентрацией 5 мкг/лунку титровали двукратным шагом по вертикали до конечной концентрации 0,035 мкг/лунку (по 100 мкл/лунку в ФСБ). Для титрования использовали 96-ти луночные стрипованные планшеты для ИФА. В первый вертикальный ряд планшета вносили положительные (К+) и отрицательные контроли (K-) контроли. Лунку A1 с отрицательным контролем использовали как бланк. Планшет с антителами инкубировали в течение 1 ч на шейкере при температуре 37°C, затем 4 раза промывали ФСБ-Т. Участки неспецифического связывания блокировали добавлением в лунки по 160 мкл молока 0,5% жирности, инкубировали в течение 1 ч на шейкере при температуре 37°C и промывали 3 раза ФСБ-Т. F1 антиген титровали двукратным шагом по горизонтали с начальной концентрацией 0,1 мкг/лунку в ФСБ до конечной концентрации 0,000097 мкг/лунку в ФСБ (по 100 мкл/лунку в ФСБ), инкубировали при тех же условиях, после чего промывали планшет 4 раза в ФСБ-Т. Биотинилированные МКА 10G4 (фракция №3-1,7 мг/мл) вносили заведомо в избытке (разведение 1:500) по 100 мкл/лунку в ФСБ, инкубацию и промывку планшета проводили четырехкратно, как описано выше. Затем в лунки планшета добавляли по 100 мкл конъюгата стрептавидин-пероксидаза хрена («Имтек», Россия) в разведении 1:5000 (согласно инструкции по применению) в ФСБ. После инкубации и четырехкратной отмывки планшета в лунки вносили по 100 мкл субстрат-индикаторной смеси (0,008 мг ортофенилендиамина в 10 мл фосфатно-цитратного буфера, pH 5,0 с 1 мкл/мл 33% H2O2). Планшет помещали на 3-5 мин в защищенное от света место при комнатной температуре, затем останавливали реакцию 4N серной кислотой (50 мкл/лунку). Учет результатов проводили с помощью планшетного спектрофотометра xMark («Bio-Rad», США) при длине волны 492 нм.
В результате проведенного анализа (таблица 4) было установлено, что для иммобилизованных МКА 13F8 наиболее оптимальной является концентрация 5 мкг/лунку, позволяющая уверенно определять минимальные количества F1 (4 нг/мл).
Источники информации
1. Bleves S, Cornells G.R. (2000) How to survive in the host: the Yersinia lesson. Microbes Infect 2.
2. Домарадский И.В.Чума - М.: Медицина, 1998 г.
3. Санитарные правила 3.4./4.2. 19-30-2005 2005 г. Профилактика заболевания людей чумой. Лабораторная диагностика чумы.
4. Пунский Е.Е., Адаменко Н.И. Медико-географические проблемы аридной зоны. - Ашхабад, 1982. - С.36-38
5. Руководство по профилактике чумы. / Под ред. Наумова А.В., Самойловой Л.В.. - Саратов, 1992. - 278 с.
6. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. / Т. 33 - М.: Высш. Шк., 1991. - С.174-175.
| Таблица 1 Результаты учета реакции латекс-агглютинации |
||||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 3+ | 3+ | 3+ | 3+ | 3+ | - |
| Таблица 2 Результаты учета реакции латекс-агглютинации |
||||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | 1+ | 1+ | 1+ | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| B | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 3+ | 3+ | 2+ | 2+ | - | - | - |
| Таблица 3 Результаты учета реакции латекс-агглютинации |
||||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| B | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| C | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Таблица 4 Выявление капсульного F1 антигена Yersinia pestis методом ИФА |
|||||||||||
| Концентрация МКА 13F8 (мкг/лунка) | Концентрация F1 антигена (мкг/лунка) | ||||||||||
| 0,1 | 0,05 | 0,025 | 0,0125 | 0,00625 | 0,003 | 0,0015 | 0,00078 | 0,00039 | 0,00019 | 0,000097 | |
| Оптическая плотность при длине волны 492 нм (о.е.) | |||||||||||
| 5,00 | 2,895 | 2,442 | 2,081 | 1,524 | 0,887 | 0,553 | 0,357 | 0,233 | 0,127 | 0,069 | 0,039 |
| 2,50 | 2,186 | 1,695 | 1,397 | 1,061 | 0,715 | 0,452 | 0,262 | 0,174 | 0,121 | 0,084 | 0,055 |
| 1,25 | 1,118 | 0,674 | 0,617 | 0,451 | 0,264 | 0,200 | 0,130 | 0,080 | 0,043 | 0,032 | 0,033 |
| 0,63 | 0,481 | 0,248 | 0,271 | 0,178 | 0,112 | 0,103 | 0,075 | 0,055 | 0,027 | 0,014 | 0,002 |
| 0,30 | 0,160 | 0,115 | 0,099 | 0,085 | 0,078 | 0,051 | 0,049 | 0,033 | 0,020 | -0,006 | -0,021 |
| 0,15 | 0,111 | 0,065 | 0,048 | 0,026 | 0,024 | 0,020 | 0,019 | 0,017 | 0,007 | -0,009 | -0,004 |
| 0,07 | 0,126 | 0,099 | 0,063 | 0,021 | 0,014 | 0,011 | 0,009 | 0,007 | 0,002 | -0,003 | -0,001 |
| 0,03 | 0,050 | 0,050 | 0,029 | 0,031 | 0,004 | -0,001 | 0,007 | 0,000 | -0,021 | -0,013 | -0,001 |
Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 13Р8 - продуцент моноклональных антител, специфичных к капсульному F1 антигену Yersinia pestis, депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск», коллекционный номер Н-18.
