Замещенные азоло[1,2,4,5]тетразины - ингибиторы актинобактериальных серин-треониновых протеинкиназ

Описываются новые производные азоло[1,2,4,5]тетразинов общей формулы (I)

где Het=3,5-диметилпиразол-1-ил, X=N,

R=циклопропилметилтио или пентилтио; или

Het=3,5-диметилпиразол-1-ил, Х=СН, R=изопропилтио; или

Het=имидазол-1-ил, Х=СН, R=H,

и применение данных соединений и дополнительно соединений общей формулы (I),

где Het=3,5-диметилпиразол-1-ил, X=N, R=циклопентилтио; или

Het=3,5-диметилпиразол-1-ил, Х=СН, R=H или фенилтио,

на основе выявленной активности в качестве ингибиторов протеинкиназ PknA, PknB Mycobacterium tuberculosis при лечении больных туберкулезом. 2 н.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл., 10 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к фармацевтической химии и касается производных триазоло[4,3-b]- и имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразинов, содержащих в тетразиновом цикле 3,5-диметилпиразолильный или имидазолильный заместитель и алкилтиогруппу в азольном фрагменте. Указанные соединения могут быть использованы в качестве ингибиторов протеинкиназ Mycobacterium tuberculosis в первую очередь для лечения больных туберкулезом.

Уровень техники

Существующие противотуберкулезные препараты были созданы 30-40 лет назад (Gagneux, S., and Small P.M. Lancet Infect Dis: 2007; 7(5): 328-337). Одной из причин трудности лечения туберкулеза является массовое возникновение множественной лекарственной устойчивости (МЛУ или MDR - Multiple Drug Resistance) у возбудителя туберкулеза как к традиционным противотуберкулезным лекарствам, так называемого первого ряда (особенно к рифампицину и изониазиду), так и к препаратам второго ряда (фторхинолонам и аминогликозидам) (Edlin et al. N Engl J Med: 1992; 326(23):1514-1521; Fischl et al., Ann Intern Med: 1992; 117(3):177-183). Среди штаммов MDR особенно опасны штаммы с так называемой широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ или XDR - Extensively Drug-Resistant); они устойчивы не менее чем к 4 (иногда - до 9) препаратам. Поэтому преодоление проблем, стоящих перед фтизиатрией в связи с появлением MDR, является задачей первостепенной важности.

К настоящему времени известно не менее 25 препаратов различных химических групп 1-го и 2-го ряда, употребляющихся при лечении туберкулеза (Shi et al., Mini Rev Med Chem: 2007; 7(11):1177-1185). Мишенью для них являются самые разные стороны метаболизма бактериальной клетки: транскрипция (для рифампицина (Sensi, Rev Infect Dis: 1983; 5 Suppl 3S402-406)); трансляция и синтез белка (для стрептомицина (Bloom and Murray, Science: 1992; 257(5073): 1055-1064), амикацина, капреомицина, канамицина); репликация ДНК (для фторхинолонов (O'brien, A J Respir Crit Care Med: 2003; 168(11):1266-1268)); синтез компонентов клеточной стенки (для изониазида (Heifets, Semin Respir Infect: 1994; 9(2):84-103), этамбутола (Forbes et al. J Bacteriol: 1965; 891299-1305), этионамида); процессы, связанные с изменением мембранного потенциала клетки (для пиразинамида). Очевидно, что нужны новые подходы и поиск новых мишеней для лекарств следующего поколения.

Решаемая проблема: поиск противотуберкулезных средств нового механизма действия (ингибиторы серин-треониновых протеинкиназ), активных в отношении штаммов с множественной лекарственной устойчивостью.

Соединения, раскрываемые в настоящем изобретении, являются новыми, не описанными ранее, производными азоло[1,2,4,5]тетразинов. Способы получения представленных соединений описаны [ЖОрХ, 1999, 35(9), 1379-1383; Изв. АН. Сер. хим., 2011, 5]. Активность азоло[1,2,4,5]тетразинов в отношении протеинкиназ PknA и РknВ Mycobacterium tuberculosis не известна и не описана.

Аналогами вышеуказанных веществ по строению являются темозоломид формулы A, использующийся для лечения онкологических заболеваний [Патент US 0286088 от 10.11.2010], и производные имидазо[1,2-b][1,2,4]триазинов формулы B, являющиеся лигандами рецепторов гамма-аминомасляной кислоты, которые могут быть использованы для лечения различных расстройств психики и центральной нервной системы, в том числе болезней Паркинсона и Альцгеймера [Патент US 6936608 от 30.08.2005].

Аналог по эффективности, канамицин формулы С, является противотуберкулезным препаратом, воздействующим на рибосомальный комплекс, однако, его недостатком является высокий процент штаммов, устойчивых к этому антибиотику.

Раскрытие изобретения

Задача изобретения - использование в качестве ингибиторов протеинкиназ Mycobacterium tuberculosis - ферментов, важных для деления клеток - при лечении больных туберкулезом впервые синтезированных производных [1,2,4]триазоло[4,3-b]- и имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразинов общей формулы I, где

1) Het=3,5-диметилпиразол-1-ил, X=N, R=циклопропилметилтио (Ia) или пентилтио (Ib);

2) Het=3,5-диметилпиразол-1-ил, X=СН, R=изопропилтио (Ic);

3) Het=имидазол-1-ил, X=СН, R=Н (Id);

и известных ранее производных [1,2,4]триазоло[4,3-b]- и имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразинов общей формулы I, где

1) Het=3,5-диметилпиразол-1-ил, X=N, R=циклопентилтио (Ie) [Eur. J. Org. Chem., 2011, 2309-2318];

2) Het=3,5-диметилпиразол-1-ил, X=СН, R=H (If) или фенилтио (Ig) [Изв. АН. Сер. хим., 2011, 5].

Вещества, представленные в настоящем изобретении, могут быть получены с использованием известных методов синтеза производных 3-(алкилтио)-[1,2,4]триазоло[4,3-b][1,2,4,5]тетразинов [ЖОрХ, 1999, 35(9), 1379-1383] и 6-(алкилтио)имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразинов [Изв. АН. Сер. хим., 2011, 5]. Структуру представленных в изобретении новых соединений подтверждают данными спектроскопии ЯМР ¹H (спектрометр Avance DRX-400 (Bruker) с рабочей частотой 400 МГц) и элементного анализа (автоматический анализатор CHN РЕ 2400 сер. II (Perkin Elmer)).

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1

6-(3,5-Диметилпиразол-1-ил)-3-(циклопропилметилтио)-[1,2,4]триазоло[4,3-b][1,2,4,5]тетразин (Ia)

К суспензии 412 мг (2.0 ммоль) 3-гидразино-6-(3,5-диметилпиразол-1-ил)-s-тетразина в 10 мл ДМФА при перемешивании добавляют 0.120 мл (2.0 ммоль) сероуглерода. В образовавшийся раствор через 5 мин вносят 168 мг (2.0 ммоль) NaHCO₃. В реакционную смесь добавляют 0.21 мл (2.2 ммоль) бромметилциклопропана и перемешивают до исчезновения исходного тетразина на ТСХ, фильтруют. Фильтрат выливают в 100 мл холодной воды, продукт экстрагируют хлороформом, чистят колоночной хроматографией (элюент CHCl₃-МеОН 9:1, Rf=0.8). Выход 411 мг (68%). Т.пл. 112-113°C. Найдено, (%): C 47.55; H 4.78; N 36.67. C₁₂H₁₄N₈S. Вычислено, (%): C 47.67; H 4.67; N 36.67. Спектр ЯМР ¹H (CDCl₃, δ, м.д.): 0.66-0.71, 0.39-0.43 (оба м, по 2H, 2СН₂ в циклопропиле); 1.29-1.35 (м, 1H, СН в циклопропиле); 2.40, 2.71 (оба c, по 3H, 2Me в пиразолиле); 3.50 (д, 2Н, 2SCH₂, J=7.4 Гц); 6.22 (c, 1H, H(4) в пиразолиле).

Пример 2

6-(3,5-Диметилпиразол-1-ил)-3-(пентилтио)-[1,2,4]триазоло[4,3-b][1,2,4,5]тетразин (Ib)

Получен аналогично примеру 1 из 3-гидразино-6-(3,5-диметилпиразол-1-ил)-s-тетразина и 1-бромпентана. Выход 41%. Т.пл. 109°C. Найдено, (%): C 49.47; H 5.22; N 35.32. C₁₃H₁₈N₈S. Вычислено, (%): C 49.04; H 5.70; N 35.19. Спектр ЯМР ¹H (CDCl₃, δ, м.д.): 0.92 (т, 3H, (СН₂)₄ CH ₃, J=7.3 Гц); 1.38, 1.48, 1,88 (все м, по 2H, 3СН₂); 2.40, 2.71 (оба c, по 3H, 2Me в пиразолиле); 3.54 (т, 2H, SCH₂, J=7.4 Гц); 6.22 (c, 1H, H(4) в пиразолиле).

Пример 3

6-(Изопропилтио)-3-(3,5-диметилпиразол-1-ил)имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразин (Ic)

К раствору 215 мг (1.0 ммоль) 3-(3,5-диметилпиразол-1-ил)имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразина в 7 мл ацетонитрила добавили 91.2 мг (1.2 ммоль) изопропилмеркаптана и 101 мг (1 ммоль) триэтиламина. Перемешивали 5 ч при комнатной температуре. Растворитель упарили, остаток промыли гексаном, перекристаллизовали из диэтилового эфира. Выход 95%. Т.пл. 108-109°C. Найдено, (%): C 49.78; H 5.30; N 33.58. C₁₂H₁₅N₇S. Вычислено, (%): C 49.81; H 5.23; N 33.88. Спектр ЯМР ¹H (ДМСО-d₆, δ, м.д.): 1.30 (д, 6H, 2Me в Prⁱ, J=6.7 Гц); 2.27, 2.58 (оба c, по 3H, 2Me в пиразолиле); 3.74 (м, 1H, CH в Prⁱ); 6.30 (c, 1H, H(4) в пиразолиле); 8.76 (c, 1H, СН).

Пример 4

3-(Имидазол-1-ил)имидазо[1,2-b] [1,2,4,5]тетразин (Id)

251 мг (1 ммоль) 3-(имидазол-1-ил)-6-(2,2-диметоксиэтиламино)-1,2,4,5-тетразина кипятили 4 ч в 7 мл CH₃COOH. Растворитель удалили при пониженном давлении. Остаток промыли этанолом. Выход 86%. Т.пл. 226-227°C. Найдено, (%): C 44.82; H 2.46; N 52.19. C₇H₅N₇. Вычислено, (%): C 44.92; H 2.69; N 52.39. Спектр ЯМР ¹H (ДМСО-d₆, δ, м.д.): 7.29, 8.05, 8.76 (все м, по 1H, 3CH в имидазолиле); 8.68, 8.83 (оба д, по 1H, 2CH, J=0.9 Гц).

Пример 5

6-(3,5-Диметилпиразол-1-ил)-3-(пентилтио)-[1,2,4]триазоло[4,3-b][1,2,4,5]тетразин (Ie)

Получен аналогично примеру 1 из 3-гидразино-6-(3,5-диметилпиразол-1-ил)-s-тетразина и бромциклопентана. Выход 72%. Т.пл. 119°C. Найдено, (%): C 49.47; H 5.22; N 35.32. C₁₃H₁₆N₈S. Вычислено, (%): C 49.35; H 5.10; N 35.42. Спектр ЯМР ¹H (CDCl₃, δ, м.д.): 1.63-1.77 (м, 6H, 3СН₂); 2.17 (м, 2H, СН₂); 2.29, 2.59 (c, 3H, СН₃ в пиразолиле); 4.17 (м, 1H, SCH); 6.38 (c, 1H, H(4) в пиразолиле).

Пример 6

3-(3,5-Диметилпиразол-1-ил)имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразин (If)

Получен аналогично примеру 4 кипячением 3-(3,5-диметилпиразол-1-ил)-6-(2,2-диметоксиэтиламино)-1,2,4,5-тетразина в уксусной кислоте. Выход 86%. Т.пл. 194-195°C. Найдено, (%): C 50.29; H 4.21; N 45.36. C₉H₉N₇. Вычислено, (%): C 50.23; H 4.22; N 45.56. Спектр ЯМР ¹H (ДМСО-d₆, δ, м.д.): 2.39, 2.77 (оба c, по 3H, 2Me в Pyr); 6.18 (c, 1H, H(4) в пиразолиле); 8.19, 8.44 (оба д, по 1H, 2CH, J=0.8 Гц).

Пример 7

3-(3,5-Диметилпиразол-1-ил)-6-(фенилтио)имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразин (Ig).

Получен аналогично примеру 3 из 3-(3,5-диметилпиразол-1-ил)имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразина и тиофенола. Выход 61 мг (38%). Т.пл. 137-140°C. Найдено, (%): C 55.61; H 3.76; N 30.31. C₁₅H₁₃N₇S. Вычислено, (%): C 55.71; H 4.05; N 30.32. Спектр ЯМР ¹H (ДМСО-d₆, δ, м.д.): 2.25, 2.36 (оба c, по 3H, 2Me в пиразолиле); 6.26 (c, 1H, H(4) в пиразолиле); 7.26-7.34 (м, 5H, Ph); 8.79 (c, 1H, CH).

Пример 8

Проверка на активность в отношении серин-треониновых протеинкиназ.

В тест-системе Streptomyces lividansAPHVIII+ [Danilenko V.N., Simonov A.Y., Lakatosh S.A., Kubbutat M.H., Totzke F., Schächtele C., Elizarov S.M., Bekker O.B., Printsevskaya S.S., Luzikov Y.N., Reznikova M.I., Shtil A.A., Preobrazhenskaya M.N. // J Med Chem., 2008, 51, 24, 7731-7736] были проверены 7 веществ класса азолотетразинов на способность ингибировать серин-треониновые протеинкиназы. Все вещества показали активность в различной степени как ингибиторы протеинкиназ в экспериментах in vitro. Отобраны Ic и If. Был проведен докинг с моделью структуры PknB Mycobacterium tuberculosis. Докинг проводили с использованием программы FRED (Fast Rigid Exhaustive Docking, OpenEye Scientific Software Inc.). По результатам докинга Ic и If показали способность взаимодействовать с аденин-связывающим карманом PknB Mycobacterium tuberculosis. Таким образом была установлена биомишень действия веществ Ic и If (см. фиг.1).

Пример 9

Определение минимальных ингибирующих концентраций в отношении Mycobacterium smegmatis.

Определение минимальных ингибирующих концентраций проводилось методом дисков. Минимальная ингибирующая концентрация для Ic составляет 1,45 мкг/диск, для If - 0,65 мкг/диск.

Таблица 1
№ вещества	Мол. масса	Действующая концентрация,	Зона ингибирования роста, мм
nmole/диск	мкг/диск
Ic		1,0	0,29	0,0
	289,36	5,0	1,45	8,5
	7,0	2,03	12,0
If		0,5	0,32	0,0
	323,38	2,0	0,65	8,5
	5,0	1,60	11,0
Канамицин	484,5	-	0,5	8,5
Диаметр диска - 7 мм.

Пример 10

Определение биологической активности Ic в отношении бактериальной микрофлоры.

Таблица 2
№ вещества	Концентрация	Зона ингибирования роста, мм
нмоль/диск	мкг/диск	Bacillus subtilis 1А2 BGSC	Lactobacillus plantarum NK-1	Escherichia coli BL21 DE3	Saccharom yces cerevisiae S288C
Ic	5,0	1,45	0	0	0	0
	10,0	2,89	8,0	0	0	0
	20,0	5,78	12,0	0	0	0
	50,0	14,50	15,0	0	0	8,0
	100,0	28,93	17,0	8,0	0	9,0
	200,0	57,86	19,0	9,0	7,5	9,5
500,0	145,0	20,0	10,0	8,5	10,0
Диаметр диска - 7 мм.

Ic в указанных в таблице концентрациях не влияет на рост компонента микробиоты человека Bifidobacterium longum, воздействует на Lactobacillus plantarum в концентрации, в 20 раз превышающей MIC на Mycobacterium smegmatis, влияет на рост Escherichia coli в концентрации, в 100 раз превышающей MIC на Mycobacterium smegmatis, воздействует на Bacillus subtilis в концентрации, превышающей в 2 раза MIC на Mycobacterium smegmatis.

Следовательно, Ic ингибирует рост приведенной в таблице бактериальной флоры в концентрациях более высоких, чем ингибирующие концентрации для Mycobacterium smegmatis.

1. 3-(Алкилтио)-[1,2,4]триазоло[4,3-b][1,2,4,5]тетразины и имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразины общей формулы I

где Het - 3,5-диметилпиразол-1-ил, X - N,
R - циклопропилметилтио или пентилтио; или
Het - 3,5-диметилпиразол-1-ил, Х - СН, R - изопропилтио; или Het - имидазол-1-ил, Х - СН, R - H.

2. Ингибиторы протеинкиназ PknA, PknB Mycobacterium tuberculosis, представляющие собой соединения формулы I, где Het - 3,5-диметилпиразол-1-ил, X - N, R - циклопропилметилтио, пентилтио или циклопентилтио; или Het - 3,5-диметилпиразол-1-ил, Х - СН, R - изопропилтио, Н или фенилтио; или Het - имидазол-1-ил, Х - СН, R - H.