Хроматографические способы

Изобретение относится к области хроматографической очистки полипептидов. Предложен способ получения монопегилированного эритропоэтина, включающий его хроматографическую очистку и регенерацию катионообменной хроматографической колонки после элюировании монопегилированного эритропоэтина. Элюирование адсорбированного монопегилированного эритропоэтина из колонки проводят забуференным водным раствором, содержащим хлорид Натрия в концентрации по меньшей мере 500 мМ, затем колонку промывают очищенной водой, вводят в колонку 0,5 М раствора гидроксида натрия, повторно промывают, вводят в колонку раствор, содержащий 0,5 М дигидрофосфата натрия и 1 М фосфорной кислоты, промывают, вводят в колонку 0,5 М раствора гидроксида натрия по меньшей мере на 4 часа и окончательно регенерируют колонку посредством ее промывания очищенной водой. Изобретение обеспечивает высокую чистоту монопегилированного эритропоэтина. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл., 1 пр.

 

Настоящее изобретение относится к области способов хроматографического выделения, применимых для очистки полипептидов, в особенности пегилированных полипептидов.

Предпосылки к созданию изобретения

Белки играют важную роль в современном медицинском арсенале. Для применения на людях всякий терапевтический белок должен соответствовать определенным критериям. Дабы обеспечить безопасность биофармацевтических средств для людей, необходимо особо озаботиться удалением побочных продуктов, накапливающихся в ходе процесса изготовления. Для удовлетворения нормативным требованиям, вслед за процессом изготовления должны следовать одна или несколько стадий очистки. Среди прочих параметров важную роль при выборе подходящего способа очистки играют чистота, производительность и выход.

Общепризнанны и широко применимы различные способы очистки белков, такие как аффинная хроматография с микробными белками (например, аффинная хроматография с А-белком или G-белком), ионообменная хроматография (например, катионообменная (сульфопропильные или карбоксиметильные смолы), анионообменная (аминоэтильные смолы) и в смешанном режиме), тиофильная адсорбционная хроматография (например, с бета-меркаптоэтанолом и другими SH-лигандами), гидрофобная хроматография или адсорбционная хроматография с ароматическими группами (например, с фенилсефарозой, аза-аренофильными смолами или м-аминофенилбороновой кислотой), металл-хелатная аффинная хроматография (например, с носителем со сродством к Ni(II)- и Cu(II)), эксклюзионная хроматография и электрофоретические методы (такие как гель-электрофорез, капиллярный электрофорез) (Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102).

Сообщалось о конъюгации для, например, полиэтиленгликоля (ПЭГ) и интерлейкина-6 (Европейский патент EP 0442724), ПЭГ и эритропоэтина (международная заявка на изобретение WO 01/02017), содержащих эндостатин химерных молекул и иммуноглобулинов (заявка на патент США US 2005/008649), гибридных белков на основе секретируемых антител (заявка на патент США US 2002/147311), содержащих альбумин гибридных полипептидов (заявка на патент США US 2005/0100991; человеческого сывороточного альбумина - патент США US 5876969), пегилированных полипептидов (заявка на патент США US 2005/0114037) и гибридных интерферонов.

Necina, R. и др. (Biotechnol. Bioeng. 60 (1998) 689-698) сообщали о захвате человеческих моноклональных антител прямо из надосадочных жидкостей клеточных культур с помощью ионообменных сред, характеризуемых высокой плотностью заряда. В международной заявке на изобретение WO 89/05157 сообщается о способе очистки получаемых иммуноглобулинов посредством непосредственной катионообменной обработки клеточной культуральной среды. Одностадийная очистка моноклональных антител IgG (иммуноглобулин G) из перитонеального выпота мышей описана в Danielsson, А., и др., J. Immun. Meth. 115 (1988), 79-88. Способ очистки полипептида с помощью ионообменной хроматографии описан в международной заявке на изобретение WO 2004/024866, в которой для отделения искомого полипептида от одного или нескольких загрязнителей применяют градиентное элюирование. В Европейском патенте EP 0530447 описан способ очистки моноклональных антител IgG с помощью комбинации трех хроматографических стадий. Удобный способ очистки монопегилированного антагониста рецептора интерлейкина-1 описано в Yu, G., и др., в Process Biotechnol. 42 (2007) 971-977. Wang и др. (Wang, H., и др., Peptides 26 (2005) 1213-1218) сообщают об очистке белка hTFF3, экспрессируемого кишечной палочкой E.coli, с помощью двухстадийной катионообменной хроматографии. Yun и др. (Yun, Q., и др., J. Biotechnol. 118 (2005) 67-74) сообщают об очистке пегилированного рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека rhG-CSF с помощью двух последовательных ионообменных хроматографических стадий.

Краткое описание изобретения

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения его объектом является способ регенерации катионообменной хроматографической колонки после элюирования искомых веществ, включающий следующие шаги в представленной последовательности:

- элюирование адсорбированных полипептидов из колонки забуференным водным раствором, содержащим хлорид натрия в концентрации по меньшей мере 500 мМ,

- промывание колонки очищенной водой,

- введение в колонку 0,5 М раствора гидроксида натрия,

- промывание колонки очищенной водой,

- введение в колонку раствора, содержащего 0,5 М дигидрофосфата натрия и 1 М фосфорной кислоты,

- промывание колонки очищенной водой,

- введение в колонку 0,5 М раствора гидроксида натрия по меньшей мере на 4 часа и

- регенерацию катионообменной колонки посредством промывания колонки очищенной водой.

Подробное описание изобретения

В первом варианте осуществления настоящего изобретения его объектом является способ регенерации катионообменной хроматографической колонки после элюирования искомых веществ, включающий следующие шаги в представленной последовательности:

- элюирование адсорбированных полипептидов из колонки забуференным водным раствором, содержащим хлорид натрия в концентрации по меньшей мере 500 мМ,

- промывание колонки очищенной водой,

- введение в колонку 0,5 М раствора гидроксида натрия,

- промывание колонки очищенной водой,

- введение в колонку раствора, содержащего 0,5 М дигидрофосфата натрия и 1 М фосфорной кислоты,

- промывание колонки очищенной водой,

- введение в колонку 0,5 М раствора гидроксида натрия по меньшей мере на 4 часа и

- регенерацию катионообменной колонки посредством промывания колонки очищенной водой.

Термин «очищенная вода», как он употребляется в настоящей заявке, означает воду для инъекций согласно Фармакопее США.

Термин «ионообменное вещество» (ионит), как он употребляется в настоящей заявке, означает неподвижную матрицу высокой молекулярной массы, несущую ковалентно связанные заряженные заместители, применяемую в качестве неподвижной фазы в ионообменной хроматографии. Для общей электронейтральности с ней нековалентно связаны противоионы. «Ионообменное вещество» характеризуется способностью обменивать свои нековалентно связанные противоионы на сходным образом заряженные ионы из окружающего раствора. В зависимости от заряда своих обмениваемых противоионов, «ионообменная смола» относится к катионообменной смоле или к анионообменной смоле. В зависимости от природы заряженной группы (заместителя) «ионообменная смола» относится, в случае, например, катионообменных смол, к сульфокислотной смоле (S), или сульфопропильной смоле (SP), или карбоксиметильной смоле (СМ). В зависимости от химической природы заряженной группы/заместителя «ионообменная смола» может быть дополнительно классифицирована как сильная или слабая ионообменная смола, что зависит от силы ковалентно связанного заряженного заместителя. Например, сильные катионообменные смолы содержат сульфокислотную группу, предпочтительно сульфопропильную группу, в качестве заряженного заместителя, а слабые катионообменные смолы содержат карбоксильную группу, предпочтительно карбоксиметильную группу, в качестве заряженного заместителя, слабые же анионообменные смолы содержат диэтиламиноэтильную группу в качестве заряженного заместителя. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения катионообменная хроматографическая колонка содержит сульфопропильную катионообменную смолу, т.е. она является сульфопропильной катионообменной хроматографической колонкой.

Различные типы ионообменных материалов, т.е. неподвижных фаз, доступны под разными наименованиями от многих компаний, включая, например, катиониты Bio-Rex® (например, тип 70), Chelex® (например, тип 100), Macro-Prep® (например, тип CM, High S, 25 S), AG® (например, тип 50W, МР), предоставляемые компанией BioRad Laboratories, WCX 2 от компании Ciphergen, Dowex® MAC-3 от компании Dow Chemical Company, Mustang С и Mustang S от компании Pall Corporation, целлюлоза CM (например, тип 23, 52), hyper-D, partisphere от компании Whatman plc., Амберлит® IRC (например, тип 76, 747, 748), Амберлит® GT 73, Тойоперл® (например, тип SP, CM, 650M), предоставляемые компанией Tosoh Bioscience GmbH, CM 1500 и CM 3000 от компании BioChrom Labs, SP-сефароза^ТМ, СМ-сефароза^ТМ от компании GE Healthcare, смолы Poros от компании PerSeptive Biosystems, Asahipak ES (например, тип 502С), CXpak P, IEC CM (например, тип 825, 2825, 5025, LG), IEC SP (например, тип 420N, 825), IEC QA (например, тип LG, 825), предоставляемые компанией Shoko America Inc., катионообменная смола 50W от компании Eichrom Technologies Inc. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, катионит является сильным катионитом, таким как Macro-Prep® High S или 25S, или MacroCap SP, или Тойоперл® SP 650M, или Source S, или SP сефароза, или POLYCAT А. Примерами анионитов являются Dowex® 1 от компании Dow Chemical Company, AG® (например, тип 1, 2, 4), Bio-Rex® 5, ДЭАЭ (диметиламиноэтил) Bio-Gel 1, Macro-Prep® ДЭАЭ, предоставляемые кампанией BioRad Laboratories, анионообменная смола типа 1 от компании Eichrom Technologies Inc., Source Q, ANX сефароза 4, ДЭАЭ-сефароза (например, тип CL-6B, FF), Q сефароза, Capto Q, Capto S, предоставляемые компанией GE Healthcare, AX-300 от компании PerkinElmer, Asahipak ES-502C, AXpak WA (например, тип 624, G), IEC ДЭАЭ, предоставляемые кампанией Shoko America Inc., Амберлит® IRA-96, Тойоперл® ДЭАЭ, TSKgel ДЭАЭ, предоставляемые кампанией Tosoh Bioscience GmbH, Mustang Q от компании Pall Corporation.

Термин «промывание», как он употребляется в настоящей заявке, означает промывание колонки указанным раствором в объеме двух или более объемов колонки.

Выражение «одинаковый тип катионита» относится к двум последовательным ионообменным хроматографическим стадиям, осуществляемым с использованием идентичного катионита. Это означает, что последовательные катионообменные хроматографические стадии осуществляют либо с использованием первой порции катионита для первой катионообменной хроматографической стадии и второй порции того же самого катионита для второй катионообменной хроматографической стадии, либо с использованием одного и того же катионита для обеих катионообменных хроматографических стадий.

Термины «ступенчатое элюирование» и «метод ступенчатого элюирования», употребляемые в настоящей заявке взаимозаменяемо, обозначают способ, в котором, например, концентрацию вещества, вызывающего элюирование, т.е. растворение связанного соединения из вещества-носителя, скачкообразно повышают или понижают, т.е. непосредственно от одного значения/уровня до другого значения/уровня. При данном «ступенчатом элюировании» одно или несколько условий, например рН, ионную силу, концентрацию соли и/или скорость элюирования, скачкообразно изменяют от первой, например, исходной, величины до второй, например, конечной, величины, т.е. условия изменяют дискретно, т.е. ступенчато, в отличие от линейных изменений. В «методе ступенчатого элюирования» собирают новую фракцию после каждого повышения ионной силы. Эта фракция содержит соединения, выделенные из ионообменного вещества при соответствующем повышении ионной силы. После каждого повышения условия поддерживают до следующей стадии данного метода элюирования.

Термины «непрерывное элюирование» и «метод непрерывного элюирования», употребляемые в настоящей заявке взаимозаменяемо, означают способ, в котором, например, концентрацию вещества, вызывающего элюирование, т.е. растворение связанного/адсорбированного соединения из хроматографического носителя, повышают или понижают непрерывно, т.е. концентрацию изменяют последовательными малыми шагами, на каждом из которых происходит не более чем двухпроцентное, предпочтительно однопроцентное, изменение концентрации вызывающего элюирование вещества. При данном «непрерывном элюировании» одно или несколько условий, например рН, ионная сила, концентрация соли и/или скорость элюирования, может быть изменена линейно, или экспоненциально, или асимптотически. Предпочтительно, изменение осуществляется линейно.

Термин «введение» и его грамматические эквиваленты, как он употребляется в настоящей заявке, означает подстадию способа очистки, на которой содержащий искомое вещество раствор вводят в контакт с неподвижной фазой. Это означает, что а) раствор вводят в хроматографическое устройство, в котором находится неподвижная фаза, или б) неподвижную фазу добавляют к раствору. В случае а) раствор, содержащий подвергаемое очистке искомое вещество, проходит через неподвижную фазу, обеспечивая взаимодействие между неподвижной фазой и веществами в растворе. В зависимости от условий, таких как, например, рН, проводимость, концентрация соли, температура и/или скорость элюирования, некоторые вещества из раствора связываются с неподвижной фазой и таким образом удаляются из раствора. Другие вещества остаются в растворе. Остающиеся в растворе вещества могут быть обнаружены в проточной фракции. Термин «проточная фракция» означает раствор, получаемый после прохождения хроматографического устройства, который может быть как введенным раствором, содержащим искомое вещество, так и буферным раствором, используемым для промывания колонки или элюирования одного или нескольких связанных с неподвижной фазой веществ. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения хроматографическое устройство является колонкой или кассетой. Искомое вещество может быть выделено из раствора после стадии очистки с помощью известных специалисту в соответствующей области способов, таких как, например, осаждение, высаливание, ультрафильтрация, диафильтрация, лиофилизация, аффинная хроматография или снижение объема растворителя, с целью получения искомого вещества в форме, являющейся в существенной степени гомогенной. В случае б) к раствору, содержащему подвергаемое очистке искомое вещество, добавляют неподвижную фазу, например твердое вещество, обеспечивая взаимодействие между неподвижной фазой и веществами в растворе. После взаимодействия неподвижную фазу удаляют, например, посредством фильтрования, а искомое вещество либо оказывается связано с неподвижной фазой и удалено вместе с ней из раствора, либо не связывается с неподвижной фазой и остается в растворе.

Выражение «в пригодных для связывания условиях» и его грамматические эквиваленты, как оно употребляется в настоящей заявке, означает, что искомое вещество, например пегилированный эритропоэтин, связывается с неподвижной фазой при введении во взаимодействие с ней, например с ионообменным веществом. Это не обязательно означает, что связываются все 100% искомого вещества, но 100% искомого вещества связываются в существенном количестве, т.е. с неподвижной фазой связывается хотя бы 50% искомого вещества, связывается хотя бы 75% искомого вещества, связывается хотя бы 85% искомого вещества или связывается более 95% искомого вещества.

Термин «забуференный», как он употребляется в настоящей заявке, означает раствор, в котором изменения рН вследствие добавления или высвобождения кислотных или основных веществ выравниваются с помощью буферного вещества. Может быть задействовано любое буферное вещество, приводящее к такому эффекту. Предпочтительно используют фармацевтически приемлемые буферные вещества, такие как, например, фосфорная кислота или ее соли, уксусная кислота или ее соли, лимонная кислота или ее соли, морфолин, 2-(N-морфолино)этансульфокислота или ее соли, гистидин или его соли, глицин или его соли или трис(гидроксиметил)аминометан (Трис) или его соли. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения в качестве буферного вещества используют фосфорную кислоту или ее соли, или уксусную кислоту или ее соли, или лимонную кислоту или ее соли, или гистидин или его соли. Буферный раствор может необязательно содержать дополнительную соль, такую как хлорид натрия, сульфат натрия, хлорид калия, сульфат калия, цитрат натрия или цитрат калия.

Общие методы хроматографии и их применение известны специалисту в соответствующей области. См., например, Chromatography (Хроматография), 5-е издание, часть A: Fundamentals and Techniques (Основы и методы), под ред. Heftmann, E., Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992); Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences (Продвинутые хроматографические и электромиграционные методы в биологических науках), под ред. Deyl, Z., Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998); Chromatography Today (Хроматография сегодня), Poole, С.F., и Poole, S.K., Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (Очистка белков: принципы и практика) (1982); под ред. Sambrook, J., и др., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Молекулярное клонирование: лабораторное руководство), 2-е издание, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; или Current Protocols in Molecular Biology (Современные методики в молекулярной биологии), под ред. Ausubel, F.М., и др., John Wiley&Sons, Inc., New York.

Пегилирование эритропоэтина приводит, как правило, к смеси различных соединений, таких как полипегилированный эритропоэтин, монопегилированный эритропоэтин, непегилированный эритропоэтин, продукты гидролиза активированного сложного эфира эритропоэтина, например пегилированная кислота в свободном виде, равно как и продукты гидролиза самого эритропоэтина. С целью получения монопегилированного эритропоэтина в форме, являющейся существенно гомогенной, эти соединения должны быть разделены, а искомое соединение должно быть очищено.

В связи с этим, во втором варианте осуществления настоящего изобретения его объектом является способ получения монопегилированного эритропоэтина в форме, являющейся в существенной степени гомогенной, включающий следующие стадии:

а) пегилирование эритропоэтина с помощью активированного пегилирующего реагента с молекулярной массой от 20 кДа до 40 кДа,

б) очистку получаемого на стадии а) пегилированного эритропоэтина с помощью двух последовательных катионообменных хроматографических стадий, где на первой и второй катионообменных хроматографических стадиях задействован катионит одного и того же типа,

в) выделение монопегилированного эритропоэтина из второй катионообменной хроматографической колонки в форме, являющейся в существенной степени гомогенной,

г) регенерацию катионообменной хроматографической колонки с помощью способа согласно настоящему изобретению.

Этот способ особенно полезен для очистки пегилированных рекомбинантных полипептидов, являющихся гликозилированными, т.е. выработанных в клетках млекопитающих, предпочтительно в клетке яичников китайского хомячка (СНО), человеческой эмбриональной клетке почек (HEK293), клетке почек детеныша хомячка (BHK), клетке линии Per.С6® или раковой клетке HeLa, и впоследствии пегилированных химически. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения регенерация катионообменной хроматографической колонки включает следующие шаги:

- удаление связанных полипептидов из катионообменной колонки с помощью забуференного водного раствора, содержащего хлорид натрия,

- промывание колонки очищенной водой, предпочтительно, в объеме по меньшей мере двух объемов колонки,

- введение в колонку 0,5 М раствора гидроксида натрия, предпочтительно, в объеме по меньшей мере двух объемов колонки,

- промывание колонки очищенной водой, предпочтительно, в объеме по меньшей мере двух объемов колонки,

- введение в колонку раствора, содержащего 0,5 М дигидрофосфата натрия и 1 М фосфорной кислоты, предпочтительно, в объеме по меньшей мере трех объемов колонки,

- промывание колонки очищенной водой, предпочтительно, в объеме по меньшей мере двух объемов колонки,

- введение в колонку 0,5 М раствора гидроксида натрия по меньшей мере на 4 часа, предпочтительно, на 4 часа, и

- регенерацию катионообменной колонки посредством промывания колонки очищенной водой, предпочтительно, в объеме по меньшей мере двух объемов колонки.

На первой стадии способа эритропоэтин пегилируют. Полимерные молекулы полиэтиленгликоля (ПЭГ), применяемые в реакции пегилирования, характеризуются молекулярной массой приблизительно от 20 кДа до 40 кДа (под термином «молекулярная масса», как он здесь употребляется, следует понимать среднюю молекулярную массу ПЭГ, поскольку ПЭГ, являющийся полимерным соединением, нельзя получить с определенной молекулярной массой, на самом же деле он характеризуется молекулярно-массовым распределением. Термин «приблизительно» указывает на то, что в подобных образцах ПЭГ некоторые молекулы будут иметь большую, а некоторые меньшую массу по сравнению с указанной молекулярной массой, т.е. термин «приблизительно» относится к молекулярно-массовому распределению, в котором 95% молекул ПЭГ характеризуются молекулярной массой в пределах +/- 10% от указанной молекулярной массы. Например, молекулярная масса 30 кДа означает диапазон от 27 кДа до 33 кДа).

Термин «эритропоэтин» относится к белку, характеризуемому последовательностью за номером 1 или за номером 2 из приведенного ниже описания последовательностей или ко в существенной степени ему гомологичному белку или полипептиду, биологические свойства которого относятся к стимуляции выработки красных кровяных клеток и к стимуляции деления и дифференцировки коммитированных эритроидных клеток-предшественников в костном мозге. Рекомбинантный эритропоэтин может быть получен посредством экспрессии в эукариотических клетках, например в клетках СНО, или клетках BHK, или клетках HeLa, с помощью технологии, основанной на рекомбинантной ДНК, или посредством эндогенной активации гена. Например, эритропоэтиновый гликопротеид экспрессируется посредством эндогенной активации гена, как это сообщается в Патентах США US 5733761, US 5641670, US 5733746 и международных заявках на изобретение WO 93/09222, WO 94/12650, WO 95/31560, WO 90/11354, WO 91/06667 и WO 91/09955. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения эритропоэтин согласно настоящему изобретению основан на последовательности человеческого эритропоэтина (ЭПО). В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения человеческий эритропоэтин характеризуется аминокислотной последовательностью, представленной в приведенном ниже описании под номером 1 или под номером 2, предпочтительно человеческий эритропоэтин характеризуется аминокислотной последовательностью, представленной в приведенном ниже описании под номером 1. Термин «эритропоэтин» также относится к таким вариантам белка согласно последовательностям под номером 1 или под номером 2, в которых один или несколько аминокислотных остатков заменены, удалены или вставлены и которые обладают той же биологической активностью, что и немодифицированный белок, как это, например, описано в Европейском патенте EP 1064951 или в патенте США US 6583272. Вариант может характеризоваться аминокислотной последовательностью человеческого эритропоэтина, содержащей от одного до шести дополнительных сайтов для гликозилирования. Специфическая активность пегилированного эритропоэтина может быть определена с помощью различных анализов, известных в соответствующей области. Биологическая активность очищенного пегилированного эритропоэтина по настоящему изобретению такова, что введение белка посредством инъекции пациентам-людям приводит к увеличению выработки клетками костного мозга ретикулоцитов и красных кровяных клеток по сравнению с не подвергнутыми инъекции или контрольными группами пациентов. Биологическая активность пегилированного эритропоэтина, полученного и очищенного в соответствии с настоящим изобретением, может быть исследована с помощью способов согласно Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2).

Термин «ПЭГ» или «ПЭГ-группа» согласно настоящему изобретению означает остаток, содержащий полиэтиленгликоль в качестве свой основной части. Подобный ПЭГ может содержать другие химические группы, необходимые для реакций связывания, т.е. конъюгации, образующиеся в результате химического синтеза молекулы, или являющиеся спейсером для оптимального расстояния между частями молекулы. Эти дополнительные химические группы не учитываются при расчете молекулярной массы полимерной молекулы ПЭГ. Кроме того, подобный ПЭГ может включать одну или несколько боковых цепей ПЭГ, связанных друг с другом. Варианты ПЭГ с более чем одной цепью ПЭГ называются многолучевыми или разветвленными ПЭГ. Разветвленные ПЭГ могут быть получены, например, посредством добавления полиэтиленоксида к различным полиолам, включая глицерин, пентаэритрит и сорбит. Разветвленные ПЭГ описаны, например, в Европейском патенте EP 0473084 и Патенте США US 5932462. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения в качестве ПЭГ с молекулярной массой 20-35 кДа используют линейные молекулы ПЭГ, а в другом варианте осуществления настоящего изобретения в качестве полимеров ПЭГ с молекулярной массой свыше 35 кДа, в особенности 40 кДа, используют разветвленные варианты ПЭГ. В качестве ПЭГ с массой 40 кДа особенно предпочтителен ПЭГ с двумя цепями.

Термин «пегилирование» означает ковалентное связывание полиэтиленгликолевого остатка по N-концу полипептида и/или внутреннему лизиновому остатку. Пегилирование белков широко известно в соответствующей области, обзор ему дан, например, в Veronese, P.M., Biomaterials 22 (2001) 405-417. ПЭГ может быть присоединен с помощью различных функциональных групп и полиэтиленгликолей различной молекулярной массы, линейных и разветвленных вариантов ПЭГ, равно как и различных соединительных групп (см. также Francis, G.E., и др., Int. J. Hematol. 68 (1998) 1-18; Delgado, С., и др., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Systems 9 (1992) 249-304). Пегилирование эритропоэтина может быть осуществлено в одном растворе с помощью пегилирующих реагентов, как это описано, например, в международной заявке на изобретение WO 00/44785, в одном из вариантов осуществления - с использованием активированных N-гидроксисукцинимидом (НГС) линейных или разветвленных молекул ПЭГ с молекулярной массой между 5 кДа и 40 кДа. Пегилирование также может быть осуществлено в твердой фазе согласно Lu, Y., и др., Reactive Polymers 22 (1994) 221-229. Нередко пегилированные по N-концу белки могут быть также получены согласно международной заявке на изобретение WO 94/01451.

Подобные способы приводят к эритропоэтину, пегилированному по одной или нескольким ε-аминогруппам лизиновых остатков и/или по N-концевой аминогруппе. Селективное пегилирование по N-концевой аминокислоте может быть осуществлено согласно Felix, A.M., и др., ACS Symp.Ser. 680 (полиэтиленгликоль) (1997) 218-238. Селективное пегилирование по N-концу может быть достигнуто в ходе твердофазного синтеза посредством сочетания N^α-пегилированного аминокислотного производного c N-1 концевой аминокислотой пептидной цепи. Пегилирование в виде боковой цепи может быть осуществлено в ходе твердофазного синтеза посредством сочетания N^ε-пегилированных производных лизина с растущей цепью. Комбинированное пегилирование по N-концу и с образованием боковой цепи осуществимо или как это описано выше в ходе твердофазного синтеза, или посредством синтеза в растворе, подвергая пептид со снятой защитой аминогруппы действию активированных пегилирующих реагентов.

Подходящими производными ПЭГ являются активированные молекулы ПЭГ со средней молекулярной массой от, приблизительно, 5 до, приблизительно, 40 кДа, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, от, приблизительно, 20 до, приблизительно, 40 кДа, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения и от, приблизительно, 30 кДа до, приблизительно, 35 кДа в более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения. Производные ПЭГ могут являться линейными или разветвленными ПЭГ. Большое разнообразие производных ПЭГ, подходящих для применения в получении ПЭГ-белковых и ПЭГ-пептидных конъюгатов, может быть получено от компании (Huntsville, AL, U.S.A.; www.nektar.com).

Активированные производные ПЭГ известны в соответствующей области и описаны, например, в Morpurgo, M., и др., J. Bioconjug. Chem. 7 (1996) 363-368, для случая ПЭГ-винилсульфона. Линейные и разветвленные виды ПЭГ пригодны для получения пегилированных фрагментов. Примерами реакционноспособных реагентов ПЭГ являются иодацетилметокси-ПЭГ или метокси-ПЭГ-винилсульфон (m предпочтительно является целым числом от, приблизительно, 450 до, приблизительно, 900, a R является низшим алкилом, линейным или разветвленным и содержащим от одного до шести атомов углерода, таким как метил, этил, изопропил и т.п., причем предпочтительным является метил):

или

Применение этих активированных иодом веществ известно в соответствующей области и описано, например, Hermanson, G. Т., в Bioconjugate Techniques (Методики биоконъюгатов), Academic Press, San Diego (1996) стр.147-148.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения ПЭГ является активированным сложным эфиром ПЭГ, например N-гидроксисукцинимидилпропионатом, или N-гидроксисукцинимидилбутаноатом, или N-гидроксисукцинимидинами, такими как ПЭГ-НГС (Monfardini, C., и др., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения сложный эфир N-гидроксисукцинимида является

или

с использованием алкокси-ПЭГ-N-гидроксисукцинимида, такого как метокси-ПЭГ-N-гидроксисукцинимид (MW 30000; Shearwater Polymers, Inc.), где R и m отвечают вышеприведенному определению. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения ПЭГ является сложным N-гидроксисукцинимидиловым эфиром метоксиполиэтиленгликольмасляной кислоты. Термин «алкоксигруппа» относится к группе простого алкилового эфира, где термин «алкил» означает неразветвленную или разветвленную алкильную группу, содержащую не более четырех атомов углерода, такую как метоксигруппа, этоксигруппа, н-пропоксигруппа и им подобные, предпочтительно метоксигруппа.

Выражение «в существенной степени гомогенная форма», как оно употребляется в настоящей заявке, означает, что полученный, содержащийся или применяющийся пегилированный эритропоэтин содержит определенное количество присоединенных групп ПЭГ. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения пегилированный эритропоэтин является монопегилированным эритропоэтином. Препарат может содержать непрореагировавший (т.е. не несущий группы ПЭГ) эритропоэтин, полипегилированный эритропоэтин, равно как и фрагменты полипептида, образованы в ходе реакции пегилирования. Термин «в существенной степени гомогенная форма» означает, что препарат монопегилированного эритропоэтина содержит в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения хотя бы 50% (мас./мас.) монопегилированного эритропоэтина, хотя бы 75% монопегилированного эритропоэтина, хотя бы 90% монопегилированного эритропоэтина или более 95% монопегилированного эритропоэтина. Величины в процентах основаны на проценте площади хроматограммы, отвечающей результатам катионообменной хроматографической очистки, после которой получают монопегилированный эритропоэтин.

Объектом настоящего изобретения является способ очистки монопегилированного эритропоэтина, имеющий целью получение монопегилированного эритропоэтина в форме, являющейся в существенной степени гомогенной. Было неожиданно обнаружено, что сочетание двух последовательных катионообменных хроматографических стадий, использующих одинаковый тип катионита, приводит к монопегилированному эритропоэтину в форме, являющейся в существенной степени гомогенной. Таким образом, объектом настоящего изобретения является способ очистки монопегилированного эритропоэтина, включающий стадии получения раствора, содержащего моно-, поли- и непегилированный эритропоэтин, осуществления двух последовательных катионообменных хроматографических стадий, выделения очищенного монопегилированного эритропоэтина на второй катионообменной хроматографической стадии, причем на обеих катионообменных хроматографических стадиях используется одинаковый тип катионита, и регенерации катионообменной хроматографической колонки с помощью способа согласно первому варианту осуществления настоящего изобретения.

Выделение очищенного монопегилированного эритропоэтина на второй катионообменной хроматографической стадии осуществляют посредством элюирования монопегилированного эритропоэтина из задействованного на второй хроматографической стадии катионита. В одном из вариантов осуществлении способа согласно настоящему изобретению две катионообменные хроматографические стадии различаются задействуемым способом элюирования. В этом варианте осуществления первую катионообменную хроматографическую стадию осуществляют с помощью способа ступенчатого элюирования, т.е. ионную силу используемого буфера повышают ступенчато, т.е. скачкообразно, от одной величины ионной силы до следующей величины ионной силы. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ ступенчатого элюирования осуществляют в виде трехступенчатого элюирования. На первой ступени из катионообменной хроматографической колонки преимущественно элюируется полипегилированный эритропоэтин. При втором увеличении ионной силы в основном элюируется монопегилированный эритропоэтин с чистотой более 60% исходя из площади соответствующей эксклюзионной хроматограммы (% площади). При третьем повышении ионной силы из колонки преимущественно элюируется остающийся непегилированный эритропоэтин.

Вторую катионообменную хроматографическую стадию проводят в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения с помощью способа непрерывного элюирования, т.е. ионная сила буфера повышается непрерывно. Элюируемые фракции, содержащие монопеглированный эритропоэтин, объединяют с целью получения монопегилированного эритропоэтина в форме, являющейся в существенной степени гомогенной, и содержащие, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, менее 0,5% форм с низкой молекулярной массой по данным площадей пиков на соответствующей хроматограмме. Буфер предпочтительно присутствует в концентрации от 10 мМ до 250 мМ, предпочтительно, от 50 мМ до 150 мМ, наиболее предпочтительно - приблизительно 100 мМ.

Таким образом, в способе согласно настоящему изобретению две последовательные катионообменные хроматографические стадии представляют собой следующую последовательность шагов:

а) введение забуференного водного раствора, содержащего смесь моно-, поли- и непегилированного эритропоэтина, а также форм с низкой молекулярной массой, в первую катионообменную хроматографическую колонку в условиях, подходящих для связывания упомянутого монопегилированного эритропоэтина с катионитом, содержащимся в указанной первой колонке,

б) выделение монопегилированного эритропоэтина из первой катионообменной хроматографической колонки с помощью способа ступенчатого элюирования со ступенчатым повышением ионной силы проточного буфера, где относительное содержание монопегилированного эритропоэтина в выделенном растворе повышено по сравнению со смесью, введенной на стадии а),

в) введение выделенного монопегилированного эритропоэтина со стадии б) во вторую катионообменную хроматографическую колонку в условиях, подходящих для связывания упомянутого монопегилированного эритропоэтина с катионитом, содержащимся в указанной второй колонке, причем катионит, содержащийся в таковой второй колонке, того же типа, что и катионит в первой колонке,

г) выделение очищенного монопегилированного эритропоэтина в форме, являющейся в существенной степени гомогенной, из упомянутой второй катионообменной хроматографической колонки с помощью способа непрерывного элюирования с непрерывным повышением ионной силы проточного буфера.

Пегилирование полипептида не приводит, как правило, к продукту пегилирования в гомогенной форме. Более того, его получают в виде смеси монопегилированного, полипегилированного и непегилированного продукта. Поэтому раствор пегилированного эритропоэтина, вводимый на стадии а) способа, является смесью моно-, поли- и непегилированного эритропоэтина, а также форм или фрагментов с низкой молекулярной массой в водном буферном растворе. Относительное содержание различных веществ определяют с помощью эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ЭВЭЖХ). Сумма площадей отнесенных пиков, т.е. площадь под пиками на эксклюзионной хроматограмме является общей площадью эксклюзионной хроматограммы. Доля отдельного пика дается в виде процента от площади, т.е. относительной доли площади от общей площади хроматограммы.

Общие хроматографические методы, их применение и относящиеся к ним термины известны специалисту в соответствующей области. См., например, Chromatography (Хроматография), 5-е издание, Part A: Fundamentals and Techniques (Часть А: Основы и методы), под ред. Heftmann, E., Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992) и другие относящиеся сюда учебники. В продолжение хрматографирования через катионообменную хроматографическую колонку протекает буфер. Этот «проточный буфер» подбирают в соответствии с требованиями стадий хроматографической процедуры. Он переносит искомое вещество к хроматографической неподвижной фазе (введение) и из нее (элюирование).

На первой катионообменной хроматографической стадии смесь монопегилированного, полипегилированного и непегилированного эритропоэтина вводят при концентрации белка около 1 мг/мл в первую катионообменную хроматографическую колонку в водном растворе, забуференном приблизительно 100 мМ фосфата калия при рН около 3,0. Термин «около» («приблизительно»), как он употребляется в настоящей заявке, означает десятипроцентный диапазон вокруг указанной величины, т.е. ±10%. До и после введения первую колонку промывают одним и тем же буферным раствором. Для первой ступени в способе ступенчатого элюирования буфер заменяют на буфер, содержащий около 100 мМ фосфата калия и около 90 мМ хлорида натрия при рН около 3,0. Под действием этого буфера из катионообменной хроматографической колонки элюируются гидролизованный активированный реагент ПЭГ, т.е. соответствующая пегилированная карбоновая кислота, непрореагировавший агент для сочетания и полипегилированный эритропоэтин. Для второй ступени в способе трехступенчатого элюирования буферный раствор заменяют буфером, содержащим около 100 мМ фосфата калия и около 250 мМ хлорида натрия при рН около 3,0. На данной ступени из первой катионообменной хроматографической колонки выделяют монопегилированный эритропоэтин. Собранный проточный буфер с данной стадии элюирования разбавляют в соотношении, приблизительно, 1:5-1:8 очищенной водой. После первой катионообменной хроматографической стадии выделенный монопегилированный эритропоэтин свободен от ПЭГ в свободной форме.

Собранный проточный буфер со второй ступени первой катионообменной хроматографической стадии, содержащий монопегилированный эритропоэтин с повышенным относительным содержанием, т.е. массовая доля или процент от площади (хроматограммы эксклюзионной хроматографии собранного проточного буфера со второй ступени) монопегилированного эритропоэтина увеличились по сравнению с состоянием, предшествовавшим первой катионообменной хроматографической стадии. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения относительное содержание монопегилированного эритропоэтина составляет более чем 60% по площади. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения относительное содержание монопегилированного эритропоэтина составляет более чем 80% по площади.

Для дальнейшей очистки монопегилированного эритропоэтина осуществляют вторую катионообменную хроматографическую стадию. На второй катионообменной хроматографической стадии собранный и разбавленный проточный буфер со второй ступени элюирования приводят к концентрации фосфата калия около 100 мМ и рН около 3,0 и вводят его во вторую катионообменную хроматографическую колонку, содержащую катионит того же типа, что и первая катионообменная хроматографическая колонка. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вторая катионообменная колонка и содержащийся в ней катионит являются теми же самыми, что и на первой катионообменной хроматографической стадии. Монопегилированный эритропоэтин выделяют из второй катионообменной хроматографической колонки посредством приложения линейного градиента, начиная от калий-фосфатного буфера с концентрацией около 100 мМ, содержащего около 50 мМ хлорида натрия при рН около 3,0, и заканчивая калий-фосфатным буфером с концентрацией около 100 мМ, содержащего около 500 мМ хлорида натрия при рН около 3,0. Концентрация хлорида натрия изменяется линейно в продолжение пропускания объема элюента, равного десяти объемам колонки. Проточный буфер разделяют на фракции и разбавляют каждую фракцию 1 М раствором моногидрофосфата калия с целью повышения величины рН до, приблизительно, 6-8.

После второй катионообменной хроматографической стадии монопегилированный эритропоэтин получают в форме, являющейся в существенной степени гомогенной, предпочтительно, с чистотой более 95% по площади.

Специалист в соответствующей области должен быть знаком с методологией ионообменной хроматографии. На стадии выделения полипептида, связанного с катионитом, ионную силу, т.е. проводимость, буфера/раствора, протекающего через ионообменную колонку, повышают. Это может быть осуществлено либо с помощью увеличения концентрации буферной соли, либо посредством добавления других солей, так называемых элюирующих солей, к буферному раствору. В зависимости от способа элюирования, концентрацию буфера/соли повышают скачкообразно (способ ступенчатого элюирования) или непрерывно (способ непрерывного элюирования) посредством добавления частями концентрированного буфера или раствора элюирующей соли. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения элюирующими солями являются цитрат натрия, хлорид натрия, сульфат натрия, фосфат натрия, хлорид калия, сульфат калия, фосфат калия или иные соли лимонной кислоты или фосфорной кислоты, или любые смеси этих компонентов. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения элюирующая соль является цитратом натрия, хлоридом натрия, хлоридом калия или их смесями.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения катионит является сильным катионитом, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения - Тойоперл® SP 650 М, а в другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения - сульфопропильным катионитом. Концентрация вызывающей элюирование соли находится, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, в пределах от 5 мМ до 500 мМ, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения - в пределах от 5 мМ до 400 мМ, а в особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения - в пределах от 5 мМ до 250 мМ, В другом варианте осуществления настоящего изобретения вызывающая элюирование соль используется в то же самое время и в качестве буферного вещества, как-то, например, лимонная кислота или ее соли или фосфорная кислота или ее соли.

Монопегилированный эритропоэтин может применяться в пригодных для инъекций фармацевтических композициях с фармацевтически приемлемым носителем или основой с помощью известных в соответствующей области способов. Например, подходящие композиции описаны в международных заявках на изобретение WO 97/09996. WO 97/40850, WO 98/58660 и WO 99/07401. Среди предпочтительных фармацевтически приемлемых носителей для изготовления препаратов продуктов по настоящему изобретению можно упомянуть человеческий сывороточный альбумин, белки плазмы крови человека и т.п. Соединения по настоящему изобретению могут быть введены в препарат в 10 мМ калий/натрий-фосфатного буфера при рН 7, содержащего средство для поддержания тоничности, например 132 мМ хлорида натрия. Фармацевтическая композиция может необязательно содержать консервант. Фармацевтическая композиция может содержать различные количества монопегилированного эритропоэтина, например 10-1000 мкг/мл, например 50 мкг или 400 мкг.

Введение эритропоэтиновых гликопротеидных продуктов по настоящему изобретению приводит к выработке у людей красных кровяных клеток. Так, введение монопегилированного эритропоэтинового гликопротеидного продукта пополняет количество данного эритропоэтинового белка, что является существенным для выработки красных кровяных клеток. Фармацевтические композиции, содержащие монопегилированные эритропоэтиновые гликопротеидные продукты, могут быть задействованы в препаратах с такой активностью, которая была бы эффективна при введении различными способами пациенту-человеку, страдающему гематологическими расстройствами, характеризуемыми низкой или нарушенной выработкой красных кровяных клеток, как самой по себе, так и в качестве составляющей состояния или заболевания. Фармацевтические композиции могут быть введены посредством инъекции, такой как подкожная или внутривенная инъекция. Средние количества монопегилированного эритропоэтинового гликопротеидного продукта могут варьироваться. Точное количество конъюгата является вопросом предпочтений, зависящих от таких факторов, как точный тип подвергаемого лечению состояния, состояние подвергаемого лечению пациента, а также другие составляющие композиции. Например, может вводиться, например, раз в неделю от 0,01 до 10 мкг на килограмм массы тела, предпочтительно от 0,1 до 1 мкг на килограмм массы тела.

Как было неожиданно обнаружено, катионообменная хроматографическая колонка может быть регенерирована с помощью способа согласно настоящему изобретению без существенного снижения эффективности разделения. Было показано, что со способом регенерации согласно настоящему изобретению катионообменная хроматографическая колонка может быть использована для не менее чем 40 циклов деления, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения - для не менее чем 50 циклов деления, в еще одном варианте осуществления настоящего изобретения - для не менее чем 60 циклов деления, без существенного снижения эффективности разделения (см. фигуру 1) и выхода (см. фигуру 2). Термин «цикл деления», как он употребляется в настоящей заявке, означает последовательность 1) приведения колонки в равновесие, 2) введения разделяемого раствора в колонку, 3) промывания колонки, 4) выделения адсорбированного соединения из колонки, 5) промывания колонки, 6) регенерации колонки. Было также обнаружено, что со способом разделения согласно настоящему изобретению можно не только избежать снижения эффективности разделения, но и предотвратить снижение емкости колонки (см. фигуру 2).

Термин «эффективность разделения», как он употребляется в настоящей заявке, означает способность катионообменной хроматографической колонки к разделению соединений из раствора. Выражение «без существенного снижения», как оно употребляется в настоящей заявке, означает, что катионообменная хроматографическая колонка обеспечивает тот же уровень разделения соединений, т.е. при изменениях в пределах +/- 5%, а в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения - при изменениях в пределах +/-2,5%, при последовательных хроматографических разделениях раствора, содержащего одни и те же соединения. Термин «емкость колонки», как он употребляется в настоящей заявке, означает количество искомого соединения, выделяемого из катионообменной хроматографической колонки.

Нижеследующие примеры, описания последовательностей и фигуры приводятся в качестве вспомогательного материала для понимания настоящего изобретения, истинный объем которого изложен далее в прилагаемой формуле изобретения. Следует понимать, что в описанные далее методики могут быть внесены модификации без отхода от духа изобретения.

Описание фигур

Фигура 1. Чистота монопегилированного эритропоэтина в пуле проточного буфера после первой хроматографической стадии в процессе установления числа циклов процесса регенерации.

Фигура 2. Выход монопегилированного эритропоэтина в пуле проточного буфера после первой хроматографической стадии в процессе установления числа циклов процесса регенерации.

Материалы и методы

ЭВЭЖХ

ЭВЭЖХ разделяет белки в соответствии с их средней молекулярной массой. Таким образом, данный метод способен обнаружить присутствие монопегилированного эритропоэтина, форм и фрагментов с низкой молекулярной массой, полипегилированных форм и высших агрегатов эритропоэтина. Установка ВЭЖХ оснащена детектором для длины волны 220 нм и колонкой Супероза 6 HR (размеры 10×300 мм, Pharmacia Biotech, номер по каталогу: 17-0537-01) или колонкой Супероза 6 10/300 GL (Pharmacia Biotech, номер по каталогу: 17-5172-01). Колонка работает в изократических условиях при комнатной температуре при объемной скорости элюирования около 0,4 мл/мин. Буфер подвижной фазы является 50 мМ натрий-фосфатным буфером, содержащим 300 мМ хлорида натрия при рН 6,8. В зависимости от используемой системы ВЭЖХ, исследование данным методом может быть осуществлено при объеме вводимого образца 100 мкл или 500 мкл. Образцы разбавляют буфером подвижной фазы до концентрации белка около 0,5 мг/мл (загрузка 100 мкл) или 0,1 мг/мл (загрузка 500 мкл). Образцы с концентрацией белка менее 0,1 мг/мл могут использоваться в неразбавленном виде. Элюируемые белки регистрируются при длине волны детектора 220 нм.

Обращенно-фазовая ВЭЖХ (ОФ-ВЭЖХ)

Чистоту анализируют с помощью ОФ-ВЭЖХ, с помощью которой разделяют монопегилированный эритропоэтин от олигомерных форм и родственных соединений. Анализ осуществляют на колонке Poroshell с использованием градиента ацетонитрил/водный раствор трифторуксусной кислоты (ТФУК). Профиль элюирования отслеживают по поглощению в УФ области при длине волны 220 нм. Процент монопегилированного эритропоэтина и родственных соединений или олигомерных форм рассчитывается исходя из общей площади пиков элюированных белков.

Пример 1

Очистка монопегилированного эритропоэтина

Эритропоэтин может быть получен согласно, например, международной заявке на изобретение WO 01/87329, и очищен так, как это описано в международной заявке на изобретение WO 96/135718. Пегилированный эритропоэтин может быть получен согласно, например, международной заявке на изобретение WO 03/029291.

а) Первая хроматографическая стадия на SP Тойоперл 650 М

Первую хроматографическую стадию очистки продукта осуществляют на сульфопропильной (СП) колонке, заполненной СП Тойоперл 650М. Колонка функционирует при комнатной температуре. Максимальная емкость первой колонки определена как 1,5 г белка на литр колоночного объема. Колонку приводят в равновесие с 100 мМ калий-фосфатного буфера с рН от 2,9 до 3,1 (буфер СП-А). После стадии загрузки колонку промывают и осуществляют элюирование с помощью последовательности калий-фосфатных буферов, содержащих увеличивающиеся количества NaCl. Свободная пегилированная карболовая кислота, т.е. гидролизованный реагент ПЭГ, и полипегилированные формы удаляют в проточной фракции, а также на следующем шаге промывания буфером СП-А и 100 мМ калий-фосфатным буфером, рН от 2,9 до 3,1, содержащим 90 мМ хлорида натрия (буфер СП-Б), соответственно.

Монопегилированный эритропоэтин элюируют с помощью 100 мМ калий-фосфатного буфера, рН от 2,9 до 3,1, содержащего 250 мМ хлорида натрия (буфер СП-В), собирают в сосуд и непосредственно разбавляют очищенной водой в соотношении 1:5. Этот собранный элюат именуют «СП элюатным пулом I». После этого колонку промывают 100 мМ калий-фосфатного буфера, рН от 2,9 до 3,1, содержащего 750 нМ хлорида натрия (буфер СП-Г) с целью удаления непрореагировавшего эритропоэтина и регенерации колонки.

б) Вторая хроматографическая стадия на СП Тойоперл 650 М

Вторая колонка функционирует при комнатной температуре. После приведения ее в равновесие с буфером СП-А, в колонку вводят СП элюатный пул I, после чего колонку промывают буфером СП-А. Монопегилированный эритропоэтин элюируют под действием линейного градиента с наклоном, приблизительно, от 50 до 500 мМ хлорида натрия на десять объемов колонки, забуференного 100 мМ калий фосфатного буфера при рН от 2,9 до 3,1. Пик продукта разделяют на отдельные фракции числом до восьми и непосредственно разбавляют каждую фракцию 1 М раствором моногидрофосфата калия с целью увеличения рН до 6-8. По окончании элюирования монопегилированного эритропоэтина наклон градиента может быть увеличен, что приводит к немедленному промыванию колонки 100 мМ калий-фосфатного буфера с рН от 2,9 до 3,1 содержащего 500 мМ хлорида натрия.

в) Регенерация колонок SP Тойоперл 650 М

Смолу из обеих колонок регенерируют с помощью семистадийной последовательности. Колонки промывают очищенной водой, а затем 0,5 М раствором гидроксида натрия. Щелочной раствор вытесняют очищенной водой, а затем осуществляют кислотное промывание (0,5 М дигидрофосфата натрия, 1 М фосфорной кислоты). После еще одной стадии с очищенной водой колонки депирогенизируют 0,5 М раствором гидроксида натрия в течение ≥4 часов. После щелочной регенерации колонки снова промывают очищенной водой. Очищенную воду III (OB III) получают с помощью ультрафильтрации. Качество OB III эквивалентно качеству воды для инъекций согласно Фармакопее США. Испытания осуществляют согласно Европейской фармакопее и Фармакопее США. В процессе контрольных опытов, осуществляемых согласно описанной первой хроматографической стадии, в проточных буферах не регистрируется остаточного белка или остатка ПЭГ. Анализ методом электрофореза в натрий-додецилсульфат-полиакриламидном геле (SDS-PAGE) смолы после 60 циклов не обнаружил в геле остаточного белка и остатка ПЭГ. На основании этих данных может быть исключен перенос остаточных белков и остатка ПЭГ от загрузки к загрузке, и регенерация колонки является, таким образом, весьма эффективной (см. также фигуру 1). Определение выхода, достигнутого после каждой хроматографической стадии, не продемонстрировало снижения последнего (см. также фигуру 2).

Таблица 1
Обзор параметров регенерации колонки
Стадия	Буферный раствор	Объемов колонки	Объемная скорость [л/мин]
Промывка	Очищенная вода III	≥2	1,6-2,1
Щелочная регенерация колонки I	0,5 моль/л NaOH	≥2	1,6-2,1
Промывка	Очищенная вода III	≥2	1,6-2,1
Кислотная регенерация колонки	1 моль/л фосфорной кислоты, 0,5 моль/л дигидрофосфата натрия	≥3	1,6-2,1
Промывка	Очищенная вода III	≥2	1,6-2,1
Щелочная регенерация колонки II	0,5 моль/л NaOH	≥3	нет данных
Промывка	Очищенная вода III	≥2	1,6-2,1

Как показано на фигурах 1 и 2, чистота и выход монопегилированного эритропоэтина в пуле проточного буфера после первой хроматографической стадии явно находятся для всех циклов в пределах не менее 80% чистоты и не менее 35% выхода. Кроме того, не наблюдается никаких тенденций изменения чистоты монопегилированного эритропоэтина в продолжение времени жизни колонки.

1. Способ регенерации катионообменной хроматографической колонки после элюирования монопегилированного эритропоэтина, включающий следующие шаги в представленной последовательности:
- элюирование адсорбированного монопегилированного эритропоэтина из колонки забуференным водным раствором, содержащим хлорид натрия в концентрации по меньшей мере 500 мМ,
- промывание колонки очищенной водой,
- введение в колонку 0,5 М раствора гидроксида натрия,
- промывание колонки очищенной водой,
- введение в колонку раствора, содержащего 0,5 М дигидрофосфата натрия и 1 М фосфорной кислоты,
- промывание колонки очищенной водой,
- введение в колонку 0,5 М раствора гидроксида натрия по меньшей мере на 4 ч и
- регенерацию катионобменной колонки посредством промывания колонки очищенной водой.

2. Способ получения монопегилированного эритропоэтина, в котором один полиэтиленгликолевый остаток ковалентно связан с эритропоэтином по N-концу и/или внутреннему лизиновому остатку, в форме, являющейся в существенной степени гомогенной, включающий следующие стадии:
а) ковалентное связывание полиэтиленгликолевого остатка с эритропоэтином по N-концу и/или внутреннему лизиновому остатку с помощью активированного реагента для ковалентного связывания полиэтиленгликолевого остатка с молекулярной массой от 20 кДа до 40 кДа с эритропоэтином по N-концу и/или внутреннему лизиновому остатку,
б) очистку получаемого на стадии а) эритропоэтина, в котором полиэтиленгликолевый остаток ковалентно связан с эритропоэтином по N-концу и/или внутреннему лизиновому остатку, с помощью двух последовательных катионообменных хроматографических стадий, где на первой и второй катионообменных хроматографических стадиях задействован катионит одного и того же типа,
в) выделение эритропоэтина, в котором один полиэтиленгликолевый остаток ковалентно связан с эритропоэтином по N-концу и/или внутреннему лизиновому остатку, из второй катионообменной хроматографической колонки в форме, являющейся в существенной степени гомогенной,
г) регенерацию катионообменной хроматографической колонки с помощью следующих шагов в представленной последовательности:
1) удаления адсорбированного монопегилированного эритропоэтина из колонки забуференным водным раствором, содержащим хлорид натрия в концентрации по меньшей мере 500 мМ,
2) промывания колонки очищенной водой,
3) введения в колонку 0,5 М раствора гидроксида натрия,
4) промывания колонки очищенной водой,
5) введения в колонку раствора, содержащего 0,5 М дигидрофосфата натрия и 1 М фосфорной кислоты,
6) промывания колонки очищенной водой,
7) введения в колонку 0,5 М раствора гидроксида натрия не менее чем на 4 ч и
8) регенерации катионобменной колонки посредством промывания колонки очищенной водой.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что упомянутая катионообменная хроматографическая колонка является сильной катионообменной хроматографической колонкой.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что упомянутая катионообменная хроматографическая колонка является сульфопропильной катионообменной хроматографической колонкой.

5. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что упомянутый буфер является фосфорной кислотой или ее солями, или уксусной кислотой или ее солями, или лимонной кислотой или ее солями, или гистидином или его солями.

6. Способ по п.2, отличающийся тем, что упомянутый эритропоэтин является человеческим эритропоэтином, характеризуемым аминокислотной последовательностью, приведенной в перечне последовательностей SEQ ID NO:1 или 2.

7. Способ по п.2 или 6, отличающийся тем, что упомянутый полиэтиленгликоль характеризуется молекулярной массой 20-35 кДа и является линейным.

8. Способ по п.2 или 6, отличающийся тем, что упомянутый полиэтиленгликоль характеризуется молекулярной массой 40 кДа и является разветвленным.

9. Способ по п.2 или 6, отличающийся тем, что упомянутую первую катионообменную хроматографическую стадию осуществляют с помощью пошагового элюирования, а вторую катионообменную хроматографическую стадию осуществляют с помощью линейного градиентного элюирования.

10. Способ по п.1, 2 или 6, отличающийся тем, что упомянутую катионообменную хроматографическую колонку используют по меньшей мере для 40 циклов разделения.