Антитела и фрагменты антител человека против рецептора фолата альфа для радиоиммунотерапии карциномы яичника

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложены антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с рецептором фолата альфа (FRα), а также димер Fab′ фрагментов антител, фармацевтическая композиция и применение антитела или его фрагмента для получения лекарственного средства. Также рассмотрены молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая легкую цепь антитела, экспрессионный вектор и клетка-хозяин. Использование изобретения может найти дальнейшее применение в лечении и профилактике нарушений, ассоциированных со сверхэкспрессией FRα. 8 н. и 12 з.п. ф-лы, 7 пр., 6 табл., 13 ил.

 

Настоящее изобретение относится к антителам и фрагментам антител человека с высокими аффинностями, в частности к фрагментам Fab, специфичным в отношении рецептора фолата альфа человека. Настоящее изобретение также относится к способам продуцирования таких антител и фрагментов и их применению в терапевтических регулированиях и установках диагнозов, таких как радиоиммунотерапия, в частности при раке яичника. Настоящее изобретение, кроме того, относится к фармацевтическим композициям, содержащим антитела и фрагменты.

Эпителиальный рак яичника (ЕОС) является самым летальным из гинекологических злокачественных образований в промышленно развитых странах и в Европе. Несмотря на относительно низкую частоту (приблизительно 1/100000 новых случаев каждый год), ЕОС показывает высокое отношение случай - летальный исход, и общее дожитие, составляющее 5 лет, остается у приблизительно 44%^(1),(2). Женщины с ограниченными органом опухолями имеют отличный прогноз выживаемости, но большинство раков на ранней стадии являются бессимптомными, и у более двух третей пациентов диагностируется запущенное заболевание. ЕОС на ранней стадии является, как правило, бессимптомным, и большинство женщин (70-75%) показывают запущенное заболевание, которое часто распространяется в виде диффузных метастазов опухоли небольшого объема. Первоначальное хирургическое вмешательство почти всегда необходимо при лечении заподозренного рака яичника для гистологического подтверждения, определения стадии и уменьшения объема опухоли. Эффективное циторедуктивное хирургическое вмешательство во время диагностирования, достижимое, главным образом, при заболевании на ранней стадии, было увязано с увеличением дожития. Однако из-за трудностей в ранней диагностике и предрасположенности к диффузному метастазу небольшого объема для подавляющего большинства пациентов с ЕОС необходимо адъювантное лечение для попытки уничтожения остаточного заболевания.

Химиотерапия играет все более важную роль в эффективном лечении карциномы яичника^(3),(4). ЕОС считается чувствительной к химиотерапии опухолью; в действительности 70-80% страдающих ЕОС пациентов, которые получают в высокой степени активную, наиболее усовершенствованную химиотерапию, вступают в стадию клинической ремиссии. Однако несмотря на разработку новых терапевтических подходов и увеличение среднего общего выживания, рецидив происходит у большинства пациентов на стадии прогрессирования после завершения ответа на первоначальные лечения, и, по крайней мере, 70-90% этих пациентов, в конечном счете, умирают от устойчивых к лекарственным средствам (терапиям) раков, при этом только 10-30% демонстрируют длительное дожитие.

Поэтому существует большая потребность в способах альтернативного лечения рака яичника. Одним из этих альтернативных лечений является радиоиммунотерапия. Карциному яичника можно лечить с помощью адъювантной радиоиммунотерапии для уничтожения метастазов, являющихся устойчивыми к химиотерапии. Радиоиммунотерапия заключается в мечении моноклонального антитела, специфичного в отношении ракового эпитопа, радиоактивным компонентом. Меченное радиоактивным изотопом моноклональное антитело затем вводят in vivo, и его специфичность будет приводить к его аккумуляции в раковой массе. Этот метод позволяет концентрировать терапевтический агент, в этом случае радиоактивное соединение в раковых клетках и в противоположность химиотерапии, которая не является сайтспецифической, имеет меньшую токсичность и меньше побочных эффектов вследствие его селективной направленности, возможного отличного механизма действия и меньшей дозы терапевтического агента, используемого для полного лечения.

Для карциномы яичника пока идентифицировано несколько различных маркеров и создано много различных антител. Среди них наиболее охарактеризованными являются антитела против СА125^(5),(6) и MUC-1 и антитела против рецептора фолата, такие как Mov18⁽⁷⁾. Последние из названных антител представляют несколько значительных преимуществ.

Рецептор фолата альфа (αFR) представляет собой связанный с гликозилфосфатидилинозитом белок с высокой аффинностью к фолиевой кислоте и некоторым восстановленным фолатам, таким как 5-метилтетрагидрофолат и тетрагидрофолат. Он также присутствует на ограниченном числе эпителиальных клеток, особенно почки, плаценты и хориодного сплетения, но экспрессируется на их апикальной поверхности, что делает его не доступным для антител. Сверхэкспрессия αFR клетками карциномы яичника и его ограниченное распространение в нормальных тканях предоставляет возможность для разработки антител против αFR для радиоиммунотерапии. MOv18 является моноклональным антителом, которое является специфичным в отношении рецептора фолата альфа, являющимся идеальной мишенью для радиоиммунотерапии, поскольку он сверхэкспрессируется в 90% карцином яичников. MOv18, меченное радиоизотопом - ¹³¹I, уже было введено, с некоторым успехом, в клиническое испытание фазы I/II. Другие мышиные моноклональные антитела, индуцированные против αFR, включают MOv19.

Ряд других мАт, включающих MOv18, продемонстрировали эффективность в различных клинических испытаниях, но их клиническая разработка была ограничена их мышиным происхождением. Для обхождения их иммуногенности были сконструированы некоторые антитела так, чтобы они образовывали химерные или гуманизированные антитела до или во время их клинической разработки, при этом последнее потомство является полностью человеческим и находится в процессе клинической разработки.

Ограничением, с которым часто сталкивается радиоиммунотерапия, является длинный период полувыведения антитела, который может составлять несколько дней. С одной стороны, это свойство может представлять преимущество, предоставляя адекватное количество времени для направленной доставки антитела к опухоли. Однако, с другой стороны, это также означает, что пациент может иметь в течение нескольких дней, в зависимости от метки, радиоактивный компонент, распадающийся в венах по всему организму. В этом случае отношение опухоли к крови или органу будет едва превышать лаг в большинстве благоприятных условий, поскольку антитело медленно выводится из организма пациента. С этой точки зрения уменьшение периода полувыведения антитела будет уменьшать токсичность лечения путем снижения побочных эффектов вследствие аккумуляции неспецифических излучений в здоровых тканях.

Следующим моментом, который следует принимать во внимание, является проникновение внутрь опухоли. Стерическое препятствие молекул мАт не оказывает влияние до тех пор, пока мишенью является изолированная клетка в кровотоке, но становится критическим при учете солидных опухолей, как в случае карциномы яичника^(8),(9). На проникновение внутрь солидных опухолей также оказывает влияние аффинность антитела к его лиганду, и ранее было продемонстрировано, что слишком низкая аффинность препятствует локализации в опухолях, в то время как слишком высокая аффинность ограничивает связывание антитела на периферии опухоли⁽¹⁰⁾, при этом это явление описывается как заслон антигена.

Принимая во внимание вышеуказанное (происхождение, размер, период полувыведения и аффинность), было предложено применение для радиоиммунотерапии карциномы яичника фрагментов (Fab) антител человека. Действительно, молекула, меньшая, чем полноразмерное антитело, вероятно, будет поддерживать проникновение внутрь опухоли, а его человеческое происхождение должно исключить иммуногенные реакции. Более того, будет укорочен период полувыведения. Аффинность таких молекул должна рассматриваться как функция отобранного фрагмента антитела. Другим преимуществом Fab-формата является то, что для этого типа молекул не требуется какого-либо гликозилирования для его функциональности. Это совместимо с продукцией микроорганизмами и связанными преимуществами.

Такой фрагмент антитела был создан в прошлом с использованием направленного отбора, начинающегося с MOv19, моноклонального антитела (мАт), отобранного из того же слияния, из которого было произведено MOv18, распознающего не дающий перекрестную реакцию эпитоп на том же самом антигене-мишени, т.е. αFR. Отобранный фрагмент Fab, названный С4⁽¹¹⁾, как охарактеризовано с помощью in vitro анализов, был способен специфически связываться с αFR. С4 проявлял K_aff, составляющую 200 нМ, вычисленную с помощью анализа по Скэтчарду, выполненному на полнеразмерных клетках ЕОС.

Поэтому была предусмотрена разработка фрагмента Fab С4, подходящего для in vivo клинического применения в терапии и диагностике рака яичника. Однако авторы настоящего изобретения обнаружили, что относительно низкая аффинность фрагмента Fab антитела С4 и его in vivo период полураспада являются несовместимыми с требованиями для клинической разработки. Действительно, in vivo эксперименты, проведенные авторами настоящего изобретения с фрагментом Fab С4, показали, что

- аффинность фрагмента Fab С4 была слишком низкой для эффективной локализации в опухоли;

- in vivo период полувыведения Fab С4 был очень коротким, что вместе с его низкой аффинностью препятствовало локализации в опухоли; было почти невозможно обнаружить фрагмент Fab в крови животного даже спустя только один час после внутривенного введения. Это сверхбыстрое выведение препятствовало аккумуляции фрагмента антитела в солидной опухоли, приводя к противоречивым результатам по биораспределению.

Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что продукции рекомбинантного Fab С4 в E.coli и его последующей очистки серьезно мешала одновременная продукция примесного не функционального гомодимера легких цепей (L₂), который трудно исключить во время стадий очистки.

Поэтому авторы настоящего изобретения решили изучить возможность продуцирования димерного фрагмента Fab, подходящего для радиоиммунотерапии карциномы яичника. Переключение с Fab-формата на F(ab)₂-формат дает несколько преимуществ, таких как двухвалентность, которая увеличивает авидность фрагмента и, следовательно, его общую аффинность, удваивает его молекулярную массу относительно соответствующего фрагмента Fab, что, в свою очередь, уменьшает экскрецию в мочу, защищая почки, и в результате увеличивает in vivo период полувыведения⁽¹²⁾.

Однако авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что эффективно подвергнуть димеризации фрагмент Fab С4 невозможно. Ни природные, ни химические способы димеризации не дали приемлемых выходов димеров С4; любое небольшое количество правильного димерного продукта было в высокой степени загрязнено неправильными суррогатными димерными видами, которые было невозможно удалить с помощью очистки с использованием гельпроникающей хроматографии. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что для продукции димера Fab требуется обширная модификация исходного фрагмента Fab С4, в том числе замена легкой цепи лямбда С4 легкой цепью каппа. Это было осуществлено с использованием процедуры направленного отбора. Новый фрагмент Fab, включающий отобранную таким образом легкую цепь каппа, был назван AFRA и вызвал разработку Fab, имеющего увеличенную аффинность связывания. Новая легкая цепь каппа также аннулировала проблему образования гомодимера легких цепей и увеличила стабильность, что является преимуществом для радиоиммунотерапии⁽¹³⁾. Дальнейшим преимуществом является тот факт, что каппа-цепи легче экспрессировать в Escherichia coli⁽¹⁴⁾, которая является особенно выгодной в случае промышленного применения. Аминокислотная последовательность легкой цепи каппа AFRA настоящего изобретения проиллюстрирована на фиг.1 и 7 (SEQ ID NO: 1). Для сравнения на фиг.1 также продемонстрирована аминокислотная последовательность легкой цепи С4 (SEQ ID NO: 12).

Таким образом, настоящее изобретение относится к антителу, предпочтительно моноклональному, или к фрагменту антитела, которые специфически связываются с рецептором фолата альфа, причем указанные антитело или фрагмент включают легкую цепь, которая включает или состоит из аминокислотной последовательности AFRA, проиллюстрированной на фиг.1 и 7 (SEQ ID NO: 1), или производное указанной легкой цепи, имеющее аминокислотную последовательность, которая функционально эквивалентна аминокислотной последовательности, проиллюстрированной на фиг.1 и 7 (SEQ ID NO: 1). Функциональные эквиваленты определены ниже.

В контексте настоящего изобретения используется следующая терминология.

Термины «антитела и фрагменты настоящего изобретения» или «антитела AFRA» или «фрагменты антител AFRA», если не указано иное, означают антитела или фрагменты, которые включают легкую цепь, включающую или состоящую из аминокислотной последовательности, которая идентична последовательности, проиллюстрированной на фиг.1 и 7 (SEQ ID NO: 1), или аминокислотной последовательности, которая функционально эквивалентна аминокислотной последовательности, проиллюстрированной на фиг.1 и 7 (SEQ ID NO: 1).

Термины «происходящее из AFRA антитело» или «фрагмент происходящего из AFRA антитела» используются для обозначения антител или фрагментов, которые включают легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность, которая функционально эквивалента аминокислотной последовательности, проиллюстрированной на фиг.1 и 7 (SEQ ID NO: 1).

Термин «легкая цепь AFRA» означает легкую цепь, проиллюстрированную на фиг.1 (AFRA) и 7 (SEQ ID NO: 1). Термин «происходящая из AFRA легкая цепь» означает легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность, которая функционально эквивалента аминокислотной последовательности, проиллюстрированной на фиг.1 (AFRA) и 7 (SEQ ID NO: 1).

Термин «антитело» используется синонимично с термином «иммуноглобулин» (или «Ig»). Если не отмечено иное, термин «антитело» или термин «иммуноглобулин» означает интактную (или полноразмерную) молекулу антитела. Фрагменты обозначаются как таковые.

Нумерацию положений аминокислот в пределах молекулы антитела осуществляют с использованием системы нумерации по Kabat (Kabat, H. A. et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. (U.S. Dept. Health and Human Services, Bethesda, Md., 1991), если не указано иное.

В природе антитела являются молекулами гликопротеинов, продуцируемыми В-лимфоцитами. Антитела настоящего изобретения могут продуцироваться В-лимфоцитами, гибридомой, с помощью экспрессии рекомбинантного антитела в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине или с помощью синтетических методов, таких как конструирование антител из существующих антител. Они могут быть или могут не быть гликозилированными. Вообще говоря, антитела связывают антигены с высокой степенью специфичности, и их можно подразделить на основе физических и функциональных свойств на пять классов (или изотипов), обозначаемых IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. Эти различные типы антител используют общую основную структурную единицу, которая имеет молекулярную массу, составляющую приблизительно 150000 Дальтон (150 кДа), и составлена из двух идентичных тяжелых (Н) полипептидных цепей и двух идентичных легких (L) цепей, ковалентно связанных посредством межцепочечных дисульфидных (S-S) связей между остатками цистеинов. Интактные антитела настоящего изобретения также имеют эту структуру. Предпочтительно они типа IgG.

В контексте настоящего изобретения «фрагмент антитела» означает любую часть антитела, предпочтительно антигенсвязывающую часть, и включает варианты таких частей. Примерами антигенсвязывающих фрагментов в соответствии с настоящим изобретением являются фрагменты Fab, фрагменты Fab', фрагменты F(ab)₂ и минитела. Варианты таких фрагментов включают димеры и тримеры фрагментов и межфрагментные слияния, получаемые путем использования встречающихся в природе последовательностей шарнирных областей, синтетических последовательностей шарнирных областей, пептидных линкеров, или химические конъюгаты. Фрагменты настоящего изобретения могут быть одновалентными (например, фрагменты Fab), двухвалентными (например, фрагменты F(ab)₂) или поливалентными (например, химический конъюгат, включающий тримерный фрагмент Fab).

Антигеном, с которым специфически связываются антитела и фрагменты AFRA настоящего изобретения, является рецептор фолата альфа человека (αFR). Рецептор фолата имеет три изоформы, альфа, бета и гамма, аминокислотные последовательности которых идентичны на приблизительно 70%. Эти различные изоформы демонстрируют значительные различия в их относительных аффинностях к фолиевой кислоте и являются дифференциально тканеспецифическими и дифференциально увеличенными в нескольких злокачественных образованиях. Альфа-изоформа в норме связана с поверхностью клетки с помощью гликозилфосфатидилинозитного мембранного якоря¹⁵. Она имеет высокую аффинность к фолиевой кислоте, опосредуя интернализацию связанных с рецептором соединений фолата и конъюгатов фолата. Рецептор фолата альфа имеет очень ограниченное распространение в нормальных тканях (т.е. присутствует на ограниченном числе нормальных эпителиальных клеток), но сверхэкспрессируется в карциноме гинекологических тканей, например в карциноме яичника. В соответствии с настоящим изобретением термин «рецептор фолата альфа» является синонимом следующих терминов: FR-альфа; FRα; рецептор 1 фолата; рецептор фолата взрослых; связывающий фолат белок взрослых; FBP; ассоциируемый с опухолью яичника антиген MOv18. В контексте настоящего изобретения термин охватывает рецептор, экспрессируемый на поверхности клетки, и также его растворимую форму. Первичная аминокислотная последовательность рецептора фолата альфа человека продемонстрирована на фиг.10А, а растворимой формы - на фиг.10В.

Важным свойством антител и фрагментов настоящего изобретения является специфичность их связывания с рецептором фолата альфа. Поскольку антитела и фрагменты настоящего изобретения имеют реактивность, наложимую на реактивности С4 и MOv19, они не связываются с бета- и гамма-изоформами рецептора фолата. Термины «специфично связываются» означают, что антитела и фрагменты настоящего изобретения связываются с высокой аффинностью (предпочтительно с K_D, составляющей, по крайней мере, 100 нМ, и наиболее предпочтительно с K_D, составляющей, по крайней мере, 20 нМ) с FRα, экспрессируемым на поверхности клетки млекопитающего, и не связываются с белками, идентичными по той же самой эпитопной области менее чем на 90%, предпочтительно менее чем 95% и наиболее предпочтительно менее чем 98%. Эпитоп, узнаваемый моноклональными антителами настоящего изобретения, может быть эпитопом непрерывного типа или может быть эпитопом прерывистого типа (конформационным), образуемым рецептором при приеме им своей природной конформации на поверхности клетки человека, предпочтительно на поверхности клетки карциномы яичника человека. Например, антитела и фрагменты настоящего изобретения не связываются с белками с общей идентичностью, составляющей менее 90%, предпочтительно менее 95% и наиболее предпочтительно менее 98%. Таким образом, возможно, что антитела и фрагменты настоящего изобретения связываются с белками, имеющими очень высокую степень идентичности с рецептором фолата альфа человека, продемонстрированным на фиг.10А и В, например, аллельными вариантами, имеющими различия в одной - пяти аминокислотах относительно последовательностей на фиг.10, и являющимися по существу идентичными последовательностям на фиг.10 относительно эпитопной области(ей), узнаваемой антителами настоящего изобретения.

Как указано выше, в то время как FRα сверхэкспрессируется в клетках карциномы яичника, он также экспрессируется на некоторых типах нормальных эпителиальных клеток. Однако экспрессия на нормальных клетках происходит на апикальной поверхности, что делает рецептор недоступным для антител настоящего изобретения в in vivo контексте. Следовательно, in vivo антитела и фрагменты настоящего изобретения специфически связываются с FRα, экспрессируемым на клетках карциномы яичника, которые в результате трансформации теряют свою полярность и в которых рецептор фолата альфа затем экспрессируется на всей поверхности клетки (или другой карциномы), и не могут связываться с рецептором, экспрессируемым на поверхности нормальных эпителиальных клеток человека. Напротив, в том случае, когда антитела и фрагменты настоящего изобретения проверяют с помощью in vitro анализов на выделенных нормальных эпителиальных клетках или тканях человека (таких как эпителиальные клетки гипофиза, эндометрия, щитовидной железы или поджелудочной железы) или линиях клеток, экспрессирующих низкие уровни FRα, можно обнаружить специфическое связывание.

Антитела AFRA и фрагменты антител AFRA настоящего изобретения характеризуются специфической легкой цепью, аминокислотная последовательность которой проиллюстрирована на фиг.1 (SEQ ID NO: 1). Иллюстрируемая легкая цепь AFRA имеет структуру, которая является типичной для легкой цепи иммуноглобулинов (L). Действительно, вообще говоря, длина легких цепей (L) составляет приблизительно 220 аминокислот, и на аминоконце легкой цепи находится одна вариабельная область («V_L») (приблизительно 110 аминокислот), а остающаяся карбоксильная половина L-цепи составляет одну константную область («C_L»). Легкая цепь AFRA настоящего изобретения включает 218 аминокислот, при этом N-концевые 113 аминокислот составляют вариабельную область («V_L»), а остающиеся 105 аминокислот карбоксильного конца составляют константную область («C_L»). Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи является уникальной для антитела AFRA настоящего изобретения. Вместе с вариабельной областью связанной тяжелой цепи она образует антигенсвязывающий сайт антитела. Константная область легкой цепи AFRA является типичной легкой цепью каппа.

В то время как легкая цепь антител и фрагментов AFRA настоящего изобретения обычно идентична легкой цепи, проиллюстрированной на фиг.1 и 7, в этой последовательности тем не менее могут быть произведены некоторые изменения без отклонения от настоящего изобретения. Действительно, настоящее изобретение также относится к «происходящим из AFRA антителам» или «происходящим из AFRA фрагментам антител», которые включают легкую цепь, которая функционально эквивалента легкой цепи, проиллюстрированной на фиг.1 и 7 (SEQ ID NO: 1). Такая функционально эквивалентная легкая цепь является аминокислотной последовательностью, которая включает легкую цепь, вариабельная область которой включает, по крайней мере, одну из областей легкой цепи AFRA, проиллюстрированной на фиг.1 и 7, определяющую специфичность для рецептора фолата альфа, и которая включает константную область каппа. Области, определяющие специфичность, соответствуют «гипервариабельным» участкам V_L-цепи, которые также называют «определяющими комплементарность участками» (CDR). Эти CDR обозначают CDR1, CDR2 и CDR3 или, альтернативно, L1, L2 и L3. Определяющими комплементарность участками, подтверждаемыми кристаллической структурой Fab, последовательности AFRA (SEQ ID NO: 1) являются

RASESVSFLGINLIH (SEQ ID NO: 3),

QASNKDT (SEQ ID NO: 4),

LQSKNFPPYT (SEQ ID NO: 5).

Эти участки проиллюстрированы на фиг.7 жирным шрифтом с подчеркиванием. Таким образом, в соответствии с этим вариантом настоящего изобретения происходящее из AFRA антитело или происходящий из AFRA фрагмент антитела специфически связываются с рецептором фолата альфа (FRα) и включают легкую цепь, вариабельная область которой включает, по крайней мере, одну и предпочтительно две, и более предпочтительно все три из следующих аминокислотных последовательностей:

CDR1: RASESVSFLGINLIH (SEQ ID NO: 3),

CDR2: QASNKDT (SEQ ID NO: 4),

CDR3: LQSKNFPPYT (SEQ ID NO: 5).

Последовательности CDR, перечисленные выше, предпочтительно присутствуют в происходящей из AFRA легкой цепи в положениях, одинаковых с положениями в исходной легкой цепи AFRA, т.е. CDR1: 24-38; CDR2: 54-60; CDR3: 93-102 (используя систему нумерации по Kabat). Остающаяся последовательность вариабельной области указанной происходящей из AFRA легкой цепи может быть любой каркасной последовательностью, например каркасной последовательностью, которая отличается от последовательности фиг.1 и 7 (SEQ ID NO: 1) заменой, делецией или вставкой вплоть до десяти или двадцати аминокислот, например, 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот, и которая при использовании для замены каркасной последовательности легкой цепи AFRA, проиллюстрированной на фиг.1, в антителе или фрагменте антитела, содержащем CDR AFRA, не изменяет качественно специфичность антитела или его фрагмента в отношении рецептора фолата альфа человека. В одном варианте осуществления вариабельная область происходящей из AFRA легкой цепи отличается от последовательности фиг.1 и 7 (SEQ ID NO: 1) заменой, делецией или вставкой вплоть до десяти или двадцати аминокислот, например 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот, причем вставки, делеции или замены могут иметь место внутри или вне CDR. Константная область указанной происходящей из AFRA легкой цепи является классической константной областью каппа, например идентичной аминокислотам 114-219 последовательности AFRA на фиг.7 (с двойным подчеркиванием). Предпочтительно эти происходящие из AFRA антитела или происходящие из AFRA фрагменты антител связываются с рецептором фолата альфа (FRα) с аффинностью (K_D), составляющей менее 50 нМ, предпочтительно менее 20 нМ.

Специфичность происходящих из AFRA антител или происходящих из AFRA фрагментов антител, определенных выше, в отношении рецептора фолата альфа можно проверить in vitro и/или in vivo, используя общепринятые экспериментальные средства для демонстрации реактивности с FRα и отсутствия перекрестной реактивности с рецепторными белками, последовательности которых идентичны менее чем на 90%, предпочтительно менее чем на 95%.

Независимо от того, является ли легкая цепь (L) не измененной последовательностью AFRA (SEQ ID NO: 1) или ее производным, описанным выше, антитело или фрагмент в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно, кроме того, включает, по крайней мере, часть тяжелой цепи антитела, например, по крайней мере, вариабельную область (V_H), с первой константной областью, обычно обозначаемой С_Н1, или без нее. Другими частями тяжелой цепи, которые могут быть связаны с легкой цепью настоящего изобретения, являются фрагменты тяжелой цепи, включающие вариабельную область (V_H), первую константную область (С_Н1) и всю шарнирную область или ее часть. В альтернативном случае тяжелая цепь может быть интактной, включающей последовательно V_H, С_Н1, шарнирную область, С_Н2, С_Н3 и необязательно С_Н4. Связь между тяжелой цепью и легкой цепью является в норме ковалентной, посредством дисульфидной связи, включающей цистеин на карбоксильном конце легкой цепи.

В контексте настоящего изобретения различные сегменты тяжелой цепи, которые могут быть связаны с легкой цепью AFRA, определяют следующим образом, имея в виду, что длина тяжелой цепи (Н) интактного иммуноглобулина обычно составляет 440 аминокислот: вариабельная область (V_H) представляет собой амино-концевой участок тяжелой цепи (как правило, приблизительно 110 аминокислот). Остаток тяжелой цепи включает три или четыре (в зависимости от класса тяжелой цепи) повтора из приблизительно 110 аминокислот, которые обладают высокой степенью (по крайней мере 30%) гомологии последовательностей в пределах данного класса. Эти области являются константными областями тяжелой цепи, обозначаемыми С_Н1, С_Н2, С_Н3 и С_Н4. Тяжелая цепь также содержит шарнирную область, расположенную между доменами С_Н1 и С_Н2, придающую гибкость и способность образовывать межцепочечные дисульфидные связи в молекуле. Шарнирная область позволяет двум антигенсвязывающим участкам каждой молекулы антитела независимо перемещаться для связывания антигена.

Вариабельная область тяжелой цепи содержит три гипервариабельных участка, снова называемых «определяющими комплементарность участками» (CDR), обозначаемыми Н1, Н2 и Н3, или, в альтернативном случае, CDR1, CDR2 и CDR3. CDR тяжелой цепи имеют длину, составляющую приблизительно 3-25 аминокислот, и играют важную роль в специфичности антител.

В природе существует пять различных Н-цепей, обозначаемых альфа (α), гамма (γ), дельта (δ), эпсилон (δ) и мю (µ), которые отличаются друг от друга по аминокислотной последовательности. Изотип данного антитела (т.е. принадлежит ли оно классу IgA, IgG, IgD, IgE или IgM) определяют по Н-цепи данного антитела, при этом Н-цепь альфа определяет изотип IgA, Н-цепь гамма определяет изотип IgG и т.д. Внутри класса IgG существует четыре подкласса, обозначаемых IgG1 - IgG4. В соответствии с настоящим изобретением тяжелая цепь антитела AFRA или его фрагмента или варианта может быть любым из этих изотипов, но особенно предпочтительным является изотип IgG, например IgG1.

В зависимости от конкретных подобластей тяжелой цепи, которые присутствуют вместе с легкой цепью AFRA, и, кроме того, в зависимости от того, насколько много субъединиц связаны вместе, антитело и фрагменты антитела настоящего изобретения могут принимать форму интактных антител или, в альтернативном случае, могут быть их антигенсвязывающими фрагментами, такими как фрагменты Fab, фрагменты Fab', фрагменты F(ab)₂ и т.д.

В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения антитело AFRA, или происходящее из AFRA антитело или фрагмент, представляет собой фрагмент Fab, состоящий из

i) легкой цепи AFRA (как вариабельной области (V_L), так и константной области (C_L)), продемонстрированной на фиг.1 или 7 (SEQ ID NO: 1), или ее производного, определенного выше, и

ii) вариабельной области (V_H) и первой константной области (C_H1) тяжелой цепи.

Предпочтительно легкая цепь и тяжелая цепь ковалентно связаны вместе с помощью дисульфидной связи, в которую вовлечен цистеин карбоксильного конца легкой цепи. Фрагменты Fab настоящего изобретения обычно имеют размер, составляющий приблизительно 55 кДа.

Особенно предпочтительным примером этого варианта осуществления настоящего изобретения является фрагмент Fab, в котором вариабельная область тяжелой цепи (V_H) имеет аминокислотную последовательность фиг.8 (SEQ ID NO: 2). В альтернативном случае вариабельная область тяжелой цепи (V_H) может иметь аминокислотную последовательность, которая включает, по крайней мере, один и предпочтительно два и три участка CDR проиллюстрированной последовательности в каркасной последовательности, которая отличается от каркасной последовательности, проиллюстрированной на фиг.8. Участки CDR последовательности фиг.8 являются следующими:

CDR1: DYAMI (SEQ ID NO: 6),

CDR2: SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO: 7),

CDR3: ERYDFWSGMDV (SEQ ID NO: 8).

Другим особенно предпочтительным примером этого варианта осуществления настоящего изобретения является фрагмент Fab, в котором константной областью тяжелой цепи (C_H1) является область C_H1 тяжелой цепи гамма, в частности тяжелой цепи гамма1. Пример типичной C_H1 тяжелой цепи проиллюстрирован на фиг.9 (SEQ ID NO: 9).

Соответственно, предпочтительный фрагмент Fab настоящего изобретения включает или состоит из следующих элементов последовательности:

i) легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1,

ii) тяжелой цепи, вариабельная область которой имеет аминокислотную последовательность, проиллюстрированную на фиг.8 (SEQ ID NO: 2), и первая константная область (C_H1) которой имеет аминокислотную последовательность, проиллюстрированную на фиг.9 (SEQ ID NO: 9).

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения фрагмент антитела может быть фрагментом Fab'. В контексте настоящего изобретения фрагмент Fab' представляет собой фрагмент Fab, в котором тяжелая цепь дополнительно включает встречающуюся в природе шарнирную область на ее карбоксильном конце, пригодную для ковалентного связывания со вторым фрагментом антитела. Шарнирная область содержит один или несколько аминокислотных остатков или химических групп, которые пригодны для образования ковалентной связи, например свободный цистеин, что делает возможной димеризацию фрагмента Fab'. Шарнирная область может быть, по крайней мере, отчасти встречающейся в природе шарнирной областью антитела, например шарнирной областью, встречающейся в природе в какой-либо одной из тяжелых цепей альфа (α), гамма (γ), дельта (δ), эпсилон (δ) и мю (µ). Особенно предпочтительными являются шарнирные области или их части, соответствующие встречающейся в природе последовательности подкласса гамма, в частности гамма1, такие как пентапептид DKTSC или гексапептид DKTHTC. Часть шарнирной области, используемая для создания фрагмента Fab', обычно содержит, по крайней мере, один остаток свободного цистеина, например, на карбоксильном конце, но может быть сконструирована так, чтобы она содержала два или три остатка свободных цистеинов.

В альтернативном случае фрагмент Fab' может быть подвергнут искусственной димеризации с использованием, например, небелковоподобной составляющей, такой как химический линкер, который придает устойчивость к гидролизу в условии in vivo. Примером такого искусственного линкера является бис(малеимидо)этан (ВМОЕ), но в литературе сообщалось о нескольких других линкерах.^(16),(17)

Преимуществом применения фрагментов Fab' является то, что их можно подвергнуть димеризации с образованием фрагментов F(ab')₂, имеющих два антигенсвязывающих домена. Фрагменты F(ab')₂ являются, следовательно, двухвалентными, с увеличенной авидностью связывания относительно мономера Fab. Два фрагмента Fab', которые составляют димер, соединены вместе с помощью связи между каждой из двух шарнирных областей тяжелых цепей Fab'. Мономеры Fab' можно подвергнуть димеризациии с помощью природного окисления свободных цистеинов на С-конце тяжелых цепей. Фрагменты F(ab')₂ обычно имеют размер, составляющий приблизительно 100 - 110 кДа.

При димеризации с использованием небелковоподобного искусственного линкера два мономера Fab', составляющие димер F(ab')₂, ковалентно связываются друг с другом посредством этого химического линкера. Например, бис(малеимидо)этан (ВМОЕ) дает начало малеимидной связи, являющейся негидролизуемой, и, следовательно, придает устойчивость димеру в условии in vivo.

В соответствии с этим аспектом настоящего изобретения два антигенсвязывающих домена димера F(ab')₂ могут иметь идентичные специфичности, при этом оба специфически связываются с данным эпитопом рецептора фолата альфа. В альтернативном случае димер F(ab')₂ может быть биспецифическим, при этом один из антигенсвязывающих доменов является специфичным в отношении первого эпитопа рецептора фолата альфа, а другой является специфичным в отношении второго эпитопа рецептора фолата альфа. Дополнительно возможно, что второй антигенсвязывающий домен связывается с антигеном, полностью отличным от рецептора фолата альфа, таким как второй карциномный антиген или маркер природных киллеров - эффекторных клеток.

Антитела и фрагменты настоящего изобретения предпочтительно являются полностью человеческими. Легкая цепь AFRA настоящего изобретения человеческого происхождения. Поэтому полезно объединять легкую цепь с тяжелой цепью человеческого происхождения. В альтернативном случае легкую цепь AFRA можно сначала объединить с тяжелой цепью нечеловеческого происхождения, например мышиной, и затем для гуманизации тяжелой цепи можно использовать методы конструирования антител.

Антитела и фрагменты настоящего изобретения характеризуются высокой аффинностью связывания и авидностью в отношении рецептора фолата альфа человека. Аффинность связывания представляет собой силу взаимодействия между отдельным антигенсвязывающим сайтом антитела или его фрагмента и своей специфической антигенной детерминантой. Чем выше аффинность, тем крепче связь между антигеном и антителом или фрагментом, и тем вероятнее сохранение антигена в сайте связывания. Термин «авидность» используется для описания общей силы взаимодействия между антигеном и антителом или фрагментом антитела и зависит как от аффинности, так и от валентности взаимодействий. Чем больше антигенсвязывающих сайтов имеет отдельная молекула антитела, тем выше ее авидность в отношении антигена.

Аффинность можно представить в виде константы аффинности К_А, которая представляет собой отношение константы скорости ассоциации (k_ass) к константе скорости диссоциации (k_diss) антитела и антигена. К_А измеряют в М^-1; чем выше аффинность, тем выше К_А. Альтернативно, аффинность можно представить в виде константы диссоциации K_D, где K_D =1/К_А. Единицами K_D являются М, и чем выше аффинность, тем ниже K_D. В контексте настоящего изобретения аффинности обычно представляют в виде K_D. Поскольку в большинстве способов определения аффинности учитывается число сайтов связывания антитела или фрагмента, значения аффинности в виде K_А и K_D, как в действительности можно считать, отражают аффинность для одновалентных антител или фрагментов и авидность для поливалентных антител или фрагментов.

Антитела и фрагменты AFRA настоящего изобретения предпочтительно связываются с рецептором фолата альфа (FRα) с аффинностью (K_D) в диапазоне 100 нМ - 1 пМ. Более предпочтительно, когда они имеют аффинность (K_D), составляющую менее 75 нМ, предпочтительно менее 50 нМ, более предпочтительно менее 30 нМ и наиболее предпочтительно менее 5 нМ. В качестве примера, одновалентные фрагменты настоящего изобретения, такие как фрагменты Fab, обычно демонстрируют K_D, составляющую менее 50 нМ. Эта аффинность представляет значительное улучшение относительно известного мономерного фрагмента Fab C4. Двухвалентные фрагменты настоящего изобретения, такие как F(ab')₂ или ди(Fab)малеимид (DFA), обычно демонстрируют K_D, составляющую менее 30 нМ, например менее 5 нМ. Эти значения можно получить, используя или растворимый рецептор, или экспрессируемый на поверхности клетки рецептор в качестве антигена.

В соответствии с настоящим изобретением аффинность связывания можно определить с помощью ряда общепринятых методов, таких как равновесный диализ, с анализом данных по Скэтчарду, в соответствии с которым:

r/c = K(n-r),

где r - связанный лиганд в молях/антитело при равновесии в молях;

c - концентрация свободного лиганда при равновесии;

K - равновесная константа ассоциации;

n - число антигенсвязывающих сайтов на каждую молекулу антитела (валентность).

Для определения К_А можно также использовать анализы конкурентного связывания ELISA, снова используя анализ по Скэтчарду. Альтернативно, относительную K_D можно определить как концентрацию, при которой получают половину от сигнала плато в ELISA.

Дополнительным методом, который можно использовать для определения аффинности связывания, является поверхностный плазмонный резонанс (SPR), например, используя технологию Biacore (Pharmacia). Используя этот метод, возможно определение кинетик связывания, а также констант аффинности. В соответствии с этим методом K_D = k_diss/k_ass, где k_diss представляет собой константу скорости диссоциации (также обозначаемую k_off), а k_ass представляет собой константу скорости ассоциации (также обозначаемую k_on).

В соответствии с настоящим изобретением используемым в анализах аффинности антигеном может быть рецептор фолата альфа, экспрессируемый на поверхности полноразмерных клеток, в частности клеток человека, например клеток карциномы человека, таких как OVCAR3 (ATCC), IGROVI (подаренные Dr. J. Benard, Institut Gustave Roussy, Villejuif, Франция), или клеток, трансфицированных рецептором фолата альфа человека, таких как клетки A431-Fr⁽¹⁸⁾. В альтернативном случае антиген может быть в форме растворимого рецептора, например рекомбинантного FRα, продемонстрированного на фиг.10. Использование растворимого рецептора особенно пригодно для анализа - поверхностного плазмонного резонанса (SPR), и может применяться для предсказания связывания in vivo у людей.

Антитела и фрагменты AFRA настоящего изобретения можно использовать в ряде применений для терапии, диагностики и визуализации. Таким образом, настоящее изобретение относится к антителу или фрагменту AFRA в соответствии с настоящим изобретением для лечения нарушений, в патологический процесс которых вовлечена сверхэкспрессия рецептора фолата альфа (FRα). В частности, антитела и фрагменты AFRA настоящего изобретения можно использовать для приготовления лекарственного средства для лечения нарушений, в патологический процесс которых вовлечена сверхэкспрессия рецептора фолата альфа (FRα), таких как рак. Таким образом, один аспект настоящего изобретения относится к способу лечения нарушения, в патологический процесс которого вовлечена сверхэкспрессия рецептора фолата альфа (FRα), включающему введение нуждающемуся в таком лечении субъекту эффективного количества антитела или фрагмента AFRA в соответствии с настоящим изобретением.

Для многих применений для терапии, диагностики и визуализации антитело или фрагмент конъюгированы с эффекторной составляющей, такой как цитотоксический агент или маркер. Это является случаем при лечении таких нарушений, как карцинома, например гинекологическая карцинома.

Особенно предпочтительным терапевтическим применением антител и фрагментов AFRA является применение в радиоиммунотерапии карциномы яичника у людей. Для такого применения антитела и фрагменты конъюгируют с цитотоксическим радионуклидом, таким как ¹³¹I, ⁹⁰Y, ¹⁷⁷Lu, ¹⁸⁸Re. Самым предпочтительным радионуклидом является ¹³¹I. Кроме того, другие радионуклиды, такие как ⁹⁹Tc, можно использовать, например, в установке диагноза или визуализации.

Антитела и фрагменты AFRA, в частности, хорошо подходят для радиоиммунотерапии вследствие их низкого значения K_D для рецептора фолата альфа, значительно улучшенного относительно известного Fab C4. Более высокая аффинность антител и фрагментов AFRA относительно аффинности С4 представляет реальное преимущество для радиоиммунотерапии, поскольку это непосредственно влияет на локализацию в опухоли и дозу антитела. В этом конкретном случае более высокая аффинность антител и фрагментов AFRA непосредственно отражает количество связанного с опухолью антитела. Другими словами, поскольку значение K_D для антител и фрагментов AFRA намного ниже соответствующего значения для С4, молекулы AFRA будут, в одном и том же разведении, достигать в опухолевых тканях более высокой концентрации по сравнению с С4. Это снижает фон и, следовательно, также уменьшает побочные эффекты лечения, которые, главным образом, обусловлены неспецифическим связыванием антитела. Радиоиммунотерапия реально основана на специфической аккумуляции радиоактивности в опухоли, и более высокое отношение опухоль/здоровые ткани, получаемое при использовании антител и фрагментов AFRA, обеспечивает четкий указатель на улучшенный терапевтический эффект.

Конъюгирование радионуклида с антителами или фрагментами настоящего изобретения можно осуществить, используя любые общепринятые методы, такие как использование линкера между антителом и радиоизотопом. Предпочтительно радиоиммуноконъюгат имеет специфическую активность, составляющую от приблизительно 0,5 до приблизительно 15 мКи/мг, в зависимости от радионуклида, и может вводиться через внутривенный или другой путь. В зависимости от желаемых продолжительности и эффективности лечения конъюгаты радионуклид-антитело настоящего изобретения можно вводить один или несколько раз, в комбинации с другими терапевтическими лекарственными средствами или радиосенсибилизирующими агентами. Применяемое количество радиоиммуноконъюгата зависит от определенной природы карциномы. Доза радиоактивности на каждое введение должна быть достаточно высокой, чтобы быть эффективной, но должна быть ниже ограничивающей дозу токсичности (DLT). Предпочтительными являются однократные введения; также возможны многократные введения. Как правило, доза радиоактивности на каждое введение будет составлять между 20 и 80 мКи/м² площади поверхности тела (BSA).

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения фрагмент антитела AFRA, используемый для радиоиммунотерапии, представляет собой димерный фрагмент, например F(ab')₂, или химический димер Fab, такой как F(ab')₂-DFM. Типичные димеры Fab AFRA для радиоиммунотерапевтических применений включают легкую цепь AFRA в соединении с тяжелой цепью IgG, имеющей вариабельную область, такую как вариабельная область, проиллюстрированная на фиг.8, или вариабельную область, включающую CDR последовательности на фиг.8, в отличной каркасной последовательности.

Антитела и фрагменты настоящего изобретения можно использовать в качестве единственных терапевтических агентов при лечении таких нарушений, как рак, в частности рак яичника. В альтернативном случае их можно использовать в соединении с другими терапевтическими агентами при комбинированной терапии, включающей множество лекарственных средств и/или способов лечения. Например, антитела или фрагменты настоящего изобретения можно использовать вместе с химиотерапией, лучевой терапией, гормональной терапией или биологической терапией.

Этот вариант осуществления настоящего изобретения, таким образом, относится к продукту, содержащему антитело или фрагмент в соответствии с настоящим изобретением и, по крайней мере, один дополнительный терапевтический агент, в качестве комбинированного препарата для одновременного, отдельного или последовательного применения в терапии. Дополнительный терапевтический агент обычно выбирают из группы, состоящей из химиотерапевтического агента и радиотерапевтического агента. Такие продукты для комбинированной терапии, в частности, пригодны для лечения рака у человека, например рака яичника.

В контексте такой комбинированной терапии антитела или фрагменты настоящего изобретения можно использовать в качестве первичного лечения в соединении с подходящим вторичным лечением, которое назначают одновременно или последовательно с антителами или фрагментами AFRA. В альтернативном случае антитела или фрагменты настоящего изобретения можно использовать в качестве вторичного лечения для содействия первичному лечению, такому как химиотерапия. Этот аспект настоящего изобретения, следовательно, включает способ лечения нарушения, в патологический процесс которого вовлечена сверхэкспрессия рецептора фолата альфа (FRα), включающий введение нуждающемуся в таком лечении субъекту эффективного первого терапевтического агента и эффективного количества второго терапевтического агента, причем первый и второй терапевтические агенты вводят субъекту одновременно, последовательно или отдельно, и первый или второй терапевтический агент включает антитело или фрагмент AFRA в соответствии с настоящим изобретением.

Антитела или фрагменты настоящего изобретения можно, таким образом, использовать для проведения вспомогательной или адъювантной терапии с дополнительным терапевтическим агентом, например химиотерапевтическим агентом, для лечения рака у человека, в частности рака яичника.

В соответствии с дополнительным аспектом настоящего изобретения антитела или фрагменты AFRA могут присутствовать вместе с другими антителами или фрагментами в форме коктейля или смеси. Эти другие антитела или фрагменты могут быть дополнительными антителами или фрагментами AFRA, специфичными для рецептора фолата альфа, или могут быть антителами или фрагментами, имеющими специфичность в отношении отличного антигена. Коктейли или смеси настоящего изобретения также включают смеси антител или фрагментов AFRA, включающие различные форматы антител AFRA, такие как смеси мономерных и димерных фрагментов AFRA или фрагментов, имеющих, по крайней мере, одну легкую цепь с аминокислотной последовательностью AFRA, проиллюстрированной на фиг.1 или 7 (SEQ ID NO: 1), или функциональный эквивалент указанной легкой цепи.

Таким образом, настоящее изобретение включает смеси антител или фрагментов AFRA, которые включают гетерогенную смесь фрагментов антител, включающую или состоящую из:

i) двухвалентных фрагментов антител, специфически связывающихся с рецептором фолата альфа человека, при этом указанные двухвалентные фрагменты включают два ковалентно связанных фрагмента Fab', при этом каждый из них имеет легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательностью AFRA, проиллюстрированную на фиг.1 или 7 (SEQ ID NO: 1), или функциональный эквивалент указанной легкой цепи, и

ii) дополнительных фрагментов антител, включающих, по крайней мере, одну легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательностью AFRA, проиллюстрированную на фиг.1 или 7 (SEQ ID NO: 1), или функциональный эквивалент указанной легкой цепи,

при этом двухвалентный фрагмент антитела (i) составляет, по крайней мере, 50%, предпочтительно, по крайней мере, 60% и наиболее предпочтительно, по крайней мере, 70% композиции. Предпочтительно фрагменты (ii) составляют менее 20% композиции, наиболее предпочтительно менее 10%.

Двухвалентные виды могут быть встречающимися в природе димерами, соединенными дисульфидными связями между шарнирными областями фрагментов Fab', или могут быть химическими димерами, такими как DMF-AFRA.

Например, в условиях природной димеризации приблизительно 80% продуктов димеризации AFRA, как обнаружено, являются после очистки F(ab')₂. Высокая доля антигенсвязывающих димеров, образованных фрагментами AFRA настоящего изобретения, составляет дополнительное преимущество по сравнению с известным Fab C4. Авторы настоящего изобретения наблюдали, что во время димеризации образуется псевдодимер. Этот псевдодимер состоит из двух легких цепей, ковалентно связанных с одной тяжелой цепью, а вторая тяжелая цепь сохраняется в структуре благодаря гидрофобным взаимодействиям. Поскольку этот псевдодимер может распадаться при электрофорезе в SDS-PAGE на два вида: один с молекулярной массой 75 кДа (L₂H) и другой с молекулярной массой 25 кДа (тяжелая цепь), он был назван для простоты L₂H. Во время «природной» димеризации Fab' C4 правильный димер, L₂H₂, представляет только приблизительно 30% продукта реакции, в то время как остальные 70% материала соответствуют димеру L₂H. Невозможно хроматографически очистить димер С4 от его суррогата, и поскольку процент псевдодимера намного выше процента правильного димера, разработка молекулы С4 для радиоиммунотерапии невозможна.

Для димеров, получаемых с помощью химической димеризации, фрагменты AFRA продуцируют смеси продуктов димеризации, имеющие, по крайней мере, 50% F(ab')₂. Виды L₂H могут присутствовать, составляя менее 20% композиции, наиболее предпочтительно менее 10%, и гетерогенная смесь существует в подвергнутой очистке форме, если две формы невозможно разделить с помощью хроматографических способов. Несмотря на присутствие видов L₂H, гетерогенные смеси AFRA-DFA, как было продемонстрировано, имеют высокую аффинность связывания с рецептором фолата альфа человека, например с K_D, составляющей менее 50 нМ, предпочтительно менее 30 нМ и наиболее предпочтительно менее 5 нМ.

Сильная тенденция легкой цепи С4 к реагированию во время образования «природного» димера даже более выражена во время химического синтеза димеров (DFM) и почти предотвращает любую сборку димеров, даже при проверке нескольких условий рН и температуры. Химическая реакция димеризации С4 дает выход, составляющий менее пяти процентов, из которых только приблизительно 30% составляют правильный димер. Общий % димера, получаемый в конце реакции, таким образом, в десять раз ниже, чем для AFRA. Это специфическое свойство вместе с низкой аффинностью Fab C4, который невозможно использовать в качестве мономера, мешает разработке фрагмента антитела С4 для радиоиммунотерапии.

Дальнейший аспект настоящего изобретения относится к молекуле нуклеиновой кислоты, включающей последовательность, которая кодируют легкую цепь антитела или его фрагмента, специфически связывающихся с рецептором фолата альфа (FRα), причем указанная легкая цепь включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или ее функциональный эквивалент. Нуклеиновая кислота может быть ДНК или РНК и может быть двухцепочечной или одноцепочечной.

Настоящее изобретение также относится к экспрессионному вектору, включающему указанную последовательность нуклеиновой кислоты, причем указанная кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты функционально связана с регуляторными в отношении транскрипции сигналами, делая, таким образом, возможной экспрессию легкой цепи AFRA в подходящей клетке-хозяине. Нуклеиновая кислота может, кроме того, включать последовательность, кодирующую тяжелую цепь антитела или ее фрагмент, например, в бицистронном размещении, что способствует природному соединению легкой и тяжелой цепей в клетке-хозяине.

Настоящее изобретение также распространяется на клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь AFRA, например клетку-хозяина, трансформированную экспрессионным вектором настоящего изобретения. Клетки-хозяева могут быть прокариотическими или эукариотическими. В качестве примера прокариотических клеток-хозяев особенно предпочтительной является Escherichia coli. Примеры подходящих эукариотических клеток включают клетки человека, приматов, мышей или дрожжей.

Особенно предпочтительной клеткой является штамм E.coli, депонированный в CNCM 15 марта 2006 согласно условиям Будапештского договора с номером поступления CNCM I-3586. Этот микроорганизм (Escherichia coli штамм BW25113 ΔPyrC::kan (lacI^q, rrnB_T14, ΔlacZ_WJ16, hsdR514, ΔaraBA-D_AH33, ΔrhaBAD_LD78)) содержит плазмиду DoB0134 и продуцирует Fab AFRA настоящего изобретения. Фрагмент Fab AFRA, получаемый из этого депонированного штамма, также находится в пределах объема данного изобретения.

Настоящее изобретение также относится к способу продуцирования антител человека или их фрагментов с высокими аффинностями, которые специфически связываются с рецептором фолата альфа (FRα), причем указанный способ включает стадии:

- трансфекцию экспрессионного вектора, описанного выше, в подходящую клетку-хозяина;

- выделение экспрессированного антитела AFRA или его фрагмента;

- необязательно мутирование и/или димеризацию выделенного антитела или его фрагмента.

Мутацию экспрессированного таким образом антитела или фрагмента можно осуществить для добавления частей шарнирной области или остатков цистеинов, или можно использовать для точной настройки или модулирования аффинности и специфичности антитела/фрагмента.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения экспрессионный вектор коэкспрессируют в клетке со вторым экспрессионным вектором, включающим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую тяжелую цепь антитела или ее фрагмент, при этом указанная нуклеиновая кислота функционально связана с регуляторными в отношении транскрипции сигналами.

Альтернативный способ продуцирования антител настоящего изобретения включает стадии:

- конструирование репертуара V_HC_H человека; репертуар человека предпочтительно конструируют из В-клеток человека, получаемых или из костного мозга, лимфатических узлов, селезенки, или из периферической крови пациентов с карциномой яичника, но которые предпочтительно не имеют заболевания в период времени конструирования репертуара, или, в альтернативном случае, от здоровых доноров. Репертуар можно также создать путем синтеза;

- отбор тяжелой цепи антитела человека, обладающей способностью специфически связываться с рецептором фолата альфа (FRα), при этом указанный отбор осуществляют путем направленного отбора с использованием фрагмента антитела, включающего легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в качестве направляющей формы на репертуаре V_HC_H человека, с последующим отбором на клетках человека, сверхэкспрессирующих FRα, или на растворимом белке FRα;

- экспрессию гена, кодирующего отобранную тяжелую цепь антитела человека, вместе с геном, кодирующим легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в подходящей клетке-хозяине в условиях, делающих возможной сборку указанной легкой и тяжелой цепей.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения ген, кодирующий отобранную тяжелую цепь антитела человека, и ген, кодирующий легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, экспрессируют в клетке с помощью экспрессионного вектора, включающего последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую отобранную тяжелую цепь антитела человека и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, функционально связанную с регуляторными в отношении транскрипции сигналами.

В альтернативном варианте осуществления настоящего изобретения ген, кодирующий отобранную тяжелую цепь антитела человека, экспрессируют в клетке с помощью первого экспрессионного вектора, включающего последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую отобранную тяжелую цепь антитела человека, функционально связанную с регуляторными в отношении транскрипции сигналами, а ген, кодирующий легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, экспрессируют в клетке с помощью второго экспрессионного вектора, включающего последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую легкую цепь AFRA, функционально связанную с регуляторными в отношении транскрипции сигналами.

Этот способ позволяет отбирать различные тяжелые цепи, которые создают связывающие домены, специфичные в отношении рецептора фолата альфа при объединении с легкой цепью AFRA. Конкретные детали этого типа способа предоставлены в примерах ниже.

Дальнейший аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело или фрагмент настоящего изобретения в соединении с фармацевтически приемлемым носителем. В такой композиции антитело или его фрагмент могут быть конъюгированы с эффекторной составляющей, такой как цитотоксический агент, например радионуклид, такой как ¹³¹I, ⁹⁰Y, ¹⁷⁷Lu, ¹⁸⁸Re, или с токсином, или с химиотерапевтическим агентом, или с пролекарством, или с ферментом, обычно используемыми для связывания с антителами. Для диагностических применений можно использовать ⁹⁹Tc.

Настоящее изобретение также относится к способу диагностирования или визуализации карциномы яичника или ее метастазов, включающему, например, приведение ткани, или ее образца, субъекта в контакт с антителом или фрагментом в соответствии с настоящим изобретением, при этом указанные антитело или фрагмент конъюгированы с подходящей меткой, такой как радионуклид. Процесс диагностирования или визуализации можно провести in vivo, причем обнаружение значительного связывания антитела с тканью указывает на наличие сверхэкспрессии рецептора фолата альфа, что говорит о злокачественной трансформации клеток. В альтернативном случае процесс диагностирования или визуализации можно провести вне организма, например in vitro, на биологическом образце, таком как образец ткани, полученном от субъекта. В этом последнем случае рекомендуется сравнение уровня связывания антител или фрагментов настоящего изобретения с уровнем связывания, наблюдаемым с образцом нормальной ткани, для учета обнаружения какой-либо апикальной экспрессии рецептора фолата альфа в нормальных, нетрансформированных клетках такой ткани.

Различные аспекты настоящего изобретения проиллюстрированы на фигурах.

Фиг.1: Выравнивание аминокислотных последовательностей легких цепей С4 (SEQ ID NO: 12) и AFRA (SEQ ID NO: 1). Легкая цепь AFRA включает 218 аминокислот, из которых первые 113 аминокислот составляют вариабельную область каппа, а остальные 105 аминокислот представляют константную область каппа. Основные различия между антителами С4 и AFRA находятся в CDR.

Фиг.2: Схематическое представление бицистронного экспрессионного вектора DoB0134, подходящего для экспрессии Fab AFRA в E.coli. Этот вектор, содержащий последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие легкую цепь AFRA, проиллюстрированную на фиг.1, (SEQ ID NO: 1) и тяжелую цепь AFRA (включающую мутацию Q1N), содержащийся в E.coli, был депонирован 15 марта 2006 в CNCM под номером поступления CNCM I-3586. BW25113 ΔPyrC::kan (lacI^q, rrnB_T14, ΔlacZ_WJ16, hsdR514, ΔaraBA-D_AH33, ΔrhaBAD_LD78.

Фиг.3 (связывание BIAcore): Определение параметров связывания фрагментов антител на рецепторе фолата альфа. Для этого несколько концентраций мономера Fab (от 3 до 2000 нМ) подвергали втеканию в элемент в виде сенсорного чипа, предварительно покрытый рекомбинантным рецептором, и связывание регистрировали в течение 30 минут. После этого периода времени промывку контролировали в течение дополнительных двадцати минут. Для AFRA K_D, как определено, составляла 43,9 нМ с Chi2 1,85 (панель А), в то время как для С4 определенная K_D составляла 168 нМ с Chi2 2,19 (панель В).

Фиг.4 (природная димеризация): Fab AFRA и С4 подвергали восстановлению в мягких условиях и легкому окислению для получения природных димеров. Продукты реакции анализировали с помощью электрофореза в SDS-PAGE, и результаты представлены в верхней панели А для AFRA с использованием относительного денситометрического анализа, в то время как панель В соответствует С4. Образование видов L₂H представлено на рисунке панели С.

Фиг.5 (Иммуногистохимия): Моноклональное антитело против СА125 в качестве внутреннего положительного контроля использовали для зондирования биопсии человека, соответствующей карциноме яичника (панель А). Таким же образом оценивали AFRA-DFM (0,5 мкг/мл) на той же ткани (панель В). Оба антитела были помечены FITC, и фон оценен на предметном стекле С.

Фиг.6: (Биораспределение AFRA-DFM-¹³¹I). Ди-Fab-малеимид, меченный радиоизотопом - ¹³¹I, вводили внутривенно мышам, несущим опухоли. Животных умерщвляли через 1, 3, 6, 15, 24 и 48 часов после введения. Опухоль, кровь и заранее определенные органы выделяли, взвешивали и подсчитывали для определения концентрации AFRA-DFM. Результат биораспределения представлен на фиг. ниже в виде процента введенной дозы на грамм.

Фиг.7: Аминокислотная последовательность легкой цепи каппа AFRA (SEQ ID NO: 1), демонстрирующая:

- вариабельную область (Vκ), простирающуюся от аминокислоты 1 до аминокислоты 113;

- гипервариабельные участки, подтвержденные кристаллической структурой: CDR1 (аминокислоты 24-38), CDR2 (аминокислоты 54-60) и CDR3 (аминокислоты 93-102) (жирный шрифт с подчеркиванием);

- константную область каппа (Сκ), простирающуюся от аминокислоты 114 до аминокислоты 219 (двойное подчеркивание).

Фиг.8: Аминокислотная последовательность (вариабельной области) тяжелой цепи AFRA (SEQ ID NO: 2):

- вариабельная область (Vκ), простирающаяся от аминокислоты 1 до аминокислоты 120;

- гипервариабельные участки: CDR1 (аминокислоты 31-35), CDR2 (аминокислоты 50-66) и CDR3 (аминокислоты 99-110) (жирный шрифт с подчеркиванием).

Фиг.9: Тяжелая цепь AFRA (константная область: СН1 IgG1) (SEQ ID NO: 9).

Фиг.10 (Рецептор фолата альфа):

А: Аминокислотная последовательность рецептора фолата альфа (SEQ ID NO: 10):

- сигнальная последовательность: аминокислоты 1-24;

- последовательность зрелого рецептора: аминокислоты 25-234

- пропептидная последовательность: аминокислоты 235-237, удаленные в зрелой форме

- сайты гликозилирования: аминокислоты 69, 161 и 201.

В: рекомбинантный растворимый рецептор фолата альфа с His-6-меткой для очистки (SEQ ID NO: 11).

Фиг.11: In vivo эффективность меченного радиоизотопом AFRA-DFM в ксенотрансплантированных опухолях у мышей в средней дозе 1 мКи/мышь. Черные прямоугольники: опухоль из клеток А431, трансфицированных рецептором фолата альфа человека (A431FR). Диагонально заштрихованные прямоугольники: опухоль из клеток А431, не трансфицированных рецептором фолата альфа человека (А431). Открытые прямоугольники: контроль.

Фиг.12: In vivo локализация после внутрибрюшинного введения. Меченный радиоизотопом - ¹³¹I AFRA-DFM вводили внутрибрюшинно (средняя доза = 0,074 мКи/мышь) мышам, несущим внутрибрюшинно растущие опухолевые клетки IGROV1. Животных умерщвляли через 1, 3, 6, 15 и 24 часов после введения. Асцит, солидные внутрибрюшинные опухолевые массы, кровь и заранее определенные органы выделяли, взвешивали и подсчитывали для определения концентрации AFRA-DFM. Результат биораспределения представлен в виде процента введенной дозы на грамм.

Фиг.13: In vivo эффективность меченного радиоизотопом AFRA-DFM в ксенотрансплантированных клетках рака яичника у мышей. А: общее выживание мышей, которым ввели внутрибрюшинно клетки IGROV1, природно сверхэкспрессирующие рецептор фолата альфа человека, и которые подвергнуты лечению путем внутрибрюшинного введения в день +2 1 мКи/мышь ¹³¹I-DFM-AFRA или солевого раствора (контроль). В: общее выживание мышей, которым ввели внутрибрюшинно клетки OVCAR3, природно сверхэкспрессирующие рецептор фолата альфа человека, и которые подвергнуты лечению путем внутрибрюшинного введения в день +2 или +4 1 мКи/мышь ¹³¹I-DFM-AFRA или солевого раствора (контроль).

ПРИМЕРЫ

1. Продукция фрагмента Fab человека с высокой аффинностью, специфичного в отношении рецептора фолата альфа

Были осуществлены значительные модификации фрагмента Fab C4 для получения фрагмента Fab человека с улучшенными связывающими свойствами, включающими увеличенную аффинность связывания. Эти модификации описываются ниже.

а) Перестановка цепи: отбор легкой цепи каппа, специфичной в отношении рецептора фолата альфа

Сначала было решено заменить легкую цепь лямбда С4 легкой цепью каппа. Замену легкой цепи Fab осуществляли, как ранее описано для фрагмента С4, с помощью направленного отбора с использованием фагового дисплея⁽¹¹⁾.

Конкретно, библиотеку легких цепей каппа антител (VκCκ) создавали из В-клеток человека.

Библиотеку получали из смешанной мРНК из лимфоцитов периферической крови, полученной от четырех женщин, которые ранее страдали раком яичника, но у которых не было заболевания в период времени взятия крови. Женщины не имели заболевания в течение нескольких лет до взятия крови. Три женщины имели карциному серозного гистотипа, диагностированную на стадии III или IV заболевания. Четвертый пациент имел карциному яичника эндометроидного гистотипа, диагностированную на стадии III. Для приготовления библиотеку от каждого пациента брали между 2,0×10⁷ и 5,0×10⁷ PBMC. Семейство каждой цепи амплифицировали отдельно с помощью соответствующих пар праймеров для корректировки эффективности специфических ПЦР в соответствии с температурой отжига праймеров.

Уникальный репертуар VκCκ, полученный таким образом, не был «наивным» репертуаром, поскольку пациенты подвергались сверхэкспрессии антигена в виде рецептора фолата альфа. Он потенциально содержит гены для антител, формирующиеся против специфической опухоли и возможно против рецептора фолата альфа, экспрессируемого у женщин с таким заболеванием.

Полученную таким образом библиотеку использовали для отбора новой легкой цепи, совместимой с тяжелой цепью С4. Поскольку авторы настоящего изобретения искали фрагмент антитела, имеющий такую же специфичность для рецептора фолата альфа, как и молекула С4, использовали протокол направленного отбора. После трех циклов пэннинга на клетках карциномы рака (клетках OVCAR-3), используя тяжелую цепь С4 в качестве направляющей формы для отбора новой легкой цепи каппа, несколько фагов были случайным образом отобраны и оценены на свою связывающую способность на этих клетках. Наилучшее связующее вещество было идентифицировано и названо AFRA (антирецептор фолата альфа), а его легкая цепь подвергнута секвенированию.

Аминокислотная последовательность отобранной легкой цепи каппа представлена на фиг.1. Фрагменты AFRA и С4 имеют одинаковую тяжелую цепь, за исключением мутации Q1N, введенной в первую аминокислоту тяжелой цепи AFRA, как сообщается в примере 1с.

b) Экспрессия Fab в E.coli

Были приготовлены экспрессионные конструкции, подходящие для экспрессии фрагмента Fab AFRA и фрагмента Fab С4 в E.coli: гены, кодирующие тяжелую и легкую цепи AFRA или С4, клонировали в рамке считывания с лидерными последовательностями (лидерной последовательностью StII, происходящей из устойчивого к нагреванию энтеротоксина II E.coli) для того, чтобы направить синтез фрагмента в периплазматический компартмент Escherichia coli. Экспрессионный вектор был специально сконструирован для ферментации, включая бицистронную конструкцию, кодирующую как легкую цепь, так и тяжелую цепь под контролем промотора арабинозы araP, вместе с селектируемым маркером pyrC, кодирующим дигидрооротазу (базовая экспрессионная кассета описывается в заявке на Европейский патент ЕР 05109274.0, поданной от имени Dompe S.p.a. 6 октября 2005, которая включена сюда посредством ссылки, и в WO 2007/039632). Бицистронный вектор сконструирован для экспрессии небольшого избытка первой (легкой) цепи по сравнению с экспрессией второй (тяжелой) цепи, поскольку в настоящем случае тяжелая цепь при экспрессии отдельно может быть токсичной для Escherichia coli.

Экспрессирующий AFRA вектор назван DoB0134 (см. фиг.2) и депонирован в CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 Rue du Docteur Roux, F-75724 Paris Cedex 15, 15 марта 2006, в Escherichia coli штамме BW25113 ΔPyrC::kan (lacI^q, rrnB_T14, ΔlacZ_WJ16, hsdR514, ΔaraBA-D_AH33, ΔrhaBAD_LD78)) под номером поступления CNCM I-3586. Этот штамм экспрессирует легкую цепь AFRA с N-концевой модификацией, описанной в примере 1с, и тяжелую цепь, включающую встречающуюся в природе шарнирную область.

Экспрессионный вектор DoB0134 трансформировали в Escherichia coli, и фрагмент антитела AFRA экспрессировали и очищали. Для сравнительных целей проводили аналогичные эксперименты, используя соответствующую конструкцию, экспрессирующую известный Fab C4.

Во время продукции С4 наблюдалась значительная аккумуляция гомодимера легких цепей (L₂), представляющая вплоть до 50% синтеза рекомбинантного белка. Это может быть отчасти обусловлено конструкцией экспрессионного вектора, который экспрессирует небольшой избыток первой цепи по сравнению с экспрессией второй цепи. Однако этот экспрессионный вектор был использован для продуцирования нескольких различных Fab, и продукция гомодимеров легких цепей никогда не наблюдалась с другими последовательностями. Этот гомодимер L₂ является бесполезным побочным продуктом микроорганизма, который представляет значительный недостаток в процессе продукции. Действительно, он оказывается тяжелым грузом для метаболизма хозяина, его трудно отделить от полезных Fab', он не обладает какой-либо целевой связывающей способностью и продуцируется вместо желаемого фрагмента.

Напротив, Fab AFRA настоящего изобретения не продуцирует какого-либо определяемого гомодимера легких цепей из того же самого экспрессионного вектора и в том же самом штамме Escherichia coli. Поэтому общий выход продукции искусственно увеличивается, и объемы хроматографических колонок сильно уменьшаются, поскольку нет конкуренции за связывание со смолой между представляющим интерес фрагментом Fab' и гомодимером легких цепей.

Специфичность Fab AFRA оценивали, используя FACS. Сдвиг флуоресценции регистрировали только с клетками, экспрессирующими рецептор фолата альфа человека.

с) Модификация AFRA в виде N-концевой мутации Q1N

В результате первичного протокола направленного отбора с использованием тяжелой цепи С4 в качестве направляющей формы AFRA и фрагмент С4 первоначально имели одинаковую тяжелую цепь, первой аминокислотой которой был глютамин. Однако известно, что глютамин в этом положении может подвергаться превращению в пироглютаминовую кислоту(¹⁹), что создает гетерогенность продуктов. Поэтому N-концевой глютамин был заменен аспарагином, используя сайт-направленный мутагенез. Такая замена уменьшает длину боковой цепи аминокислоты на один атом углерода, предотвращая ее циклизацию. Сайт-направленный мутагенез осуществляли для модификации кодона в виде триплета ДНК, соответствующего первой аминокислоте тяжелой цепи AFRA, и превращения его в желаемый остаток аспарагина.

Сайт-направленную мутацию подтверждали с помощью секвенирования всего гена для проверки того, что за исключением этой мутации никаких других неожидаемых мутаций не было введено во время амплификации с использованием ПЦР. Соответствующий белок был продуцирован и очищен до гомогенности. В это время с помощью анализа с использованием HPLC с обращенной фазой на дифенильной колонке был обнаружен при любом рН единственный пик, соответствующий уникальному виду. Это было подтверждено с помощью анализа масс с электрораспылением, при котором молекулярная масса AFRA соответствовала молекулярной массе, рассчитанной из его первичной структуры.

2. Особенности связывания фрагмента Fab AFRA с рецептором фолата альфа человека

Новый фрагмент Fab человека AFRA оценивали на его способность связываться с рецептором фолата альфа человека, и его связывание сравнили со связыванием С4. Кинетический анализ проводили с помощью плазмонного резонанса с использованием оборудования BIAcore (Pharmacia), используя растворимый рекомбинантный рецептор фолата альфа человека в качестве белка-мишени (см. фиг.8).

а) Очистка растворимой альфа-изоформы рецептора фолата (αFR)

Конструировали линию клеток яичника китайского хомячка (СНО-К1), экспрессирующую альфа-изоформу рецептора фолата (αFR). Для облегчения очистки ген растворимого αFR субклонировали в экспрессионный вектор pIRES-neo для экспрессии растворимой His-меченной альфа-изоформы гликопротеина - рецептора фолата.

Для создания растворимого белка с помощью метода ПЦР, в котором используются подходящие пары праймеров, конструировали укороченную форму αFR, обрывающуюся на положении аминокислоты 234, для исключения части карбоксильного конца рецептора, которая опосредовала привязку белка к плазматической мембране, (GPI-якоря).

ПЦР-праймеры конструировали так, чтобы они имели сайт рестрикции, часть EcoRV в прямом праймере и EcoRI в обратном праймере, которые являются совместимыми с сайтами рестрикции для множественного клонирования вектора pIRES-neo. Продукты ПЦР очищали с использованием набора для выделения из геля Quiaex (Quiagen) и расщепляли EcoRI. После расщепления продукты очищали и подвергали лигированию в течение ночи с расщепленным EcoRV и EcoRI и дефосфорилированным вектором pIRES-neo, используя систему Т4-лигирования (Biolabs). Подвергнутые лигированию образцы трансформировали в Escherichia coli DH5α и помещали на чашки с LB-агаром и ампициллином.

Несколько колоний amp^R было отобрано и проверено, используя метод ПЦР. Один клон, который продемонстрировал правильный тип, был отобран для экстракции ДНК и исследований экспрессии. Последовательность ДНК экспрессионного вектора подтверждали с использованием автоматического секвенирования.

Экспрессионный вектор затем трансфицировали в клетки СНО и отбирали стабильные благодаря устойчивости к неомицину колонии. Среди них наилучший продуцирующий клон подтверждали с помощью анализа Вестерн-блоттингом супернатанта культуры, и масштаб продукции увеличивали вплоть до 1 литра. Супернатант культуры осветляли центрифугированием при 10000 × g в течение 15 мин для отделения супернатанта от клеток и фильтровали через 0,22 мкм, и очистку проводили при 4°С, в то время как все буферы содержали 0,05% Tween-20.

Из супернатанта белок рецептора фолата очищали следующим образом. На первой стадии His-меченный гликопротеин концентрировали с помощью аффинной хроматографии с использованием иммобилизованного металла (IMAC), используя Ni⁺⁺-Charged Chelating Sepharose Fast Flow (Amerscham Biosciences, Uppsala, Швеция), как описано. Супернатант культуры клеток СНО наносили на колонку, предварительно уравновешенную 20 мМ фосфатом, 0,15 М NaCl, рН 7,0, при скорости потока 5 мл/мин. После нанесения всего супернатанта на колонку ее промывали начальным буфером до тех пор, пока А_280нм в элюенте не возвращалась на базовую линию. Белок элюировали тем же буфером, содержащим 0,5 М имидазол. На следующей стадии собирали пик А_280нм. В этот момент эндогенные молекулы фолата подвергали диссоциации от αFR путем понижения рН до 3,0 с помощью добавления по каплям 1 М HCl и перемешивали в ледяной бане в течение 1 ч. Затем образец подвергали обмену буфера на колонке G-25 Sephadex (HiPrep 26/10 desalting Amersham Biosciences, Uppsala, Швеция) на 20 мМ фосфат, 0,15 М NaCl, рН 7,0. Наконец, образец медленно (0,5 мл/мин) пропускали через 2 мл колонку фолиевая кислота-Сефароза (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), уравновешенную 5 объемами колонки 20 мМ фосфата, 0,15 М NaCl, рН 7,0. Не связавшийся образец собирали для анализа. После промывки колонки буфером для уравновешивания αFR элюировали с аффинной смолы с использованием 0,1 М глицина, 0,5 М NaCl, pH 2,8.

Фракции собирали в пробирку из полипропилена, содержащую 50 мл 1 М фосфата натрия, рН 7,0, для повышения рН вытекающей жидкости до 7,0. Чистоту αFR в препарате определяли с помощью электрофореза в SDS-(15%)-полиакриламидном геле в не восстанавливающих условиях в соответствии со способом Laemmli⁽¹³⁾, и гель окрашивали Кумасси бриллиантовым голубым на присутствие белков. Фракции, обнаруживаемые чистыми на 100%, объединяли и подвергали определению концентрации белка, используя набор для анализа белка DC (Bio-Rad Richmond, CA), используя BSA в качестве стандарта⁽¹⁴⁾. Очищенный αFR хранили при -25°С в небольших аликвотах.

b) Определение аффинности

Белком-мишенью покрывали сенсорный чип C5 BIAcore и использовали несколько концентраций фрагментов обоих антител для определения кинетик связывания. В частности, рекомбинантный FR ковалентно связывали с сенсорным чипоп СМ5, используя набор для сопряжения с аминами (Pharmacia), с использованием концентрации антигена 0,6 мкг/мл в 10 мМ ацетате натрия, рН 4,8, получая поверхность 280 RU. Остаточные активированные группы блокировали введением 35 мкл этаноламина (1,0 М, рН 8,5). Видимые кинетические константы скорости диссоциации (K_off) рассчитывали в условиях насыщения антителом от 200 нМ до 3,125 нМ при скоростях буферного потока 50 мкл/мин, используя мастер-программу. Оценку проводили в течение, по крайней мере, 30 минут. Впоследствии осуществляли отсоединение остаточного антитела, связанного с сенсорным чипом, с использованием 100 мМ глицинного буфера, рН 2,7.

Соответствующие аффинности были выведены из кривых связывания. Как С4, так AFRA были способны связывать иммобилизованный антиген. Однако рассчитанная K_D (43,9 нМ) для AFRA была более чем в 3 раза ниже K_D для С4 (168 нМ), что указывает на большую аффинность. Результаты представлены на фиг.3. Кинетики связывания мономера AFRA демонстрируют очень высокую скорость ассоциации, но также увеличенную константу диссоциации, которая может иногда быть недостатком для антитела, включенного в радиоиммунотерапию, поскольку после связывания антитела с опухолью его длительно сохраняемый эффект является существенным для эффективного облучения опухоли.

3. Продукция природного димера F(ab') ₂ и in vitro связывающие свойства F(ab') ₂

а) Природная димеризация

Для замедления скорости диссоциации Fab AFRA и для дальнейшего увеличения авидности фрагмента было решено подвергнуть фрагмент Fab димеризации. Для того чтобы это осуществить, пентапептид DKTSC, соответствующий встречающейся в природе шарнирной последовательности семейства человека гамма1, был добавлен к карбоксильному концу обеих тяжелых цепей AFRA и С4, получая фрагмент, обозначенный Fab' (т.е. Fab с дополнительным свободным цистеином на карбоксильном конце, принадлежащем шарнирной области). Из этого Fab'-формата затем можно было получить димер F(ab')₂ с помощью природного окисления остатка свободного цистеина, намеренно добавленного к карбоксильному концу тяжелой цепи антитела⁽²⁰⁾ и соответствующего первому цистеину шарнирной области встречающегося в природе полноразмерного антитела.

Оба фрагмента AFRA и С4 инкубировали с ТСЕР (Трис(2-карбоксиэтил)фосфина гидрохлоридом) в мягких условиях для восстановления цистеина карбоксильного конца тяжелой цепи, буфер обменивали для удаления восстановителя и рН доводили до 8, при котором образование дисульфидной связи, как известно, является химически преимущественным.

Димеры отделяли от реакционной смеси с помощью гельпроникающей хроматографии, при которой они определялись в виде уникального пика. Анализ электрофорезом в SDS-PAGE обнаружил, что препараты димеров не были гомогенными, как это можно было бы ожидать, и в геле пики образовывали несколько полос.

- Для фрагмента AFRA основная полоса, представляющая 80% материала, мигрировала, как и ожидалось, в области 100 кДа и была приписана димеру AFRA. Другая полоса, представляющая 16% всего материала, с видимой молекулярной массой 75 кДа могла быть обнаружена и была приписана «димеру», состоящему из нормального мономера, ковалентно связанного с другой легкой цепью Fab (L₂H). Этот «димер» являлся следствием необычной атаки цистеина карбоксильного конца первого мономера на цистеин карбоксильного конца легкой цепи второго мономера Fab. Этот цистеин легкой цепи является цистеином, который в норме вовлечен в дисульфидную связь с тяжелой цепью и поэтому не может быть доступен для какого-либо другого образования дисульфидной связи. Поскольку в результирующем димере тяжелая цепь Fab более не связана ковалентно с остальной частью молекулы и только взаимодействует через силы Ван-дер-Ваальса и гидрофобные взаимодействия с легкой цепью, эта молекула элюирует как нормальный димер во время очистки гель-фильтрацией, которую проводят в нативных условиях, но определяется в виде двух полос во время анализа электрофорезом в SDS-PAGE, при котором концентрация детергента (SDS) является достаточной для распада молекулы (фиг.4). Фактически на этой линии вместе с L₂H другая полоса, соответствующая нековалентно связанной тяжелой цепи, вырванной из суррогата димера, может быть обнаружена на дне геля и представляет 4% от всего материала.

- В случае Fab С4 ситуация была неожиданно даже хуже, поскольку в это время при электрофорезе в SDS-PAGE основная полоса (43% от всего материала), соответствующая соединению L₂H или, другими словами, примеси реакции AFRA, стала теперь самым обильным продуктом реакции димеризации С4. Ковалентно связанный димер представлял только 29% от всего материала, и SDS отделял тяжелую цепь, составляющую 25% смеси.

Этот анализ был далее подтвержден LC-масс-анализом, который смог определенно идентифицировать все виды, присутствующие в материале, полученном после очистки гель-фильтрацией.

В нативных водных условиях никакие различия в хроматографическом поведении между правильным димером и примесью, соответствующей «димеру» с нековалентно связанной тяжелой цепью, нельзя использовать для разделения двух видов. Авторы настоящего изобретения безуспешно пытались разделить оба вида с помощью ионообменной хроматографии или основанной на гидрофобных взаимодействиях хроматографии в попытке получить чистый димер. Авторы настоящего изобретения также пытались безуспешно исключить примесь из димера с помощью избирательной денатурации при нагревании.

b) ELISA: прямое связывание F(ab') ₂ с рецептором фолата альфа

Два димера F(ab')₂ были затем проверены на связывание в формате ELISA непосредственно на линии клеток А431, трансфицированной рецептором фолата альфа человека, и на линиях клеток карциномы яичника человека OVCAR3 и IGROVI.

4 × 10⁴ клеток (линий клеток карциномы яичника человека OVCAR3 (АТСС) и IGROVI (подарок от Dr. J. Benard, Institut Gustave Roussy, Villejuif, Франция) и клеток А431-FR (¹⁷), которые являются эпидермоидными раковыми клетками человека, трансфицированными рецептором фолата альфа человека) помещали в каждую лунку 96-луночного планшета и выращивали до получения конфлюэнтного монослоя. Клетки фиксировали в течение 5 минут при комнатной температуре 0,1% глутаральдегидом в PBS. Планшеты дважды промывали PBS, затем один раз (в течение 5 минут) 0,1 М глицином в PBS + 0,02% NaN₃, последовательно пять раз PBS и, наконец, PBS, содержащим 1% BSA и 0,02% NaN₃.

Серийным разведениям фрагментов антител (С4 или AFRA) предоставляли возможность связываться в течение 1 часа при комнатной температуре в PBS + 0,03% BSA и трижды промывали PBS.

Для обнаружения связывания фрагментов антител использовали конъюгированное с пероксидазой антитело против IgG человека (специфичное для Fab, Sigma), разведенное 1:1000 в PBS + 0,03% BSA. Реакцию в планшете для ELISA выявляли добавлением 100 мкл раствора ТМВ (Sigma) на 30 минут при комнатной температуре, останавливали добавлением 50 мкл раствора H₂SO₄ (1М) и считывали при 450 нм.

Поскольку по сравнению с клетками, трансфицированными FR-альфа, на контрольных клетках А431, которые являются клетками, трансфицированными пустым вектором, сигнал не обнаруживался, рассудили, что оба антитела AFRA и С4 являются специфичными для рецептора фолата альфа. Оба фрагмента продемонстрировали почти одинаковые общие аффинности в низкой наномолярной области, активности, совместимые с использованием в радиоиммунотерапии (заметьте, однако, что F(ab')₂ С4 настолько сильно загрязнен псевдодимером L₂H, что его практические применения, в частности в радиоиммунотерапии, невозможны). В таблице 1 приводится определение в ELISA значений K_D F(ab')₂ из фрагментов антител С4 и AFRA. K_D определяли в виде концентрации, при которой получают половину от сигнала плато в ELISA.

Таблица I
F(ab')2	KD (нМ)
OVCAR3	A431-FR	IGROV1
C4	11±2	1,2±0,1	118+64
AFRA	26±10	2,5+0,7	57±21

4. Химическая димеризация Fab' и in vivo связывающие свойства

In vivo анализы проводили для подтверждения специфичности для опухоли и локализации в ней. Однако in vivo дисульфидный мостик, сохраняющий вместе две половинки молекулы F(ab')₂, быстро гидролизуется, и F(ab')₂ быстро обратно превращается во фрагмент Fab и выводится из кровотока. Поэтому для сохранения F(ab')₂-формата in vivo была осуществлена химическая димеризация, описываемая ниже.

а) Димеризация фрагмента Fab' с использованием бисмалеимида (ВМОЕ)

Для сохранения F(ab')₂-формата in vivo использовали негидролизуемый линкер, соединяющий два Fab', образующих F(ab')₂ (²¹). Конкретнее, линкер бис(малеимидо)этан (ВМОЕ) определили для димеризации фрагмента Fab' (²²) в ди(Fab)малеимид (DFM). Оба фрагмента AFRA и С4 подвергали этой обработке и проверяли в in vivo эксперименте на биораспределение для идентификации наилучшего кандидата на клиническую разработку.

В литературе уже сообщалось о химической димеризации Fab' в DFM. Эта химическая реакция основана на уникальной способности остатков цистеинов специфически реагировать с гетероциклом - малеимидом. Химическая реакция приводит к образованию химической связи между остатками цистеинов и малеимидом. В настоящем случае уникальный свободный цистеин в белке Fab' находится на карбоксильном конце тяжелой цепи Fab'. Поэтому атака малеимида была сайт-специфической и с противоположной стороны от сайта связывания рецептора фолата.

Белок инкубировали с 70 молями ТСЕР (Трис(2-карбоксиэтил)фосфина гидрохлорида) на каждый моль Fab' в течение 5 часов при комнатной температуре для восстановления остатка цистеина карбоксильного конца тяжелой цепи. ТСЕР удаляли с помощью обессоливающей хроматографической HiPrep-колонки 26/10 (General Electrics), предварительно уравновешенной 40 мМ MES, pH 6,0. Белок концентрировали до 8 мг/мл и инкубировали с легким перемешивании при комнатной температуре в течение 2,5 часов для того, чтобы сделать возможным реокисление дисульфидной связи, присутствующей между цепями Fab. Кинетики реакции контролировали с помощью анализа с использованием HPLC с обращенной фазой. Линкер ВМОЕ (Sigma) добавляли к раствору белка (1 мг/мл в DMSO) в молярном соотношении 0,35 линкера/белок и инкубировали в течение 16 часов при комнатной температуре с легким перемешиванием.

Для удаления природных F(ab')₂ реакционную смесь снова восстанавливали с использованием 70 молей ТСЕР на каждый моль Fab' в течение 3,5 часов при комнатной температуре. Димер очищали на колонке HiPrep Sephacryl S-100 HR, предварительно уравновешенной 40 мМ MES, pH 6,0. Белок анализировали с помощью электрофореза в SDS-PAGE, и его количество определяли по Бредфорду.

Используя эту стратегию, AFRA-DMF получали почти с тем же количеством примеси L₂H. Неожиданно, однако, было практически невозможно получить какой-либо правильный С4-DMF. Было оценено с помощью гель-фильтрации после восстановления дисульфида для избавления от «природного» димера, что только 4% молекул С4 реагируют с линкером с образованием DMF. Протокол повторяли несколько раз с Fab' С4 и использовали различные условия, но авторам настоящего изобретения так и не удалось получить более высоких концентраций димера. За реакцией постоянно следили с помощью анализа масс, и было показано, что реакция не продолжалась после добавления молекулы ВМОЕ на Fab'. Вероятно линкер взаимодействовал неожидаемым образом, вероятно вследствие легкой цепи лямбда С4, которая является единственным различием между фрагментами Fab AFRA и С4. В качестве противоположности, в тех же самых условиях димеризация всегда наблюдалась для составляющей AFRA (таблица II).

Таблица II
Фрагмент антитела	Общая димеризация в %	Процент димерного продукта в пике, проанализированного с помощью электрофореза в SDS-PAGE
Высокая М.м.	Димер L2H2	L2H	60 кДа	Fab'	Свободная Н-цепь
F(ab')2-C4	65	-	29	43	-	-	25
F(ab')2-AFRA	61	-	80	16	-	-	4
DFM-C4	4	3	34	17	17	14	15
DFM-AFRA	44	10	48	17	-	17	8

Из этой таблицы можно видеть, что в случае С4 можно определить неожидаемый продукт с молекулярной массой 60 кДа, но остаток реакции димеризации дает почти одинаковые продукты в одинаковых количествах. Значительное различие можно наблюдать между AFRA и С4 в отношении % димера, получаемого в конце реакции, с превышающим 10 множителем между двумя молекулами в пользу AFRA.

b) Иммуногистохимический анализ на образцах биопсии

Сообщаемые выше анализы проводили in vitro на трансфицированных клетках или линиях клеток карциномы яичника. Однако каждая из различных линий клеток может экспрессировать различные количества и различные варианты гликозилирования рецептора. Поэтому важно проверить димеры Fab в in vivo контексте. AFRA проверяли в иммуногистохимическом анализе на его способность узнавать in situ рецептор фолата альфа, экспрессируемый в карциноме яичника.

Димер AFRA-DFM метили FITC in vitro, и образцы биопсий готовили для окрашивания. Конкретно, замороженные срезы образцов биопсий толщиной 5 мм готовили, сушили и фиксировали в холодном ацетоне в течение 5 мин. Избыток ацетона исключали промыванием предметных стекол в PBS (pH 7,4) и затем сушкой на воздухе. Подвергнутые криостатированию срезы блокировали 3% BSA, 10% сывороткой человека в 3% снятом молоке в течение 60 минут при комнатной температуре. FITC-меченный фрагмент антитела AFRA-DFM сначала инкубировали в течение ночи при 4°С в трех различных разведениях.

Осуществляли промывку буфером для автоокраски. Добавляли мАт против FITC (кроличье, в разведении 1:200) на 30 минут при комнатной температуре. Предметные стекла последовательно промывали буфером для автоокраски. Затем на 30 минут при комнатной температуре добавляли мАт свиньи против Ig кролика, конъюгированное со щелочной фосфатазой (разведение 1:80). Предметные стекла промывали буфером для автоокраски. Последовательно добавляли красный буфер (предоставляемый Vector), осуществляли промывку, и последнюю промывку проводили в дистиллированной воде. Добавляли гематоксилин на 15 секунд при комнатной температуре. Предметные стекла промывали в водопроводной воде, дегидратировали, очищали и монтировали для микроскопического наблюдения.

AFRA-DFM снова мог локализоваться в области опухоли и не окрашивал какие-либо окружающие здоровые ткани (фиг.5), что подтверждает специфичность димера AFRA-DFM в in vivo контексте.

c) Биораспределение in vivo

Продемонстрировав специфичность AFRA-DFM, провели эксперимент, связанный с биораспределением. Для этой цели макромолекулу метили радиоактивным изотопом - йодом¹³¹ с помощью трубок для йодирования, предварительно покрытых йодогеном, используя способ Chizzonite, по существу как описано производителем (Pierce), с использованием свободных от пирогенов реагентов клинического качества(¹⁷). Способ Chizzonite позволяет лучше сохранить целостность и функциональность; в действительности, конечный меченный радиоизотопом продукт со специфической активностью 5 мКи/мг демонстрирует среднюю иммунореактивность, составляющую, по крайней мере, 65%. ¹³¹I-меченный AFRA-DFM вводили в кровь животного.

В нескольких заранее определенных моментах времени после введения животных умерщвляли, органы выделяли, взвешивали и подсчитывали для определения кинетик аккумуляции и выведения радиоактивности в каждом из них. Нормальные ткани использовали в качестве контролей в сравнении с опухолью, которую заранее имплантировали под кожу животного.

Конкретнее, самок мышей CD1 nu/nu (без вилочковой железы) возрастом 5-6 недель получали от Charles River Laboratories (Calco, Италия). После 1 недели адаптации мышей подвергли подкожной ксенотрансплантации с использованием 3,5×10⁶ клеток А431, трансфицированных рецептором фолата альфа человека, или контрольных клеток A431t в 0,1 мл 0,9% NaCl. Через две-три недели после введения опухолевых клеток мышей случайным образом разделили на группы и ввели внутривенно в латеральную хвостовую вену меченный радиоизотопом фрагмент антитела (¹³¹I-DFM-AFRA 5.3). Эксперимент выполнен с этим радиоизотопом, а его детали представлены в таблице III ниже.

Таблица III
Изучаемая ксенотрансплантированная опухоль	A431FR
Размер группы на каждый момент времени	4
Специфическая активность (мКи/мг)	5,0
Общая введенная доза (мкКи)/животное	30,0
Общая введенная доза (мкг)/животное	6,0
Оцениваемые моменты времени после введения для биораспределения (ч)	1, 3, 6, 15, 24, 48
Оцениваемые моменты времени после введения для фармакокинетик (ч)	10 мин, 30 мин, 1, 3, 6, 15, 24, 48

d) Локализация радиоактивности

После вскрытия опухоли и другие ткани/органы (селезенку, почку, печень, мочевой пузырь с мочой, грудину, сердце и мышцы) собирали и взвешивали мокрыми. Радиоактивность, связанную с каждой тканью, оценивали с помощью гамма-счетчика с использованием внутренних стандартов (5 и 10 мкл вводимого раствора).

Результаты представлены на фиг.6 и выражены в виде процента введенной дозы на каждый грамм ткани (%ВД/г) и корректированы с учетом распада радиоактивности. Нормализация таким способом делает возможным прямое сравнение органов или животных. Для радиоиммунотерапии идеальная молекула будет обладать высокой аккумуляцией в течение длительного времени в опухоли и наименьшим возможным фоном в здоровых тканях.

Результат связанного с биораспределением эксперимента демонстрирует, что AFRA-DFM специфически аккумулируется в опухоли. Увеличенные значения, соответствующие мочевому пузырю и моче, хорошо коррелируют с ожидавшейся экскрецией DFM и подтверждают путь детоксикации. Как и ожидалось, DFM аккумулируется в опухоли, в которой спустя шесть часов после введения его концентрация начинала превосходить концентрацию, измеряемую в других органах.

5. Доказательство принципа in vivo эффективности меченного радиоизотопом AFRA-DFM

Продемонстрировав, что меченный радиоизотопом фрагмент антитела ¹³¹I-AFRA-DFM специфически аккумулируется в опухоли, эктопически экспрессирующей FR, (A431FR), оценили его способность контролировать рост опухоли. Общую введенную дозу определяли в соответствии с фармакокинетиками. Макромолекулы метили радиоизотопом - йодом¹³¹ и вводили в кровоток животных, несущих подкожно имплантированные опухолевые клетки.

Конкретнее, самок мышей CD1 nu/nu (без вилочковой железы) возрастом 7 недель получали от Charles River Laboratories (Calco, Италия). После 1 недели адаптации мышей подвергли подкожной ксенотрансплантации с использованием 3,5×10⁶ клеток А431, трансфицированных рецептором фолата альфа человека (A431FR), или контрольных клеток A431t в 0,1 мл 0,9% NaCl (физиологического раствора). Через одну неделю после введения опухолевых клеток мышей случайным образом разделили на группы и ввели внутривенно в латеральную хвостовую вену 0,3 мл меченного радиоизотопом DFM-AFRA в физиологическом растворе или только физиологический раствор в качестве контроля. Рост опухоли контролировали каждые 2-3 дня и измеряли с помощью циркуля; объем опухоли определяли следующим образом: D × d² × 1/6 × π, где D = большой диаметр; d = малый диаметр. Провели три независимых эксперимента, и детали представлены в таблице IV ниже.

Таблица IV
Изучаемая ксенотрансплантированная опухоль	A431FR + контрольные А431
Число независимых экспериментов	3
Размер группы на каждое лечение	6-7
Средняя специфическая активность (мКи/мг)	4,87 ± 0,57
Общая введенная радиоактивная доза (мкКи)/животное	1002 ± 8 0
Общий введенный белок (мкг)/животное	211 ± 35

Результаты представлены на фиг.11 и выражены в виде процента роста опухоли относительно контроля, обработанного только физиологическим раствором. AFRA-DFM, меченный радиоизотопом - ¹³¹I, вводили несущим опухоли мышам в средней дозе, составляющей 1 мКи/мышь. Рост опухоли контролировали каждые 2-3 дня после введения. Результаты задержки роста опухоли, зарегистрированные в трех независимых экспериментах, приводятся на фиг.11 в виде среднего процента роста опухоли относительно соответствующего контроля. В каждом эксперименте средний объем в каждой подвергнутой лечению группе, т.е. A431FR или контрольные A431, сравнивали со средним объемом соответствующей контрольной группы. Результаты этих связанных с эффективностью экспериментов демонстрируют, что меченный радиоизотопом AFRA-DFM специфически задерживает рост опухолей, экспрессирующих представляющий интерес антиген-мишень (A431FR), но не задерживает рост нерелевантных опухолей (контрольных A431), и что процент уменьшения опухоли был значительным как в день 11, так и в день 16 после лечения (р=0,006 и р=0,05, соответственно).

6. Локализация меченного радиоизотопом AFRA-DFM на клетках карциномы яичника, растущих в виде внутрибрюшинных опухолей

Продемонстрировав, что меченный радиоизотопом фрагмент антитела ¹³¹I-DFM-AFRA после внутривенного введения способен специфически аккумулироваться в опухоли, эктопически экспрессирующей FR (A431FR), и контролировать рост такой опухоли, оценили его способность локализоваться на клетках карциномы яичника, природно сверхэкспрессирующих рецептор фолата. ¹³¹I-DFM-AFRA вводили в брюшинную полость животных, несущих внутрибрюшинно имплантированные клетки карциномы яичника, модель, которая воспроизводит природный рост и распространение эпителиального рака яичника человека.

Конкретнее, самок мышей CD1 nu/nu (без вилочковой железы) возрастом 7 недель получали от Charles River Laboratories (Calco, Италия). После 1 недели адаптации мышей подвергли внутрибрюшинной ксенотрансплантации с использованием 8-10 × 10⁶ клеток IGROV1, сверхэкспрессирующих рецептор фолата альфа человека, в 0,3 мл 0,9% NaCl (физиологического раствора). Когда образование асцита становилось явным (14-20 дней после введения опухолевых клеток), внутрибрюшинно вводили меченный радиоизотопом AFRA-DFM в 0,3 мл физиологического раствора, мышей случайным образом делили на группы, и в различные моменты времени асциты, солидные опухолевые массы, растущие прикрепленными к брюшине, и другие ткани/органы (кровь, почки, печень и мышцы) собирали и взвешивали мокрыми. Асцит центрифугировали, осажденные асцитические опухолевые клетки отделяли от жидкости и подсчитывали отдельно. Радиоактивность, связанную с каждой тканью, оценивали с помощью гамма-счетчика с использованием внутренних стандартов (5 и 10 мкл вводимого раствора). Были выполнены три независимых эксперимента, и их детали представлены в таблице V ниже.

Таблица V
Изучаемая ксенотрансплантированная опухоль	IGROV1
Число независимых экспериментов	3
Размер группы на каждый момент времени	3-4
Диапазон специфической активности (мКи/мг)	3,9-9,7
Общая введенная радиоактивная доза (мкКи)/животное (диапазон)	30-158
Общий введенный белок (мкг)/животное (диапазон)	3,6-40
Оцениваемые моменты времени для биораспределения (ч)	1, 3, 6, 15, 24

Результаты представлены на фиг.12 и выражены в виде процента введенной дозы на каждый грамм ткани (%ВД/г) и корректированы с учетом распада радиоактивности. Нормализация таким способом делает возможным прямое сравнение органов или животных. Результаты этих экспериментов демонстрируют, что меченный радиоизотопом AFRA-DFM специфически связывался с поверхностью клеток карциномы яичника, присутствующих в асците, (IGROV1), и что меченный радиоизотопом AFRA-DFM оставался на поверхности клетки и солидных опухолевых массах вплоть до 15 ч.

7. Эффективность меченного радиоизотопом AFRA-DFM против клеток карциномы яичника, растущих в виде внутрибрюшинных опухолей

Продемонстрировав, что ¹³¹I-DFM-AFRA способен специфически аккумулироваться в опухоли, природно экспрессирующей FR, (IGROV1) после внутрибрюшинного введения, оценили его способность контролировать распространение внутрибрюшинной опухоли - карциномы яичника. ¹³¹I-DFM-AFRA вводили в брюшинную полость животных, несущих внутрибрюшинно клетки карциномы яичника, имплантированные за 2-4 дня до введения фрагмента антитела.

Конкретнее, самок мышей CD1 nu/nu (без вилочковой железы) возрастом 7 недель получали от Charles River Laboratories (Calco, Италия). После 1 недели адаптации мышей подвергли внутрибрюшинной ксенотрансплантации с использованием 8-10 × 10⁶ клеток карциномы яичника, сверхэкспрессирующих рецептор фолата альфа человека, (IGROV1 или OVCAR3) в 0,3 мл 0,9% NaCl (физиологического раствора). Через два или четыре дня после введения опухолевых клеток мышей случайным образом делили на группы и вводили внутрибрюшинно 0,3 мл меченного радиоизотопом AFRA-DFM в физиологическом растворе или только физиологический раствор в качестве контроля. Рост опухоли контролировали каждые 2-3 дня, взвешивали и контролировали образование асцита или развитие солидной внутрибрюшинной массы. Регистрировали выживание животных. Были выполнены два независимых эксперимента, и их детали представлены в таблице VI ниже.

Таблица VI
Изучаемая ксенотрансплантированная опухоль	IGROV1 или OVCAR3
Число независимых экспериментов	2
Размер группы на каждое лечение	8-9
Средняя специфическая активности (мКи/мг)	4,3
Общая введенная радиоактивная доза (мкКи)/животное	1,004
Общий введенный белок (мкг)/животное	250

Результаты представлены на фиг.13 и выражены в виде кривых выживания. Увеличение выживания оценивали с помощью логарифмического рангового критерия. Результаты этих экспериментов демонстрируют, что меченный радиоизотопом AFRA-DFM при введении вплоть до 4 дней после имплантации опухоли в брюшинную полость способен значительно задерживать рост опухоли и, следовательно, продлевать дожитие животных в обеих моделях ортотопических опухолей (р=0,0014 и р<0,001 в модели IGROV1 и OVCAR3, соответственно).

1. Антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с рецептором фолата альфа (FRα), причем указанные антитело или его фрагмент включают
легкую цепь, вариабельная область которой включает определяющие комплементарность участки (CDR), имеющие следующие аминокислотные последовательности:
RASESVSFLGINLIH (SEQ ID NO:3),
QASNKDT (SEQ ID NO:4),
LQSKNFPPYT (SEQ ID NO:5),
а константная область указанной легкой цепи является константной областью каппа; и
тяжелую цепь, включающую CDR, имеющие следующие аминокислотные последовательности:
DYAMI (SEQ ID NO:6),
SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO:7),
ERYDFWSGMDV (SEQ ID NO:8).

2. Антитело или его фрагмент по п.1, которые включают легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность фиг.1 (SEQ ID NO:1).

3. Антитело или его фрагмент по п.1 или 2, которые являются полностью человеческими.

4. Антитело или его фрагмент по п.1 или 2, являющиеся моноклональными.

5. Фрагмент антитела по п.1 или 2, который является фрагментом Fab, включающим вариабельную область (V_H) и первую константную область (С_H1) тяжелой цепи.

6. Фрагмент антитела по п.5, в котором указанная вариабельная область (V_H) имеет аминокислотную последовательность фиг.8 (SEQ ID NO:2).

7. Фрагмент антитела по п.5, который является фрагментом Fab′, где тяжелая цепь дополнительно включает шарнирную область, содержащую цистеин на С-конце тяжелой цепи.

8. Антитело или его фрагмент по п.1 или 2, которые конъюгированы с эффекторной составляющей, где эффекторной составляющей является радионуклид.

9. Антитело или его фрагмент по п.8, в которых радионуклид выбирают из группы, состоящей из ¹³¹I, ⁹⁰Y, ¹⁷⁷Lu, ¹⁸⁸Re и ⁹⁹Тс.

10. Димер, образованный двумя ковалентно связанными фрагментами Fab′ по п.7, который специфически связывается с рецептором фолата альфа (FRα).

11. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая легкую цепь антитела или его фрагмента, определенные в п.1 или 2.

12. Экспрессионный вектор, включающий нуклеиновую кислоту по п.11, причем указанная нуклеиновая кислота функционально связана с регуляторными в отношении транскрипции сигналами.

13. Клетка-хозяин, трансформированная вектором по п.12, способная экспрессировать экзогенный генетический материал.

14. Клетка-хозяин по п.13, являющаяся Escherichia coli.

15. Фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество антитела или его фрагмента, определенных в любом из пп.1-9, в соединении с фармацевтически приемлемым носителем для лечения или предупреждения лечения нарушений, в патологический процесс которых вовлечена сверхэкспрессия рецептора фолата альфа (FRα).

16. Применение антитела или его фрагмента, определенных в любом из пп.1-9, для приготовления лекарственного средства для лечения или предупреждения нарушений, в патологический процесс которых вовлечена сверхэкспрессия рецептора фолата альфа (FRα).

17. Применение по п.16, при котором нарушением является карцинома яичника у людей.

18. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или его фрагмент, определенные в любом из пп.1-9, и дополнительный терапевтический агент в качестве комбинированного препарата для одновременного, отдельного или последовательного применения в терапии.

19. Фармацевтическая композиция по п.18, в которой дополнительный терапевтический агент выбирают из группы, состоящей из химиотерапевтического агента и радиотерапевтического агента.

20. Фармацевтическая композиция по п.18 или 19 в качестве комбинированного препарата для одновременного, отдельного или последовательного применения в терапии рака яичника.