Штамм бактерий azotobacter chroococcum 5 v(e), используемый для получения азотфиксирующего удобрения для зерновых и кормовых культур
Владельцы патента RU 2464308:
Государственное научное учреждение Татарский научно-исследовательский институт агрохимии и почвоведения Российской академии сельскохозяйственных наук (RU)
Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в сельском хозяйстве при производстве азотфиксирующих удобрений для улучшения азотного питания растений. Штамм бактерий Azotobacter chroococcum 5 V(e) выделен из светло-серой лесной почвы поселка Раифа Зеленодольского района Республики Татарстан и депонирован в ВКПМ под номером В-10387. Штамм синтезирует витамины группы В и индолил-3-уксусную кислоту. Штамм обладает азотфиксирующей активностью 515,7 нМ N2/мл·ч. Изобретение позволяет повысить урожайность зерновых и кормовых сельскохозяйственных культур. 13 табл., 4 пр.
Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в сельском хозяйстве, а именно при производстве бактериальных удобрений для улучшения азотного питания растений.
Для улучшения азотного питания растений недостаточно вводить в почву соединения азота. Необходимо повысить эффективность потребления азота растением. Для этого давно применяют взаимодействие микроорганизма, производящего азот в форме, приемлемой для растений, и клеток корней растений.
Так, известны штаммы бактерий Azotobacter chroococcum, позволяющие улучшить азотное питание томатов (патент №2076088 RU), огурцы (патент №2074157 RU), ячменя (авторское удостоверение №1316189 SU). Приведенные штаммы выделены из ризосферы или ризопланы объекта повышения азотного питания, и их недостатком является узкое действие.
Известен штамм бактерий Azotobacter chroococcum B35 (патент №2074159 RU), который может быть использован при получении бактериальных удобрений под зеленые культуры, такие как салат, сельдерей, петрушка и др. При его использовании в удобрении снижается уровень нитратов в почве. Недостатком является то, что штамм также выделен из ризосферы томата Lycopersicon esculentum и может быть плохо приспособлен к выживанию в климатических и биологических условиях, отличных от области происхождения томата Lycopersicon esculentum.
Наиболее близким аналогом является штамм бактерий Azotobacter chroococcum для получения препарата, применяемого в растениеводстве (патент №1703634 SU), обладающего широким спектром подавления фитопатогенных грибов, а также способностью к синтезу индолил-3-уксусную кислоту (ИУК). Этот штамм выделен из серозема.
Целью изобретения является получение штамма бактерий для азотфиксирующего удобрения, обладающего действием на широкий круг зерновых и кормовых растений, а также обладающего высокой устойчивостью к внешним условиям.
Цель достигается за счет использования штамма бактерий Azotobacter chroococcum 5 V(e). Штамм найден в естественных условиях, выделен из светло-серой лесной почвы поселка Раифа Зеленодольского района Республики Татарстан.
Культура идентифицирована до вида с помощью анализа 16S РНК во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ФГУП ГосНИИгенетики), где зарегистрирована за №В-10387.
Культурально-морфологические особенности штамма: Величина клеток 5-суточной культуры на среде Эшби около (0,7-1,7)×(3,0-3,6) мкм. Клетки крупные, округлые, одиночные или соединенные попарно, неподвижные, грамотрицательные. На среде Эшби образуют колонии средних размеров (5 мм). На 5-е сутки колонии блестящие, светло-бежевого цвета, круглые с фестончатыми краями и гладкой поверхностью, выпуклые, по структуре - однородные.
Активность (продуктивность) штамма, другие производственные показатели: Нитрогеназная активность штамма 515,7 нМ N2/мл·ч; способен синтезировать и выделять в среду витамины группы В (мг/л): биотин (В7) - 1,2, пиридоксин (В6) - 1,31, тиамин (В1) - 2,1, пантотеновую кислоту (В3) - 1,2, а также индолил-3-уксусную кислоту (ИУК) - 77,5 (Максимальное накопление происходит на 4 сутки).
Оптимальной температурой роста штамма Azotobacter chroococcum 5 V(e) является 25-30°C. Пределы pH для его роста 5,5-8,5, оптимум 7,0-7,5.
Для инокуляции использовали 4-суточную культуру, выращенную на жидкой среде Эшби (среда Эшби (г/л): K2HPO4 - 0,2; MgSO4 - 0,2; NaCl - 0,2; KH2PO4 (или K2SO4) - 0,1; CaCO3 - 5,0; сахароза - 20,0; вода водопроводная - 1000 мл [Колешко О.И. Экология микроорганизмов почвы. Лабораторный практикум. - Минск: Высшая школа, 1981. - 175 с.]. По истечении 4-х суток с помощью светового микроскопа осуществляли подсчет клеток в камере Горяева - определяли титр, который должен быть 2,0·109-8,0·109 кл./мл.
Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма: Штамм может храниться без потери полезных свойств при температуре +4-6°C (в холодильнике) на косяках с агаризованной средой Эшби.
Способ, условия и состав сред для размножения штамма: Среда Эшби - 0,02% K2HPO4, 0,02% MgSO4, 0,02% NaCl, 0,01% KH2PO4, 0,5% CaCO3, 2% маннит, 2% агар.
Оптимальные условия и состав среды для ферментации: Среда Бэрка - 0,064% K2HPO4, 0,02% MgSO4, 0,02% NaCl, 0,016% KH2PO4, 2% сахароза, 0,005% CaSO4·2H2O, 0,0001% NaMoO4, 0,0003% FeSO4.
Штамм Azotobacter chroococcum 5 V(e) обладает способностью прикрепляться к поверхности корней различных сельскохозяйственных культур, где размножается и функционирует в течение 5-6 месяцев после инокуляции.
Использование заявляемого штамма Azotobacter chroococcum 5 V(e) позволяет значительно повысить урожайность различных сельскохозяйственных культур. К тому же и время жизнедеятельности этого штамма (и, следовательно, продолжительность воздействия бактериального удобрения) не менее 5 мес.
У выделенного штамма Azotobacter chroococcum 5 V(e) определена азотфиксирующая активность (515,7 нМ N2/мл·ч). Выделенный штамм может быть отнесен к высокоактивным, так как величина ацетиленредукции у него выше 150 нМ N2/мл·ч (Садыков Б.Ф., Умаров М.М. Продуктивность азотфиксации в филосфере растений // Микробиология. - 1980. - Т.49. - Вып.6. - С.998-1002).
Предлагаемый штамм способен синтезировать витамины группы В и индолил-3-уксусную кислоту (ИУК).
Наибольшая способность продуцировать физиологически активные соединения установлена для него на 4 сутки ((мг/л): биотин (B7) - 1,2, пиридоксин (В6) - 1,9, тиамин (B1) - 2,1, пантотеновую кислоту (В3) - 1,2, а также индолил-3-уксусную кислоту (ИУК) - 107,5). Эти витамины играют важную роль в процессах обмена азотистых веществ. Известно, что гетероауксин оказывает стимулирующее действие в пределах концентраций 17,5-140,0 мг/л (Гуськов А.В., Земская В.А. Изменения ауксиноксидазной активности в укореняющихся черенках фасоли под действием ИУК и 2,4-Д // Физиология растений. - 1985. - Т.32, вып.6. - С.1137-1143). Следовательно, предлагаемый штамм может быть использован для производства ростстимулирующего препарата.
Также штамм хорошо культивируется в недорогих питательных средах, что уменьшает затраты на производство удобрений на основе этого штамма.
Известно, что хорошее качество посевного материала, высокая энергия прорастания семян и дружный рост всходов - важные условия, обеспечивающие в дальнейшем получение высоких урожаев. Результаты тестов, показывающих эффективность предлагаемого штамма, приведены в примерах.
Для всех примеров семена тестовых культур обрабатывались суспензией Azotobacter chroococcum 5 V(e) в течение 1 ч при 28°C (титр клеток 109).
При изучении влияния суспензии Azotobacter chroococcum 5 V(e) на развитие проростков тестовых культур, их длину и биомассу установлено его ростстимулирующее действие (табл.1-5).
Пример 1.
Суспензией Azotobacter chroococcum 5 V(e) обрабатывались семена пшеницы, ржи, проса, кукурузы. Получено увеличение энергии прорастания семян на 5-30% в зависимости от культуры по сравнению с необработанными семенами. Данные представлены в таблице 1.
Пример 2.
Суспензией Azotobacter chroococcum 5 V(e) обрабатывались семена пшеницы, ржи, проса, кукурузы. Получено значительное увеличение длины корешков (от 20% до 80% на 10 сутки), что очень важно, так как корни обеспечивают растение различными питательными элементами, в том числе минеральными (табл.2-3).
Развитие корешков способствовало активному росту проростков тестовых растений (табл.4-5).
Таким образом, полученные данные позволяют рекомендовать для предпосевной обработки семян зерновых и кормовых культур штамм Azotobacter chroococcum 5 V(e), обладающий полифункциональным положительным действием на растения.
Пример 3.
Исследования были продолжены в вегетационных опытах с яровой пшеницей (табл.6-8), где установлена высокая отзывчивость тестовых растений на обработку семян суспензией Azotobacter chroococcum 5 V(e).
Пример 4.
Были проведены вегетационные опыты с кукурузой, также показавшие высокую эффективность обработку семян суспензией Azotobacter chroococcum 5 V(e) (табл.9-13).
| Таблица 1 | |||
| Влияние Azotobacter chroococcum 5 V(e) на энергию прорастания семян различных сельскохозяйственных культур | |||
| Культура | Контроль | Azotobacter chroococcum 5V(e) | % к контролю |
| Зерновые | |||
| Пшеница | 72 | 88 | +22,2 |
| Рожь | 82 | 86 | +4,9 |
| Просо | 90 | 96 | +6,7 |
| Кормовые | |||
| Кукуруза | 72 | 94 | +30,6 |
| Таблица 2 | |||
| Влияние Azotobacter chroococcum 5 V(e) на длину корешков различных сельскохозяйственных культур | |||
| Культура | Контроль | Azotobacter chroococcum 5V(e) | % к контролю |
| Зерновые | |||
| Пшеница | 9,2 | 16,7 | +81,5 |
| Рожь | 10,3 | 17,4 | +68,9 |
| Просо | 4,3 | 6,4 | +48,8 |
| Кормовые | |||
| Кукуруза | 17,8 | 21,4 | +20,2 |
| Таблица 3 | |||
| Влияние Azotobacter chroococcum 5 V(e) на биомассу корешков различных сельскохозяйственных культур | |||
| Культура | Контроль | Azotobacter chroococcum 5V(e) | % к контролю |
| Зерновые | |||
| Пшеница | 0,0055 | 0,0075 | +36,4 |
| Рожь | 0,0078 | 0,0103 | +32,1 |
| Просо | 0,0003 | 0,0004 | +33,3 |
| Кормовые | |||
| Кукуруза | 0,0232 | 0,0297 | +28,0 |
| Таблица 4 | |||
| Влияние Azotobacter chroococcum 5 V(e) на длину проростков различных сельскохозяйственных культур | |||
| Культура | Контроль | Azotobacter chroococcum 5V(e) | % к контролю |
| Зерновые | |||
| Пшеница | 10,6 | 12,4 | +17,0 |
| Рожь | 12,0 | 14,9 | +24,2 |
| Просо | 7,8 | 8,9 | +14,1 |
| Кормовые | |||
| Кукуруза | 9,0 | 13,9 | +54,4 |
| Таблица 5 | |||
| Влияние Azotobacter chroococcum 5 V(e) на биомассу проростков различных сельскохозяйственных культур | |||
| Культура | Контроль | Azotobacter chroococcum 5V(e) | % к контролю |
| Зерновые | |||
| Пшеница | 0,0103 | 0,0127 | +23,3 |
| Рожь | 0,0118 | 0,0130 | +10,2 |
| Просо | 0,0014 | 0,0018 | +28,6 |
| Кормовые | |||
| Кукуруза | 0,0574 | 0,0593 | +3,3 |
| Таблица 6 | |||
| Влияние Azotobacter chroococcum 5 V(e) на урожай зерна яровой пшеницы (вегетационный опыт) | |||
| № п/п | Вариант | Урожайность, г/сосуд | % к контролю |
| 1 | Контроль без удобрений | 7,6 | - |
| 2 | Azotobacter chroococcum 5V(e) | 8,2 | +7,9 |
| Таблица 7 | |||
| Влияние Azotobacter chroococcum 5 V(e) на вес соломы яровой пшеницы (вегетационный опыт) | |||
| № п/п | Вариант | Вес соломы, г/сосуд | % к контролю |
| 1 | Контроль без удобрений | 16,1 | - |
| 2 | Azotobacter chroococcum 5V(e) | 18,5 | +14,9 |
| Таблица 8 | |||
| Влияние Azotobacter chroococcum 5 V(e) на качество зерна яровой пшеницы (вегетационный опыт) | |||
| № п/п | Вариант | Содержание белка, % | % к контролю |
| 1 | Контроль без удобрений | 11,3 | - |
| 2 | Azotobacter chroococcum 5V(e) | 12,5 | +10,6 |
| Таблица 9 | ||||||
| Влияние Azotobacler chroococcum 5 V(c) на содержание в почве фосфора, калия, нитратного (N-NО3) и аммиачного (N-NH4) азота в фазе семи листьев кукурузы (вегетационный опыт) | ||||||
| № п/п | Вариант | Содержание, мг/кг почвы | ||||
| P2O5 | K2O | N-NO3 | N-NH4 | N-NO3 + N-NH4 | ||
| 1 | Контроль без удобрений | 1065 | 915 | 386 | 6,9 | 392,9 |
| 2 | Azotobacler chroococcum 5 V(e) | 1658 (+55,7%) |
920 (+0,6%) |
397 (+2,8%) |
7,1 (+2,9%) |
404,1 (+2,9%) |
| Примечание: (+55,7%) - % к контролю |
| Таблица 10 | |||
| Влияние Azotobacter chroococcum 5 V(e) на площадь листовой поверхности растений кукурузы | |||
| № п/п | Вариант | Площадь листовой поверхности одного растения, см2 | % к контролю |
| 1 | Контроль без удобрений | 1180 | - |
| 2 | Azotobacter chroococcum 5 V(e) | 1493 | +26,5 |
| Таблица 11 | |||
| Влияние Azotobacter chroococcum 5 V(e) на урожай зеленой массы кукурузы | |||
| № п/п | Вариант | Урожайность, г/сосуд | % к контролю |
| 1 | Контроль без удобрений | 200,0 | - |
| 2 | Azotobacter chroococcum 5 V(e) | 232,3 | +16,2 |
| Таблица 12 | |||||
| Влияние Azotobacter chroococcum 5 V(e) па структуру урожая кукурузы | |||||
| №п/п | Вариант | Вес зеленой массы кукурузы, г/сосуд | В том числе вес зерна, г/сосуд | ||
| вес стебля | вес листьев | вес початка | |||
| 1 | Контроль без удобрений | 118 | 29,0 | 53,0 | 6,8 |
| 2 | Azotobacter chroococcum 5V(e) | 127 (+7,6%) |
32,0 (+10,3%) |
72,6 (+37,0%) |
7,1 (+4,4%) |
| Примечание: (+7,6%) - % к контролю |
| Таблица 13 | |||
| Влияние Azotobacter chroococcum 5 V(e) на микробную биомассу в ризосфере кукурузы во время уборки | |||
| № п/п | Вариант | Cmic, мг/100 г·ч | % к контролю |
| 1 | Контроль без удобрений | 30,6 | - |
| 2 | Azotobacter chroococcum 5 V(e) | 56,8 | +85,6 |
Штамм бактерий Azotobacter chroococcum 5 V(e), депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП «ГосНИИГенетика» под № В-10387, используемый для получения азотфиксирующего удобрения для зерновых и кормовых культур.
