Вакцина для профилактики кокцидиоза (эймериоза) кур

Изобретение относится к области ветеринарной паразитологии и биотехнологии и касается вакцины для профилактики кокцидиоза. Представленная вакцина в качестве антигена содержит суспензию смеси спорулированных ооцист штаммов возбудителя кокцидиоза, депонированных в коллекции ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии -

штамма возбудителя кокцидиоза Eimeria acervulina Л-2-15 КЭ №2,

штамма возбудителя кокцидиоза Eimeria maxima Л-3-2 КЭ №3,

штамма возбудителя кокцидиоза Eimeria necatrix Л-4-18 КЭ №4,

штамма возбудителя кокцидиоза Eimeria tenella Л-1-23 КЭ №1,

взятых в соотношении 3000:500:1000:1000 спорулированных ооцист в одной иммунизирующей дозе, а в качестве консерванта - 1% водный раствор хлорамина. Представленное изобретение позволяет вырабатывать иммунитет у цыплят к эймериям четырех видов, а также имеет длительный срок годности. 4 табл., 4 пр.

 

Изобретение относится к ветеринарной паразитологии и биотехнологии, а именно к препаратам ветеринарного назначения для профилактики кокцидиоза (эймериоза) кур.

Вакцинация птиц против кокцидиоза является альтернативным способом профилактики данного паразитоза с использованием антикокцидийных препаратов (химических либо искусственных антибиотиков). Последний способ в настоящее время имеет наиболее широкое распространение в птицеводстве. Однако в связи с тем, что существующие тенденции к получению экологически безопасных продуктов питания предполагают постепенный отход от использования не только антибиотиков, но и химиопрепаратов в кормах для птицы, применение вакцин станет, возможно, основным способом профилактики кокцидиоза в птицеводстве.

Как известно, иммунитет при кокцидиозе вырабатывается только после того, как паразит пройдет определенный цикл развития в клетках слизистой оболочки кишечника цыплят и без повторных заражений длится непродолжительное время. Основной способ применения вакцин заключается в пероральном введении строго дозированных количеств экзогенных стадий развития паразита (ооцист), которые вызывают формирование иммунитета к кокцидиозу без клинического проявления болезни. При этом паразиты проходят полный цикл развития, а вакцинированные цыплята выделяют во внешнюю среду небольшое количество ооцист, которые при склевывании снова попадают в организм цыплят, что приводит к поддержанию иммунитета в стаде на достаточном уровне в течение всего периода выращивания птицы.

Известна промышленная вакцина против кокцидиоза, разработанная Edgar (США) и поступившая в продажу в 1952 году под названием «DM^® Cecal coccidiosis Vaccine», которая содержала живые ооцисты одного вида - Eimeria tenella. (1)

В настоящее время известны также два типа живых зарубежных вакцин - неаттенуированные (Coccivac^®, Immucox^®, Nobilis^®COX ATM, VAC M^®) и аттенуированные (Paracox^®, Livacox^®) (2). Все вакцины содержат живые экзогенные стадии паразитов (ооцисты) в определенных количествах. Существует также субъединичная вакцина Coxabic^®.

Однако, данные препараты не всегда эффективны при применении в отечественных птицехозяйствах.

Известна культура кокцидий для иммунохимиопрофилактики эймериозов цыплят, являющаяся прототипом заявленного изобретения и содержащая оттитрованные иммуногенные дозы ооцист эймерий нескольких видов, которую используют с одновременным применением в течение 20 дней антикокцидийного препарата. (3, 4).

Данная культура кокцидий вводится вместе с кормом и позволяет создать у птицы иммунитет к эймериям трех видов (Eimeria tenella, Eimeria acervulina, Eimeria maxima).

У птицы формируется напряженный иммунитет, увеличивается сохранность поголовья, выход деловой молодки и среднесуточный прирост, снижаются затраты на корма.

Однако в данном случае иммунитет формируется только против трех видов эймерий, включенных в культуру, и, если в хозяйстве распространен другой патогенный вид, то он неизбежно вызовет вспышку болезни, так как иммунитет к эймериям неспецифичен. Заметим также, что в настоящее время в птицехозяйствах РФ получил широкое распространение штамм Eimeria necatrix.

Известный препарат также имеет короткий срок годности (3 месяца), ограничение при применении - только с кормом, в качестве консерванта содержит формальдегид. Все это снижает эффективность профилактики кокцидиоза в современных условиях.

Задачей, решаемой в рамках заявленного изобретения, является создание вакцины для иммунопрофилактики кокцидиоза (эймериоза) кур с высокими иммуногенными свойствами, экологичной и экономичной, с увеличенным сроком годности, более технологичной в использовании.

Поставленная задача решена путем создания вакцины, содержащей в качестве антигена суспензию смеси спорулированных ооцист штаммов возбудителя кокцидиоза, депонированных в коллекции ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии -

штамма возбудителя кокцидиоза Eimeria acervulina Л-2-15 КЭ №2,

штамма возбудителя кокцидиоза Eimeria maxima Л-3-2 КЭ №3,

штамма возбудителя кокцидиоза Eimeria necatrix Л-4-18 КЭ №4,

штамма возбудителя кокцидиоза Eimeria tenella Л-1-23 КЭ №1 в соотношении 3000:500:1000:1000 спорулированных ооцист в одной иммунизирующей дозе, а в качестве консерванта - 1% водный раствор хлорамина.

Высокие иммуногенные свойства заявляемой вакцины обусловлены как высокими иммуногенными свойствами используемых штаммов, так и расширением видового состава кокцидий, содержащихся в ней.

Для иммунизации птицы используются специально подобранные штаммы кокцидий, обладающие слабой вирулентностью и высокой иммуногенностью, в дозах, не вызывающих клинического переболевания кокцидиозом. Такими свойствами и обладают указанные выше штаммы.

Увеличение срока годности вакцины до 6 месяцев достигается за счет использования хлорамина или экоцида в указанной концентрации.

Применение для профилактики кокцидиозов (эймериозов) кур заявленной вакцины приводит к отказу от использования антикокцидийных препаратов после иммунизации поголовья, что, в свою очередь, положительно сказывается на экологической безопасности продуктов питания.

Заявляемая вакцина более технологична и удобна в использовании, поскольку ее можно применять не только с кормом, но и способом выпаивания, что также способствует равномерной выработке иммунитета у всего поголовья.

Заявленную вакцину изготавливают из производственных штаммов четырех видов кокцидий, депонированных в коллекции ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии -

штамма возбудителя кокцидиоза Eimeria acervulina Л-2-15 КЭ №2,

штамма возбудителя кокцидиоза Eimeria maxima Л-3-2 КЭ №3,

штамма возбудителя кокцидиоза Eimeria necatrix Л-4-18 КЭ №4,

штамма возбудителя кокцидиоза Eimeria tenella Л-1-23 КЭ №1, которые размножают на 14-дневных цыплятах, свободных от эймерий.

По внешнему виду вакцина представляет собой гомогенную взвесь серовато-оранжевого цвета. При хранении выпадает в осадок, легко разбивающийся при встряхивании в гомогенную взвесь.

Штаммы поддерживаются путем пассирования на 14-дневных цыплятах, свободных от кокцидий, не реже одного раза в 6 месяцев.

Характеристика производственного штамма Л-2-15 Eimeria acervulina КЭ №2.

Систематическое положение. Штамм Л-2-15 Е. acervulina КЭ №2 относится к роду Eimeria, семейству Eimeriidae, отряду Coccidiida.

Морфологическая характеристика. Ооцисты овоидной формы, длиной 14,0-23,0 мкм, шириной 13,0-18,0 мкм (средняя 18,7-14,6 мкм).

Биологические свойства. Препатентный период развития паразита составляет 96 часов. Место эндогенного развития паразита в кишечнике инвазированных цыплят - 12-перстная кишка и верхняя треть тонкого кишечника.

Клинические и патологоанатомические признаки. Характерны для данного вида.

Вирулентные свойства. При заражении 15-дневных цыплят ооцистами, хранившимися не более 2-х месяцев, в дозе 6 млн. ооцист на голову летальность составляет не менее 30%.

Иммуногенные свойства. Заражение цыплят ооцистами вызывает формирование специфического иммунитета (гуморального и клеточного).

Культурально-биохимические свойства. Штамм Л-2-15 Е. acervulina КЭ №2 не культивируется на питательных средах. Поддерживается путем пассирования на цыплятах, вызывая через 72 часа характерные поражения в кишечнике с выделением ооцист, начиная с 96-го часа после заражения.

Штамм чувствителен к антикокцидийным препаратам - ампролиуму, никарбазину, фармкокциду, химкокциду, клинакоксу, ко всем ионофорным антибиотикам.

Специфичность. Штамм Л-2-15 Е. Acervulina КЭ № 2 специфичен только для кур (5).

Характеристика штамма Л-2-3 Eimeria maxima ( возбудителя кокцидиоза) КЭ №3

Систематическое положение. Штамм Л-3-2 Е. maxima относится к роду Eimeria, семейству Eimeriidae, отряду Coccidiida.

Морфологическая характеристика. Ооцисты овоидной формы, длиной 26,0-36,0 мкм, шириной 18,0-27,0 мкм (средняя - 30,0-22,0 мкм).

Биологические свойства. Препатентный период развития паразита составляет 126 часов. Место эндогенного развития паразита в кишечнике инвазированных цыплят - весь тонкий кишечник.

Клинические и патологоанатомические признаки. Характерные для данного вида.

Вирулентные свойства. При заражении 15-дневных цыплят ооцистами, хранившимися не более 2-х месяцев, в дозе 3 млн. ооцист на голову летальность составляет не менее 30%.

Иммуногенные свойства. Заражение цыплят ооцистами вызывает формирование специфического иммунитета (гуморального и клеточного).

Культурально-биохимические свойства. Штамм не культивируется на питательных средах. Поддерживается путем пассирования на цыплятах, вызывая через 96 часа характерные поражения в кишечнике с выделением ооцист, начиная с 126-го часа после заражения.

Штамм чувствителен к антикокцидийным препаратам - ампролиуму, никарбазину, фармкокциду, химкокциду, клинакоксу, ко всем ионофорным антибиотикам.

Специфичность. Штамм Л-3-2 Е. maxima специфичен только для кур (6).

Характеристика производственного штамма Л-4-18 Eimeria necatrix КЭ №4

Систематическое положение. Штамм Л-4-18 E.necatrix относится к роду Eimeria, семейству Eimeriidae, отряду Coccidiida.

Морфологическая характеристика. Имеет удлиненно-овальные ооцисты длиной 17-26 мкм, шириной 15-20 мкм (средняя - 21,5-17,5 мкм).

Биологические свойства. Препатентный период развития паразита составляет 128 часов. Место эндогенного развития в кишечнике инвазированных цыплят - средний отдел тонкого кишечника, ооцисты развиваются в слизистой слепых отростков.

Вирулентные свойства. При заражении 15-дневных цыплят ооцистами, хранившимися не более 2-х месяцев, в дозе 900000 ооцист на голову летальность составляет не менее 30%.

Иммуногенные свойства. Заражение цыплят ооцистами вызывает формирование специфического иммунитета (гуморального и клеточного).

Культурально-биохимические свойства. Штамм Л-4-18 E.necatrix не культивируется на питательных средах. Поддерживается путем пассирования на цыплятах, вызывая через 96 часов характерные поражения в кишечнике с выделением ооцист, начиная с 128 часа после заражения.

Штамм чувствителен к антикокцидийным препаратам - ампролиуму, никарбазину, фармкокциду, химкокциду, клинакоксу, ко всем ионофорным антибиотикам.

Специфичность. Штамм Л-4-18 E.necatrix специфичен только для кур (7).

Характеристика производственного штамма Л-1-23 Eimeria tenella КЭ №1

Систематическое положение. Штамм Л-1-23 Е. tenella относится к роду Eimeria, семейству Eimeriidae, отряду Coccidiida.

Морфологическая характеристика. Имеет широкоовальные ооцисты длиной 19,0-26,0 мкм, шириной 16,0-22,0 мкм (средняя 22,6-18,8 мкм). Шизонты 2-й генерации имеет размеры.

Биологические свойства. Препатентный период развития паразита составляет 130 часов. Место эндогенного развития паразита в кишечнике инвазированных цыплят - слепые отростки.

Вирулентные свойства. При заражении 15-дневных цыплят ооцистами, хранившимися не более 2-х месяцев, в дозе 800000 ооцист на голову летальность составляет 50% (ЛД₅₀).

Иммуногенные свойства. Заражение цыплят ооцистами вызывает формирование специфического иммунитета (гуморального и клеточного).

Культурально-биохимические свойства. Штамм Л-1-23 Е. tenella не культивируется на питательных средах. Поддерживается путем пассирования на цыплятах, вызывая через 72-96 часов характерные поражения в кишечнике с выделением ооцист, начиная с 130-го часа после заражения.

Штамм чувствителен к антикокцидийным препаратам - ампролиуму, никарбазину, фармкокциду, химкокциду, клинакоксу, ко всем ионофорным антибиотикам.

Специфичность. Штамм Л-1-23 Е. tenella специфичен только для кур. Паразит может проходить полный цикл развития также в куриных эмбрионах (8).

Все штаммы чувствительны к ампролиуму, клинакоксу, никарбазину и ионфорным антибиотикам.

Пассирование штаммов.

Цыплят заражают в зоб с помощью шприца и полиэтиленовой канюли спорулированными ооцистами кокцидий в дозе: Eimeria acervulina - 50 тыс., Е. maxima - 20 тыс., Е. necatrix - 40 тыс., Е. tenella - 2-3 тыс. на голову. Объем инокулята - не более см³. Пассажи каждого вида коцидий проводят отдельно.

На третьи сутки после заражения проводят исследование фекальных масс цыплят на наличие ооцист кокцидий с целью исключения спонтанного заражения кокцидиями в соответствии с ГОСТ 25383-82.

Помет для получения ооцист для цыплят, зараженных Eimeria acervulina, собирают с 5 по 8 сутки после заражения, Е. maxima с 6 по 9 сутки, Е. necatrix - с 6 по 9 сутки, Е. tenella - с 6 по 10 сутки. Для предотвращения высыхания помета в период сбора на поддоны стелят двойной слой фильтровальной бумаги, обильно смачиваемой 2% раствором двухромовокислого калия.

Получение и очистку кокцидий из помета проводят, используя принцип флотации ооцист в насыщенном растворе поваренной соли. Гомогенизированный помет, смешанный с водой, фильтруют через сито, полученный фильтрат осаждают в центрифуге с объемом стаканов 500 см³ и более в течение 5 минут при 3000 об/мин.

Надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют насыщенный раствор поваренной соли, тщательно размешивают и центрифугируют в течение 10 минут при 100 об/мин. Всплывшие ооцисты собирают перистальтическим насосом в сосуд с водой, следя, чтобы соотношение насыщенного раствора поваренной соли с ооцистами и воды было 1:10 (плотность по денсиметру 1,010-1,020). С целью максимального получения ооцист осадок центрифугируют трижды. Затем собранные ооцисты осаждают из воды в центрифуге в течение 5 минут при 3000 об/мин.

Споруляцию ооцист проводят в 2% растворе двухромовокислого калия при обильном доступе воздуха (использованием микрокомпрессора МК-Л2).

При температурном режиме 26±2°С в течение 3-5 суток. Процент споруляции ооцист определяют под микроскопом при среднем увеличении.

Хранят спорулированные ооцисты в промежутках между пассажами в 1% растворе хлорамина в конических колбах, заполненных не более, чем на 1/3 объема под ватно-марлевыми пробками или бумажными колпачками в холодильнике при температуре 4±2°С.

Для проведения контроля производственных штаммов кокцидий необходимо через 10-15 пассажей исследовать указанные ранее свойства этих штаммов (размеры ооцист, препатентный период, чувствительность к кокцидиостатикам).

Измерение длины и ширины ооцист проводят с помощью микроскопа с окулярным микрометром марки МБИ - 3, об.х 90, ок.х 10. Измеряют по 100 спорулированных ооцист каждого штамма, вычисляют средние размеры. Эти биометрические показатели не должны существенно отличаться от указанных выше.

Препатентный период (время от момента заражения до появления первых ооцист в помете зараженных цыплят) устанавливают, исследуя помет цыплят, зараженных Eimeria acervulina - начиная с 4 суток, Е. maxima, Е. necatrix, Е. tenella - начиная с 5 суток после заражения. Колебания продолжительности препатентного периода должны составлять не более ±5 часов.

Для определения чувствительности штаммов кокцидий к антикокцидийным препаратам двухнедельных цыплят, разделенных на группы по 10 голов, заражают коцидиями в дозе, вызывающей гибель не менее 50% цыплят и в течение 10 суток дают с кормом антикокцидийные препараты в профилактической дозе, начиная применять за день до заражения. Учет ведут по проявлению клинических признаков, летальности от кокцидиозов и по приросту массы тела в подопытных и контрольной (без применения препарата) группах.

Производство вакцины включает следующие этапы:

- выращивание цыплят, свободных от кокцидий;

- получение ооцист кокцидий;

- составление производственной серии вакцины;

- контроль вакцины.

1. Выращивание цыплят, свободных от кокцидий.

Цыплят, предназначенных для заражения производственными штаммами кокцидий и для контроля качества вакцины, получают в суточном возрасте из хозяйства, благополучного по инфекционным заболеваниям.

Содержат цыплят в изолированных условиях, исключающих спонтанное заражение кокцидиями и возбудителями инфекционных заболеваний. Для этого их выращивают в отдельном боксе в металлических клетках, которые обжигают паяльной лампой перед посадкой птицы. При кормлении используют комбикорм, прогретый в течение 30 минут при 70-80°С, поение проводят прокипяченной и охлажденной водой. Уход за этой птицей осуществляет лицо, не имеющее контактов с другой птицей и не участвующее в работах, связанных с производством вакцины в период от начала подготовки помещения до передачи выращенной птицы. Перед заражением птицы производственными штаммами или началом контроля вакцины проводят исследование помета цыплят на наличие ооцист с целью исключения спонтанного заражения кокцидиями в соответствии с ГОСТ 25383-82. В дальнейшем в работе используют только неинвазированную птицу.

2. Получение ооцист.

Заражение цыплят, сбор от них помета, выделение и споруляцию ооцист кокцидий проводят по описанной выше методике. Размножение ооцист каждого вида кокцидий проводят отдельно.

3. Составление производственной серии вакцины.

Материалом для составления производственной серии вакцины служат ооцисты разных видов кокцидий. Одна иммунизирующая доза содержит: Eimeria acervulina - 3 тыс., E.maxima - 0,5 тыс., E.necatrix - 1,0 тыс., E.tenella - 1,0 тыс. спорулированных ооцист.

Подсчет количества ооцист каждого вида проводят отдельно. Перед подсчетом колбу с суспензией ооцист помещают на магнитную мешалку на 10 минут.

Ооцисты считают в камере Горяева (не менее 3 камер), выводя среднее арифметическое, которое умножают на коэффициент 1111. Полученное число показывает количество ооцист в 1 мл суспензии. Зная общий объем суспензии, рассчитывают количество доз каждого вида.

Для составления определенного количества доз вакцины рассчитывают необходимый объем каждого вида кокцидий, сливают в единую емкость и осаждают на центрифуге при 3000 об/мин в течение 10 минут в профламбированных центрифужных стаканах. Надосадочную жидкость выливают, а осадки ресуспендируют в 1% растворе хлорамина и сливают в стерильную емкость, доводят до необходимого объема 1% раствором хлорамина. Содержимое тщательно перемешивают и разливают в стерильные мерные колбы.

Вакцину при постоянном перемешивании на магнитной мешалке разливают в стерильные стеклянные флаконы по 5 и 10 тыс. доз, заполняя не более 2/3 объема. Флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками, обеспечивая герметичность. На флаконы с вакциной наклеивают этикетки с указанием наименования организации-производителя и ее товарного знака, наименования препарата, видового состава вакцины, номера серии и контроля, даты изготовления (число, месяц, год), количество доз во флаконе и объем (см³), обозначения СТО, условий хранения.

3.1. Контроль вакцины.

Каждая серия вакцины должна быть принята (проверена) государственным контролером предприятия-изготовителя.

Серией вакцины считают смесь ооцист кокцидий, полученную в процессе одновременного изготовления в одних и тех же производственных условиях, объединенную в одной емкости, расфасованную в стеклянные флаконы, получившую свой номер, номер госконтроля и оформленную одним документом о качестве установленной формы. Для проверки качества вакцины госконтролер делает из разных мест серии выборку в зависимости от объема серии:

от серии до 1500 флаконов - 2% всех флаконов;

от серии 1500-3000 флаконов - 1% всех флаконов;

от серии свыше 3000 флаконов - 0,5% всех флаконов.

После проверки качества расфасовки, упаковки и маркировки отобранные флаконы с препаратом сдают на склад, отобранные флаконы хранят в архиве госконтролера в течение 9 месяцев.

Направляемые в архив госконтролера флаконы с вакциной опечатывают и снабжают документом установленной формы с указанием: наименования препарата, даты изготовления (число, месяц, год), номера серии, номера госконтроля, даты отбора пробы, общего количества единиц упаковки, объема серии, должности и подписи лица, отобравшего пробу, обозначения СТО.

Для определения цвета, наличия посторонней примеси, плесени, неразбившегося осадка, каждый флакон с вакциной тщательно встряхивают и просматривают в проходящем свете, одновременно флаконы проверяют на прочность упаковки и правильность этикетировки. Препарат должен иметь вид гомогенной взвеси серовато-оранжевого цвета, без наличия плесени и не разбивающихся комочков.

3.2. Определение безвредности

Оборудование и материалы

При проведении исследований применяют:

- магнитная мешалка

- стаканы стеклянные объемом 100 см³ по ГОСТ 25336

- шприцы инъекционные типа «Рекорд» вместимостью 1-5 см³ по ГОСТ 18137

- цыплята 5-суточного возраста.

Проведение испытания

Испытание проводят на 5-суточных цыплятах, свободных от кокцидий. Отсутствие ооцист в фекальных массах определяют по ГОСТ 25383.

Цыплят 5-суточного возраста делят на две группы по 10 голов (опытная и контрольная) и взвешивают. Птицам опытной группы вводят в зоб по 5 доз вакцины и переводят на напольное содержание. Цыплят контрольной группы содержат внутриклеточно и в корм вводят кокцидиостатик в профилактической дозе.

Вакцина считается безвредной, если вакцинированные цыплята в течение 10 суток не проявят клинических признаков кокцидиоза, вирусных и бактериальных инфекций. Прирост массы тела у них не должен существенно отличаться от такового цыплят контрольной группы. Допустимо наличие в фекальных массах на 5-7 сутки следов крови.

В случае гибели от кокцидиоза среди вакцинированных цыплят двух голов или проявления клинических признаков заболевания вирусной или бактериальной этиологии опыт повторяют на удвоенном количестве цыплят.

3.3. Определение жизнеспособности

Оборудование и материалы

При проведении исследований применяют:

- микроскоп световой биологический

- центрифуга до 3 тыс. оборотов в минуту

- бактериологические петли

- камера Горяева

- стекла предметные по ГОСТ 9284

- стекла покровные ГОСТ 6672

- магнитная мешалка

- гомогенизатор.

Проведение испытания

Десяти цыплятам 5-суточного возраста вводят в зоб по одной дозе вакцины и переводят на напольное содержание. На шестые сутки от цыплят собирают помет и из него отбирают усредненную пробу 100 г. Пробу помета промывают одним литром водопроводной воды через металлическое сито с диаметром ячеек 0,05 см. Фильтрат центрифугируют при 3 тыс.об/мин 5 минут. Осадки объединяют, добавляют 200 мл насыщенного раствора поваренной соли, гомогенизируют и центрифугируют при 1 тыс.об/мин - 10 мин. Перистальтическим насосом снимают верхний слой супернатанта 10-15 мл. Осадок ресуспендируют, центрифугируют и снимают верхний слой. Процесс снятия ооцист повторяют три раза. Измеряют объем снятой жидкости и разводят водопроводной водой 1:10 (если подсчет ооцист в камере Горяева будет затруднен, то разведение увеличивают). Разведенные ооцисты размешивают на магнитной мешалке не менее 10 минут, заправляют 2-3 камеры Горяева и ведут подсчет ооцист во всех 225 квадратах камеры. При подсчете ооцисты разделяют по размеру на три категории - мелкие, средние, крупные. Из полученных результатов выводят среднее значение по категориям ооцист и по формуле определяют их количество в 1 г помета:

х=а*b*1111*v: m, где

x - количество ооцист в 1 г помета

а - среднее количество ооцист в камере Горяева

b - коэффициент разведения

1111 - коэффициент перерасчета количества ооцист в 1 мл

V - объем в мл, полученный в результате разведения

m - навеска помета.

Ооцисты считаются жизнеспособными, если их общее количество в 1 г помета будет не менее 800 тысяч при наличии мелких ооцист - 60-70%, средних - 25-35%, крупных - 5% от общего количества.

При существенных количественных колебаниях по категориям ооцист окончательное решение принимается по результатам проверки иммуногенности вакцины.

Определение иммуногенной активности.

Оборудование и материалы

Для проведения испытания применяют оборудование и материалы, указанные в п.3.3.

Проведение испытания

Испытание проводят на 5-суточных цыплятах, свободных от кокцидий. Отсутствие ооцист в фекальных массах определяют по ГОСТ 25383.

Цыплят 5-дневного возраста делят на две группы (опытная и контрольная) по принципу аналогов по 10 голов в группе. Птицам опытной группы вводят в зоб по одной дозе вакцины и переводят на напольное содержание. Цыплят контрольной группы содержат в клетке, и они получают кокцидиостатик в профилактической дозе. Через 20 дней птицам обеих групп вводят по 150 иммунизирующих доз вакцины, исключив из корма цыплят контрольной группы кокцидиостатик за три дня до заражения. Наблюдение ведут в течение 10 дней.

Вакцина считается иммуногенной, если среди цыплят опытной группы отсутствует летальность от кокцидиоза (допускается незначительное наличие крови в помете) при летальности от кокцидиоза не менее 20% среди цыплят контрольной неиммунной группы.

В случае гибели птиц от кокцидиоза в опытной группе опыт повторяют на удвоенном количестве образцов вакцины.

При получении повторных отрицательных результатов серию вакцины выбраковывают.

3.5. Определение стерильности

Определение стерильности проводят в соответствии с (9).

Вакцина должна быть стерильной в отношении бактериальной и грибковой флоры.

4. Условия хранения и срок годности вакцины.

4.1. Вакцину хранят в защищенном от света месте при температуре +2-6°С.

4.2. Срок годности вакцины 6 месяцев со дня изготовления.

Сущность и практическая применимость заявленного изобретения иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Результаты изучения эффективности четырехвидовой вакцины в экспериментальных условиях

В Таблице 1 приведены данные, полученные в эксперименте на цыплятах, которым в 5-дневном возрасте ввели 4-видовую вакцину, а через 20 дней провели контрольное заражение живыми ооцистами 4 видов кокцидий в дозе ЛД₅₀. Контролем служили цыплята невакцинированные зараженные в возрасте 25 дней живыми ооцистами 4 видов кокцидий в дозе ЛД₅₀, а также невакцинированные незараженные (так называемый «чистый» контроль).

Таблица 1.
Результаты изучения эффективности четырехвидовой вакцины в экспериментальных условиях
Назначение групп	Количество голов в группе	Вакцинация в 5-дневном возрасте	Контрольное заражение в 25-дневном возрасте	Процент гибели цыплят от кокцидиоза	Процент выживших цыплят
Опытная вакцинированная	10	+	+	0	100
Контрольная невакцинированная зараженная	10	-	+	50	50
Контрольная невакцинированная незараженная	10	-	-	0	100

Полученные результаты показали, что 4-видовая вакцина защищает 100% цыплят от заражения кокцидиозом, при этом из невакцинированных выжило только 50% цыплят. Таким образом, установлено, что 4-видовая вакцина иммуногенна и может, наряду с КК, применяться для специфической профилактики кокцидиоза.

Пример 2. С целью увеличения срока годности 4-видовой вакцины против кокцидиоза для замены формальдегида, используемого в качестве консерванта (дезинфектанта) при изготовлении КК, в лабораторных опытах изучили активность хлорамина и экоцида (виркона).

Таблица 2.
Влияние различных консервантов (дезинфектантов) на сроки хранения 4-видовой вакцины
№№ п/п	Назначение групп	Дезинфектант	Срок хранения, месяцы	Количество голов	Результат контрольного заражениия
Пало (голов)	Процент выживаемости
1	Опытная	Формалин 2%	3	10	0	100
2	Опытная	Формалин 2%	5	10	1	90
3	Опытная	Формалин 2%	6	10	2	80
4	Опытная	Хлорамин 1%	3	10	0	100
5	Опытная	Хлорамин 1%	5	10	0	100
6	Опытная	Хлорамин 1%	6	10	0	100
7	Опытная	Экоцид 2%	3	10	0	100
8	Опытная	Экоцид 2%	5	10	0	100
9	Опытная	Экоцид 2%	6	10	0	100
10	Опытная	-	-	10	0	100
11	Контроль зараженный	-	-	10	4	60
12	Контроль незараженный	-	-	10	0	100

Полученные в результате проведенного опыта данные показывают, что в группах цыплят, которых вакцинировали ооцистами, обработанными хлорамином и экоцидом (№№4, 5, 6 и 7, 8, 9 соответственно) выживаемость птиц после контрольного заражения через 5 и 6 месяцев хранения составила 100%, в то время как в группах, обработанных формалином (№№1, 2, 3) выжило 90 и 80% соответственно. Таким образом, замена дезинфектанта в вакцине на хлорамин или экоцид позволяет увеличить срок ее годности до 6 месяцев.

Пример 3. В Таблице 3 приведены данные, полученные в эксперименте на цыплятах, которым применили 4-видовую вакцину с кормом и методом выпаивания.

Таблица 3.
Влияние способа применения вакцины на ее эффективность
Назначение групп	Вакцинация в 5-дневном возрасте	Контрольное заражение в 50-дневном возрасте	Процент гибели цыплят от кокцидиоза	Процент выживаемости
Опытная (с кормом)	+	+	-	100
Опытная (выпаивание)	+	+	-	100
Контрольная (невакцинированная)	-	+	50	50
Контрольная (незараженная)	-	-	-	100

Показано, что вакцинация цыплят против кокцидиоза методом выпаивания так же эффективна, как и применение вакцины с кормом. При этом метод выпаивания менее трудоемок и позволяет добиться более равномерной выработки иммунитета у всего поголовья.

Пример. В Таблице 4 приведены данные по иммунизации цыплят различными дозами вакцины.

Таблица 4.
Результаты иммунизации цыплят различными дозами вакцины.
№ гр.	Иммунизирующая доза	Возраст в день иммуниз. 1-й иммуниз.	Кол-во голов	Доза КЗ	Результаты контрольного заражения
	Пало				Результаты наблюдений и патологоанатомического вскрытия
1 иммуниз.	2 иммуниз.
1	0,5 ИД	0,5ИД	5	10	150 ИД	0	На 5 спз цыплята слегка угнетены, помет жидкий, с кровянистыми прожилками
2	1,0 ИД	1,0 ИД	5	10	150 ИД	0	Все цыплята здоровы в течение 10 дней после КЗ, помет нормальный
3	1,5 ИД	1,5 ИД	5	10	150 ИД	0	Все цыплята здоровы в течение 10 дней после КЗ, помет нормальный
4	Нет	Нет	Нет	10	150 ИД	4	Сильное угнетение, отказ от корма, жидкий пенистый помет с прожилками и кусочками слизистой, при вскрытии павших цыплят обнаружены геморрагические поражения среднего отдела тонкого кишечника и слепых отростков, характерные для кокцидиоза

Содержание цыплят - клеточное, первая иммунизация - в 5-дневном возрасте, вторая - через 7 дней после первой.

Одна иммунизирующая доза (ИД) содержит: E.acervulina - 3000, E.maxima - 500, E.necatrix - 1000, E.tenella - 1000 спорулированных ооцист.

Контрольное заражение (КЗ) проводили через 14 дней после второй иммунизации в дозе 150 ИД.

Цыплята 4 (контрольной) группы до КЗ содержались в условиях, исключающих их спонтанное заражение кокцидиями. Наблюдение за цыплятами всех групп вели в течение 10 дней после КЗ.

Таким образом, заявленная вакцина для иммунопрофилактики кокцидиоза (эймериоза) кур обладает высокими иммуногенными свойствами, увеличенным сроком годности, экологична и экономична, более технологична в использовании.

Источники информации

1. Edgar S.A. Coccidiosis of chickens and turkeys and control by immunization. Proc. 11 th World Poultry Congress. Mexico City, 1958.

2. Williams R.B. Progress towards anticoccidial vaccines for broiler chickens / Shering-Plough Animal Health, 2000.

3. Immunoprophylaxis of coccidiosis in birds. Symposia biologica hungarica, 33, 1986.

4. Ананьева Н.Б., А.И.Кириллов, Крылова Н.П. Иммунохимиопрофилактика эймериозов цыплят. Ветеринария, №6, 1987.

5. RU, заявка №2009129306/15 A, C12N 1/20, A61K 39/012.

6. RU, заявка №2009129341/15 А, C12N 1/20, A61K 39/012.

7. RU, заявка №2009129305/15 А, C12N 1/20, A61K 39/012.

8. RU, патент №2312890.

9. ГОСТ 28085-89. Препараты биологические. Метод бактериологического контроля стерильности. Москва, Стандартинформ, 2007.

Вакцина для профилактики кокцидиоза (эймериоза) кур, содержащая суспензию смеси ооцист кокцидий и консервант, отличающаяся тем, что в качестве антигена содержит суспензию смеси спорулированных ооцист штаммов возбудителя кокцидиоза, депонированных в коллекции ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии -
штамма возбудителя кокцидиоза Eimeria acervulina Л-2-15 КЭ №2,
штамма возбудителя кокцидиоза Eimeria maxima Л-3-2 КЭ №3,
штамма возбудителя кокцидиоза Eimeria necatrix Л-4-18 КЭ №4,
штамма возбудителя кокцидиоза Eimeria tenella Л-1-23 КЭ №1 в соотношении 3000:500:1000:1000 спорулированных ооцист в одной иммунизирующей дозе, а в качестве консерванта 1%-ный водный раствор хлорамина.