Способ выявления яиц гельминтов, клещей и ооцист простейших в пробах почвы
Владельцы патента RU 2466388:
Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана" (RU)
Изобретение относится к области медицины, ветеринарии, экологии. Способ выявления яиц гельминтов, клещей и ооцист простейших в пробах почвы заключается в том, что пробу почвы весом 25 г помещают в центрифужную пробирку вместимостью 250 мл и заливают 150 мл воды, смесь тщательно размешивают стеклянной палочкой в течение 5 мин или с помощью электромешалки 1 мин и центрифугируют в течение 3 мин при 800-1000 об/мин, воду сливают, а в пробирки добавляют 150 мл трехкомпонентной флотационной системы, состоящей из насыщенных растворов цинка хлорида (2 кг ZnCl2 на 1 л), натрия хлорида (0,42 кг NaCl на 1 л) и глицерина, взятых в соотношении 1:1:1, в пробирку доливают тот же раствор до образования выпуклого мениска, пробирку накрывают обезжиренным стеклом так, чтобы оно касалось слоя жидкости, через 20-30 мин стекло снимают и микроскопируют, снятие препарата рекомендуется повторить 2-3 раза. Способ позволяет значительно повысить процент выявляемых в почве яиц таких геогельминтов, как человеческая и свиная аскарида, а также токсокара, приблизительно в 4-5 раз. Выявляемость ооцист простейших и яиц клещей повышается на 76,6 и 87,1% соответственно. Способ позволяет вдвое сократить время ожидания при проведении анализа. 4 табл., 3 ил., 2 пр.
Данное изобретение относится к области медицины, ветеринарии, экологии. Может быть использовано для выявления яиц гельминтов, клещей и ооцист в пробах почвы.
Наиболее актуальна оценка загрязненности почвы яйцами часто встречающихся в песке, в частности на детских площадках и в песочницах - Toxocara canis, Toxocara cati и Ascaris lumbricoides. На выгульных птичьих дворах из простейших часто встречаются эймерии (Eimeria tenella, E. maxima, Е. acervulina), а из клещей - Knemidocoptes mutans.
Наиболее часто используемым методом исследования почвы с целью выявления яиц гельминтов является комбинированный метод Романенко Н. А., где в качестве флотационной жидкости используется насыщенный раствор нитрата натрия (МУК 4. 2. 796 - 99. «Методы санитарно-паразитологических исследований»).
Почву для исследования отбирают на индивидуальных и общественных огородах, полях орошения, территории усадеб, детских учреждений, рынков, мест игр детей, животноводческих ферм, в местах проживания владельцев скота и т.д. Исследуют также активный ил и осадок на очистных сооружениях, донные осадки в местах впадения сточных вод или других стоков в водоемы. После обследования участка намечают места для отбора проб, где можно ожидать наличие яиц гельминтов.
Пробы почвы отбирают с поверхности и на глубине 10-20 см, а с иловых площадок, компостов - на глубине до 1-2 м.
На однотипном участке («точка обследования») почву собирают в 5-10 различных местах по 10-20 г, объединяя пробы в одну общей массой не менее 100-200 г. На территории одного объекта (усадьба, детский сад и т.д.) отбирают 10 проб.
Пробу помещают в плотно закрытую стеклянную посуду или полиэтиленовый пакет. Внутрь вкладывают этикетку с указанием места и условий отбора пробы.
Пробы, доставленные в лабораторию, желательно исследовать немедленно, так как яйца ряда гельминтов или личинки могут погибнуть и разрушиться. Хранить пробы рекомендуется в холодильнике (5°С) не более месяца.
Для исследования по методу Н.А.Романенко из общей пробы отбирают 25 г почвы, помещают в центрифужную пробирку вместимостью 250 мл и заливают 150 мл воды. Смесь тщательно размешивают стеклянной палочкой в течение 5 мин или с помощью электромешалки 1 мин.
Всплывшие крупные частицы сразу же удаляют. После центрифугирования (для этой цели пригодна центрифуга марки ЦЛС-3) в течение 3 мин при 800-1000 об/мин воду сливают, а в пробирки добавляют 150 мл насыщенного раствора нитрата натрия. Перемешивают палочкой и вновь центрифугируют 3 мин.
Пробирки устанавливают в штатив, доливают тем же раствором до образования выпуклого мениска, накрывают обезжиренным стеклом (размер 6×12 см) так, чтобы оно касалось слоя жидкости. Через 15 мин стекло снимают, на влажную поверхность добавляют несколько капель 50% водного раствора глицерина и микроскопируют. С целью повышения эффективности выявления яиц рекомендуется снятие препарата повторить 2-3 раза. В очагах тениидозов и эхинококкоза обнаружение яиц затруднено тем, что они обладают определенной липкостью и, склеиваясь с частицами почвы, плохо всплывают во флотационном растворе.
Основным недостатком данного метода является низкая удельная плотность флотационного раствора. Кроме того, насыщенный раствор нитрата натрия, а также альтернативные растворы, предлагаемые в литературе (тиосульфата натрия и натриевой селитры), очень быстро кристаллизуются, что затрудняет просмотр проб и снижает выявление яиц гельминтов.
Целью работы являлось улучшение выявления яиц гельминтов, клещей и ооцист простейших в пробах почвы, осуществление количественной оценки степени загрязненности почвы.
Нами при использовании разработанной методики был проведен сравнительный анализ методов исследования почвы: Романенко и разработанного метода выявления яиц гельминтов, клещей и ооцист простейших.
В пробу песка искусственно вносились яйца гельминтов Ascaris suum, Toxocara canis и Ascaris lumbricoides, простейших Eimeria tenella, E. maxima, E. acervulina, клещей Knemidocoptes mutans в количестве 100 яиц или ооцист на г песка. Яйца были получены из матки самок гельминтов. Простейших получали из помета спонтанно инвазированных кур. Knemidocoptes mutans получали из соскобов с пораженных конечностей больных птиц.
Эффективность выявления яиц в почве статистически достоверно отличается при оценке по критерию Стьюдента на уровне значимости 0,95 (Савилов E.Д., Мамонова Л.М., Астафьев В.А., Жданова С.Н., 2004).
По результатам сравнительного анализа были получены следующие результаты.
Разработанный нами метод позволил дополнительно выявить на 36% яиц аскарид больше, по сравнению с методом Романенко Н.А., что обусловлено использованием флотации в многокомпонентной флотационной системе, использование которой было положено в основу данного метода. Компоненты предлагаемой нами флотационной системы не нарушают морфологию яиц паразитов и не создают затруднений с морфологической идентификацией возбудителя. Каждый из них выполняет определенную функцию: хлористый цинк повышает плотность раствора, глицерин снижает время кристаллизации, увеличивая качество исследования, хлорид цинка снижает себестоимость анализа. Как правило, применение такого рода смесей позволяет повысить выявление яиц, ооцист и цист простейших, но требуется проведение оптимизации состава смеси к каждому конкретному случаю (Лутфуллин М.X., Латыпов Д.Г., Корнишина М.Д. Гельминто-копроскопические исследования животных. Казань, 2002, 24 с.). Таким образом, предлагаемый способ позволяет в значительно повысить эффективность выявления яиц, цист и ооцист простейших в пробах почвы по сравнению с методом Романенко Н.А. и может использоваться на практике и при проведении научных исследований.
Выявление яиц гельминтов, клещей, ооцист простейших пробах почвы патентуемым способом проводилось по следующей схеме: вначале готовили комбинированную флотационную смесь из трех ингредиентов:
1) насыщенный раствор цинка хлорида (2 кг ZnCl2 на 1 л воды);
2) насыщенный раствор натрия хлорида (0,42 кг NaCl на 1 л воды);
3) глицерин (Ч).
Далее эти три компонента смешивают в соотношении 1:1:1. Всплывшие крупные частицы сразу же удаляют. После центрифугирования (для этой цели пригодна центрифуга марки ЦЛС-3) в течение 3 мин при 800-1000 об/мин воду сливают, а в центрифужные стаканчики добавляют 150 мл трехкомпонентной флотационной системы. Перемешивают палочкой и вновь центрифугируют 3 мин.
Пробирки устанавливают в штатив, доливают тем же раствором до образования выпуклого мениска, накрывают обезжиренным стеклом (размер 6×12 см) так, чтобы оно касалось слоя жидкости. Через 20-30 мин стекло снимают и микроскопируют, с целью повышения эффективности выявления яиц рекомендуется снятие препарата повторить 2-3 раза.
Сравнительная эффективность выявления яиц Ascaris suum в пробах почвы представлена в Таблице 1.
| Таблица 1 | ||
| Сравнение эффективности выявления яиц в пробах почвы с искусственным внесением яиц Ascaris suum методом Романенко Н.А. и патентуемым способом | ||
| № пробы почвы | Количество яиц Ascaris suum в пробе почвы | |
| Романенко | Патентуемый метод | |
| 1 | 2 | 9 |
| 2 | 3 | 8 |
| 3 | 2 | 10 |
| 4 | 4 | 11 |
| 5 | 5 | 11 |
| 6 | 2 | 7 |
| 7 | 3 | 12 |
| 8 | 2 | 11 |
| 9 | 1 | 8 |
| 10 | 2 | 10 |
| M±m | 2,6±0,41 | 9,7±0,52 |
Из таблицы видно, что патентуемый метод позволил выявить на 7,1 яиц Ascaris suum больше, чем метод Романенко.
Сравнительная эффективность выявления яиц Toxocara canis в пробах почвы представлена в Таблице 2.
| Таблица 2 | ||
| Сравнение эффективности определения яиц в пробах почвы с искусственным внесением яиц Toxocara canis методом Романенко Н.А. и патентуемым способом | ||
| № пробы почвы | Количество яиц Toxocara canis в пробе почвы | |
| Романенко | Патентуемый метод | |
| 1 | 1 | 13 |
| 2 | 3 | 14 |
| 3 | 4 | 10 |
| 4 | 4 | 12 |
| 5 | 5 | 12 |
| 6 | 3 | 11 |
| 7 | 3 | 13 |
| 8 | 1 | 11 |
| 9 | 1 | 12 |
| 10 | 3 | 9 |
| M±m | 2,8±0,47 | 11,7±0,41 |
Из таблицы видно, что патентуемый метод позволил выявить на 8, 9 яиц Toxocara canis больше, чем метод Романенко.
Аналогичные результаты получены с использованием яиц человеческой аскариды Ascaris lumbricoides (Таблица 3).
| Таблица 3 | ||
| Сравнение эффективности определения яиц в пробах почвы с искусственным внесением яиц Ascaris lumbricoides методом Романенко Н.А. и патентуемым способом | ||
| № пробы почвы | Количество яиц Ascaris lumbricoides в пробе почвы | |
| Романенко | Патентуемый метод | |
| 1 | 1 | 11 |
| 2 | 4 | 12 |
| 3 | 2 | 10 |
| 4 | 1 | 13 |
| 5 | 2 | 11 |
| 6 | 5 | 12 |
| 7 | 3 | 12 |
| 8 | 2 | 12 |
| 9 | 3 | 11 |
| 10 | 2 | 15 |
| M±m | 2,5±0,42 | 11,9±0,46 |
Из таблицы видно, что патентуемый метод позволил выявить на 9,4 яйца Ascaris lumbricoides больше, чем метод Романенко.
Результаты исследования сравнительной эффективности выявления в пробах почвы ооцист эймерий и яиц клещей рода Knemidocoptes патентуемого метода и метода Романенко Н.А. представлены в Таблице 4.
| Таблица 4 | ||||
| Сравнение эффективности определения ооцист эймерий и клещей Knemidocoptes mutans в пробах почвы с искусственным внесением ооцист Eimeria tenella, E. maxima, E. acervulina и клещей методом Романенко Н.А. и патентуемым способом | ||||
| № пробы почвы | Романенко | Патентуемый метод | ||
| Ооцисты | Яйца | Ооцисты | Яйца | |
| эймерий | К. mutans | эймерий | К. mutans | |
| 1 | 7 | 1 | 11 | 12 |
| 2 | 4 | 1 | 15 | 11 |
| 3 | 3 | 3 | 12 | 12 |
| 4 | 1 | 1 | 13 | 13 |
| 5 | 2 | 2 | 11 | 15 |
| 6 | 2 | 2 | 16 | 14 |
| 7 | 2 | 3 | 11 | 11 |
| 8 | 4 | 1 | 14 | 11 |
| 9 | 4 | 1 | 18 | 15 |
| 10 | 3 | 1 | 16 | 10 |
| М±m | 3,2±0,56 | 1,6±0,28 | 13.7±0,83 | 12,4±0,59 |
Из таблицы видно, что патентуемый метод позволил выявить на 10,5 ооцист эймерий и на 10,8 яиц клещей больше, чем метод Романенко.
Пример 1 (лабораторный номер - №8). Проба была собрана в песочнице, принадлежащей детскому саду №373 Приволжского района г.Казани 11.06.2010 г. Во двор детского сада возможен доступ животных. Общая масса пробы 200 г.
При исследовании методом Романенко Н.А. яиц гельминтов не было выявлено.
Затем был применен двухингредиентный комбинированный метод исследования почвы, патентуемый нами.
Для исследования из общей пробы отобрали 25 г почвы, поместили в центрифужную пробирку вместимостью 250 мл и залили 150 мл воды. Смесь тщательно размешали стеклянной палочкой в течение 5 мин.
Всплывшие крупные частицы сразу же удалили. После центрифугирования (в течение 5 мин при 1000 об/мин) воду слили, а в пробирки добавили 150 мл двухингредиентной флотационной смеси. Перемешали палочкой и вновь центрифугировали 5 мин.
Пробирки установили в штатив, долили той же смесью до образования выпуклого мениска, накрыли обезжиренным стеклом (размер 6×12 см) так, чтобы оно касалось слоя жидкости. Через 20-30 мин стекло снимают и микроскопируют. С целью повышения эффективности выявления яиц снятие препарата повторить 2-3 раза.
Нами было выявлено: яйца sp. Toxocara, Trichocepalus и свободноживущий червь.
Пример 2 (лабораторный номер - №9). Проба была собрана на внутридворовой территории птичника, имеется свободный доступ птицы на территорию. Общая масса пробы 200 г.
При исследовании методом Романнеко Н.А. яиц червей, простейших и клещей вявлено не было.
Патентуемым трехингредиентным способом исследования почвы были выявлены ооцисты Eimeria tenella, E. maxima, яйца Thominx collaris, яйца Ascaridia galli и яйца клещей Dermanyssus gallinae и К. mutans.
Из представленных данных видно, что патентуемый способ выявления яиц позволяет значительно повысить процент выявляемых в почве яиц таких геогельминтов, как человеческая и свиная аскарида, а также токсокара, приблизительно в 4-5 раз, по сравнению с рекомендованным в литературе способом Романенко Н.А. Кроме того, патентуемый способ позволяет вдвое сократить время ожидания при проведении анализа. Это делает оправданным использование патентуемого нами метода на практике и для проведения научных исследований.
Рисунок 1. Яйца аскарид, выделенные из матки червя и выявленные в пробе почвы после искусственного внесения.
Рисунок 2. Свободноживущий червь, обнаруженный патентуемым методом; увеличение ×200.
Рисунок 3. Яйцо трихоцефал, обнаруженное в пробе почвы патентуемым методом; увеличение ×200.
Литература
1. МУК 4. 2. 796 - 99. «Методы санитарно-паразитологических исследований». 2. Лутфуллин М.X., Латыпов Д.Г., Корнишина М.Д. Гельминто-копроскопические исследования животных. Казань, 2002, 24 с.3. Савилов Е.Д., Мамонова Л.М., Астафьев В.А., Жданова С.Н. Применение статистических методов в эпидемиологическом анализе. - М.: «МЕДпресс-информ», 2004. - С.21 - 26.
Способ выявления яиц гельминтов, клещей и ооцист простейших в пробах почвы, заключающийся в том, что пробу почвы весом 25 г помещают в центрифужную пробирку вместимостью 250 мл и заливают 150 мл воды, смесь тщательно размешивают стеклянной палочкой в течение 5 мин или с помощью электромешалки 1 мин и центрифугируют в течение 3 мин при 800-1000 об/мин, воду сливают, а в пробирки добавляют 150 мл трехкомпонентной флотационной системы, состоящей из насыщенных растворов цинка хлорида (2 кг ZnCl2 на 1 л), натрия хлорида (0,42 кг NaCl на 1 л) и глицерина, взятых в соотношении 1:1:1, в пробирку доливают тот же раствор до образования выпуклого мениска, пробирку накрывают обезжиренным стеклом так, чтобы оно касалось слоя жидкости, через 20-30 мин стекло снимают и микроскопируют, снятие препарата рекомендуется повторить 2-3 раза.
