Способ выявления специфических антител к вирусу геморрагического энтерита индеек
Владельцы патента RU 2469321:
Государственное научное учреждение Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии (ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии) (RU)
Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и эпизоотологии. Способ выявления специфических антител к вирусу геморрагического энтерита индеек заключается в исследовании биоматериала от птицы, в реакции непрямой гемагглютинации, где в качестве эритроцитарного диагностикума используют эритроциты кролика с осажденным на них антигеном вируса геморрагического энтерита индеек, а для регулировки скорости оседания эритроцитов используют гранулы декстрана размерами от 200 до 500 мкм. 2 табл., 2 пр.
Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, эпизоотологии, а именно к способам выявления специфических антител [AT] к вирусу геморрагического энтерита индеек [ГЭИ].
Известен способ выявления специфических AT к ГЭИ в сыворотке крови птицы с использованием реакции иммуноферментного анализа [ИФА] (Domeruth, C.H., W.B. Gross and F.W.Pierson. Hemorrhagic enteritis of turkeys. A Laboratory Manual for the Isolation and Identification of Avian Pathogens. 3rd ed. H.G. Purchase et al. eds. Kendall/Hunt Publishing Co. Dubuque, IA. pp.82-84. 1989), который является аналогом предлагаемого способа. Однако данный тест не позволяет проводить обнаружение AT к ГЭИ без использования коммерческих тест-систем, связанных с видовой принадлежностью исследуемых образцов, а также требует использования технически сложного и дорогостоящего оборудования для регистрации результатов реакции.
Наиболее близким в техническом отношении и принятым за прототип является способ обнаружения AT к вирусу Ньюкаслской болезни птиц в сыворотке крови птицы с использованием реакции задержки гемагглютинации [РЗГА]. (Czifra G, M Nilsson, D.J.Alexander, R.Manvell, S.Kecskemeti, B.E.Engstrom. Detection of PMV-1 specific antibodies with a monoclonal antibody blocking enzyme-linked immunosorbent assay. Avian Pathol. 1996 Dec; 25(4): 691-703). Однако данный тест не позволяет выявлять AT к вирусу ГЭИ.
Задачей заявляемого решения является расширение арсенала диагностических методов для выявления специфических антител к вирусу ГЭИ. Поставленная задача решается тем, что предложен способ выявления специфических антител к вирусу геморрагического энтерита индеек в сыворотке крови или плазме крови птицы с использованием реакции непрямой гемагглютинации [РНГА], отличающийся тем, что при приготовлении эритроцитарного диагностикума для РНГА необходимо использовать эритроциты кролика, с осажденным на них антигеном вируса ГЭИ, а при постановке реакции - указанный эритроцитарный диагностикум, 96-луночные микропланшеты с V-образным дном и гранулы декстрана размерами от 200 до 500 мкм.
Способ осуществляют следующим образом.
Материалы и оборудование: вакцина против геморрагического энтерита индеек «Dindoral», фосфатно-солевой буфер [PBS] рН 7,2-7,4, 1М водный раствор аланина, забуференный 10% раствор формалина, центрифуга, шейкер.
Протокол получения диагностикума.
1. Отмыть эритроциты из 2 мл крови кролика PBS в соотношении 1:5 двукратно, центрифугируя суспензию при 2000 об/мин 1 минуту.
2. Ресуспендировать полученную эритроцитарную массу PBS до 12 мл.
3. Добавить к 12 мл суспензии 1,2 мл 10% формалина.
4. Инкубировать при 22-24°С, плавно перемешивая на шейкере 2 часа.
5. Осадить центрифугированием при 2000 об/мин в течение 1 минуты.
6. Ресуспендировать осадок PBS, доведя до объема 6 мл.
7. Добавить 100 мкл предварительно разведенной, в соответствии с инструкцией и осветленной центрифугированием при 10000 об/мин 2 минуты, вакцины против геморрагического энтерита «Dindoral».
8. Инкубировать при 22-24°С, плавно перемешивая на шейкере 1 час.
9. Добавить 600 мкл 1М раствора аланина.
10. Инкубировать при 22-24°С, плавно перемешивая на шейкере 10 мин.
11. Осадить центрифугированием при 2000 об/мин в течение 1 минуты.
12. Отмыть осадок PBS в соотношении 1:5 однократно, центрифугируя суспензию при 2000 об/мин 1 минуту.
13. Ресуспендировать осадок PBS, доведя объем до 40 мл.
Полученной суспензии эритроцитов достаточно для проведения исследования 400 проб. Срок хранения диагностикума при +4°С - 1 месяц.
Образцы для исследования: пробы сыворотки крови, плазмы крови.
РНГА проводят по следующему протоколу:
1. Подготовить гранулы декстрана размерами от 200 до 500 мкм (коммерческий препарат - Sefadex G25): ресуспендировать их в PBS 1:2; инкубировать для набухания при 22-24°С 2 часа. Использовать осадок гранул.
2. Приготовить серийные двукратные разведения исследуемых сывороток начиная с разведения 1:4 в микропланшетах с V-образным дном в объеме 100 мкл в PBS.
3. Внести в лунки 96-луночного микропланшета с V-образным дном по 50 мкл приготовленных по п.1 гранул Sefadex G25.
4. Внести в лунки микропланшета по 100 мкл эритроцитарного диагностикума.
5. Инкубировать при температуре 22-24°С до формирования зонтиков 2-5 часов, можно на ночь.
В случае положительной реакции в толще гранул сефадекса формируется зонтик, в случае отрицательной реакции эритроциты с иммобилизированным на них вирусным антигеном беспрепятственно просачиваются между гранулами и оседают на дне V-образных лунок в виде пуговки.
Для иллюстрации способа приведены примеры.
Пример 1
Результаты РНГА с сывороткой крови индейки разных возрастов. Отражена динамика прироста титров антител к вирусу ГЭИ у птицы с птицефабрики, неблагополучной по геморрагическому энтериту индеек.
| Таблица 1 | ||||||||||
| возраст | Всего проб | отр. | 1:2 | 1:4 | 1:8 | 1:16 | 1:32 | 1:64 | 1:128 | 1:256 |
| 1 дн. | 12 | 8 | 2 | 2 | ||||||
| 6 дн. | 12 | 2 | 4 | 4 | 1 | 1 | ||||
| 10 дн. | 12 | 4 | 6 | 2 | ||||||
| 13 дн. | 12 | 6 | 4 | 2 | ||||||
| 18 дн. | 12 | 2 | 2 | 2 | 2 | 4 | ||||
| 19 дн. | 12 | 2 | 2 | 4 | 2 | 2 | ||||
| 25 дн. | 12 | 2 | 2 | 6 | 2 | |||||
| 57 дн. | 12 | 12 | ||||||||
| 122 дн. | 12 | 12 | ||||||||
| Примечание: вакцинация живой вакциной против геморрагического энтерита индеек проводилась в возрасте 22 дней. |
Как следует из таблицы, уровень антител к дате вакцинации (22 дня) не снижается за счет естественного распада трансовариальных антител, а растет. Таким образом, одной из ведущих проблем на стационарно неблагополучных по ГЭИ птицефабриках является наличие антител до вакцинации, что способно снизить эффективность вакцинации.
Пример 2
Титры антител в РНГА к вирусу ГЭИ на пике заболевания у реконвалесцентов.
| Таблица 2 | ||
| Титры антител к вирусу ГЭИ | Возраст 19 дн. на пике падежа, кол-во проб | Возраст 36 дн. на спаде падежа, кол-во проб |
| 0 | 9 | |
| 1:2 | ||
| 1:4 | ||
| 1:8 | 1 | 1 |
| 1:16 | ||
| 1:32 | 9 | |
| % реагирующих (за положительные принимаем 1:8 и выше) | 10% | 100% |
Как следует из таблицы 2, защитными титрами антител в РНГА в очаге заболевания можно считать значение 1:32.
Способ выявления специфических антител к вирусу геморрагического энтерита индеек, включающий исследование биоматериала от птицы, отличающийся тем, что используют реакцию непрямой гемагглютинации, где в качестве эритроцитарного диагностикума используют эритроциты кролика с осажденным на них антигеном вируса геморрагического энтерита индеек, а для регулировки скорости оседания эритроцитов используют гранулы декстрана размерами от 200 до 500 мкм.
