Лечение и предупреждение нейродегенеративных заболеваний с использованием генной терапии

Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии, и касается лечения и предупреждения нейродегенеративных заболеваний, в частности болезни Альцгеймера, с использованием генной терапии. Для этого вводят композицию, содержащую одну или более нуклеиновых кислот, индуцирующих клеточный иммунный ответ. При этом вводимые нуклеиновые кислоты кодируют один или более цитокинов, выбранных из группы, состоящей из IL-4 (интерлейкин-4), IL-10 (интерлейкин-10) и TGF-β (трансформирующий фактор роста бета). Способ обеспечивает уменьшение накопления амилоидных образований в головном мозге больного. 15 з.п. ф-лы, 7 ил., 7 пр.

 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном изобретении предложены композиции и способы лечения и/или предупреждения нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера. В некоторых аспектах данные композиции и способы относятся к адоптивным клеточным терапиям и к ДНК-иммунизации.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Нейровоспаление связано с патологией болезни Альцгеймера (БА) (Chen, K. et al., 281 Peptide J.Biol. Chem. 3651-59 (2006) и Frenkel, D. et al., 115 J.Clin. Inves. 2423-33 (2005)). Нейровоспаление включает накопление большого количества активированной микроглии и астроцитов, а также небольших количеств Т-клеток, прикрепляющихся в основном к посткапиллярным венулам (Agadjanyan, M.G. et al., 174 J. Immunol. 1580-86 (2005); Dickson, D. et al., 7 Glia 75-83 (1993); и Fillit, H. et al., 129 Neurosci. Lett. 318-20 (1991)). Было показано, что и микроглия, и астроциты генерируют β-амилоидный белок (Аβ), один из главных патологических признаков БА. Было показано, что сам Аβ действует как провоспалительный агент, вызывающий активацию многих воспалительных компонентов. Сопутствующие биохимические изменения включают появление или повышающую регуляцию многочисленных молекул, характерных для воспаления и свободнорадикальной атаки. Особенно важными могут быть белки комплемента, агенты острой фазы и воспалительные цитокины. Пациенты, которые принимают нестероидные противовоспалительные лекарственные средства, имеют меньший риск БА, чем пациенты, которые не принимают их. Эти результаты привели к повышенному интересу к проведению противовоспалительной терапии БА (Fillit, H. 1991).

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Хотя нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера, классически не рассматриваются как опосредованные воспалением или иммунной системой, в некоторых случаях иммунная система играет важную роль в дегенеративных процессах. Для лечения БА ранее были разработаны иммунотерапевтические подходы, предназначенные для индукции гуморального иммунного ответа. Эти исследования привели к клиническим испытаниям на людях, которые привели как к полезным, так и вредным эффектам. В животных моделях было показано, что иммунотерапия, предназначенная для индукции клеточного иммунного ответа, может быть полезной при повреждении центральной нервной системы, хотя Т-клетки могут оказывать либо полезный, либо вредный эффект, в зависимости от типа индуцированного Т-клеточного ответа. Эти исследования дали новое направление для исследования терапии нейродегенеративных заболеваний на основе иммунной системы.

Адаптивная иммунная система может быть широко классифицирована на два типа ответов: клеточные и гуморальные (антительные) типы ответов. Среди клеточных ответов идентифицировали три главных типа или класса иммунного ответа, которые играют решающую роль в понимании механизмов регуляции воспалительного процесса, например, Th1-ответ (вовлекающий, например, IFN-γ (интерферон-гамма)) в отличие от Th2- и Th3-ответов (вовлекающих, например, IL-4 (интерлейкин-4), IL-10, IL-13 и TGF-β (трансформирующий фактор роста бета)). Разные классы Т-клеточных ответов имеют важные последствия для разработки стратегии вакцинации против болезни Альцгеймера.

В данном изобретении предложены композиции и способы лечения и/или предупреждения нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера. В некоторых аспектах данные композиции и способы относятся к ДНК-вакцинам и адоптивным клеточным генным терапиям для лечения или облегчения симптомов нейродегенеративного заболевания. В некоторых конкретных аспектах данные композиции и способы относятся к ДНК-вакцинам, кодирующим элемент клеточного иммунного ответа, такой как Th2 или Th3 цитокин.

В одном аспекте предложен способ лечения или облегчения симптомов нейродегенеративного заболевания, который включает введение композиции, которая индуцирует клеточный иммунный ответ. В другом аспекте предложен способ лечения или облегчения симптомов нейродегенеративного заболевания путем введения композиции, которая индуцирует клеточный иммунный ответ, путем введения композиции, которая включает элемент клеточного иммунного ответа; предпочтительно элементом клеточного иммунного ответа является белок, пептид, нуклеиновая кислота или полинуклеотид. В родственном аспекте также предложен способ лечения или облегчения симптомов нейродегенеративного заболевания, который включает введение двух или более; трех или более; четырех или более; пяти или более; или шести или более элементов клеточного иммунного ответа. В другом аспекте также предложен способ изготовления композиции для лечения или профилактики нейродегенеративного заболевания, который может включать получение полинуклеотида или его фрагмента с промотором/энхансером, транскрипционно связанным с последовательностью, кодирующей ген элемента клеточного иммунного ответа или его фрагмент. В родственном аспекте предложен способ получения композиции для экспрессии полинуклеотида элемента клеточного иммунного ответа или его фрагмента у субъекта, который включает получение полинуклеотида с промотором/энхансером, транскрипционно связанным с последовательностью, кодирующей ген элемента клеточного иммунного ответа или его фрагмент; и объединение вещества, облегчающего трансфекцию, с указанным полинуклеотидом. Также предложены композиции и способы введения млекопитающему, предпочтительно человеку. В другом аспекте композиция может содержать фармацевтически приемлемый носитель и полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую полипептид элемента клеточного иммунного ответа. В некоторых аспектах предложен набор, который может включать контейнер, подходящий для хранения фармацевтического препарата для введения субъекту, предпочтительно человеку; полинуклеотид, включающий последовательность, кодирующую полипептид элемента клеточного иммунного ответа, фармацевтически приемлемый носитель и этикетку, приклеенную к контейнеру, или вкладыш в упаковку. В других аспектах предложены способы введения полипептидного гомолога полипептида элемента клеточного иммунного ответа или его фрагмента.

В некоторых воплощениях предложена композиция, которая индуцирует элемент клеточного иммунного ответа. Данные способы и композиции могут включать белок, нуклеиновую кислоту или полинуклеотид; предпочтительно, полинуклеотид и/или нуклеиновая кислота представляет собой ДНК или РНК; предпочтительно, полинуклеотид представляет собой кольцевую ДНК; предпочтительно, полинуклеотид представляет собой плазмиду; предпочтительно, полинуклеотид включает промотор/энхансер, транскрипционно связанный с последовательностью, кодирующей ген элемента клеточного иммунного ответа; предпочтительно, полинуклеотид включает участок начала репликации (ORI); предпочтительно, полинуклеотид включает сайт множественного клонирования (MCS); предпочтительно, промотор подходит для экспрессии в эукариотических клетках; в некоторых предпочтительных воплощениях полинуклеотид представляет собой вектор, предпочтительно вирусный вектор; в других предпочтительных воплощениях полинуклеотид представляет собой РНК; предпочтительно, полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК; предпочтительно, полинуклеотид представляет собой короткую интерферирующую РНК (киРНК); или предпочтительно более чем одну композицию, которая уменьшает воспаление, можно вводить одновременно. В некоторых воплощениях один элемент клеточного иммунного ответа находится на одном полинуклеотиде или плазмиде; в других воплощениях более чем один элемент клеточного иммунного ответа может находиться на одном полинуклеотиде или плазмиде. В других воплощениях один полинуклеотид или плазмида включает один или более чем один элемент клеточного иммунного ответа и дополнительно включает один или более полипептидов или его фрагменты, которые, как известно, лечат или облегчают симптомы нейродегенеративного заболевания (например нейротрофический фактор головного мозга (BDNF), фактор роста нервов (NGF), β-амилоид, β-амилоидные пептиды 1-42 (β-амилоид_1-42), аполипопротеин Е (АроЕ) или АроЕ-2.

Другие воплощения относятся к введению белков, пептидов и/или полипептидов элемента клеточного иммунного ответа. В других воплощениях предложены способы введения нуклеиновых кислот и/или полинуклеотидов, кодирующих полипептиды элементов клеточного иммунного ответа. Данные композиции можно получать и вводить таким способом, что у субъекта, которому вводят композицию, экспрессируется полипептид элемента клеточного иммунного ответа. Композиции могут включать системы экспрессии, системы доставки и кодирующие последовательности иммунорегуляторных генов, таких как противовоспалительные цитокины, агонисты цитокинов или антитела против TNF (фактор некроза опухолей). Предпочтительно, элемент клеточного иммунного ответа из данных способов и композиций увеличивает (экспрессию) гена, который снижает воспаление; предпочтительно, увеличение экспрессии гена происходит путем повышающей регуляции экспрессии;

предпочтительно, ген, который уменьшает воспаление, представляет собой Th2-цитокин; предпочтительно, Th2-цитокин представляет собой IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 или TGF-β; в других предпочтительных воплощениях композиция, содержащая элемент клеточного иммунного ответа, ингибирует или ослабляет ген, который увеличивает воспаление; предпочтительно, геном, который увеличивает воспаление, представляет собой Тh1-цитокин; предпочтительно, ослабление экспрессии гена осуществляется путем понижающей регуляции экспрессии; предпочтительно, Th1-цитокин представляет собой IL-2, IL-12 или TNFα, в некоторых воплощениях композиция оказывает влияние на регуляцию путем стимуляции экспрессии или продукции гена, который уменьшает воспаление, тогда как в других воплощениях композиция оказывает влияние на регуляцию путем ингибирования экспрессии гена, который усиливает стимуляцию, такого как антагонист Th1.

Неожиданно показали, как описано в Примерах 3 и 4, что введение полинуклеотида, кодирующего IFN-γ, может лечить или предупреждать эффекты болезни Альцгеймера в животных моделях. Несмотря на то, что IFN-γ представляет собой Th1-цитокин, было показано, что его введение в качестве генной вакцины минимизирует эффекты нейродегенеративного заболевания. Поэтому композиции и способы, включающие полинуклеотиды, кодирующие IFN-γ или кодирующие полипептидный гомолог IFN-γ, предложены в данном изобретении в качестве способа лечения и/или облегчения симптомов нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, у субъекта, предпочтительно млекопитающего, более предпочтительно человека.

В некоторых воплощениях элемент клеточного иммунного ответа включает ген или белок, кодирующий аутоантиген, цитокин, снижающий аутоиммунное воспаление, антагонист цитокина, повышающего аутоиммунное воспаление, или ген, который индуцирует анергию, или их фрагменты; предпочтительно, элемент клеточного иммунного ответа представляет собой или гомологичен интерлейкину (IL)-4, IL-5, IL-10, IL-13, трансформирующему фактору роста бета (TFG-β) или интерферону-гамма (IFN-γ), или их фрагментам.

В предпочтительных воплощениях дополнительно вводится элемент клеточного иммунного ответа с нуклеиновой кислотой или белком, кодирующим полипептид, который дополнительно лечит и/или уменьшает эффекты нейродегенеративного заболевания, или его фрагменты; предпочтительно, дополнительный ген или белок, кодирующий полипептид, представляет собой или гомологичен мозговому нейротрофному фактору (BDNF), фактору роста нервов (NGF), β-амилоиду, β-амилоидным пептидам 1-42 (β-амилоид_1-42), аполипопротеину Е (АроЕ) или АроЕ-2.

В других предпочтительных воплощениях композиции и способы, индуцирующие клеточный иммунный ответ, включают доставку посредством адоптивной клеточной генной терапии. Предпочтительно, тип клетки, используемой для адоптивной клеточной терапии, является аутологичным или неаутологичным; предпочтительно, типом клетки, используемой для адоптивной клеточной терапии, является Т-клетка, антигенпредставляющая клетка, фибробласт или стволовая клетка; предпочтительно, типом клетки, используемой для адоптивной клеточной генной терапии, является дендритная клетка; клетка NIH3T3, неаутологичные стволовые клетки, такие как клетки из Американской коллекции типовых культур (АТСС) или аутологичная стволовая клетка.

В некоторых воплощениях описанные в данном изобретении полинуклеотиды вводят пациенту с фармацевтически приемлемым носителем. В некоторых воплощениях полинуклеотид включает эукариотический промотор; предпочтительно, данный эукариотический промотор обеспечивает экспрессию у человека. В некоторых воплощениях полинуклеотид представляет собой плазмиду в комплексе с промотором/энхансером, транскрипционно связанным с последовательностью, кодирующей элемент клеточного иммунного ответа. В некоторых воплощениях полинуклеотид представляет собой вирусный вектор. В некоторых воплощениях полинуклеотид вводят с реагентом липофекции. В некоторых воплощениях способы могут включать один или более способов введения предложенных в данном изобретении композиций, выбранных из группы, состоящей из внутривенного, инраназального, подкожного, посредством инъекции, посредством ингаляции или посредством генной пушки.

В некоторых предпочтительных воплощениях предложенных в данном изобретении способов полинуклеотид, включающий последовательность, кодирующую полипептид элемента клеточного иммунного ответа или его фрагмент, вводят млекопитающему; более предпочтительно млекопитающим является человек; предпочтительно, полинуклеотид, включающий последовательность, кодирующую ген элемента клеточного иммунного ответа или его фрагмент, вводят вместе с веществом, облегчающим трансфекцию; предпочтительно, вещество, облегчающее трансфекцию, включает липид; предпочтительно, полинуклеотид вводят в фармацевтически приемлемом носителе; в некоторых предпочтительных воплощениях полинуклеотид вводят посредством вирусной трансдукции; предпочтительно, полинуклеотид вводят посредством генной пушки; предпочтительно, полинуклеотид вводят посредством ингаляции; или, предпочтительно, полинуклеотид вводят посредством инъекции, или, предпочтительно, подкожной инъекции, или, предпочтительно, внутримышечной инъекции.

В некоторых воплощениях композиции содержат полинуклеотид, включающий последовательность, кодирующую полипептид элемента клеточного иммунного ответа или его фрагмент; предпочтительно, композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель; предпочтительно, композиция содержит вещество, облегчающее трансфекцию; предпочтительно, вещество, облегчающее трансфекцию, включает липид; предпочтительно, композицию вводят с адъювантом; предпочтительно, композиция подходит для инъекции млекопитающему, предпочтительно млекопитающим является человек; предпочтительно, композиция подходит для ингаляции млекопитающему, предпочтительно млекопитающим является человек; предпочтительно, композиция заключена в фармацевтически приемлемом носителе, предпочтительно фармацевтически приемлемый носитель имеет этикетку, указывающую его состав, и инструкцию относительно введения полинуклеотида; предпочтительно, композиция включает вкладыш в упаковку, предпочтительно вкладыш в упаковку включает выписку о составе композиции, более предпочтительно вкладыш в упаковку включает инструкции относительно дозировки.

Используемый в данном изобретении термин "антиген" относится в широком смысле к любой композиции, к которой индивидуум может вырабатывать иммунный ответ. Используемый в данном изобретении термин "антиген" относится в широком смысле к молекуле, которая содержит по меньшей мере одну антигенную детерминанту, на которую может быть направлен иммунный ответ. Иммунный ответ может быть клеточно-опосредованным или гуморальным, или и тем, и другим. Как общеизвестно в данной области, антиген может представлять собой белок по своей природе, углевод по своей природе, липид по своей природе, нуклеиновую кислоту по своей природе или комбинации этих биомолекул. Например, антиген может включать неприродные молекулы, такие как полимеры и тому подобное. Антигены включают аутоантигены и чужеродные антигены, такие как антигены, продуцируемые другим животным, или антигены из инфекционного агента. Антигены инфекционного агента могут быть бактериальными, вирусными, грибковыми, протозойными и тому подобным.

Используемый в данном изобретении термин "аутологичный" используется в связи с выделением клеток из субъекта, возможно с изменением данных этих клеток, или с сохранением клеток и повторной инфузией этих клеток обратно субъекту.

Используемый в данном изобретении термин "кодирующая область" или "кодирующая последовательность" относится к последовательности нуклеиновой кислоты, ее комплементарной последовательности или ее части, которая кодирует конкретный генный продукт или его фрагмент, экспрессия которого является желательной, согласно нормальным взаимосвязям по спариванию оснований и использованию кодонов. Кодирующие последовательности включают экзоны в геномной ДНК или незрелых первичных транскриптах РНК, которые связаны вместе посредством биохимических механизмов в клетке с образованием зрелой мРНК. Антисмысловая цепь комплементарна такой нуклеиновой кислоте, и кодирующая последовательность может быть выведена из нее. Кодирующая последовательность размещена в зависимости от элементов, контролирующих транскрипцию, и кодонов инициации и терминации трансляции так, что будет продуцироваться транскрипт правильной длины, который будет приводить к трансляции в подходящей рамке считывания с образованием функционального желаемого продукта.

Используемый в данном изобретении термин "комплемент", "комплементарный" или "комплементарность" относится к полинуклеотидам (т.е. к последовательности нуклеотидов, такой как олигонуклеотид или целевая нуклеиновая кислота) согласно стандартным правилам спаривания Уотсона/Крика. Последовательность, комплементарная последовательности нуклеиновой кислоты, находится в "антипараллельной ассоциации", так что 5'-конец одной последовательности спаривается с 3'-концом другой последовательности. Например, последовательность "5'-A-G-T-3'" комлементарна последовательности "3'-Т-С-А-5'". В описанные в данном изобретении нуклеиновые кислоты могут быть включены некоторые нуклеотиды, обычно не встречающиеся в природных нуклеиновых кислотах; они включают, например, инозин, 7-деазагуанин, закрытые нуклеиновые кислоты (LNA), пептид-нуклеиновые кислоты (PNA). Комплементарной последовательностью также может быть последовательность РНК, комплементарная последовательности ДНК, или ее комплементарной последовательности, и также может быть кДНК. Комплементарность не обязательно должна быть идеальной; стабильные дуплексы могут содержать неправильно спаренные пары оснований, вырожденные или неспаренные основания. Специалисты в области технологии нуклеиновых кислот могут эмпирически определить стабильность дуплекса, рассматривая целый ряд переменных, включающих, например, длину олигонуклеотида, состав оснований и последовательность олигонуклеотида, ионную силу и частоту неправильно спаренных пар оснований.

Комплементарность может быть "частичной", при которой только некоторые нуклеотидные основания двух цепей нуклеиновой кислоты соответствуют согласно правилам спаривания оснований. Комплементарность может быть "полной" или "абсолютной", когда все нуклеотидные основания двух цепей нуклеиновой кислоты спариваются согласно правилам спаривания оснований. Комплементарность может отсутствовать, когда ни одно из нуклеотидных оснований двух цепей нуклеиновой кислоты не спариваются согласно правилам спаривания оснований. Степень комплементарности между цепями нуклеиновой кислоты оказывает значительные эффекты на эффективность и силу гибридизации между цепями нуклеиновой кислоты. Это особенно важно в реакциях амплификации, а также в методах детекции, которые зависят от связывания между нуклеиновыми кислотами. Любой из терминов также может быть использован в отношении индивидуальных нуклеотидов, особенно в контексте полинуклеотидов. Например, конкретный нуклеотид в олигонуклеотиде может быть известен своей комплементарностью или ее отсутствием к нуклеотиду в другой цепи нуклеиновой кислоты в отличие или по сравнению с комплементарностью между остальной частью олигонуклеотида и данной цепью нуклеиновой кислоты.

Используемый в данном изобретении термин "по существу комплементарный" относится к двум последовательностям, которые гибридизуются в жестких условиях гидридизации. Специалисту в данной области будет понятно, что по существу комплементарные последовательности не обязательно гибридизуются по всей их длине. В частности, по существу комплементарные последовательности содержат смежные последовательности оснований, которые не гибридизуются с целевой последовательностью, расположенные 3' и 5' по отношению к смежной последовательности оснований, которые гибридизуются с целевой последовательностью в жестких условиях гидридизации.

Используемый в данном изобретении термин "дендритная клетка" (ДК) относится к антигенпредставляющей клетке (АПК), которая может происходить из гематопоэтической стволовой клетки. ДК могут быть получены из многих лимфоидных и нелимфоидных тканей, а также из периферической крови и костного мозга. У людей гематопоэтические стволовые клетки, такие как клетки CD34+, можно искусственно дифференцировать в ДК in vitro. Дендритная клетка имеет характерную морфологию с тонкими складками (ламеллоподиями), простирающимися от тела дендритной клетки в нескольких направлениях. Несколько фенотипических критериев также являются типичными, но могут варьировать в зависимости от источника дендритной клетки. Они включают высокие уровни молекул МНС (главный комплекс гистосовместимости) и костимулирующих молекул (например В7-1 и В7-2), отсутствие маркеров, специфичных для гранулоцитов, NK-клеток, В-клеток и Т-клеток. У мышей некоторые (но не все) дендритные клетки экспрессируют 33D1 (ДК из селезенки и пейеровых бляшек, но не кожи или медуллярной области тимуса), NLDC145 (ДК в коже и Т-зависимых участках некоторых лимфоидных органов) и CD11C (Cd11c также реагирует с макрофагом). Дендритные клетки способны инициировать первичные Т-клеточные ответы in vitro и in vivo. Эти ответы являются антигенспецифичными. Дендритные клетки направляют сильную реакцию смешанных лейкоцитов (MLR) по сравнению с лейкоцитами периферической крови, спленоцитами, В-клетками и моноцитами.

Используемый в данном изобретении термин "экспрессия" относится к биологической продукции продукта, кодируемого кодирующей последовательностью. В большинстве случаев последовательность ДНК, включая кодирующую последовательность, транскрибируется с образованием матричной РНК (мРНК). Матричная РНК транслируется с образованием полипептидного продукта, который имеет биологическую активность. Однако в некоторых случаях РНК продукт может иметь релевантную активность и, таким образом, рассматривался бы как генный продукт. Экспрессия может включать дополнительные стадии процессинга продукта транскрипции РНК, такие как сплайсинг для удаления интронов и/или посттрансляционный процессинг полипептидного продукта.

Термины, относящиеся к иммунологической толерантности, в том виде, как они используются в данном изобретении, относятся к приобретению нечувствительности к аутоантигенам. Способность различать аутоантигены и не-аутоантигены является существенной для сохранения организма. Иммунологическая толерантность дополнительно описана в Seroogy, C.M., et al., Gene Therapy, vol.7, p.9-13 (2000); Costa, G.L, et al., J. Immunol., vol.164, p.3581-90 (2000); и (Weiner, H.L, etal., NYAcad. Sci., vol.778, p.xiii-xviii (1996).

Используемый в данном изобретении термин "элемент клеточного иммунного ответа" относится к любой молекуле, которая индуцирует клеточный иммунный ответ. Предпочтительно, клеточный иммунный ответ является ответом Th2- или Th3-типа. Предпочтительно, молекула представляет собой белок, пептид, полипептид, нуклеиновую кислоту, олигонуклеотид или полинуклеотид. Некоторые элементы клеточного иммунного ответа хорошо известны в данной области и включают, но не ограничиваются этим, молекулы, которые могут осуществлять повышающую регуляцию или продуцировать полипептиды, которые уменьшают аутоиммунное воспаление, которые включают, но не ограничиваются этим, полипептиды IL-4 (т.е. № доступа в GenBank M13982; SEQ ID NO: 12) и IL-10 (а именно № доступа в GenBank М57627; SEQ ID NO: 14) и нуклеиновые кислоты, кодирующие IL-4 и IL-10 (а именно SEQ ID NO: 1 и 3). Элементы клеточного иммунного ответа также могут осуществлять понижающую регуляцию или ингибировать полипептиды, которые увеличивают аутоиммунное воспаление, которые включают, но не ограничиваются этим, полипептид TGF-β (а именно № доступа в GenBank М60316; SEQ ID NO: 16) и нуклеиновые кислоты, кодирующие TGF-β (а именно SEQ ID NO: 5). Однако следует понимать, что другие элементы клеточного иммунного ответа включают элементы, известные в данной области, и элементы, еще не идентифицированные. Предпочтительно, полипептид элемента клеточного иммунного ответа или его фрагмент имеет аминокислотную последовательность, которая гомологична аминокислотной последовательности элемента клеточного иммунного ответа, как предложено в данном изобретении, т.е. SEQ ID NO: 12-22. В некоторых предпочтительных воплощениях фрагмент элемента клеточного иммунного ответа имеет по меньшей мере 25 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 50 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 150 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 200 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 250 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 300 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 400 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 500 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 600 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 700 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 800 аминокислот, которые гомологичны элементу клеточного иммунного ответа, как предложено в данном изобретении, т.е. SEQ ID NO: 12-22. Термин "гомологичный", когда он в данном изобретении относится к аминокислотной последовательности, означает, что данная аминокислотная последовательность по меньшей мере на 70%, более предпочтительно на 75%, более предпочтительно на 80%, более предпочтительно на 85%, более предпочтительно на 90%, более предпочтительно на 95%, более предпочтительно на 98% и наиболее предпочтительно на 100% идентична известной аминокислотной последовательности (например SEQ ID NO: 12-22). Используемый в данном изобретении термин "реагент липофекции" относится к веществу, используемому для включения генетического материала в клетку посредством липосом. Примеры липофекциих реагентов включают липофектин, липофектамин, катионные липиды и нейтральные солипиды.

Используемый в данном изобретении термин "плазмида" относится к конструкции, сделанной из генетического материала (т.е. из нуклеиновых кислот). Она включает генетические элементы, расположенные таким образом, что встроенная кодирующая последовательность может транскрибироваться в эукариотических клетках. Хотя плазмида может включать последовательность из вирусной нуклеиновой кислоты, такая вирусная последовательность не вызывает включения плазмиды в вирусную частицу и поэтому плазмида представляет собой невирусный вектор. Предпочтительно, плазмида представляет собой замкнутую кольцевую нуклеиновую кислоту. Предпочтительно, нуклеиновая кислота представляет собой ДНК или РНК. Предпочтительно, плазмиды можно вводить в клетки посредством трансформации и можно автономно реплицировать в клетке.

Используемый в данном изобретении термин "фармацевтически приемлемый" относится к композиции, подходящей для введения человеку. Специалисты в данной области понимают, что для того, чтобы композиция была подходящей для введения человеку, она должна удовлетворять определенным критериям, например, данная композиция предпочтительно соответствует качественной лабораторной практике (Good Laboratory Practices) (GLP); предпочтительно, данная композиция соответствует надлежащей практике организации производства (Good Manufacturing Practices) (GMP); более предпочтительно данная композиция соответствует нормативным актам, таким как нормативные акты, разработанные Управлением США по контролю за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств; предпочтительно, данная композиция соответствует 21 U.S.С. (Свод законов США) §301-392.

Используемые в данном изобретении термины "начало репликации" или "участок начала репликации" относятся к нуклеотидной последовательности, в которой начинается синтез ДНК с целью репликации последовательности нуклеиновой кислоты. Его обычно называют сайт ORI. Кольцевая (ДНК) бактерий обычно имеет один сайт ORI, тогда как на каждой эукариотической хромосоме может быть много сайтов ORI. Этот термин включает репликоны, которые, при использовании в данном изобретении, относятся к генетическому элементу, который во время репликации ДНК ведет себя как автономная единица. У бактерий хромосома функционирует как один репликон, тогда как эукариотические хромосомы содержат сотни репликонов, расположенных последовательно.

Термин "транскрипционная единица" или "экспрессионная кассета" относится к нуклеотидной последовательности, которая содержит по меньшей мере одну кодирующую последовательность вместе с элементами последовательности, которые управляют инициацией и терминацией транскрипции. Однако транскрипционная единица может включать дополнительные последовательности, которые могут включать последовательности, участвующие в посттранскрипционных или посттрансляционных процессах.

Используемый в данном изобретении термин "последовательность, регулирующая транскрипцию" относится к последовательности, которая регулирует скорость транскрипции транскрипционно связанной кодирующей области. Данный термин может включать такие элементы, как промоторы, операторы и энхансеры. Предпочтительно, последовательности, регулирующие транскрипцию, будут включать по меньшей мере одну промоторную последовательность.

Используемый в данном изобретении термин "транскрипционно связанный" относится к системе, подходящей для транскрипции, причем транскрипция будет инициироваться под управлением регуляторной последовательности и продолжаться вплоть до последовательностей, которые транскрипционно связаны с этой регуляторной последовательностью. Предпочтительно, в образующемся транскрипте не создается мутации, которая изменила бы образующийся продукт трансляции. Например, "транскрипционно связанный" обычно означает, что связанные последовательности ДНК являются смежными и, в случае секреторной лидерной последовательности, являются смежными и в фазе считывания. Однако энхансеры не должны быть смежными. Связывание осуществляется путем лигирования по удобным сайтам рестрикции. Если такие сайты не существуют, то можно использовать синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры согласно традиционной практике.

Используемый в данном изобретении термин "5'-нетранслируемая область" или "5'-UTR" относится к последовательности, расположенной 3' относительно промоторной области и 5' относительно нижерасположенной кодирующей области. Таким образом, такая последовательность при транскрипции находится выше (т.е. 5') кодона, инициирующего трансляцию, и, следовательно, обычно не транслируется в участок полипептидного продукта.

Используемый в данном изобретении термин "3'-нетранслируемая область/поли(А)-сигнал" или "3'-UTR поли(А)-сигнал" представляет собой последовательность, расположенную ниже (т.е. 3') области, кодирующей полипептид. Как и в случае с 5'-UTR, эта область обычно транскрибируется, но не транслируется. Для экспрессии в эукариотических клетках обычно предпочтительно включать последовательность, которая сигнализирует добавление поли-А хвоста. Как и в случае с другими синтетическими генетическими элементами, синтетический 3'-UTR/поли(А)-сигнал имеет последовательность, которая отличается от встречающихся в природе UTR-элементов.

Используемый в данном изобретении термин "цитомегаловирусные промоторные/энхансерные последовательности" относится к последовательностям из цитомегаловируса, которые являются функциональными в эукариотических клетках в качестве транскрипционного промотора и расположенной выше энхансерной последовательности. Энхансерная последовательность позволяет транскрипции протекать с более высокой частотой с ассоциированного промотора.

Описанные в данном изобретении плазмиды могут включать одно или более чем одно из следующего: промотор, 5'-нетранслируемую область (5'-UTR), 3'-UTR/поли(А)-сигнал, и интроны могут представлять собой синтетическую последовательность. В этом контексте термин "синтетическая" относится к последовательности, которая не представлена непосредственно последовательностью встречающегося в природе генетического элемента этого типа, но скорее представляет собой искусственно созданную последовательность (т.е. созданную индивидуумом молекулярно-биологическими способами). Несмотря на то, что один или более участков такой синтетической последовательности могут быть идентичными участкам встречающихся в природе последовательностей, полная последовательность в пределах заданного генетического элемента отличается от встречающегося в природе генетического элемента этого типа. Применение таких синтетических генетических элементов позволяет соответствующим образом конструировать функциональные характеристики этого элемента для желательной функции.

Используемый в данном изобретении "полинуклеотид, включающий последовательность, кодирующую полипептид элемента клеточного иммунного ответа или его фрагмент" относится к полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует пептид или белок, способный индуцировать клеточный иммунный ответ, как определено в данном изобретении. Подразумевается, что существует много разных нуклеотидных последовательностей, которые могли бы кодировать одну полипептидную последовательность на основе нормальных взаимосязей при спаривании оснований и использовании кодонов. Как таковой, данный термин относится к любой последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует элемент клеточного иммунного ответа или его фрагмент. В некоторых предпочтительных воплощениях полинуклеотид, включающий последовательность, кодирующую полипептид элемента клеточного иммунного ответа или его фрагмент, включает нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок, гомологичный IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 или TGF-P, или его фрагменты. Предпочтительно, полинуклеотид, включающий последовательность, кодирующую полипептид элемента клеточного иммунного ответа или его фрагмент, включает непрерывный отрезок из по меньшей мере 50 нуклеотидов; более предпочтительно по меньшей мере 100 нуклеотидов; более предпочтительно по меньшей мере 300 нуклеотидов; более предпочтительно по меньшей мере 600 нуклеотидов; более предпочтительно по меньшей мере 1000 нуклеотидов; более предпочтительно по меньшей мере 1500 нуклеотидов; более предпочтительно по меньшей мере 2000 нуклеотидов, которые гомологичны последовательности, кодирующей полипептиды IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, TGF-β или IFN-γ (как показано в SEQ ID NO: 1-6). Термин "гомологичный", когда он относится в данном изобретении к нуклеотидной последовательности, означает, что данная нуклеотидная последовательность по меньшей мере на 70%, более предпочтительно на 75%, более предпочтительно на 80%, более предпочтительно на 85%, более предпочтительно на 90%, более предпочтительно на 95%, более предпочтительно на 98% или наболее предпочтительно на 100% идентична известной нуклеотидной последовательности (например последовательностям, кодирующим IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, TGF-β или IFN-γ, как они представлены в SEQ ID NO: 1-6). Подразумевается, что полинуклеотид, включающий последовательность, кодирующую полипептид элемента клеточного иммунного ответа, может содержать дополнительные нуклеотиды, отличающиеся от нуклеотидов, образующих последовательность, которая кодирует элемент клеточного иммунного ответа.

Используемый в данном изобретении термин "образец" или "образец для тестирования" относится к любому жидкому или твердому материалу, который, как считается, содержит интересующие нуклеиновые кислоты. Образец для тестирования может быть получен из любого биологического источника (т.е. биологического образца), такого как клетки в культуре или образец ткани, или получен синтетически, включая химически синтезированную матрицу.

Используемый в данном изобретении термин "последовательность, кодирующая ген элемента клеточного иммунного ответа или его фрагмент" относится к любой последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей ген элемента клеточного иммунного ответа или его фрагмент. Термин "ген элемента клеточного иммунного ответа" относится к полинуклеотиду, который кодирует аминокислотную последовательность, соответствующую полипептиду, который может оказывать влияние на воспаление. Примеры генов элемента клеточного иммунного ответа включают, но не ограничиваются этим, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, TGF-β или IFN-γ. Предпочтительно, ген элемента клеточного иммунного ответа, как описано в данном изобретении, кодирует пептид с аминокислотной последовательностью, соответствующей аминокислотной последовательности любых полипептидов элемента клеточного иммунного ответа или их фрагментов на основе нормальных взаимосвязей по спариванию оснований и использованию трансляционных кодонов. Предпочтительно, кодирующая последовательность кодирует точную полную аминокислотную последовательность природного гена элемента клеточного иммунного ответа.

Используемый в данном изобретении термин "трансдуцированная" относится к клетке с выбранной нуклеиновой кислотой, транслоцированной в клетку. Клетка является "стабильно трансдуцированной" выбранной нуклеиновой кислотой, когда выбранная нуклеиновая кислота реплицируется и переходит в дочерние клетки. Клетка "трансформирована" выбранной нуклеиновой кислотой, когда выбранная нуклеиновая кислота интегрируется в геном клетки.

Используемые в данном изобретении термины "проведение лечения", "лечение" или "терапия" относятся к куративной терапии, профилактической терапии и превентивной терапии. Примером "превентивной терапии" или "профилактической терапии" является предупреждение или облегчение целевого патологического состояния или расстройства. Индивидуумы, нуждающиеся в лечении, включают индивидуумов, уже имеющих расстройство, в также индивидуумов, склонных иметь расстройство, или тех, у кого данное расстройство следует предупредить. Введение может быть "длительным" введением, которое относится к введению агента(ов) непрерывным способом, в отличие от экстренного способа, для того чтобы поддерживать первоначальный терапевтический эффект (активность) в течение длительного периода времени. Введение также может быть "периодическим" введением, которое представляет собой лечение, которое осуществляется не последовательно без прерывания, а скорее является циклическим по природе. Введение также может быть "в комбинации с" одним или более чем одним другим терапевтическим агентом, (и) включает одновременное (сопутствующее) и последовательное введение в любом порядке.

Используемый в данном изобретении термин "повышающая регуляция" относится к экспрессии гена, или уровню РНК или эквивалентной РНК, кодирующей одну или более субъединиц белка, или активности одной или более белковых субъединиц, таких как Th2-цитокины, большим, чем наблюдающиеся в отсутствие раскрытых в данном изобретении композиций. Например, экспрессию белка, такого как IL-4, можно увеличить для того, чтобы вылечить, предупредить, облегчить симптомы или смодулировать патологическое состояние, вызванное или усугубленное отсутствием или низким уровнем экспрессии гена.

Используемый в данном изобретении термин "ингибировать" или "осуществлять понижающую регуляцию" относится к экспрессии гена, или уровню РНК, или эквивалентной РНК, кодирующей одну или более субъединиц белка, или активности одной или более белковых субъединиц, таких как Th1-цитокины, меньшим, чем те, которые наблюдаются в отсутствие данных молекул нуклеиновой кислоты. В одном воплощении ингибирование или понижающая регуляция молекулой ферментативной нуклеиновой кислоты предпочтительно ниже, чем уровень, наблюдающийся в присутствии ферментативно неактивной или аттенуированной молекулы, которая способна связываться с тем же сайтом на РНК-мишени, но не способна расщеплять эту РНК. В другом воплощении ингибирование или понижающая регуляция антисмысловыми олигонуклеотидами предпочтительно ниже уровня, наблюдающегося в присутствии, например, олигонуклеотида со скремблированной последовательностью или с ошибочным спариванием оснований. В другом воплощении ингибирование или понижающая регуляция ТМ-цитокина раскрытыми в данном изобретении композициями больше в присутствии данной композиции, чем в ее отсутствие.

Используемый в данном изобретении термин "примерно" означает в количественных показателях плюс или минус 10% от указанного значения.

Другие отличительные признаки и преимущества данного изобретения будут очевидными из следующего описания предпочтительных воплощений и из формулы изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг.1а. Гистологический срез мозга, произведенный в возрасте девяти месяцев у АРР трансгенной мышиной модели болезни Альцгеймера с контрольным вектором (группа без обработки) после двух инъекций (в возрасте шести и восьми месяцев). Стрелки на гистологическом срезе показывают мечение амилоидных бляшек после окрашивания антителом против β-амилоидного белка (специфическое иммуногистохимическое окрашивание).

Фиг.1б. Гистологический срез мозга, произведенный в возрасте девяти месяцев у АРР трансгенной мышиной модели болезни Альцгеймера после двух иммунизации (в возрасте шести и восьми месяцев) генной вакциной IL-10. Гистология не показывает какого-либо мечения амилоидных бляшек после окрашивания антителом против β-амилоидного белка (специфическое иммуногистохимическое окрашивание).

Фиг.1в. Гистологический срез мозга, произведенный в возрасте девяти месяцев у АРР трансгенной мышиной модели болезни Альцгеймера после двух иммунизации (в возрасте шести и восьми месяцев) генной вакциной IL-4. Гистология не показывает какого-либо мечения амилоидных бляшек после окрашивания антителом против β-амилоидного белка (специфическое иммуногистохимическое окрашивание).

Фиг.1г. Гистологический срез мозга, произведенный в возрасте девяти месяцев у АРР трансгенной мышиной модели болезни Альцгеймера после двух иммунизации (в возрасте шести и восьми месяцев) генной вакциной TGF-β. Гистология не показывает какого-либо мечения амилоидных бляшек после окрашивания антителом против β-амилоидного белка (специфическое иммуногистохимическое окрашивание).

Фиг.1д. Гистологический срез мозга, произведенный в возрасте девяти месяцев у АРР трансгенной мышиной модели болезни Альцгеймера после двух иммунизации (в возрасте шести и восьми месяцев) генной вакциной IFN-γ. Стрелки на гистологическом срезе показывают мечение амилоидных бляшек после окрашивания антителом против β-амилоидного белка (специфическое иммуногистохимическое окрашивание).

Фиг.2а и 2б. Гистологический срез мозга в области гиппокампа, произведенный в возрасте восемнадцати месяцев у АРР трансгенной мышиной модели болезни Альцгеймера после шести иммунизации (в возрасте шести, восьми, десяти, двенадцати, четырнадцати и шестнадцати месяцев) только вектором (Фиг.2а) или смесью генных вакцин IL-4, IL-10, NGP и Аро-Е2 (Фиг.2б). Гистология после смешанной вакцинации не показывает какого-либо мечения амилоидных бляшек после окрашивания антителом против β-амилоидного белка (специфическое иммуногистохимическое окрашивание), что согласуется с нормальными, непораженными болезнью мышами, тогда как введение вектора действительно приводило к мечению амилоидных бляшек.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном изобретении предложены композиции и способы лечения и/или предупреждения нейродегенеративного заболевания, такого как болезнь Альцгеймера. В некоторых аспектах композиции и способы относятся к ДНК-вакцинам и адоптивным клеточным генным терапиям для лечения или облегчения симптомов нейродегенеративного заболевания у субъекта, предпочтительно млекопитающего, более предпочтительно человека. В некоторых аспектах композиции и способы относятся к ДНК-вакцинам, кодирующим Th2- или Th3-цитокин. Данные композиции можно получать и вводить таким образом, что последовательность, кодирующая элемент клеточного иммунного ответа, экспрессируется у субъекта, которому вводят композицию. Эти композиции могут включать системы экспрессии, системы доставки, вещества, облегчающие трансфекцию, и один или более элементов клеточного иммунного ответа.

Аллергические заболевания имеют иммунный ответ, который отклоняется к профилю Т-хелперов типа 2 (Th2) и от профиля Т-хелперов типа 1 (Th1). Профиль Th1 характеризуется повышенными уровнями молекул, которые поддерживают воспалительную реакцию, таких как IFN-γ и IL-2. Профиль Th2 характеризуется повышенными уровнями конкретных интерлейкинов (IL), таких как IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, Т-клеток CD4+ и продукцией антигенспецифичных IgE. IL-4 является важным в синтезе IgE и развитии Th2-ответа, а IL-5 - в выживании эозинофилов. Иммунотерапия приводит к обращению этого дисбаланса, с увеличением Th1-цитокинов IFN-γ и IL-12, которые, в свою очередь, ингибируют Th2-ответ. В то же время, эта работа по генетической вакцинации быстро развивается, как и работа по низкоаффинному рецептору IgG, представляющему собой FCγRIIB, который, будучи занят, ингибирует lgE-опосредованный ответ на тучных клетках и базофилах (Daeron, et al., J.Clin. Invest. 95(2): 577-85 (1995)).

Неожиданно, как описано выше и показано в Примерах 3 и 4, введение полинуклеотида, кодирующего IFN-γ, может лечить и предупреждать эффекты болезни Альцгеймера в животных моделях. Несмотря на то, что IFN-γ представляет собой Th1-цитокин, было показано, что его введение в качестве генной вакцины минимизирует эффекты нейродегенеративного заболевания. Следовательно, композиции и способы, включающие полинуклеотиды, кодирующие IFN-γ или кодирующие полипептидный гомолог IFN-γ, предложены в данном изобретении в качестве способа лечения и/или облегчения симптомов нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, у субъекта, предпочтительно млекопитающего, более предпочтительно человека.

В некоторых воплощениях композиции, которые уменьшают воспаление, могут стимулировать экспрессию или продуцировать ген, который уменьшает воспаление, тогда как в других воплощениях данная композиция может оказывать влияние на регуляцию путем ингибирования экспрессии гена, который увеличивает воспаление, такого как антагонист. Для ингибирования экспрессии можно использовать двухцепочечную РНК, в частности миРНК. РНК можно вводить в живую клетку для ингибирования экспрессии гена мишени в этой клетке. Данный процесс можно осуществлять ex vivo или in vivo. Такие композиции РНК и способы применения дополнительно описаны, например, в патенте США №6506559.

Для введения ДНК в клетки-хозяева можно использовать разные подходы, включая введение "голой" ДНК, ДНК в комплексе с липосомами и различных вирусных векторов. Можно использовать "голые" полинуклеотидные вещества, способы и системы доставки, такие как описанные в патентах США №№6040295, 5763270 и 5580859. Полинуклеотиды являются "голыми" в том смысле, что они не содержат какой-либо носитель для доставки, который может действовать, облегчая проникновение в клетку, или любое вещество, которое стимулирует трансфекцию, такое как липосомные препараты, заряженные липиды, такие как липофектин, или агенты преципитации, такие как CaPO₄.

Векторы для доставки нуклеиновых кислот могут быть вирусными, невирусными или физическими. См., например, Rosenberg et al., Science, 242: 1575-1578 (1988) и Wolff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 9011-9014 (1989). Обсуждение способов и композиций для применения в генной терапии включает Eck et al., in Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Edition, Hardman et al., eds., McGray-Hill, New York, (1996), Chapter 5, pp.77-101; Wilson, Clin. Exp. Immunol. 107 (Suppl.1): 31-32 (1997); Wivel et al., Hematology/Oncology Clinics of North America, Gene Therapy, S.L.Eck, ed., 12(3): 483-501 (1998); Romano et al., Stem Cells, 18: 19-39 (2000) и ссылки, процитированные в них. В патенте США №6080728 также приведено обсуждение целого ряда способов доставки генов и композиций. Пути доставки включают, например, системное введение и введение in situ. Общеизвестные способы вирусной доставки включают применение аденовирусных, ретровирусных, лентивирусных векторов, векторов на основе пенистого вируса, вируса простого герпеса и аденоассоциированных вирусных векторов.

Вирусные векторы также можно использовать для трансфекции клетки млекопитающего и введения полинуклеотида в геном. При непрямом способе вирусные векторы, несущие генетическую информацию, используют для инфицирования клеток-мишеней, выделенных из организма, и эти клетки затем повторно имплантируют. Сообщали о прямом переносе генов in vivo в животных после рождения для препаратов ДНК, инкапсулированной в липосомы, и ДНК, инкапсулированной в протеолипосомы, содержащие рецепторные белки вирусной оболочки (Nicolau et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 80: 1068-1072 (1983); Kaneda et al., Science 243: 375-378 (1989); Mannino et al., Biotechniques 6: 682-690 (1988). Вирусные векторы можно инъецировать или трансдуцировать в клетки-хозяева in vitro, которые затем адоптивно переносят и служат в качестве носителей для доставки, такие как Т-клетки (Nakajima, A., et al., J. Clin. Invest., vol. 17(21), p.1293-1310 (2001) и Tuohy, V.K., et al., J. Neuroimmunol., vol. 17(2), p.226-32 (2000), фибробласты (Rabinovich, G.A., et al., J. Exp. Med., vol. 19, p.385-98 (1999)), дендритные клетки (ДК) (Kim, S.H., et al., J. Immunol., vol. 166(21), p.3499-3550 (2001) и Morita, Y., et al., J. Clin. Invest, vol. 17(21), p.1275-84 (2001)) и стволовые клетки (АТСС или аутологичные).

В некоторых воплощениях вирусный вектор предпочтительно представляет собой ретровирусный вектор. Ретровирусные векторы представляют собой плазмиды для переноса генов, где гетерологичная нуклеиновая кислота находится между двумя ретровирусными LTR (длинный концевой повтор). Ретровирусные векторы типично содержат подходящие сигналы для упаковки, которые делают возможной упаковку ретровирусного вектора или РНК, транскрибируемой с использованием ретровирусного вектора в качестве матрицы, в вирусный вирион в подходящей упаковочной клеточной линии (см., например, патент США 4650764).

Подходящие ретровирусные векторы для применения в данном изобретении описаны, например, в патентах США 5399346 и 5252479, и в публикациях WIPO WO 92/07573, WO 90/06997, WO 89/05345, WO 92/05266 и WO 92/14829, в которых дано описание способов эффективного введения нуклеиновых кислот в человеческие клетки с использованием таких ретровирусных векторов. Другие ретровирусные векторы включают, например, векторы на основе вируса опухоли молочной железы мышей (например Shackleford et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 9655-9659 (1998)), лентивирусов и тому подобного. Типичный вирусный вектор представляет собой plentilox-IRES-GFP.

Адоптивная клеточная генная терапия

Методики введения нуклеиновых кислот в клетки варьируют в зависимости от того, трансфицируется нуклеиновая кислота в культивируемую клетку in vitro или в клетки предполагаемого хозяина in vivo. Методики, подходящие для переноса нуклеиновой кислоты в клетки млекопитающих in vitro, включают применение липосом, электропорацию (Luxembourg A., et al., Expert Opinion Biol. Ther. 7(11); 1647-1664 (2007); Kesaraju P, et al., Mol. Ther. 14(3): 416-422 (2006); Luxembourg, et al., Vaccine (24(21): 4490-4493 (2006)), микроинъекцию, слияние клеток, DEAE-декстран, преципитацию фосфатом кальция и т.д. Предпочтительные методики переноса генов in vivo включают трансфекцию вирусными (типично ретровирусными) векторами и трансфекцию, опосредованную липосомами с белками вирусной оболочки (Dzau, et al., Trends in Biotechnology 11(5): 205-10 (1993)). Подходящие векторы можно сконструировать любым из способов, хорошо известных в данной области. См., например, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press (1989) и Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1987 и дополненные издания). Векторы, разработанные для ДНК-вакцин, такие как pVAX1 (Invitrogen Carlsbad, СА), также подходят для доставки нуклеиновой кислоты млекопитающему. Было широко описано применение катионных липосом, таких как липосома CD-Chol/DOPE, в качестве подходящего носителя для доставки ДНК к целому ряду тканей посредством внутривенной инъекции комплексов ДНК/катионная липосома. См. Caplen et al., Nature Med., 1: 39-46 (1995); Zhu et al., Science, 261: 209-211 (1993). Липосомы переносят гены в клетки-мишени посредством слияния с плазматической мембраной. Примеры успешного применения липосомных комплексов включают примеры из Lesson-Wood et al., Human Gene Therapy, 6: 395-405 (1995), и Xu et al., Molecular Genetics and Metabolism, 63: 103-109(1998).

Направленной доставки нуклеиновой кислоты индивидууму можно добиваться любым из разных способов, известных в данной области. Например, источник нуклеиновой кислоты можно объединять с агентом, который имеет в качестве мишени клетки в поврежденной ткани, таким как антитело, специфичное к мембранному белку клеточной поверхности или клетке-мишени, лиганд для рецептора на клетках-мишенях и т.д. При использовании липосом, белки, которые связываются с ассоциированным с эндоцитозом мембранным белком клеточной поверхности, можно использовать для направленной доставки и/или облегчения поглощения, например, капсидные белки или их фрагменты, тропные к конкретному типу клеток, антитела к белкам, которые подвергаются интернализации при прохождении цикла, белки, которые имеют в качестве мишени внутриклеточную локализацию и увеличивают время полужизни внутри клетки. Методика рецептор-опосредованного эндоцитоза описана, например, в Wu, et al., J. Biol. Chem. 262(10): 4429-32 (1987); и Wagner, et al., Proc. Natl, Acad. Sci. USA 87(9): 3410-4 (1990). Для обзора протоколов генной маркировки и генной терапии см. Anderson, Science 256(5058): 808-13 (1992).

Предложенные в данном изобретении способы и композиции также можно использовать в адоптивной клеточной генной терапии с использованием иммунных клеток, модифицированных генной инженерией, таких как первичные Т-клетки, дендритные клетки, фибробласты и стволовые клетки, которые обладают способностью мигрировать к участкам воспаления при орган-специфическом аутоиммунном заболевании для экспрессии и доставки иммунорегуляторных продуктов и/или терапевтических генных продуктов после вирусной трансдукции ex vivo. Ex vivo трансдукция этих клеток позволяет избежать системного воздействия хозяина на вектор, кодирующий трансген и, таким образом, увеличивает безопасность этого подхода. Были использованы антигенспецифические Т-клеточные гибридомы, которые экспрессировали противовоспалительные цитокины, такие как IL-4, антагонисты цитокинов, такие как антагонист рецептора IL-12 IL-12p40, или одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) антитела против TNF. Все эти молекулы ингибировали развитие заболевания и снижали тяжесть заболевания. CIA модели адоптивной клеточной генной терапии представляют собой примеры удобных генных челноков для опосредования противовоспалительной генной терапии. Дополнительные исследования показали, что первичные Т-клетки, которые сложнее трансдуцировать, являются одинаково эффективными при экспрессии IL-12p40, что указывает на то, что успешная адоптивная клеточная генная терапия может применяться независимо от используемого типа клеток. Следовательно, для миграции к участкам воспаления можно использовать такие клетки, как дендритные клетки (ДК), происходящие из костного мозга.

Клетки из семейства дендритных клеток являются особенно подходящими для выполнения двух различных функций в двух дискретных участках. В периферических тканях дендритные клетки (ДК) действуют в качестве "стражей" против "опасных" антигенов. ДК мигрируют и транспортируют антигены в лимфоидный орган, где они инициируют активацию Т-лимфоцитов, которые являются специфичными для данного антигена. Во время миграции ДК переключаются с антигензахватывающего пути на путь сенсибилизации Т-клеток. ДК также влияют на характер дифференцировки Т-клеток, т.е. на баланс Th1/Th2. ДК обеспечивают антигенные и костимулирующие сигналы, необходимые для оптимальной активации Т-лимфоцитов. ДК и способы применения дополнительно описаны, например, в патенте США №6734014.

Стволовые клетки также можно использовать для адоптивной клеточной генной терапии. Для предложенных в данном изобретении композиций и способов можно использовать человеческие эмбриональные стволовые (ЭС) клетки. ЭС клетки представляют собой линии культивируемых клеток, происходящих из внутренней клеточной массы бластоцисты, которые можно неопределенно долго выращивать в недифференцированном состоянии, однако они также способны дифференцироваться во все клетки взрослого организма. Предпочтительно, стволовые клетки, подходящие для применения в предложенных в данном изобретении способах и композициях, происходят от самого субъекта или подвергаются генной инженерии способом, позволяющим обойти иммунную реакцию, таким как перенос ядра или перенос ядра соматической клетки, что влечет за собой замену ДНК эмбриональной стволовой клетки на ДНК субъекта. Эмбриональные стволовые клетки представляют собой наиболее универсальные стволовые клетки благодаря их способности дифференцироваться приблизительно в 200 разных типов клеток, обнаруженных в организме взрослого человека, и являются единственным типом стволовых клеток, для которых были разработаны рутинные протоколы генной инженерии. Способы генерации стволовых клеток ex vivo хорошо известны в данной области и включают патенты США №№6326198, 6261549, 6093531, 5935565, 5670351, 5670147, 5646043, 5437994.

Вакцинация «ДНК требует относительно небольшого количества инъекций и имеет более быструю фазу увеличения. Также может быть снижен риск вредных реакций на иммунотерапию. Обнаружили, что экспрессия плазмидной ДНК и ее генов продолжается в течение длительного времени (Wolff, et al., Hum. Mol. Genet. 1: 363-69 (1992)), и подтвердили, что иммунные ответы у приматов и грызунов длятся в течение более чем одного года после ДНК-вакцинации (Donnelly, et al., J. Immunol. Meth. 176: 145-152 (1994); и Raz, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 9519-9523 (1994)). По-видимому, плазмидная ДНК не включается в геном хозяина, но сохраняется в виде эписомы (Tang, et al., Nature. 356: 152-4 (1992)). Открытие, что "голые" ДНК и РНК поглощаются и временно экспрессируются в мышечных клетках in vivo, повысило интерес к использованию невирусных носителей для генетической доставки. См. Wolff et al., Science, 247, 1465-1468 (1990); Acsadi, et al., Nature, 352, 815-818, (1991). Несмотря на то, что "голые" ДНК и РНК могут поглощаться клетками млекопитающих, эффективность трансфекции можно очень сильно увеличить, если ДНК или РНК образует комплекс с липосомами (Chen, et al., Gene Therapy 7(19): 1698-705 (2000)).

Введение полинуклеотида млекопитающему in vivo так, чтобы элемент клеточного иммунного ответа или его фрагмент экспрессировался у данного млекопитающего, можно осуществить с использованием любого из множества способов, известных в области экспрессии генов млекопитающих. Например, такие способы введения экспрессируемых полинуклеотидов млекопитающим, включающие системы экспрессии и системы доставки, можно найти в патентах США №№6875748, 5763270, 5580859, 6040295 и 6034072.

Описанные в данном изобретении полинуклеотидные конструкции включают нуклеотидные последовательности, кодирующие элемент клеточного иммунного ответа или его фрагмент. Данный полинуклеотид вводят таким образом, что полинуклеотид включается в клетки и экспрессирует определимое количество профилактически или терапевтически эффективного количества желательного элемента клеточного иммунного ответа или его фрагмента. Типичные элементы клеточного иммунного ответа, подходящие для применения, как предложено в данном изобретении, включают IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, TGF-β и IFN-γ.

Системы экспрессии

Невирусное введение нуклеиновой кислоты in vivo осуществляли различными способами. Они включают липофектин/липосомное слияние: Proc. Natl. Acad. Sci.84, pp.7413-7417 (1993); полилизиновую конденсацию с аденовирусным усилением или без него: Human Gene Therapy 3, pp.147-154 (1992); и доставку нуклеиновой кислоты в клетки с помощью системы трансферрин: трансферриновый рецептор: Proc. Natl. Acad. Sci.87, pp.3410-3414 (1990). Применение конкретной композиции, состоящей из полиакриловой кислоты, было раскрыто в WO 94/24983. "Голую" ДНК вводили, как раскрыто в WO 90/11092.

Таким образом, в одном аспекте предложена плазмида для экспрессии элемента клеточного иммунного ответа или его фрагмента, которая включает экспрессионную кассету, которая также может называться транскрипционной единицей. Когда плазмиду помещают в среду, подходящую для экспрессии генов, транскрипционная единица будет, таким образом, экспрессировать полинуклеотид, включающий последовательность, кодирующую элемент клеточного иммунного ответа или его фрагмент. Транскрипционная единица включает последовательность, контролирующую транскрипцию, которая транскрипционно связана с последовательностью, кодирующей элемент клеточного иммунного ответа. Последовательность, контролирующая транскрипцию, может включать последовательности промотора/энхансера, такие как последовательности промотора/энхансера цитомегаловируса (CMV). Однако специалистам в данной области понятно, что известны многие другие промоторные последовательности, подходящие для экспрессии в эукариотических клетках, и они аналогично могут быть использованы в раскрытых в данном изобретении конструкциях. Уровень экспрессии генного продукта будет зависеть от связанного промора и присутствия и активации связанного энхансерного элемента. В некоторых воплощениях последовательность, кодирующую ген элемента клеточного иммунного ответа или его фрагмент, можно клонировать в экспрессирующую плазмиду, которая содержит регуляторные элементы для транскрипции, трансляции, стабильности РНК и репликации (т.е. включает последовательность, контролирующую транскрипцию). Такие экспрессирующие плазмиды хорошо известны в данной области, и обычный специалист был бы способен сконструировать подходящую экспрессирующую конструкцию с полинуклеотидом, включающим последовательность, кодирующую элемент клеточного иммунного ответа или его фрагмент, таким образом, что данный элемент клеточного иммунного ответа является экспрессируемым. Существует множество примеров подходящих экспрессирующих плазмид, таких как pCl-neo, pUMVC или pcDNA3, в которые можно было бы клонировать полинуклеотид, включающий последовательность, кодирующую ген элемента клеточного иммунного ответа или его фрагмент.

Большие количества бактериального хозяина, содержащего плазмиду для экспрессии элемента клеточного иммунного ответа или его фрагмента, можно ферментировать, и данную плазмиду можно очистить для последующего применения. В текущих клинических испытаниях на человеке с использованием плазмид применяется этот подход. Recombinant DNA Advisory Committee Data Management Report, Human Gene Therapy 6: 535-548 (1994).

Назначением плазмиды, подлежащей применению в генной терапии человека, обычно является эффективная доставка последовательностей нуклеиновой кислоты и экспрессия терапевтических генов (т.е. элементов клеточного иммунного ответа) в клетке или в ткани млекопитающего. В частности, назначением плазмиды может быть достижение большого числа копий, предотвращение потенциальных причин нестабильности плазмиды и обеспечение способов селекции плазмиды. Что касается экспрессии, кассета нуклеиновой кислоты содержит необходимые элементы для экспрессии нуклеиновой кислоты в кассете. Экспрессия включает эффективную транскрипцию встроенного гена, последовательности нуклеиновой кислоты или кассеты нуклеиновой кислоты с плазмидой. Продукты экспрессии могут представлять собой белки, полипептиды или РНК. Последовательность нуклеиновой кислоты может содержаться в кассете нуклеиновой кислоты. Экспрессия нуклеиновой кислоты может быть непрерывной или регулируемой.

Исходной стадией в процессе получения, в конечном счете, экспрессии продукта, кодируемого нуклеиновой кислотой, является осуществление поглощения данной нуклеиновой кислоты клетками. Поглощение нуклеиновой кислоты клетками зависит от целого ряда факторов, одним из которых является период времени, на протяжении которого нуклеиновая кислота находится в непосредственной близости от клеточной поверхности. Например, после внутримышечного (в/м) введения плазмидной ДНК в буфере, наблюдается значительное снижение экспрессии генов, если мышцу подвергают массажу, предположительно из-за утечки ДНК из мышцы либо непосредственно, либо через лимфатические сосуды (Human Gene Therapy 4: 151-159; 1993). Соответственно, может быть желательным приготовление нуклеиновых кислот в виде препарата с соединениями, которые уменьшали бы скорость, с которой нуклеиновые кислоты диффундируют или выводятся из участка, в котором поглощение данной нуклеиновой кислоты клеткой является желательным. Кроме того, эти соединения могли бы быть подходящими для введения в организм посредством таких способов, как инъекция, при поддержании или восстановлении физических характеристик, необходимых для усиления поглощения клеткой нуклеиновых кислот.

Фармацевтические композиции

Предложенные в данном изобретении композиции можно вводить в виде фармацевтической композиции, где соединение приготовлено в виде препарата с фармацевтически приемлемым носителем, как хорошо известно в данной области. Методы приготовления и введения фармацевтических композиций можно найти, например, в "Remington's Pharmaceutical Sciences", (18th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990). Соответственно, данные соединения можно использовать при изготовлении лекарственного средства. Фармацевтические композиции данных соединений можно приготовить в виде растворов или лиофилизированных порошков для парентерального введения. Перед применением такие порошки можно растворять путем добавления подходящего разбавителя или другого фармацевтически приемлемого носителя. Такие порошки также можно распылять в сухой форме. Жидкий препарат может представлять собой забуференный, изотонический, водный раствор. Примерами подходящих разбавителей являются нормальный изотонический физиологический раствор, стандартный 5%-ный раствор декстрозы в воде или забуференный раствор ацетата натрия или аммония. Такой препарат особенно подходит для парентерального введения, но также может использоваться для перорального введения или содержаться в дозирующем игаляторе или небулайзере для вдувания. Может быть желательным добавление эксципиентов, таких как поливинилпирролидон, желатин, гидроксицеллюлоза, аравийская камедь, полиэтиленгликоль, маннит, хлорид натрия или цитрат натрия.

Альтернативно, композиции, содержащие полинуклеотид, включающий последовательность, кодирующую элемент клеточного иммунного ответа или его фрагмент, могут быть инкапсулированными, таблетированными или приготовленными в виде эмульсии или сиропа для перорального введения. Могут быть добавлены фармацевтически приемлемые твердые или жидкие носители для улучшения или стабилизации композиции, или для облегчения приготовления композиции. Твердые носители включают крахмал, лактозу, сульфата кальция дигидрат, гипс, стеарат магния или стеариновую кислоту, тальк, пектин, аравийскую камедь, агар или желатин. Жидкие носители включают сироп, арахисовое масло, оливковое масло, физиологический раствор и воду. Для водных композиций, используемых in vivo, предпочтительным является применение стерильной апирогенной воды. Такие препараты будут содержать эффективное количество полинуклеотида вместе с подходящим количеством водного раствора с целью получения фармацевтически приемлемых композиций, подходящих для введения млекопитающему, предпочтительно человеку. Носитель также может включать вещество для замедленного высвобождения, такое как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат, одно или с воском. Количество твердого носителя варьирует, но предпочтительно будет составлять от примерно 20 мг до примерно 1 г на единицу дозировки. Данные фармацевтические препараты делают, следуя традиционным методикам фармации, включающим размол, смешивание, гранулирование и прессование, при необходимости, для таблетированных форм; или размол, смешивание и наполнение твердых желатиновых капсульных форм. Когда используется жидкий носитель, препарат может находиться в форме сиропа, эликсира, эмульсии или водной или неводной суспензии. Для ректального введения соединения можно объединять с эксципиентами, такими как масло какао, глицерин, желатин или полиэтиленгликоли, и отливать в суппозитории.

Включено введение фармацевтически приемлемых солей, описанных в данном изобретении полинуклеотидов. Такие соли могут быть получены из фармацевтически приемлемых нетоксичных оснований, включающих органические основания и неорганические основания. Соли, происходящие из неорганических оснований, включают натриевые, калиевые, литиевые, аммониевые, кальциевые, магниевые и тому подобное. Соли, происходящие из фармацевтически приемлемых органических нетоксичных оснований включают соли первичных, вторичных и третичных аминов, основных аминокислот и тому подобное. Для полезного обсуждения фармацевтических солей, см. S.M.Berge et al., Journal of Pharmaceutical Sciences 66: 1-19 (1977).

Также, предложенные в данном изобретении фармацевтические композиции для применения в обеспечении полипептида элемента клеточного иммунного ответа млекопитающему могут включать фармацевтически эффективное количество полинуклеотида, включающего последовательность, кодирующую элемент клеточного иммунного ответа или его фрагмент, контейнер, включающий носитель и полинуклеотид в стерильной форме, и средства, связанные с контейнером, для обеспечения переноса полинуклеотида из контейнера в интерстициальное пространство ткани, в результате чего клетки данной ткани могут поглощать и экспрессировать полинуклеотид. Средства обеспечения такого переноса могут включать традиционную перегородку, которую можно проколоть, например, иглой. Альтернативно, когда контейнер представляет собой шприц, можно считать, что данные средства включают поршень шприца или иглу, прикрепленную к шприцу. Для получения одной или более чем одной стандартной дозы контейнеры могут содержать по меньшей мере 1, предпочтительно по меньшей мере 5 или 10, и более предпочтительно по меньшей мере 50 или 100 микрограммов полинуклеотида. Для многих применений данный контейнер будет содержать по меньшей мере 500 микрограммов или 1 миллиграмм, и часто будет содержать по меньшей мере 50 или 100 миллиграммов полинуклеотида.

Также предложены фармацевтические композиции, которые могут включать полинуклеотид, включающий последовательность, кодирующую элемент клеточного иммунного ответа или его фрагмент, в фармацевтически приемлемой вводимой форме в контейнере, и уведомление, связанное с контейнером, в форме, предписанной государственным органом, регулирующим изготовление, применение или продажу фармацевтических средств, причем уведомление отражает одобрение данным органом формы полинуклеотида для введения человеку или животному. Такое уведомление, например, может представлять собой этикетку, одобренную Управлением США по контролю за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств для отпускаемых по рецепту лекарственных средств или одобренный листок-вкладыш с информацией о продукте.

Предложенные в данном изобретении композиции можно вводить в виде фармацевтической композиции, где данную композицию готовят в виде препарата с фармацевтически приемлемым носителем, как общеизвестно в данной области. Методики изготовления препарата и введения можно найти, например, в "Remington's Pharmaceutical Sciences", (18th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990). Соответственно, композиции можно использовать в изготовлении лекарственного средства. Подразумевается, что фармацевтически приемлемый носитель или фармацевтическую композицию, или любое вещество, подходящее для введения млекопитающему, следует готовить и хранить согласно стандартам местных постановлений. Например, многие правительственные организации имеют руководства или правила, которые регулируют разные аспекты изготовления и обращения с композициями, которые предназначены для введения млекопитающим и/или людям, такие как санитарный контроль, контроль технологического процесса, оборудование и единство документов, и квалификация персонала. Предпочтительно, предложенные в данном изобретении композиции, которые включают фармацевтическую композицию или фармацевтически приемлемый носитель, подходят для введения человеку и соответствуют местным постановлениям, руководствам и/или предписаниям GMP (надлежащая практика организации производства), таким, как предписания, изложенные для такой цели Управлением США по контролю за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств.

Полинуклеотиды, включающие последовательность, кодирующую элемент клеточного иммунного ответа или его фрагмент, для инъекции, предпочтительного пути доставки, можно получить в стандартной лекарственной форме в ампулах или в многодозовых контейнерах. Данные полинуклеотиды могут присутствовать в таких формах, как суспензии, растворы или эмульсии в масляных или предпочтительно водных наполнителях. Альтернативно, полинуклеотид в форме соли может находиться в лиофилизированной форме для растворения, в момент доставки, подходящим наполнителем, таким как стерильная апирогенная вода. Как жидкие, так и лиофилизированные формы, которые подлежат растворению, будут содержать агенты, предпочтительно буферы, в количествах, необходимых для подходящей корректировки рН инъецируемого раствора. Для парентерального применения, особенно если препарат подлежит внутривенному введению, общую концентрацию растворенных веществ следует контролировать для того, чтобы сделать препарат изотоническим, гипотоническим или слабо гипертоническим. Для корректировки тоничности предпочтительными являются неионные вещества, такие как сахара, и сахароза является особенно предпочтительной. Любые из этих форм могут дополнительно содержать подходящие агенты для изготовления препаратов, такие как крахмал или сахар, глицерин или физиологический раствор. Данные композиции, как жидкие, так и твердые, могут содержать на единицу дозировки от 0,1% до 99% полинуклеотидного вещества.

Однодозовые ампулы или многодозовые контейнеры, в которых полинуклеотиды упакованы до применения, могут включать герметично закрытый контейнер, заключающий количество полинуклеотида или раствора, содержащего полинуклеотид, подходящее для его фармацевтически эффективной дозы или кратного числа эффективных доз. Данный полинуклеотид упакован в виде стерильного препарата, и герметично закрытый контейнер предназначен для сохранения стерильности препарата до применения.

Контейнер, в котором содержится полинуклеотид, включающий последовательность, кодирующую элемент клеточного иммунного ответа или его фрагмент, может включать упаковку, которая снабжена этикеткой, и этикетка может нести уведомление в форме, предписанной государственным органом, например, Управлением по контролю за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств, причем данное уведомление отражает одобрение данным органом, согласно Федеральному закону, изготовления, применения, продажи находящегося в нем полинуклеотидного вещества для введения человеку.

Федеральный закон требует, чтобы применение фармацевтической композиции в терапии человека было одобрено органом Федерального правительства. В Соединенных Штатах обеспечение выполнения находится в компетенции Управления по контролю за пищевыми продуктами и лекарствами, которое издает соответствующие инструкции для обеспечения такого одобрения, подробно изложенные в §301-392 U.S.С. 21. Инструкции для биологического материала, включая продукты, полученные из тканей животных, даны под §262 U.S.С. 42. Аналогичное одобрение требуется для большинства зарубежных стран. Инструкции варьируют от страны к стране, но отдельные процедуры хорошо известны специалистам в данной области, и предложенные в данном изобретении композиции и способы соответственно предпочтительно удовлетворяют им.

Дозировка, подлежащая введению, в большой степени зависит от состояния и размера субъекта, которого лечат, а также от частоты лечения и пути введения. Схемы длительной терапии, включая дозу и частоту, могут быть определены по первоначальному ответу и клиническому заключению. Предпочтительным является парентеральный путь инъекции в интерстициальное пространство тканей, хотя при определенном введении могут требоваться другие парентеральные пути, такие как ингаляция аэрозольного препарата, как, например, на слизистые оболочки носа, глотки, бронхиальных тканей или легких.

Как таковой, в данном изобретении предложен фармацевтический продукт, который может включать полинуклеотид, включающий последовательность, кодирующую элемент клеточного иммунного ответа или его фрагмент, в растворе в фармацевтически приемлемом инъецируемом носителе, и подходящий для интерстициального введения в ткань для того, чтобы вызвать экспрессию элемента клеточного иммунного ответа или его фрагмента в клетках ткани, контейнер, содержащий данный раствор, и уведомление, связанное с контейнером, в форме, предписанной правительственным органом, регулирующим изготовление, применение или продажу фармацевтических средств, причем данное уведомление отражает одобрение данным органом изготовления, применения или продажи раствора полинуклеотида для введения человеку.

Введение

В любом из раскрытых в данном изобретении способов предпочтительно, чтобы композиция, содержащая полинуклеотид, включающий последовательность, кодирующую элемент клеточного иммунного ответа или его фрагмент, была доставлена млекопитающему. Более предпочтительно, млекопитающим является человек. Введение композиций согласно любому из раскрытых в данном изобретении способов можно осуществлять согласно любому из разных способов, известных в данной области. Например, в патенте США №5676954 раскрыта инъекция генетического материала в комплексе с катионными липидными носителями мышам. Также в патентах США №№ 558966, 5693622, 5580859, 5703055 и в международной патентной заявке РСТ PCT/US 94/06069 (WO 94/29469) предложены способы доставки композиций, содержащих "голую" ДНК или комплексы ДНК с катионными липидами, позвоночным.

В некоторых воплощениях соединение, содержащее полинуклеотид, включающий последовательность, кодирующую элемент клеточного иммунного ответа или его фрагмент, можно вводить парентерально, например, внутрисосудисто, внутривенно, внутриартериально, внутримышечно, подкожно или тому подобное. Данное соединение можно вводить в мышечную, кожную, мозговую, легочную ткань, в ткани печени или селезенки. Соединение также можно вводить в кровь. Введение также может быть пероральным, интраназальным, ректальным, чрескожным или ингаляционным посредством аэрозоля. Данную композицию также можно вводить в виде болюса или осуществлять медленную инфузию.

Полинуклеотид, включающий последовательность, кодирующую элемент клеточного иммунного ответа или его фрагмент, можно доставлять в интерстициальное пространство тканей животного организма, включая ткани мышц, кожи, мозга, легкого, печени, селезенки, костного мозга, тимуса, сердца, лимфы, крови, кости, хряща, поджелудочной железы, почки, желчного пузыря, желудка, кишок, яичка, яичника, матки, прямой кишки, нервной системы, глаза, железы и соединительную ткань. Интерстициальное пространство тканей содержит межклеточную жидкость, мукополисахаридный матрикс среди ретикулярных волокон тканей органов, эластичные волокна в стенках сосудов или полостей, коллагеновые волокна фиброзных тканей или тот же самый матрикс в соединительной ткани, окружающей мышечные клетки, или в лакунах кости. Аналогично, оно представляет собой пространство, занятое плазмой в системе кровообращения и лимфатической жидкостью в лимфатических каналах. Доставка в интерстициальное пространство мышечной ткани является предпочтительной по причинам, которые обсуждаются ниже. Их можно с удобством доставлять путем инъекции в ткани, содержащие эти клетки. Они предпочтительно доставляются и экспрессируются в стабильных неделящихся клетках, которые являются дифференцированными, хотя доставка и экспрессия могут осуществляться в недифференцированных или менее полно дифференцированных клетках, таких как, например, стволовые клетки крови или фибробласты кожи.

In vivo мышечные клетки являются особенно компетентными в их способности поглощать и экспрессировать полинуклеотиды. Эта способность может быть обусловлена особой архитектурой ткани мышц, содержащих многоядерные клетки, саркоплазматический ретикулум и поперечную ретикулярную систему. Предложенные в данном изобретении полинуклеотиды могут поступать в мышцы через поперечную ретикулярную систему, которая содержит внеклеточную жидкость и простирается глубоко в мышечную клетку. Также возможно, что полинуклеотиды проникают в поврежденные мышечные клетки, которые затем восстанавливаются.

Мышцу также преимущественно используют в качестве участка для доставки и экспрессии полинуклеотидов во многих терапевтических приложениях, поскольку животные имеют пропорционально большую мышечную массу, к которой удобно получить доступ посредством прямой инъекции через кожу; по этой причине сравнительно большая доза полинуклеотидов может быть внесена в мышцу посредством множественных инъекций, и повторные инъекции для продолжения терапии в течение длительных периодов времени легко выполняют и могут быть осуществлены безопасно и без специальной квалификации или устройств.

Ткани, отличные от мышц, также можно успешно использовать в качестве участков для инъекции для получения элементов клеточного иммунного ответа. Одним таким условием является применение полинуклеотида для получения полипептида, который, для того, чтобы быть эффективным, должен присутствовать в ассоциации с клетками конкретного типа; например, с рецепторами клеточной поверхности клеток печени, связанных с гомеостазом холестерина (Brown and Goldstein, Science 232: 34-47 (1986)). В этом приложении и во многих других, таких как приложения, в которых фермент или гормон являются продуктом гена, может отсутствовать необходимость достижения высоких уровней экспрессии с целью вызвать ценный терапевтический результат.

В некоторых воплощениях полинуклеотид, включающий последовательность, кодирующую элемент клеточного иммунного ответа или его фрагмент, вводят в ткани с использованием одного инъецируемого носителя. Данный носитель предпочтительно является изотоническим, гипотоническим или слабо гипертоническим и имеет относительно низкую ионную силу, например, обеспечиваемую раствором сахарозы. Данный препарат может дополнительно предпочтительно содержать источник цитокина, который включен в липосомы в форме полипептида или полинуклеотида.

Соединения, содержащие полинуклеотид, включающий последовательность, кодирующую элемент клеточного иммунного ответа или его фрагмент, могут быть приготовлены таким образом, чтобы включать другие полезные в медицинском отношении лекарственные средства или биологические агенты. Данные соединения также можно вводить в сочетании с введением других лекарственных средств или биологических агентов, полезных для лечения заболевания или состояния, против которого направлены описанные в данном изобретении соединения (см., например, патент США №6413955 в отношении активных ингредиентов, полезных для лечения остеопороза).

Соединения, содержащие полинуклеотид, включающий последовательность, кодирующую элемент клеточного иммунного ответа или его фрагмент, также можно вводить в ткани или в клетки посредством "генной пушки". ДНК можно наносить на микрочастицы золота и можно доставлять внутрикожно с помощью установки для бомбардировки частицами, или "генной пушки", как описано в литературе (см., например, Tang et al. (1992), Nature 356: 152-154), где бомбардирующие частицы из золота покрывают терапевтической ДНК, затем бомбардируют клетки кожи.

Соединения, содержащие полинуклеотид, включающий последовательность, кодирующую элемент клеточного иммунного ответа или его фрагмент, также можно вводить посредством интраназального или перорального введения. Низкие дозы благоприятствуют активному подавлению, тогда как более высокие дозы благоприятствуют клональной анергии/делеции. Пероральный и/или интраназальный антиген индуцирует Т-хелперные 2 (Th2) Т-клетки, например IL-4 и IL-10, и Т-хелперные 3 (Th3) Т-клетки, например TGF-β, плюс CD4+ CD25+ регуляторные клетки и Т-клетки с латентно ассоциированным пептидом (latency-associated peptide). Таким образом, индукцию пероральной толерантности можно усилить путем введения IL-4, IL-10, анти-IL-12, TGF-β, В субъединицы холерного анатоксина, Flt-3 лиганда и анти-CD40 лигандов.

Пероральное и интраназальное введение антигена (например мукозальная толерантность) подавляет животные модели аутоиммунных заболеваний, включающих экспериментальный аутоиммунный энцефалит, увеит, тироидит, миастению, артрит и диабет у диабетических мышей, не страдающих ожирением (NOD), плюс неаутоиммунных заболеваний, таких как астма, атеросклероз, отторжение трансплантата, аллергия (такая как контактная чувствительность к динитрохлорбензолу (DNCB) и аллергия к никелю), колит, инсульт и модели болезней Альцгеймера (McGeer P. et al., 42 Neurology 447-449 (1992); Okuray Y., 103(25) PNAS USA 9619-24 (Epub June 12, 2006); Qu В. et al., 244(1-2) J. Neurol. Sci. 151-158 (2006)). Мукозальная толерантность может быть полезной для лечения нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, благодаря легкости введения, отсутствию токсичности и антигенспецифическим механизмам действия.

Мукозальная толерантность представляет собой привлекательный подход для лечения нейродегенеративных заболеваний из-за отсутствия токсичности, легкости введения в течение некоторого периода времени и антигенспецифических механизмов действия. Успешное применение оральной толерантности для лечения заболеваний человека будет зависеть от дозы, разработки иммунных маркеров для оценки иммунологических эффектов, пути (интраназальный по сравнению с пероральным), препарата, мукозальных адъювантов, комбинированной терапии и ранней терапии.

Фраза "эффективное количество" в том виде, как она используется в данном изобретении, относится к дозе, достаточной для обеспечения достаточно высоких концентраций для оказания полезного эффекта на ее реципиента. Конкретный уровень терапевтически эффективной дозы для любого конкретного субъекта будет зависеть от множества факторов, включая расстройство, которое лечат, тяжесть расстройства, активность конкретного соединения, путь введения, скорость выведения соединения, продолжительность лечения, лекарственные средства, используемые в комбинации или одновременно с данным соединением, возраст, массу тела, пол, диету и общее состояние здоровья субъекта, и подобные факторы, хорошо известные в данных областях науки и медицины. Разные общие соображения, принимаемые во внимание при определении "терапевтически эффективного количества", известны специалистам в данной области и описаны, например, в Oilman et al., eds., Goodman And Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990.

Адъюванты

Для доставки полинуклеотида, включающего последовательность, кодирующую элемент клеточного иммунного ответа или его фрагмент, в систему млекопитающего, обычно предпочтительно использовать систему доставки. Такая система может дать много преимуществ, в частности обеспечение стабилизации для защиты целостности ДНК, а также содействие поглощению клеткой.

Кроме того, как проиллюстрировано типичными системами доставки, описанными в данном изобретении (т.е. трансфекционными реагентами), не-ДНК компоненты данного препарата могут способствовать усилению или активации иммунной системы. В результате, для усиления или минимизации иммуностимулирующего эффекта можно выбрать компоненты системы доставки в сочетании с конкретным генным продуктом.

Иммуностимулирующие эффекты также описаны для определенных нуклеотидных последовательностей. Например, Sato et al., Science 273: 352-354 (1996) описывает эффекты вакцинации двухцепочечной ДНК, имеющей определенные последовательности, содержащие CpG, на продукцию интерферона-γ, интерферона-β и интерлейкина-12.

Трансфекционные реагенты

Композиции, включающие полинуклеотид, включающий последовательность, кодирующую элемент клеточного иммунного ответа или его фрагмент, как предложено в данном изобретении, также могут включать одно или более вещество, облегчающие трансфекцию, которые облегчают доставку полинуклеотидов внутрь клетки и/или к желательному месту в клетке. Многие такие вещества, облегчающие трансфекцию, имеются в продаже, например, Lipofectin, Lipofectamine, Lipofectamine 2000, Optifect, Superfect. Примеры веществ, облегчающих трансфекцию, включают, но не ограничиваются этим, липиды, предпочтительно катионные липиды; неорганические вещества, такие как фосфат кальция и частицы металла (например, золота или вольфрама) (например, растворы для доставки "порошкового" типа); пептиды, включая катионные пептиды, нацеливающие пептиды для селективной доставки в определенные клетки или внутриклеточные органеллы, такие как ядро или ядрышко, и амфипатические пептиды, т.е. спиральобразующие или порообразующие пептиды; основные белки, такие как гистоны; асиалопротеины; вирусные белки (например, белок оболочки вируса Сендай); порообразующие белки; и полимеры, включая дендримеры, звездообразные полимеры, "гомогенные" полиаминокислоты (например, полилизин, полиаргинин), "гетерогенные" полиаминокислоты (например, смеси лизина и глицина), сополимеры, поливинилпирролидинон (PVP) и полиэтиленгликоль (PEG). Кроме того, такие вспомогательные агенты, которые облегчают и усиливают поступление полинуклеотида в клетки позвоночных in vivo, также можно рассматривать в качестве "веществ, облегчающих трансфекцию".

Трансфекция, облегченная липофекцией, хорошо известна в данной области, как описано, например, в патентах США №№6034072, 6040295 и 6710035. Некоторые воплощения предложенных в данном изобретении композиций могут включать в качестве вещества, облегчающего трансфекцию, липиды, включая катионные липиды (например DOTMA, DMRIE, DOSPA, DC-Chol, GAP-DLRIE), основные липиды (например стериламин), нейтральные липиды (например холестерин), анионные липиды (например фосфатидилсерин) и цвиттерионные липиды (например DOPE, DOPC). Предпочтительно, катионный липид смешивают с одним или более чем одним солипидом. В целях определения термин "солипид" относится к любому гидрофобному веществу, которое можно объединять с катионным липидным компонентом, и включает амфипатические липиды, такие как фосфолипиды, и нейтральные липиды, такие как холестерин. Катионные липиды и солипиды можно смешивать или объединять различными способами для получения множества нековалентно связанных макроскопических структур, включая, например, липосомы, многослойные везикулы, однослойные везикулы, мицеллы и простые пленки.

Доставка также может осуществляться посредством применения ДНК-транспортеров. Термин "ДНК-транспортеры" относится к молекулам, которые связывают ДНК-векторы и способны поглощаться эпидермальными клетками. ДНК-транспортеры содержат молекулярный комплекс, способный нековалентно связываться с ДНК и эффективно транспортировать ДНК через клеточную мембрану. ДНК-транспортерная система может состоять из частиц, содержащих несколько элементов, которые независимо и нековалентно связываются с ДНК. Каждый элемент состоит из лиганда, который распознает специфические рецепторы или другие функциональные группы, такие как белок в комплексе с катионной группой, которая связывается с ДНК. Примерами катионов, которые могут быть использованы, являются спермин, производные спермина, гистон, катионные пептиды и/или полилизин. Первый элемент способен связываться как с ДНК-вектором, так и с рецептором клеточной поверхности на клетке-мишени. Примерами таких элементов являются органические соединения, которые взаимодействуют с рецептором асиалогликопротеина, рецептором фолата, рецептором маннозо-6-фосфата или рецептором карнитина. Второй элемент способен связываться как с ДНК-вектором, так и с рецептором на ядерной мембране. Ядерный лиганд способен распознавать и транспортировать транспортерную систему через ядерную мембрану. Примером такого лиганда является последовательность нацеливания на ядро из большого Т антигена или гистона SV40. Третий элемент способен связываться как с ДНК-вектором, так и с элементами, которые индуцируют эписомный лизис. Примеры включают инактивированные вирусные частицы, такие как аденовирус, пептиды, родственные гемагглютинину вируса гриппа, или пептид GALA.

ПРИМЕР 1

Исследование ДНК-вакцины на животной модели

Для исследования эффектов ДНК-вакцинации и болезни Альцгеймера использовали трансгенных мышей (Tg-2576), содержащих двойную мутацию K670N/M671L АРР. Мышей содержали в комплексе помещений для животных Университета Теннеси согласно институциональным руководствам для таких исследований. Эти исследования были одобрены Институциональным комитетом Университета Теннеси по уходу и использованию животных согласно политике Министерства здравоохранения по уходу за человеком и использованию лабораторных животных. Результаты экспериментирования на животной модели дают доказательство приниципа адоптивной клеточной генной терапии у других организмов, конкретно у людей.

У мышей Tg-2576 в возрасте от четырех до пяти месяцев появляются поражения мозга. После девяти-десяти месяцев поражения полностью проявляются. Вакцинация, начинающаяся примерно в возрасте около четырех месяцев демонстрирует превентивные эффекты лечения против болезни Альцгеймера, тогда как вакцинация, начинающаяся после пятимесячного возраста (т.е. начиная с шести месяцев) демонстрирует лечение мышей, у которых уже развилась болезнь Альцгеймера.

Четырехмесячных мышей обрабатывали ДНК-вакцинами, кодирующими IL-4, IL-10, TGF-β, IFN-γ, или вводили им контрольный вектор. Каждой мыши давали 100 мкг вакцины. Мышей дважды подвергали повторной иммунизации с двухмесячными интервалами. Использовали как самцов, так и самок мышей Tg-2576, и содержали их до 60-недельного возраста. Мышей затем умерщвляли и их мозги удаляли, быстро замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С.

ПРИМЕР 2

Оценка памяти

Пространственное обучение и память оценивали с использованием задачи по навигации в водном лабиринте Морриса (водный лабиринт). Мышей тренировали в круглом бассейне с непрозрачной водой узнавать расположение платформы для того, чтобы вылезать из воды. Бассейн располагался в центре контейнера, имеющего отчетливые дистально расположенные пространственные ориентиры. Все испытания записывали на видеопленку камерой, расположенной над (бассейном). Водный резервуар (80 см в ширину, 80 см в глубину) заполняли водой с температурой 23°С. Скрытую круглую платформу (шириной 15 см) помещали на глубине 1 см под поверхностью воды, и она служила для животного в качестве спасительной платформы. Максимальное время плавания для каждого испытания составляло 90 секунд с последующим 20-секундным отдыхом на платформе. Каждую мышь тренировали в течение пяти суток, осуществляя четыре испытания в сутки. Четыре исходные точки рандомизировали для каждых суток тренировки. Тесты на запоминание (измерительное испытание) проводили в отсутствие платформы через 30 минут после последнего испытания. Каждое животное выпускали из места, расположенного напротив намеченного квадранта и позволяли ему плавать в течение 60 секунд. После переобучения на 7-е сутки, спасительную платформу передвигали в противоположный квадрант, и процедуру тренировки по изменению навыка проводили на 8-10-е экспериментальные сутки. Тесты на запоминание для тренировки по изменению навыка также проводили через 30 минут после последнего испытания на научение. Для каждого теста регистрировали латентный период (продолжительность времени, затраченного мышью на достижение платформы).

ПРИМЕР 3

Результаты с водным лабиринтом для предупреждения болезни

Альцгеймера

Результаты с водным лабиринтом восьмимесячных мышей, которых вакцинировали, начиная с четырехмесячного возраста.

Группа	Идентификационный номер мыши	Латентный период
Нормальная необработанная мышь	1	6 секунд
Мышь Тg-2576 с контрольным вектором	1	2 минуты
Мышь Тg-2576 с IL-10 вектором	1	15 секунд
Мышь Тg-2576 с TGF-β вектором	1	23 секунды

Результаты с водным лабиринтом девятимесячных мышей, которых вакцинировали, начиная с четырехмесячного возраста.

Группа	Идентификационный номер мыши	Латентный период
Нормальная необработанная мышь	1	6 секунд
Мышь Тд-2576 с контрольным вектором	1	2 минуты 40 секунд
2	52 секунды
Мышь Тд-2576 с IL-10 вектором	1	8 секунд
	2	7 секунд
3	15 секунд
Мышь Тд-2576 с TGF-β вектором	1	1 минута 20 секунд
2	1 минута 10 секунд
Мышь Тд-2576 с IL-4	1	10 секунд
вектором
Мышь Тд-2576 с IFN-γ вектором	1	25 секунд

Эти результаты показывают, что эффекты болезни Альцгеймера можно предупредить и/или значительно уменьшить посредством ранней обработки с использованием ДНК-вакцин.

ПРИМЕР 4

Результаты с водным лабиринтом для лечения болезни Альцгеймера

Результаты с водным лабиринтом для мышей в возрасте семи с половиной, девяти с половиной и одиннадцати месяцев, которых вакцинировали в возрасте шести, восьми, десяти и двенадцати месяцев.

Эксперимент 1: Результаты мышей в возрасте семи с половиной месяцев

Группа	Идентификационный номер мыши	Латентный период
Нормальная необработанная мышь	1	6 секунд
Мышь Тg-2576 с контрольным вектором	1	2 минуты
Мышь Тg-2576 с TGF-β вектором	1	23 секунды
Мышь Тg-2576 c IL-10 вектором	1	15 секунд

Эксперимент 2: Результаты мышей в возрасте девяти с половиной месяцев

Группа	Идентификационный номер мыши	Латентный период
Мышь Тg-2576 с контрольным вектором	1	2 минуты 24 секунды
2	52 секунды
Мышь Тg-2576 с TGF-β вектором	1	1 минута 12 секунд
2	1 минута 6 секунд
Мышь Тg-2576 с IFN-γ	1	25 секунд
вектором
Мышь Тд-2576 с IL-4 вектором	1	10 секунд
Мышь Тд-2576 с IL-10 вектором	1	8 секунд
2	7 секунд

Эксперимент 3: Результаты мышей в возрасте одиннадцати месяцев

Группа	Идентификационный номер мыши	Латентный период
Мышь Тg-2576 с контрольным вектором	1	2 минуты 24 секунды
Мышь Тg-2576 со смешанными генами*	1	13 секунд
Мышь Тg-2576 с TGF-β вектором	1	1 минута 18 секунд
2	6 секунд
Мышь Тg-2576 с IFN-γ вектором	1	4 секунды
Мышь Тg-2576 с IL-4 вектором	1	10 секунд
Мышь Тg-2576 с IL-10 вектором	1	2 секунды
2	7 секунд
* Смешанные гены включают BDNF, IL-10, IL-4, АроЕ.

Поскольку поражения мозга образуются в возрасте около четырех-пяти месяцев, эти мыши имеют уже развившуюся болезнь Альцгеймера, и эти результаты показывают, что болезнь Альцгеймера может быть вылечена и ее эффекты снижены или обращены ДНК-вакцинами, кодирующими элемент клеточного иммунного ответа.

ПРИМЕР 5

Гистология мозга

После анестезии авертином осуществляли перфузию мышей через ухо раствором теплого 0,1 М фосфатного буфера (PBS), затем теплым забуференным 1,5%-ным раствором параформальдегида в течение двух минут. После этого следовала обработка вторым фиксатором, содержащим холодный 4%-ный параформальдегид в течение 25 минут. Животных обезглавливали, обнажая мозг и кости, и целую голову погружали в раствор нейтрального 10%-ного формальдегида и хранили в течение ночи. После промывки PBS, мозг дегидратировали этанолом и заливали в парафин. Собирали группы коронарных срезов толщиной 6 мкм, начиная с лобной доли к мозжечку, и монтировали последовательно с использованием микротома. Все срезы монтировали и окрашивали стандартным гематоксилином и эозином (Н&Е), и изучали иммуногистохимическое окрашивание бета-амилоида для доказательства поражения или нейродегенерации. Все срезы исследовали на световом микроскопе (Carl Zeiss Axioskop 2 plus HAL 100 с конечным увеличением × 400). Цифровые изображения срезов получали с использованием камеры (Leica), связанной с компьютером.

Протокол окрашивания гематоксилином и эозином (Н&Е)

Поместить предметные стекла, содержащие срезы в парафине, в держатель для предметных стекол (стеклянный или металлический).

Депарафинизировать и регидратировать срезы, используя:

3×3 мин ксилол (удалить фильтровальной бумагой избыток ксилола перед использованием этанола) (StatLab #8400, лабораторного качества, торговая марка Anapath, Lewisville, TX)

3×3 мин 100% этанол

1×3 мин 95% этанол

1×3 мин 80% этанол

1×5 мин деионизированная вода

Когда срезы находятся в воде, снять поверхностный слой гематоксилина Kimwipe для удаления окисленных частиц. Удалить фильтровальной бумагой избыток воды из держателя предметных стекол перед переносом в гематоксилин.

Окрашивание гематоксилином включает:

1×3 мин гематоксилин (Poly Scientific #212А, гематоксилин по Харрису с ледяной уксусной кислотой, Bayshore, NY)

Промыть деионизированной водой

1×5 мин водопроводная вода (для обеспечения развития окрашивания)

Окунуть 8-12 раз (быстро) в подкисленный этанол (для обесцвечивания)

Промыть 2×1 мин водопроводной водой

Промыть 1×2 мин деионизированной водой (на этой стадии можно оставить на ночь).

Удалить фильтровальной бумагой избыток воды из держателя предметных стекол перед переносом в эозин.

Окрашивание эозином и дегидратация:

1×30 секунд эозин (вплоть до 45 секунд при использовании эозина из более старой партии) (Poly Scientific#s176, Eosin Phloxine stain, Bayshore, NY)

3×5 мин 95% этанол

3×5 мин 100% этанол (удалить фильтровальной бумагой избыток этанола перед переносом в ксилол)

2×15 мин ксилол

Можно оставить предметные стекла в ксилоле на ночь для получения хорошей очистки от какого-либо количества воды.

Поместить каплю Permount (на основе ксилола) (Fisher Scientific #SP15-100, гистологическая заключающая среда) на предметное стекло с использованием стеклянного стержня, следя за тем, чтобы не оставить пузырей.

Установить под углом покровное стекло и дать ему мягко опуститься на предметное стекло. Дать Permount распространиться под покровным стеклом, покрывая всю ткань.

Сушить в течение ночи в вытяжном шкафу.

Протокол иммуногистохимического окрашивания бета-амилоида

Бета-амилоид представляет собой отложение внеклеточного филаментного белка, обнаруженное в мозге. Он представляет собой главный белковый компонент амилоидных ядер и нейритных бляшек и также обнаруживается в виде отложения в нейрофибриллярных клубках. У людей болезнь Альцгеймера является самой распространенной причиной старческого слабоумия и характеризуется аномальными отложениями филаментного белка в мозге. Отложения бета-амилоида также определяются при деменции с тельцами Леви, синдроме Дауна, амилоидозе (голландского типа) и при комплексе деменции с болезнью Паркинсона (Гуам типа). Мозговую ткань с этими заболеваниями, помимо мозговой ткани с болезнью Альцгеймера, использовали в качестве положительных контролей.

Стадия фиксации: фиксированные формалином, залитые в парафин срезы.

Положительные контроля: мозговая ткань с болезнью Альцгемера, деменцией с тельцами Леви, синдромом Дауна, амилоидозом (голландского типа) и комплексом деменции с болезнью Паркинсона (Гуам типа).

Растворы и реагенты:

Первичное антитело:

Мышиное против бета-амилоида (клон: 6F/3D) (Novocastra, Cat# NCL-B-Amyloid). Оптимальное разведение 1:100. Видовая реактивность: человек, мышь (для дополнительной информации обратитесь к таблице с данными по антителу).

Вторичное антитело:

Лошадиное против IgG мыши (H+L), биотинилированное (Vector Laboratories, Cat# BA-2000). Оптимальное разведение 1:500.

Реагент для определения:

НРР(пероксидаза хрена)-стрептавидин (Vector Laboratories, Cat# SA-5004). Оптимальное разведение 1:500.

Методика:

1. Парафиновые срезы переносят в дистиллированную воду.

2. Демаскировка антигена: использовать способ демаскировки антигена муравьиной кислотой.

3. Промыть срезы в 2 сменах промывочного буфера, по 2 минуты каждый раз.

4. Блокирование сывороткой: инкубировать срезы с блокирующим раствором нормальной лошадиной сыворотки в течение 30 минут для блокирования неспецифичного связывания иммуноглобулина.

5. Первичное антитело: инкубировать срезы с мышиными антителами против бета-амилоида (Novocastra, Cat# NCL-B-Amyloid), разведенными 1:100 в буфере для разведения первичного антитела в течение 1 часа при комнатной температуре.

6. Промыть в промывочном буфере 2 раза по 2 мин.

7. Блокирование пероксидазы: инкубировать срезы в растворе, блокирующем пероксидазу, в течение 10 минут для блокирования эндогенной пероксидазной активности.

8. Промыть в промывочном буфере 3 раза по 2 мин.

9. Вторичное антитело: инкубировать срезы с биотинилированными антителами лошади против IgG мыши, разведенными в буфере для разведения вторичного антитела, в течение 30 минут при комнатной температуре.

10. Промыть в промывочном буфере 3 раза по 2 мин.

11. Определение: инкубировать срезы с HRP-стрептавидином, разведенным в буфере для разведения HRP-стрептавидина, в течение 30 минут при комнатной температуре.

12. Промыть в промывочном буфере 3 раза по 2 мин.

13. Хромоген/субстрат: инкубировать срезы в растворе пероксидазного субстрата DAB (диаминобензидин) в течение 5-10 минут.

14. Быстро промыть в дистиллированной воде,

15. Контрастное окрашивание раствором гематоксилина Гиля (Gill) или раствором гематоксилина Майера (Мауеr), если это желательно.

16. Промыть в текущей водопроводной воде в течение 5 минут.

17. Дегидратировать посредством 95% этанола в течение 2 минут, 100% этанола 2 раза по 3 мин.

18. Осветлить в ксилоле 2 раза по 3 мин.

19. Покрыть покровным стеклом с постоянной монтировочной средой.

Результаты:

Картина окрашивания: положительное окрашивание можно наблюдать в ядрах сенильных бляшек, на периферии бляшек и в диффузных бляшках. В некоторых случаях болезни Альцгеймера окрашивание можно наблюдать в стенках сосудов и в внеклеточных нейрофибриллярных клубках.

Примечания:

1. Родственные протоколы: Tau (Tau-2) (Novocastra)

2. Может быть необходимым блокирование авидина/биотина для того, чтобы блокировать активность эндогенного биотина для определенных тканей, таких как (ткани) почки, печени, простаты, толстой кишки и кишечника, которые могут содержать эндогенный биотин. Для замороженных тканей - быстро заморозить свежие ткани в изопентане, предварительно охлажденном в жидком азоте, залить в соединение ОСТ в криоформах. Нарезать 4-8 мкм срезы на Cryosat и смонтировать на предметных стеклах Superfrost plus. Хранить предметные стекла при -80°С до момента, когда они понадобятся. Перед окрашиванием высушить предметные стекла на воздухе при комнатной температуре в течение 30 минут и зафиксировать в ледяном ацетоне в течение 5 минут. Высушить на воздухе в течение еще 30 минут. Затем начать со стадии 3 для рутинного иммуноокрашивания.

ПРИМЕР 6

Результаты с водным лабиринтом для предупреждения болезни

Альцгеймера

Результаты с водным лабиринтом у мышей в возрасте шестнадцати месяцев, которых вакцинировали в возрасте шести, восьми, десяти, двенадцати и четырнадцати месяцев.

Группа	Идентификационный номер мыши	Латентный период
Нормальная необработанная мышь	1	6 секунд
Мышь Тg-2576 с контрольным вектором	1	1 минута 2 секунды
Мышь Тg-2576 с IL-10 вектором	1	3 секунды
2	4 секунды
Мышь Тg-2576 с TGF-β вектором	1	14 секунд
Мышь Тg-2576 с IL-4 вектором	1	4 секунды
Мышь Тg-2576 с IL-10 и IL-4 вектором	1	3 секунды
Мышь Тg-2576 с IFN-γ вектором	1	24 секунды

Результаты с водным лабиринтом у мышей в возрасте тринадцати месяцев, которых вакцинировали в возрасте шести, восьми, десяти и двенадцати месяцев.

Группа	Идентификационный номер мыши	Латентный период
Нормальная необработанная мышь	1	6 секунд
Мышь Тg-2576 с	1	3 минуты 40 секунд
контрольным вектором	2	1 минута 40 секунд
Мышь Тg-2576 с IL-10 вектором	1	1 секунда
	2	1 секунда
3	8 секунд
Мышь Тg-2576 с TGF-β вектором	1	1 минута 20 секунд
2	30 секунд
Мышь Тg-2576 с IL-4 вектором	1	10 секунд
Мышь Тg-2576 с IL-10 и IL-4 вектором	1	1 секунда
2	2 секунды
Мышь Тg-2576 с IL-10 и TGF-β вектором	1	45 секунд
2	44 секунды
Мышь Тg-2576 с β-амилоидным вектором	1	48 секунд
2	2 минуты 35 секунд
Мышь Тg-2576 с β-амилоидным и АРО-Е вектором	1	36 секунд
Мышь Тg-2576 с β-амилоидным и NGF вектором	1	19 секунд
2	36 секунд
Мышь Тg-2576 с IFN-γ вектором	1	2 минуты 8 секунд
2	36 секунд

ПРИМЕР 7

Гистология мозга при вакцинации смешанными генами

Мозговые ткани мышей в области гиппокампа обрабатывали, как описано выше, у восемнадцатимесячных трансгенных мышей с белком-предшественником амилоида (АРР от англ. amyloid precursor protein), которые получали только вектор с ДНК-вакциной (Фиг.2а) или смесь ДНК-вакцин, содержащих гены IL-4, IL-10, фактора роста нервов, происходящего из мозга (NGF) и Аро-Е2 (Фиг.2б). Обработанных мышей внутримышечно вакцинировали в возрасте шести, восьми, десяти, двенадцати, четырнадцати и шестнадцати месяцев. Дозировки каждой обработки смешанной ДНК-вакциной составляли приблизительно 100 микрограммов на инъекцию для каждого из четырех генов (всего приблизительно 400 микрограммов). Замороженные ткани мозга окрашивали флуоресцентно меченым антителом против амилоидного белка. В необработанном мышином мозге присутствует большое количество амилоидных тканей (Фиг.2а) и в мышином мозге, обработанном смешанной ДНК-вакциной, присутствует заметно меньше амилоидных белков (Фиг.2б).

Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в данном изобретении, имеют такое же значение, которое обычно понятно обычному специалисту в области, к которой принадлежит это изобретение.

Изобретения, описанные иллюстративно в данном изобретении, могут соответственно использоваться на практике в отсутствие какого-либо элемента или элементов, ограничения или ограничений, конкретно не раскрытых в данном изобретении. Таким образом, например, термины "состоящий", "включающий", "содержащий" и т.д. следует читать в расширительном смысле и без ограничения. Дополнительно, используемые в данном изобретении термины и выражения были использованы как термины описания, а не ограничения, и при использовании таких терминов и выражений нет намерения исключать какие-либо эквиваленты показанных или описанных признаков или их частей, но считается, что в пределах объема заявленного изобретения возможны различные модификации.

Таким образом, следует понимать, что хотя настоящее изобретение было конкретно раскрыто посредством предпочтительных воплощений и возможных признаков, модификации, улучшения и изменения изобретений, воплощенных в нем, раскрытое в данном изобретении может быть изменено специалистами в данной области, и что такие модификации, улучшения и изменения рассматриваются как находящиеся в пределах объема данного изобретения. Предложенные в данном изобретении материалы, способы и примеры являются типичными для предпочтительных воплощений, иллюстративными и не предназначены для ограничений объема данного изобретения.

Данное изобретение было описано здесь широко и в общем виде. Каждая из более узких категорий и субродовых группировок, попадающие в общее описание, также образуют часть данного изобретения. Это включает общее описание данного изобретения с условием или отрицательным ограничением, удаляющими любой объект из данного рода, независимо от того, изложен ли в данном изобретении конкретно исключенный материал или нет.

Кроме того, когда признаки или аспекты данного изобретения описаны в контексте групп Маркуша, специалисты в данной области поймут, что изобретение таким образом также описано в контексте любого отдельного члена или подгруппы членов группы Маркуша.

Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, упомянутые в данном изобретении, непосредственно включены посредством ссылки во всей своей полноте в той же степени, как если бы каждая из них была индивидуально включена посредством ссылки. В случае конфликта, настоящее описание изобретения, включая определения, будет контролироваться.

Другие воплощения изложены в следующей формуле изобретения.

1. Способ лечения или облегчения симптомов болезни Альцгеймера у млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему композиции, содержащей одну или более нуклеиновых кислот, индуцирующих клеточный иммунный ответ, где указанные одна или более нуклеиновых кислот кодируют один или более цитокинов, выбранных из группы, состоящей из IL-4 (интерлейкин-4), IL-10 (интерлейкин-10) и TGF-β (трансформирующий фактор роста бета).

2. Способ по п.1, где указанная композиция дополнительно содержит одну или более нуклеиновых кислот, выбранных из группы, состоящей из нуклеиновых кислот, кодирующих АроЕ-2, фактор роста нервов (NGF) и нейротрофический фактор головного мозга (BDNF).

3. Способ по п.1, дополнительно включающий введение одной или более нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид, выбранный из группы, состоящей из NGF, BDNF и АроЕ-2 или их фрагментов.

4. Способ по п.1, где указанным млекопитающим является человек.

5. Способ по п.1, где указанное введение включает один или более способов, выбранных из группы, состоящей из внутривенной инъекции, внутримышечной инъекции, интраперитонеальной инъекции, подкожной инъекции и электропорации.

6. Способ по п.1, где указанное введение включает один или более способов, выбранных из группы, состоящей из инъекции, ингаляции и генной пушки.

7. Способ по п.1, где указанный полинуклеотид содержит кольцевую ДНК, содержащую участок начала репликации (ORI), промотор и сайт множественного клонирования (MCS).

8. Способ по п.1, где указанный полинуклеотид представляет собой плазмиду, содержащую промотор/энхансер, транскрипционно связанный с последовательностью, кодирующей ген элемента клеточного иммунного ответа.

9. Способ по п.8, где указанный промотор подходит для экспрессии в эукариотических клетках.

10. Способ по п.1, где указанную нуклеиновую кислоту вводят вместе с веществом, облегчающим трансфекцию.

11. Способ по п.1, где указанный полинуклеотид доставляют посредством адоптивной клеточной генной терапии.

12. Способ по п.1, где указанная адоптивная клеточная генная терапия включает введение клетки, способной к направленной доставке нуклеиновой кислоты к месту воспаления.

13. Способ по п.1, где указанная нуклеиновая кислота представляет собой вектор.

14. Способ по п.13, где указанный вектор включает один или более векторов, выбранных из группы, состоящей из pVAX1, pUMCV, pGCy и pLentilox-GFP.

15. Способ по п.1, где указанная композиция ингибирует или ослабляет экспрессию гена, который увеличивает воспаление.

16. Способ по п.1, где указанное введение приводит к уменьшению накопления амилоидных бляшек в головном мозге указанного млекопитающего.