Пробиотический препарат против вирусных и бактериальных инфекций "токсиспорин", способ его получения, штамм бактерий bacillus licheniformis, используемый в качестве компонента пробиотического препарата
Пробиотический препарат против вирусных и бактериальных инфекций содержит смесь биомассы штаммов бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-3679 и Bacillus licheniformis ВКПМ В-4161 в споровой форме с титром не менее 109 спор/г, и глауконит. Оптимальное содержание спор бактерий Bacillus subtilis в их смеси со спорами Bacillus lichenifbrmis составляет 50%. Препарат получают раздельным культивированием вышеоговоренных бактерий в глюкозо-мелассной среде при рН - 6,8-7,0, получают смесь спор в количестве 0,1-1 мас.% от массы препарата и смешивают ее с глауконитом до содержания КОЕ не менее 109 спор/г. Для приготовления препарата используют штамм бактерий Bacillus licheniformis ВКПМ В-4161. Изобретение обеспечивает расширение ассортимента пробиотиков, обладающих высокой антибактериальной и антивирусной активностью, и повышение терапевтической эффективности при лечении и профилактике вирусных и бактериальных инфекций. 3 н. и 4 з.п. ф-лы, 15 табл., 8 пр.
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к пробиотическим препаратам, используемым в медицине и ветеринарии для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний человека и животных, вызванных патогенными и условно патогенными микроорганизмами, а также дисбактериозов, обусловленных этиологически разнородными факторами (инфекциями, антибиотике- и химиотерапией, ионизирующими излучениями, острыми и хроническими интоксикациями и др.) и технологии их получения.
В настоящее время известно большое число пробиотических препаратов для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний человека и животных (ЕР 0097484, 1984, кл. А23С 1/05; ЕР 0043962, 1980, кл. А23С 19/086; US 4289888, 1979, кл. А23С 9/123). Такой препарат, как правило, содержит клетки бактерий, остатки культуральной жидкости (КЖ), жиры, белки, лактозу, камедь и другие добавки. Технология их получения включает в себя, как правило, подготовку раствора или взвеси биомассы микроорганизмов, введение в нее специальных добавок, сублимационное высушивание и получение готового продукта. Условия процесса и состав композиций определяются особенностями используемых микроорганизмов и характером поставленной задачи.
Так, известен препарат и способ его получения (RU 2080795, 10.06.1997). Данный препарат содержит живые клетки Lactobacillus acidophilus, желатин, сахарозу, обезжиренное молоко, воду, остатки культуральной жидкости. Способ его получения предусматривает культивирование бактерий Lactobacillus acidophilus в жидкой питательной среде, введение защитной среды, содержащей желатин, сахарозу, обезжиренное молоко, замораживание при температуре - 30 - (-)35°С в течение 18-12 часов, сублимационную сушку в течение 45-52 часов.
Недостатком препарата является относительно невысокая эффективность, ограниченная область применения, а также невозможность длительного хранения.
В настоящее время одним из перспективных направлений для обеспечения оздоровляющего воздействия на ЖКТ является применение препаратов, содержащих несколько штаммов микроорганизмов, обладающих синергетическим действием.
Известен препарат (RU 2160992, А23С 9/12; 27.12.2000), содержащий жизнеспособные клетки 2-х симбиотических штаммов Lactobacillus acidophilus, остатки культуральной жидкости (КЖ) и вспомогательные вещества - желатин, сахарозу, обезжиренное молоко. Способ его получения предусматривает культивирование бактерий в жидкой питательной среде, введение защитной среды, содержащей желатин, сахарозу и обезжиренное молоко, замораживание при температуре минус 25-30°С в течение 2-3 часов и сублимационную сушку в течение 45-48 часов.
Недостатком препарата является его недостаточная эффективность в отношении повышения резистентности организма к неблагоприятным условиям внешней среды, недостаточная термоустойчивость, относительно узкий спектр воздействия на организм.
Наиболее близким по технической сущности к заявляемой группе изобретений является препарат для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний человека, содержащий живые клетки штаммов Bacillus subtilis ВКПМ В-7092 и Bacillus licheniformis ВКПМ В-7038 в споровой форме с титром не менее 3×1010 спор/г, а также наполнитель (RU №2142287, А61К 35/74, 1999).
Препарат характеризуется высокой антагонистической активностью к широкому спектру патогенных и условно патогенных микроорганизмов, однако в него входят живые микроорганизмы, чувствительные к антибиотикам, поэтому препарат не рекомендуется применять при лечении совместно с антибиотиками, он не обладает противовирусным действием, а также антиоксидантной и ионообменной активностью.
Задачей, стоявшей перед авторами, являлось создание нового пробиотика с повышенной эффективностью на основе симбиотических культур, имеющего более выраженную амилолитическую, протеолитическую и антагонистическую активность в отношении болезнетворных микроорганизмов, и способного храниться в широком диапазоне потребительских температур.
Задача - создание препарата на основе штаммов бактерий Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis, обладающих повышенной термостабильностью, и иммобилизированых на природном ионообменнике и адсорбенте - глауконит. При этом предлагалось использовать микроорганизмы, способные подавлять рост как грибков (трихофитов, микроспориумов, эпидермофитонов, кандидомикозов и т.д.), так и болезнетворных бактерий - штаммов стафилококка, стрептококка, сальмонелл и др.
Технический результат заключается в расширении ассортимента пробиотиков, обладающих высокой антибактериальной и антивирусной активностью, и повышении терапевтической эффективности при лечении и профилактике вирусных и бактериальных инфекций.
Проведенные исследования показали, что иммобилизация спор бактерий, на глауконите обеспечивает им механическую защиту, длительный срок хранения, предотвращает слипание спор бактерий, способствует ускорению прорастания спор бактерий и пролонгированность действия, что повышает эффективность препарата и позволяет не менее суток поддерживать его активность на требуемом уровне.
При этом глауконит дополнительно обеспечивает связывание и выведение низкомолекулярных токсинов (метан, сероводород, аммиак и др.), тяжелых металлов и радионуклидов, участвует в селективном ионообмене (снимает или уменьшает негативное влияние на организм ионов алюминия, синергически взаимодействует с магнием и фтором, является дополнительным источником микроэлементов).
Технический результат был достигнут созданием группы изобретений, включающей в себя:
штамм бактерий Bacillus licheniformis, депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ), ГНИИ Генетика под номером ВКПМ В-4161;
препарат, включающий смесь биомассы штаммов бактерий Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis в споровой форме и наполнителя, отличающийся тем, что в качестве биомассы штаммов бактерий он содержит биомассу штаммов бактерий Bacillus subtilis 3/28 ВКПМ В-3679 и Bacillus licheniformis ВКПМ В-4161 в споровой форме с титрорм не менее 109 спор/г, а в качестве наполнителя - глауконит при следующем соотношении ингредиентов, мас.%:
смесь спор бактерий Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis - 0,1-1,0;
глауконит - остальное;
способ получения препарата, включающий в себя раздельное культивирование бактерии Bacillus sub-tilis 3/28 ВКПМ В-3679 и Bacillus licheniformis Л-34 ВКПМ В-4161 на глюкозо-мелассной среде при рН - 6,8-7,0, смешение полученной биомассы штаммов в споровой форме в соотношении 1:1 между собой и затем в количестве 0,1-1% мас. от массы препарата с глауконитом до содержания КОЕ не менее 109 спор/г.
Оптимальные результаты достигаются при использовании спор микроорганизмов в равном соотношении, однако возможно их использование при несколько большей или меньшей доле одного из штаммов в смеси, например, в количестве 40-60% от общей массы смеси.
Высокий титр спор бактерий при культивировании (1012 спор/г и более) обеспечивается за счет использования глюкозо-мелассной среде, оптимальной для выбранных микроорганизмов, имеющей следующий состав:
(NH4)2SO4 - 10,0 г/дм3; КН2РO4 - 4,0 г/дм3; меласса - 50,0 г/дм3;
глюкоза - 20,0 г/дм3; соевый пептон 2,0 г /дм3; дрожжевой экстракт - 3,0 г/дм3, и проведения культивирования в следующих условиях: температура 37°С; аэрация -1,0 объем воздуха/объем среды в минуту; скорость перемешивания 250 об/мин; рO2 - 40-60% от насыщения, время культивирования 24-36 часов.
Микроорганизмы до стадии смешения, как правило, подвергают сублимационной сушке, после чего смешивают сублимационно высушенную биомассу Bacillis subtilis 3/28 ВКПМ В-3679 и Bapillis licheniformis Л-34, ВКПМ В-4161 с глауконитом или напыляют биомассу на глауконит в сушильных установках или вакуумных аппаратах.
Иcпользуемые в композиции штампы обладают следующими характеристиками.
Штамм бактерий Bacillus subtilis 3/28, депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ), ГНИИ Генетика под номером ВКПМ В-3679. Штамм выделен из грубых кормов и подвергался многостадийной селекции на подавление бактериального и грибкового роста.
Штамм не является патогенным - Заключение ОАО Всероссийского научного центра по безопасности биологически активных веществ (ВНЦ БАВ), 2008 г.
Штамм ВКПМ В-3679 продуцирует биоспорицин - антибиотик широкого спектра действия, подавляющий рост грибков, стафилококков, стрептококков и синегнойной палочки.
С лучшими вариантами проводили эксперименты по подавлению роста: трихофитов, микроспориумов, эпидермофитонов, кандидомикозов и других грибков.
При длительном хранении штамма субстанцию лиофильно высушивают. Для размножения бактерий используют мясопептонный агар (МПА), а культивирование проводят при температуре 37°С.
В качестве компонента пробиотического препарата, используемого для подавления патогенной и условно-патогенной микрофлоры, оказывающего противовоспалительное и иммунокорректирующее действие, описан в патенте RU 2367454, 20.09.2009.
Изучаемая культура характеризуется отсутствием гемолитической активности (табл.1).
| Таблица 1 | |
| Физиолого-биохимические свойства штамма B.subtilis ВКПМ В-3679 | |
| Рост в анаэробных условиях | - |
| Ферментация | |
| Глюкозы | + |
| арабинозы | + |
| ксилозы | + |
| маннита | + |
| Утилизация | |
| цитрата | + |
| пропионата | - |
| Гидролиз | |
| крахмала | + |
| мочевины | - |
| Редукция нитратов | + |
| Образование газа из NO3 - в анаэробных условиях | |
| Обесцвечивание метиленовой сини | + |
| Аргининдигидролаза | - |
| Лецитиназа | - |
| Гиалуронидаза | - |
| Гемолитическая активность | - |
| Образование глобул поли-β-оксимасляной кислоты на глюкозном агаре | |
| Лизоцимная активность | + |
Как свидетельствуют данные, секционированный штамм Bacillus subtilis характеризуется типичными для этого вида физиолого-биохимическими признаками, которые могут обусловить широкий диапазон положительного действия при применении.
Антибиотикочувствительность. Исследования антибиотикоустойчивости штамма В.subtilis в отношении антибиотиков и антибиотических веществ, широко применяемых в практике здравоохранения, показали, что штамм обладает устойчивостью к ампициллину, бензилпенициллину, азтреонаму, цефтазидиму, цефтизоксиму и полимиксину Е (табл.2).
| Таблица 2 | |
| Антибиотикочувствительность штамма B.subtilis ВКПМ В-3679 | |
| Изучаемый препарат | Диаметр зон задержки роста культур, мм |
| B.subtilis 3А | |
| Амоксициллин | 18±0,1 |
| Ампициллин | 10±0,3 |
| Мезлоциллин | 20±0,3 |
| Метициллин | 18±0,1 |
| Оксациллин | 14±0,3 |
| Бензилпенициллин | 8±0,1 |
| Азтреонам | 0 |
| Имипенем | 36±0,4 |
| Моксалактам | 12±0,3 |
| Цефалотин | 32±0,5 |
| Цефамандол | 37±0,1 |
| Цефоперазон | 16±0,1 |
| Цефотаксим | 14±0,2 |
| Цефтазидим | 8±0,2 |
| Цефтизоксим | 0 |
| Цефтриаксон | 18±0,3 |
| Амикацин | 20±0,2 |
| Гентамицин | 24±0,2 |
| Канамицин | 23±0,1 |
| Тобрамицин | 24±0,3 |
| Ванкомицин | 12±0,1 |
| Клиндамицин | 10±0,3 |
| Тетрациклин | 24±0,3 |
| Хлорамфеникол | 16±0,2 |
| Полимиксин Е | 10±0,1 |
| Нитрофурантоин | 16±0,2 |
| Триметоприм | 24±0,1 |
| Норфлоксацин | 24±0,2 |
Штамм бактерий Bacillus licheniformis Л-34, депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ), ГНИИ Генетика под номером ВКПМ В-4161. Штамм выделен из молока и получен многостадийным селекционным путем. Штамм подвергался селекции на подавление бактериального и грибкового роста. С лучшими вариантами проводили эксперименты по подавлению роста болезнетворных штаммов: стафилококка, стрептококка, сальмонелл, трихофитов, микроспориумов, эпидермофитонов, кандидомикозов и др.
Культурально-морфологические и биохимические свойства штамма Вас.licheniformis ВКПМВ-4161. Штамм ВКПМ В-4161 относится к аэробам; грамположительная палочка, способная образовывать споры. Размеры вегетативных клеток (0,5-0,8) мкм и (1,5-3) мкм, иногда достигают до 6 мкм. Споры эллиптические, преимущественно расположены центрально, не более одной в клетке-спорангии, без отчетливой раздутости спорангии.
Вегетативные клетки В.licheniformis ВКПМ В-4161 хорошо растут на богатых питательных средах (мясопептонный бульон - МПБ и мясопептонный агар - МПА) при температуре (37-40)°С. Нет роста в присутствии 0,02% азида, но наблюдается рост на агаре Сабуро, при 7% NaCl и при добавлении 0,001%лизоцима.
Наблюдается слабый рост в анаэробном агаре.
На мясопептонном бульоне рН (7,30,1) через 48 часов инкубации при температуре (371)°С образует помутнение среды, а на поверхности - сухую пленку; на мясопептонном агаре Хоттингера рН (7,30,1) - слабовыпуклые сухие непрозрачные белесые колонии, полиморфные, мелкозернистые диаметром (4-6) мм, врастающие в питательную среду.
Биохимические свойства. Вегетативные клетки В.licheniformis ВКПМ В-4161 гидролизуют казеин и крахмал, каталазоположительны. Реакция Фогес-Проскауэра положительная.
Штамм не является патогенным - Заключение ОАО ВНЦ БАВ 2008 г.
Штамм ВКПМ В-4161 продуцирует протеолитические ферменты, подавляющие рост грибков, стафилокков, стрептококков и синегнойной палочки.
Терапевтическое действие препарата заключается в эффективном устранении условно-патогенной микрофлоры и восстановлении нормофлоры.
Препарат на основе ассоциации спор бактерий рода Bacillus получил условное наименование ТОКСИСПОРИН (заявителем подана заявка на товарный знак).
ТОКСИСПОРИН может использоваться как в сухой, так и в жидкой формах, путем введения в корм или пищу или самостоятельно. Для лечения препарат назначают перорально из расчета 1 кг препарата на 1 т корма или от 3 до 10 г на голову до выздоровления организма.
Препарат эффективен для всех видов млекопитающих при лечении и профилактике колибактериозов, дисфункций и дисбактериозов различной природы, чумки, парагриппа, гриппа, диспепсии, сальмонеллезов, инфекционного ринотрахеита крупнорогатого скота, вирусной диареи, ротавирусного энтерита, дизентерии, стафилококковых инфекций, везикулярного стоматита, язвенного дерматита, а также для профилактики иммунодефицитных состояний.
Препарат обладает одновременно антибактериальной и антивирусной активностью за счет высокой антагонистической активности микробной ассоциации спор бактерий рода Bacillus и действия глауконита, а также стимулирует клеточные и гуморальные факторы иммунитета и способен повышать неспецифическую резистентность организма.
Ассоциация бактерий, иммобилизированная на глауконите, отличается высокой устойчивостью к пищеварительным сокам и ферментам желудочно-кишечного тракта млекопитающих и способностью к быстрому заселению желудка и кишечника. При приеме внутрь с водой или пищей бактерии размножаются в желудочно-кишечном тракте в течение 3-6 суток, затем они полностью выводятся из организма, не вызывая негативных последствий даже при передозировке.
Размножаясь, бактерии своими протеазами лизируют все несвойственные организму млекопитающего белки, денатурированные белки и нуклеопротеиды. При этом уничтожаются бактериальные токсины, элементы опухолевых новообразований и другие дефектные клетки. Здоровые клетки остаются неповрежденными благодаря наличию в них ингибиторов-антиферментов.
Предлагаемый способ достаточно технологичен, не требуется использование дорогих ферментов на стадии культивирования, не требуется очистка и концентрирование препарата; удаление или перераспределение влаги совмещено с получением готовой формы препарата.
Сущность и преимущества заявляемой группы изобретений иллюстрируются следующими примерами.
Пример 1. Штаммы B.subtilis ВКПМ В-3679 и В.licheniformis ВКПМ В-4161 культивировали на среде Громыко (мясо-пептонный агар+сусло-агар в соотношении 1:1) при 37°С в течение 48 часов. Бактерии смывали с поверхности агара 7%-ным раствором NaCl и прогревали при 121°С в течение 15 мин. Полученный лизат разводили физиологическим раствором до получения вариантов с различной концентрацией клеток (по оптическому стандарту мутности). В другом варианте бактерии смывали с поверхности агара 7%-ным раствором NaCl и разводили физиологическим раствором до получения вариантов с различной концентрацией клеток (по оптическому стандарту мутности).
Вариант 1
Лизат биомассы штаммов B.subtilis и В.licheniformis - 1×108 КОЕ/мл
Вариант 2
Лизат биомассы штаммов B.subtilis и В.licheniformis - 1×109 КОЕ/мл
Вариант 3
Лизат биомассы штаммов B.subtilis и В.licheniformis - 1×1010 КОЕ/мл
Вариант 4
Лизат биомассы штаммов B.subtilis и В.licheniformis - 1×1011 КОЕ/мл
Вариант 5
Биомасса штаммов B.subtilis и В.licheniformis - 1×108 КОЕ/мл
Вариант 6
Биомасса штаммов B.subtilis и В.licheniformis - 1×109 КОЕ/мл
Вариант 7
Биомасса штаммов B.subtilis и В.licheniformis - 1×1010 КОЕ/мл
Вариант 8
Биомасса штаммов B.subtilis и В.licheniformis - 1×1011 КОЕ/мл
Изучали антагонистическую активность полученных вариантов препарата в отношении тест-культур (Таблица 3).
| Таблица 3 | ||||
| Антагонистическая активность различных вариантов пробиотика | ||||
| Варианты препарата | Зона подавления роста тест-культур, мм | |||
| Staphylococcus aures | Salmonella typhimurium | Shigella zonnei | Candida albicans | |
| 1 | 22 | 9 | 9 | 17 |
| 2 | 25 | 11 | 9 | 20 |
| 3 | 28 | 12 | 10 | 22 |
| 4 | 26 | 10 | 10 | 19 |
| 5 | 6 | 10 | 9 | 21 |
| 6 | 6 | 12 | 10 | 23 |
| 7 | 29 | 13 | 12 | 25 |
| 8 | 27 | 11 | 12 | 24 |
Как видно из данных, приведенных в таблице 3, оптимальным количеством микробных клеток в 1 мл препарата является - 1×109-1×1010 КОЕ/мл как живых клеток, так и их лизатов. Дальнейшее увеличение количества бактериальных клеток не изменяет существенным образом специфическую активность препарата в отношении тест-культур микроорганизмов.
Пример 2. Исследование антагонистической активности штаммов В.subitilis ВКПМ В-3679 и В.licheniformis ВКПМ В-4161
Антагонистическую активность в отношении тест-культур проверяют методом отсроченного антагонизма. В качестве тест-культур используют Shigella sonnei, Salmonella typhimurium. S.stenly, S.reading, S.derby, Staphylococous aureus, Pseudomonas aeruginose, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Candida albicans, C.tropicalis и др. Используемые тест-микробы должны удовлетворять следующим требованиям: находиться в S-форме, иметь типичные морфологические и ферментативные свойства.
Используемые штаммы тест-микробов давали положительную керато-конъюнктивальную пробу на морских свинках.
Тест-штаммы стафилококков образовывали зону гемолиза размером 3-5 мм вокруг своих колоний через 18-20 часов роста на кровяном агаре, коагулировали плазму крови кролика в течение 2-х часов, вызывали некроз в течение 48-72 часов при внутрикожном введении кролику 200 млн микробных клеток суточной культуры в 0,2 мл физиологического раствора.
Исследование антагонистической активности штаммов В.subtilis ВКПМ В-3679 и В.licheniformis ВКПМ В-4161 производили на плотной среде Гаузе N2.
Рецептура плотной среды Гаузе N2 на 1 л:
1. Бульон Хоттингера (700 мг% общего азота) - 30 мл
2. Пептон - 5 г
3. Натрия хлорид - 5 г
4. Глюкоза - 10 г
5. Агар микробиологический - 15 г
6. Дистиллированная вода - до общего объема 1 л.
После смешивания компонентов среду разогревали до полного растворения агара и фильтровали через ватно-марлевый фильтр в колбы по 0,3-0,4 л. Колбы со средой стерилизовали в автоклаве при давлении 0,1 МПа в течение 15 мин. После остывания до температуры (45±2)°С среду разливали по стерильным чашкам Петри. Чашки Петри со средой помещали в термостат и выдерживали при температуре (371)°С в течение (24±2) часов для проверки стерильности.
Культуры Shigella sonnei, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Candida albicans и другие вышеуказанные тест-культуры выращивали на чашках Петри в течение (18±2) часов на мясопептонном агаре (МПА). В стерильные пробирки приливали по 1 мл физиологического раствора и готовили суспензии тест-штаммов с концентрацией (3,0±0,2)109 клеток/мл.
Для проведения испытания от каждой серии отбирали четыре пробы по 2 г. Далее 0,5 г препарата на основе штамма В.subtilis разводили в 1 мл физиологического раствора. Полученную взвесь высевали штрихом с помощью микробиологической петли по диаметру чашки Петри с плотной средой Гаузе N2. Посевы инкубировали в термостате при 37°С в течение 72 часов. Затем к выросшей культуре подсеивали посевной материал тест-микробов методом перпендикулярных штрихов.
Учет результатов проводили через 18 часов инкубирования при 37°С по величине зон отсутствия роста тест-культур. Контролем роста тест-культур служил их параллельный высев на чашки с той же плотной средой Гаузе N2 без исследуемой ассоциации культур.
Штамм В.subtilis ВКПМ В-3679 характеризуется следующими показателями зон задержки роста тест-культуры (мм):
Shigella sonnei - 17-22
Salmonella typhimarium - 21-25
S.stenly - 13-17
S.reading - 14-18
S.derby - 15-18
Staphylococcus aureus - 22-27
Pseudomonas fluoresocens - 8-10
Pseudomonas vulgaris - 10-12
Pseudomonas aeruginose - 7-9
Proteus vulgaris - 12-14
Klebsiella pheumoniae - 13-15
Candida albicans - 25-32
С.tropicalis - 22-26
Штамм В.licheniformis 4161 характеризуется следующими показателями зон задержки роста тест-культуры (мм):
Shigella sonnet - 22-27
Salmonella typhimurim - 26-30
S.stenly - 18-22
S.reading - 19-23
S.derby - 20-23
Stapgylococcus aureus - 27-33
Pseudomonas aeruginose - 12-15
Proteus vulgaris - 17-19
Klebsiella pneumoniae - 18-20
Candida albicans - 30-34
С.tropicalis - 27-31
Таким образом, исследуемые штаммы бактерий имеют высокую антагонистическую активность в отношении широкого спектра патогенных и условно патогенных микроорганизмов.
Следует отметить, что штаммы не проявляют антагонистическую активность в отношении представителей нормальной микрофлоры - бифидо-, лактобактерий и кишечной палочки и относительно друг друга.
Спектр биологической активности штамма B.subtilis ВКПМ В-3679 дополнительно изучали по диффузии продуцируемых биологически активных веществ (БАВ) в агар по зонам задержки роста тест-культур.
Тест-культуры в концентрации 109 КОЕ/мл засевали на поверхность ага-ризованной среды (100 мкл суспензии/чашку). Сверлом (диаметр 6 мм) в агаре делали лунки, в которые вносили по 100 мкл лизата культуры B.subtilis. Чашки культивировали при 37°С в течение 24-48 часов. Активность препарата определяли по зонам угнетения роста штаммов.
| Таблица 4 | |
| Спектр биологической активности штамма B.subtilis ВКПМ В-3679 | |
| Тест-культура | Зона задержки роста тест-культур, мм |
| S.aureus 209 | 13±1.8 |
| S.aureus 3Ч | 14±2.0 |
| E.fecalis 115Ч | 17±1.9 |
| E.coli 22Ч | 9±1.1 |
| Enterobacter ssp.3Ч | 10±1.4 |
| Candida albicans 5Ч | 16±2.0 |
| Helicobacter pylori 2 | 14±1.3 |
| H.pylori 1 | 11±0.7 |
| H.pylori 5 | 15±1.4 |
| H.pylori 38 | 12±1.2 |
| H.pylori 11 | 13±0.9 |
| H.pylori 54 | 16±1.7 |
Данные таблицы 4 свидетельствуют о том, что пробиотический штамм B.subtilis ВКПМ В-3679 продуцирует биологически активные вещества широкого спектра специфического действия.
Пример 3. При промышленной технологии культивирование штаммов В.Subtilis и В.licheniformis ведется раздельно в ферментере с глюкозо-мелассной средой, содержащей: (NH4)2SO4 - 10,0 г/дм3; KH2PO4 - 4,0 г/дм3; мелассу - 50,0 г/дм3; глюкозу - 20,0 г/дм3; соевый пептон - 2,0 г/дм3; дрожжевой экстракт - 3,0 г/дм3, рН 6,8-7,0, при температуре 37°С, скорости аэрации 1,0 об.воздуха/об.среды в минуту; скорости перемешивания 250 об/мин; pO2 - 40-60% от насыщения в течение 24-36 и 30-36 ч соответственно.
Процесс считается законченным, если концентрация клеток составляет 3-3,5 и 1 млрд/мл соответственно и соотношение спор и вегетативных клеток 1:1.
По окончании инкубации штаммов B.subtilis и В.licheniformis и смешивании в соотношении 1:1, смесь концентрируют на бактофуге с периодической выгрузкой пасты. Сепарирование культуральной жидкости проводят при скорости вращения ротора - 6000 об/мин. Скорость подачи культуральной жидкости 80-100 л/ч. Выгрузку производят через каждый час. Выход пасты по объему составляет 10-15% от объема культуральной жидкости. Содержание сухих веществ в пасте - 18-20%. По окончании сепарирования пасту охлаждают до 20°С, разливают в ампулы (флаконы) или в кассеты из нержавеющей стали, после чего подвергают замораживанию и обезвоживанию на вакуум-сушильной установке или высушивают распылительным способом без добавления протекторов.
Концентрат лиофильно высушенных споровых культур Bacillis subtilis 3/28 штамм ВКПМ В-3679 и Bacillis licheniformis Л-34 штамм ВКПМ В-4161 смешивается с глауконитом в смесителе до содержания КОЕ не менее 1-3×109 в 1 грамме.
Пример 4.
Получение препарата путем обезвоживания.
По окончании инкубации штаммов B.subtilis и В.licheniformis и смешивании их в соотношении 1:1, по технологии примера 4, отбирают 10% весовых частей от массы конечной формы препарата. Навеску биомассы в жидком виде смешивают с расчетным количеством глауконита до достижения остаточной влажности 4-6%, после чего препарат расфасовывают. При необходимости препарат подсушивают в вакуум сушильном агрегате (на полках). Конечное содержание клеток не менее 1×109 КОЕ/г.
Пример 5. Получение препарата в вакуум сушильных агрегатах.
По окончании инкубации штаммов B.subtilis и В.lichenifbrmis и смешивании 1:1, по технологии примера 4, отбирают 10% весовых частей от массы конечной формы препарата. Навеску биомассы в жидком виде напыляют на расчетное количество глауконита фонтанирующее в нагретом до 90°С воздухе в сушильной установке до достижения остаточной влажности 4-6%, после чего препарат выгружают и расфасовывают. Конечное содержание клеток - не менее 1×109 КОЕ/г.
Пример 6. Исследование стабильности препарата. Было изучено влияние технологии получения на стабильность Токсиспорина на примере исследования 9 экспериментальных серий препарата, полученного тремя различными способами. Полученные результаты приведены в таблице 5.
| Таблица 5. | ||||
| Стабильность Токсиспорина полученного различными способами высушивания | ||||
| Способ высушивания | Показатели Токсиспорина в процессе хранения, КОЕ/г | |||
| 6 мес. | 12 мес. | 18 мес. | 24 мес. | |
| Сублимация | 3×109 | 3×109 | 3×109 | 2×109 |
| Капиллярно-химическое обезвоживание | 4×109 | 3×109 | 2×109 | 2×109 |
| Вакуум сушильный шкаф | 2×109 | 2×109 | 2×109 | 109 |
Как показывают полученные результаты, после хранения препарата при комнатной температуре на протяжении 24 мес. содержание живых микробных клеток ни в одной партии не оказалось ниже 109 КОЕ/г, что свидетельствует об эквивалентности данных способов получения.
Пример 7. Изучение способности препарата Токсиспорин адсорбировать ротавирус из жидкости.
Адсорбционную активность пробиотика Токсиспорин в отношении ротавирусов изучали, анализируя изменение количества пробиотика в вируссодержащей жидкости. При этом использовали культуральную жидкость ротавирусов крупного рогатого скота - штаммы Тиверваль и человека HRV-134 на культурах клеток почек зеленых мартышек с 0,25% раствора трипсина (20 БОЕ). Для исследований были выбраны следующие дозы пробиотика Токсиспорина в вируссодержащей жидкости (мг/мл): 1,0, 5,0, 10,0, 15,0, 20,0, 25,0, 30,0, 35,0, 40,0, 45,0, 50,0.
Во флаконы с различными навесками Токсиспорина вносили 10,0 мл вируссодержащей жидкости. Флаконы интенсивно встряхивали в течение 10 минут, центрифугировали при 3000 об/мин на протяжении 10 мин. Надосадочную жидкость отбирали и исследовали на наличие инфекционно-активного вируса методом титрования в культуре клеток по ЦПД50/мл вирусных антигенов в РНГА.
Полученные значения титра вирусов преобразовали в % адсорбированного вируса по формуле: А=100·(1-Т/То)%,
где Т - титр вируса в надосадочной жидкости после адсорбции,
То - исходный титр вируса в культуральной среде.
В итоге проведенного исследования установлена способность пробиотика Токсиспорин адсорбировать ротавирус из культуральной жидкости.
Установлено, что внесение пробиотика Токсиспорин в количестве 1,0 мг/мл количество адсорбированного вируса для штамма HVR-134 составило 45,0±1,0%, для штамма Тиверваль - 65,0±0,5%. Увеличение дозы Токсиспорина до 10,0 мг/мл повышался процент адсорбированного вируса для всех исследованных штаммов.
Сорбировалось: 73,0±1,0% штамма HRV-134 и 80,0±0,6% штамма Тиверваль. Увеличение дозы Токсиспорина до 15,0 мг/мл приводило к дальнейшему повышению процента адсорбированного ротавируса: 95,5±0,3% - для штаммов Тиверваль и 89,4±0,4% - для штамма HRV-134. Дальнейшее увеличение дозы Токсиспорина в вируссодержащей жидкости не вызывало изменений достигнутых величин.
Проведенные исследования показали способность пробиотика Токсиспорина адсорбировать ротавирусы из жидкой среды, что дает основания для использования его для профилактики и лечения ротавирусных диарей животных и человека.
Пример 8. Терапевтическая эффективность препарата Токсиспорин при желудочно-кишечных болезнях поросят.
Оценку терапевтического действия препарата проводили на поросятах-сосунах 2-3 недельного возраста (26 голов, из них 8 - контрольных) и поросятах-отъемышах в возрасте 2-3 месяцев (40 голов, из них 10 контрольных). Для этой цели были отобраны животные с признаками диареи: угнетенное состояние, низкая потребность в пище, наличие жидкого фекалия с неприятным запахом, повышенная температура тела. Больные животные опытных групп получали препарат в разных дозах 2 раза в день в течение 6 дней. Перед применением прпарат растворяли в теплой кипяченой воде и давали поросятам-сосунам из резиновой пипетки, а поросятам-отъемышам - смешав с кормом. Поросят-сосунов контрольной группы лечили тилоном (внутрь по 1,0 мл 4-5 дней), а поросят-отъемышей - смесью фармазина с трихополом (4-5 дней). Наблюдения проводились в течение 60 дней с начала постановки опыта. Схема формирования опытных и контрольных групп поросят в зависимости от применяемых доз препарата и результаты клинического наблюдения представлены в таблице 6.
| Таблица 6 | ||||||
| Терапевтическая эффективность Токсиспорина при желудочно-кишечных болезнях поросят | ||||||
| Группы животных | Кол-во голов | Лечебный курс | Доза и кратность | Выздоровело, гол. | Пало, гол | Эффективность, % |
| Поросята-сосуны | ||||||
| 1 гр.-3,0 г на гол. | 10 | 6 дней | 0,5×2 | 10 | - | 100 |
| 2 гр. - 2,5 г на гол. | 8 | 6 дней | 0,25×2 | 8 | - | 100 |
| 3 гр. - контрольная | 8 | 4-5 дн. | - | 5 | 1 | - |
| Поросята-отъемыши | ||||||
| 1 гр. - 10,0 г на гол. | 20 | 6 дней | 1,0×2 | 20 | - | 100 |
| 2 гр. - 5,0 г на гол. | 10 | 6 дней | 0,5×2 | 9 | - | 90,0 |
| 3 гр. - контрольная | 10 | 4-5 дн. | - | 6 | - | - |
Из данных, представленных в таблице видно, что высокая терапевтическая эффективность Токсиспорин (100%) отмечается при дозе препарата поросятам-сосунам 3 г на голову, так и 2,5 г на голову раз в день 6 дней подряд. У поросят-отъемышей 100%-ная эффективность препарата отмечена в группе, где животных лечили препаратом Токсиоспорин из расчета 10,0 г на голову раз в день. Продолжительность болезни у поросят опытных групп составила 5-7 дней, у поросят контрольных групп - 7-10 дней. Один поросенок контрольной группы пал на 4 день болезни.
Таким образом, эффективной терапевтической дозой Токсиспорин для поросят-сосунов является 3,0 г на голову раз в день 6 дней подряд (100%-ная эффективность), а для поросят-отъемышей - 10,0 г на голову раз в день 6 дней подряд (100%-ная эффективность). Пробы фекалий от поросят всех групп для бактериологических исследований отбирали до и после постановки опыта и определяли количественный и качественный бактериальный состав кишечной микрофлоры в 1 г. У идентифицированных бактерий определяли биохимические, гемолитические, адгезивные свойства и патогенность на белых мышах (табл.7).
| Таблица 7 | ||
| Бактериологические исследования фекалий поросят до и после дачи Токсиспорин в терапевтических дозах | ||
| Группы животных | Динамика исследований | |
| До дачи препарата | После лечения | |
| Поросята - сосуны | ||
| 1 группа 3,0 г на гол. | Бифидо-лактобакт.- 105, E.coli - 106; P.mirabilis - 105, Salmonella - 103, C.freundi - 103. | Бифидо-лактобакт.- 1010, E.coli - 107, C.freundi - 103. |
| 2 группа 2,5 г на гол. | Бифидо-лактобактобактер-105; E.coli-106-107; P.mirabilis - 105; K.pneumonia - 106. | Бифидо-лактобактобакт - 109; E.coli - 108. |
| Контрольная группа | Бифидо-лактобакт.- 105, Е.соli - 106-107, P.mirabilis - 105, Salmonella - 103, K.pneumonia - 105 | Бифидо-лактобакт.- 108, P.mirabilis - 105, Salmonella - 103, K.pneumonia - 105 |
| Поросята - отьемыши | ||
| 1 группа 10,0 г на гол. | Бифидо-лактобакт.- 107, E.coli - 107-108, P.mirabilis - 105, Salmonella - 103, K.pneumonia - 106, Staphilococcus - 103. | Бифидо-лактобакт.- 1010, E.coli - 107. |
| 2 группа 5,0 г на гол. | Бифидо-лактобакт.- 106, E.coli - 107, P.mirabilis - 105, Salmonella - 103, C.freundi - 103, Staphilococcus - 103. | Бифидо-лактобакт.- 108, E.coli - 107, P.mirabilis - 105, C.freundi - 103, Staphi-lococcus - 103. |
| Контрольная группа | Бифидо-лактобакт.- 107, E.coli - 107-108, P.mirabilis - 105, P.vulgaris - 105, Salmonella - 103. | Бифидо-лактобакт.- 108, E.coli - 107-108, P.mirabilis - 105, P.vulgaris - 105, Salmonella - 103. |
Из данных таблицы следует, что содержание бифидо- и лактобактерий в 1 г кишечного содержимого поросят-сосунов до дачи препарата находилось на достаточно низком уровне и составляло 105 м.кл. От всех поросят-сосунов как опытных, так и контрольной групп выделяли Е.соli и P.mirabilis. От поросят-сосунов 1-й опытной группы, кроме того, выделяли Salmonella и C.freundi; от поросят-сосунов 2-й опытной и контрольной групп выделяли также K.pneumonia.
От поросят-отъемышей выделяли такую же микрофлору, как и от поросят-сосунов, а также Staphylococcus. Выделенные Staphylococcus были коагулазоположительными, что является одним из признаков патогенности этих микроорганизмов.
Выделенная от поросят до постановки опыта условно-патогенная микрофлора обладала вирулентными свойствами. Такие микроорганизмы как P.mirabilis, E.coli и Salmonella образовывали зоны гемолиза на кровяном агаре. Особенно четко эти свойства были выражены у энтеропатогенной E.coli (преобладал, в основном, β-гемолиз).
Адгезивные свойства определяли в РА с антиадгезивными сыворотками К88, К99, F41, Р987. Энтеропатогенные E.coli, выделенные от поросят как опытных, так и контрольных групп, обладали различными адгезивными антигенами - 80% изолятов E.coli содержали К88-антиген, 12% - К99-антиген и 8% изолятов E.coli содержали антиген F41. Кроме того, 8 изолятов P.mirabilis давали положительную РА с К99 адгезивной сывороткой. Контролем в этом случае служили те же микроорганизмы, выращенные при комнатной температуре (при этом не образуются адгезивные антигены).
Патогенность выделенных микроорганизмов определяли на белых мышах, которым вводили внутрибрюшинно суточные культуры микроорганизмов в концентрации 500 млн. м.кл. Мыши пали на 2-3 сутки. При вскрытии павших мышей выделяли исходные бактерии.
Результаты опытов представлены в таблице 8.
| Таблица 8 | ||||||
| Вирулентные свойства бактерий, выделенных от поросят | ||||||
| Исследуемые культуры | До дачи препарата | После лечения | ||||
| гемол. | адгез. | токсиг. | гемол. | адгез. | токсиг. | |
| E.coli | 22 | 22 | 22 | 15 | 15 | 15 |
| P.mirabilis | 15 | 18 | 15 | 12 | 5 | 10 |
| P.vulgaris | 2 | - | 2 | - | - | - |
| C.freundii | 11 | 2 | 11 | 8 | - | 8 |
| Salmonella | 9 | 3 | 9 | 3 | - | 1 |
| K.pneumonia | 6 | - | 6 | 3 | - | 3 |
| Staphylococcus | 15 культур коагулазоположительные | 7 культур коагулазоположительные |
Из данных таблицы следует, что после лечения Токсиспорином происходило не только снижение частоты выделения условно-патогенных и патогенных бактерий, но и ослабевали их вирулентные свойства. Особенно это заметно в группе поросят-отъемышей, где количество коагулазоположительных штаммов стафилококков снизилось вдвое, что свидетельствует о высоком антагонистическом действии препарата по отношению к указанным бактериям.
В контрольной группе поросят-отъемышей к концу лечения не наблюдали значительных изменений в составе кишечной микрофлоры. Нормализация микрофлоры кишечника происходила медленно, и концентрация клеток составила 108 м.кл. в 1 г кишечного содержимого. Выделялась та же микрофлора, что и перед постановкой опыта.
Результаты бактериологических исследований дают основание предполагать, что причиной расстройства пищеварения у поросят явилась ассоциация условно-патогенных микроорганизмов, обладающих вирулентными свойствами. При исследовании фекалий после лечения поросят различными дозами препарата Токсиспорин отмечалось следующее:
- в группе сосунов, где поросята получали препарат в дозе 3 г, происходило увеличение концентрации бифидо- и лактобактерий до 109-1010 м.кл. в 1 г фекалий, а в группе поросят-сосунов, которым давали препарат в дозе 10 г, концентрация бифидо- и лактобактерий увеличивалась до - 108-109 м. кл. У поросят контрольной группы отмечали низкое содержание бифидо- и лактобактерий (103-105 м. кл);
- у поросят опытных групп после лечения не обнаруживали сальмонелл, в то время как в контрольных группах эти микроорганизмы обнаруживались во все дни исследований;
- в группе поросят-отъемышей к концу лечения происходило увеличение содержания бифидо- и лактобактерий до 1010 м.кл. в 1 г фекалий, особенно в той группе, где применяли 10,0 г препарата Токсиспорин - на 1 голову;
- на 6 день с момента постановки опыта было установлено ослабление вирулентных свойств бактерий, выделенных из кишечника поросят опытных групп.
Проводили также гематологические исследования, которые заключались в анализе лейкограммы крови больных поросят контрольных и опытных групп (табл.9).
| Таблица 9 | ||||||
| Лейкограмма крови поросят-сосунов | ||||||
| Поросята в возрасте 14 дней (норма по Кар-путь) | Клинически здоровые | Больные поросята | После лечения | |||
| 1 группа | 2 группа | Контрольная группа | ||||
| Лейкоциты | ||||||
| Базофилы | - | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Эозинофилы | 0,6-1,4 | 0,62 | 0,9 | 1,0 | 1,0 | 1,5 |
| Нейтрофилы: | ||||||
| Ю | 0,5-1,1 | 0,45 | 0,9 | 1,0 | 1,0 | 1,0 |
| П | 4,3-9,7 | 9,95 | 10,4 | 9,6 | 10,25 | 10,75 |
| С | 29,1-36,9 | 30,4 | ||||
| 31,3 | 33,6 | 41,0 | 40,0 | |||
| Лимфоциты | 51,2-56,8 | 55,4 | 52,1 | 54,0 | 37,5 | 43,25 |
| Моноциты | 3,2-4,88 | 3,4 | 6,3 | 3,6 | 4,75 | 3,25 |
При анализе лейкограммы больных поросят-сосунов до лечения отмечали, прежде всего, выраженный моноцитоз, свидетельствующий о бактериальной инфекции и усилении фагоцитарной активности этих клеток. При микроскопии мазков крови в моноцитах наблюдали бактериальные включения в цитоплазме. Также отмечали множество лимфоцитов с цитоплазматическими выпячиваниями, что указывает на интоксикацию организма.
Анализируя данные лейкограммы поросят-сосунов, получавших различные дозы препарата, можно констатировать, что после прекращения дачи Токсиспорина у поросят 1 группы, получавших 3 г препарата на голову раз в день, показатели лейкограммы соответствовали показателям здоровых поросят.
У поросят 1 группы, получавших Токсиспорин по 2,5 г раз в день обнаружили увеличение числа сегментоядерных нейтрофилов в сочетании с лимфопенией, что, вероятно, связанно с недостаточной дозировкой препарата и наличием в организме воспалительного процесса. Аналогичная картина лейкограммы в послетерапевтический период отмечена у поросят контрольной группы, которых лечили химиотерапевтическими препаратами.
Лейкограмма крови больных поросят-отъемышей представлена в таблице 10.
| Таблица 10 | ||||||
| Лейкограмма крови поросят-отъемышей | ||||||
| 3-4 месячные поросята (норма по Карпутю) | Клинически здоровые | Больные поросята | После лечения | |||
| Лейкоциты | 1 группа | 2 группа | Контрольная группа | |||
| Базофилы | 0,2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Эозинофилы | 1,1-3,3 | 2,0 | 1,0 | 1,6 | 0,5 | 0,7 |
| Нейтрофилы: | ||||||
| 0,4-0,8 | 0,4 | 0,53 | 0,6 | 0,5 | 0,6 | |
| Ю | 9,6-13,3 | 14,2 | 9,6 | 9,3 | 11,0 | 11,0 |
| П | 27,2-32,0 | 32,8 | 17,8 | 23,7 | 27,5 | 34,4 |
| С | 49,0-57,8 | 47,1 | 64,0 | 61,0 | 58,5 | 50,3 |
| Лимфоциты | 1,9-5,5 | 3,5 | 9,7 | 4,0 | 2,0 | 3,0 |
Как следует из таблицы 10, лейкограмма заболевших поросят-отъмышей характеризовалась эозинопенией, нейтропенией, выраженным моноцитозом и повышенным уровнем лимфоцитов. При анализе лейкограммы больных поросят-отъемышей до лечения установили следующее:
у больных животных, по сравнению с клинически здоровыми, отмечали эозинопению, характеризующую острую интоксикацию организма. Уменьшение числа эозинофилов связано с разрушением этих клеток, а также с миграцией в ткани для элиминации комплексов антиген - антитело;
наблюдаемое снижение числа нейтрофилов, особенно сегментоядерных, у больных поросят, объясняется разрушением этих клеток за счет интенсификации фагоцитоза в результате внедрения микробных элементов. В цитоплазме нейтрофилов при микроскопии обнаруживали фагоцитированные бактериальные субстанции;
выраженный лимфо- и моноцитоз также свидетельствовали о заболевании бактериальной этиологии. В мазках крови встречались лимфоциты с цитоплазматическими выпячиваниями, что является показателем высокой интоксикации организма;
по сравнению с поросятами-сосунами, у отъемышей воспалительный процесс был более выраженным, что подтверждается данными бактериологических и гематологических исследований.
После лечения поросят-отъемышей отмечали следующее:
в группе поросят, получавших препарат в дозе 3,0 г раз в день, отмечали эозинопению; приблизительно на 60% повысилось число сегментоядерных нейтрофилов, не достигнув при этом нормы, т.е. имело место наличие некоторой нейтропении, свидетельствующей о продолжительном фагоцитозе в процессе действия препарата Токсиспорин. Число лимфоцитов несколько снизилось, однако оставалось на более высоком уровне, по сравнению с клинически здоровыми животными. Количество моноцитов было значительно сниженным, что также свидетельствует о защитной функции этих клеток;
у поросят, получавших препарат Токсиспорин по 10,0 г на голову раз в день количество эозинофилов практически соответствовало уровню у клинически здоровых поросят. Отмечалась нейтропения, что, возможно, свидетельствует о передозировке препарата. Число лимфоцитов изменилось незначительно. Уровень моноцитов снизился до нормального;
у животных контрольной группы имела место эозинопения, что говорит о достаточно устойчивой и продолжительной интоксикации организма. Число нейтрофилов, особенно зрелых, увеличилось практически в 2 раза и было выше, чем у клинически здоровых поросят данного хозяйства.
Таким образом, характер лейкограммы крови поросят-отъемышей опытных и контрольной групп свидетельствует о воспалительном процессе в организме животных. Тем не менее, клиническое состояние животных, высокая терапевтическая эффективность препарата Токсиспорин, а также результаты бактериологических исследований говорят о предпочтительной терапевтической дозе - 3,0 г препарата на голову при однократном применении в течение 6 дней.
При изучении влияния Токсиспорина на интенсивность роста поросят-отъемышей опытных групп, поставленных на откорм, в комбикорм поросятам опытных групп вносили препарат Токсиспорин в дозе 3 г на голову в сутки в течение 1 месяца. В опыте использовалось то же поголовье поросят-отъемышей, которым препарат вводили с профилактической целью. Животных 2-х опытных групп объединили в одну группу (табл.11).
| Таблица 11 | ||
| Изменение живой массы и среднесуточных приростов у поросят-отъемышей на откорме | ||
| Показатель | Группа животных | |
| опытная | контрольная | |
| Живая масса, кг | 43,3±2,16 | 43,6±1,22 |
| Среднесуточный прирост, г | 624±26,9 | 534±42,8 |
| В % к контрольной группе | 116,8 | 100,0 |
| Общий прирост, кг | 67,4 | 58,2 |
| Среднесуточное потребление комбикорма, кг | ||
| 2,18 | 2,18 | |
| Затрачено комбикорма на 1 кг прироста, кг | 3,27 | 3,78 |
| В % к контрольной группе | 86,5 | 100,0 |
Установлено, что Токсиспорин способствует усвоению корма животными и приросту живой массы.
У свиней опытной группы, получавших Токсиспорин, среднесуточный прирост массы увеличился до 667 г (Р<0,02), у животных контрольной группы - в целом за опыт составил 576 г.
Таким образом, среднесуточный прирост массы у свиней опытной группы увеличился по сравнению с контролем на 15,8%.
Кроме повышения интенсивности роста поросят, использование в составе комбикормов Токсиспорин способствовало улучшению эффективности использования кормов, что выразилось в снижении их затрат на 1 кг прироста живой массы откармливаемых свиней опытной группы на 16,9-19,4%.
В результате исследований фекалий подопытных животных было установлено, что использование препарата Токсиспорин для откармливаемых свиней привело к повышению переваримости питательных веществ у животных опытной группы - жира и БЭВ соответственно на 3,2 абс.% и 4,4 абс.%.
Сырую клетчатку животные опытной группы переваривали в сравнении с контрольными аналогами лучше на статистически достоверную величину (Р<0,01) или в процентном выражении на 13,8 абс.% (табл.12).
| Таблица 12 | ||
| Переваримость питательных веществ подопытными поросятами | ||
| Показатель, абс.% | Группа животных | |
| опытная | контрольная | |
| Органическое вещество | 83,8±1,15 | 80,6±1,73 |
| Сырой протеин | 79,5±1,27 | 75,1±2,08 |
| Сырой жир | 43,2±6,39 | 40,0±3,55 |
Использование Токсиспорина оказывало положительное влияние на использование азота в организме поросят опытной группы (табл.13).
| Таблица 13 | ||
| Среднесуточный баланс и использование азота подопытными животными | ||
| Показатель | Группа животных | |
| опытная | контрольная | |
| Принято с кормом, г | 67,5 | 66,72 |
| Выделено в кале, г | 13,84±0,62 | 16,67±1,38 |
| Переварено, г | 53,66±0,3 | 50,05±1,38 |
| Выделено в моче, г | 28,50±1,1 | 27,08±0,51 |
| Отложилось в теле, г | 25,16±1,15 | 22,97±1,55 |
| Использовано, в %: | ||
| от принятого | 37,3 | 34,44 |
| от переваренного | 46,8 | 45,8 |
Установлено, что «потери» азота с калом и мочой у поросят контрольной группы составили 43,75 г, а опытной - 42,34 г, в связи, с чем у животных контрольной группы ежесуточно откладывалось 22,97 г азота, в сравнении с контролем поросята опытной группы откладывали азота в теле на 2,19 г больше. Поросята опытной группы также наиболее рационально использовали азот. От принятого количества азота с кормом они откладывали в теле 37,3%, а от переваренного - 46,8%, против 34,44% и 45,8% в контроле.
Влияние препарата Токсиспорина на качество мясной продуктивности оценивали после контрольного убоя 10 поросят и разделки туш. Результаты убоя и обвалки туш приведены в таблице 14.
| Таблица 14 | ||
| Показатели продуктивности откормленных свиней | ||
| Показатели | Мясная продуктивность по группам животных | |
| опытная | контрольная | |
| Предубойная живая масса, кг | 110,7 | 101,8 |
| Убойная масса, кг | 86,2 | 78,6 |
| Убойный выход, % | 77,9 | 77,2 |
| Масса охлажденной полутуши, кг | 32,2 | 30,6 |
| в том числе масса ткани, кг: | ||
| мышечной | 18,3 | 17,3 |
| жировой | 10,4 | 9,8 |
| костной | 3,5 | 3,2 |
| Соотношение тканей к массе полутуши, %: | ||
| мышечная | 56,8 | 56,5 |
| жировая | 32,8 | 32,0 |
| костная | 10,9 | 10,5 |
Анализ результатов убоя подопытных животных показал, что у поросят опытной группы наблюдалось увеличение убойной массы на 9,7%, в сравнении с поросятами контрольной группы. Использование Токсиспорина значительно не повлияло на качество туш.
Таким образом, Токсиспорин не оказывает существенного влияния на убойный выход и морфологический состав туш, однако масса туш животных из опытной группы была больше. От них было получено в среднем на 1 голову на 3,2 кг мяса больше, чем от контрольных животных.
В таблице 15 представлены результаты производственной проверки по изменению живой массы поросят, приростам и затратам кормов.
| Таблица 15 | ||
| Зоотехнические показатели эффективности Токсиспорина при откорме свиней | ||
| Показатель | Группа животных | |
| опытная | контрольная | |
| Живая масса, кг: | ||
| в начале откорма | 39,6±0,23 | 39,4±0,25 |
| в конце откорма | 116,0±0,69 | 108,0±0,78 |
| Среднесуточный прирост, г | 735±5,97 | 660±7,57 |
| % к контрольной группе | 111,4 | 100,0 |
| Среднесуточное потребление комбикорма | 2,30 | 2,30 |
| Затрачено комбикорма на 1 кг прироста, кг | 3,13 | 3,48 |
| % к контрольной группе | 89,9 | 100,0 |
Установлено, что Токсиспорин способствует усвоению корма животными и приросту живой массы. Среднесуточный прирост живой массы за период производственной проверки у животных опытной группы в сравнении с контрольной был выше на 5 г (11,4% при достоверном р<0,001), а затраты комбикорма на 1 кг были ниже на 10,1% (3,13 кг против 3,48 кг). Анализ результатов убоя подопытных животных показал, что у поросят опытной группы наблюдалось увеличение убойной массы на 9,7% по сравнению с поросятами контрольной группы.
Приведенные данные показали, что Токсиспорин эффективен для всех видов млекопитающих при лечении и профилактике колибактериозов, дисфункций и дисбактериозов различной природы, чумки, парагриппа, гриппа, диспепсии, сальмонеллезов, инфекционного ринотрахеита крупнорогатого скота, вирусной диареи, ротавирусного энтерита, дизентерии, стафилококковых инфекций, везикулярного стоматита, язвенного дерматита, а также для профилактики иммунодефицитных состояний.
Производственная оценка эффективности препарата Токсиспорин при откорме свиней подтверждена результаты экспериментов на поросятах-отъемышах о благоприятном влиянии препарата на гомеостаз организма животных, интенсивность роста и конверсию корма.
Предлагаемый способ достаточно технологичен, не требуется использование дорогих ферментов на стадии культивирования, не требуется очистка и концентрирование препарата; удаление или перераспределение влаги совмещено с получением готовой формы препарата.
1. Пробиотический препарат против вирусных и бактериальных инфекций, содержащий смесь биомассы штаммов бактерий Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis в споровой форме и наполнитель, отличающийся тем, что в качестве биомассы штаммов бактерий он содержит биомассу штаммов бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-3679 и Bacillus licheniformis ВКПМ В-4161 в споровой форме с титром не менее 109 спор/г, а в качестве наполнителя глауконит при следующем соотношении ингредиентов, мас.%:
| смесь спор бактерий Bacillus subtilis и | |
| Bacillus licheniformis | 0,1 -1,0 |
| глауконит | остальное |
2. Пробиотический препарат по п.1, отличающийся тем, что содержание спор бактерий Bacillus subtilis в их смеси со спорами Bacillus licheniformis составляет 50%.
3. Способ получения пробиотического препарата по п.1, включающий в себя раздельное культивирование бактерии Bacillus subtilis ВКПМ В-3679 и Bacillus licheniformis ВКПМ В-4161 на глюкозо-мелассной среде при рН 6,8-7,0, смешивание полученной биомассы штаммов в споровой форме в соотношении 1:1 между собой и затем в количестве 0,1-1 мас.% от массы препарата с глауконитом до содержания КОЕ не менее 109 спор/г.
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что микроорганизмы культивируют при температуре 37°С в течение 24-36 ч, аэрации 1,0 об. воздуха/об. среды в минуту, скорости перемешивания 250 об/мин, рO2 40-60% от насыщения, рН 6,8-7,0.
5. Способ по п.3, отличающийся тем, что полученную смесь биомассы штаммов в споровой форме перед смешиванием с глауконитом подвергают сублимационной сушке.
6. Способ по п.3, отличающийся тем, что бактерии наносят на глауконит путем напыления.
7. Штамм бактерий Bacillus licheniformis ВКПМ В-4161, используемый в качестве компонента пробиотического препарата против вирусных и бактериальных инфекций.
