Поперечно сшитые полисахаридные и белковые матрицы и способы их получения

Изобретение относится к матрицам и препаратам на основе поперечно сшитых полисахаридов. Предложены варианты способа получения поперечно сшитых полисахаридов, включающие взаимодействие по меньшей мере одного полисахарида, выбранного из амино-полисахарида, амино-функционализированного полисахарида, содержащих одну или более аминогрупп, которые способны быть поперечно сшитыми восстанавливающим сахаром, и их сочетаний, с по меньшей мере одним восстанавливающим сахаром. Предложены также полисахариды, полученные предложенным способом, способ получения поперечно сшитых матриц на основе полисахаридов и полученные этим способом матрицы. Полученные матрицы могут включать полисахаридные матрицы и композиционные поперечно сшитые матрицы, включающие полисахариды, поперечно сшитые с белками и/или полипептидами. Технический результат - полученные полисахариды имеют удовлетворительную устойчивость к ферментативному расщеплению в сочетании с реологическими свойствами препарата для инъекций. Полученные матрицы проявляют различные физические, химические и биологические свойства. 5 н. и 24 з.п. ф-лы, 12 ил., 6 табл., 11 пр.

 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

По настоящей заявке испрашивается приоритет по предварительной патентной заявке США, порядковый номер 60/713390, поданной 2 сентября 2005, включенной в настоящее описание ссылкой во всей ее полноте.

Область изобретения

Данное изобретение относится, главным образом, к матрицам и препаратам на основе поперечно сшитого полисахарида и, более конкретно, к новому способу поперечной сшивки амино-полисахаридов и амино-функционализированных полисахаридов с использованием восстанавливающих сахаров и их производных в качестве агентов поперечной сшивки и к поперечно сшитым полисахаридным матрицам и препаратам, полученным с использованием данного способа.

Уровень техники

Характеристики продуктов на основе гиалуроновой кислоты или на основе другого амино-сахарида зависят, с одной стороны, от регуляции их функциональной долговечности в организме-хозяине и, с другой стороны, от сохранения биологических свойств природной гиалуроновой кислоты (НА) или другого полисахаридного компонента. Функциональная долговечность НА или другого полисахаридного компонента зависит от их способности противостоять специфическому ферментативному расщеплению гиалуронидазой или какими-либо другими расщепляющими полисахарид ферментами, присутствующими в организме-хозяине. Эта способность непосредственно соотносится с числом внутримолекулярных и межмолекулярных поперечных связей в полимере на основе НА или другого полисахарида. Обычно более высокое число поперечных связей имеет результатом более высокую устойчивость к такому ферментативному расщеплению.

Типичными предпочтительными поперечно сшивающими агентами, известными в технике для поперечной сшивки полисахаридов, и/или производных полисахаридов, и/или искусственно функционализированных форм полисахаридов, являются бифункциональные (или полифункциональные) линкеры, такие как, например, 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир, множество других синтетических бифункциональных кросс-линкеров и других родственных нефизиологических агентов. Такие поперечно сшивающие агенты взаимодействуют с аминогруппами или другими функциональными группами молекулы полисахарида с образованием межмолекулярных поперечных связей. Однако эти жесткие агенты могут оказывать негативное влияние на биосовместимость и биологическую активность биопродуктов на основе поперечно сшитого полисахарида, что может быть вызвано изменениями конформации полисахаридной молекулы и выщелачиванием поперечно сшивающих агентов. Так, полисахаридные продукты, поперечно сшитые нефизиологическими агентами, могут проявлять некоторую степень антигенности. Более того, локализованные воспалительные и более сложные системные реакции, включая местное опухание, зуд, временную или продолжительную эритему, отек, образование гранулемы, поверхностную некротическую крапивницу и угревидные повреждения, могут быть неблагоприятными побочными эффектами у небольшого относительного количества пациентов, применяющих в эстетических целях существующие коммерческие поперечно сшитые полисахаридные продукты.

Кроме того, в случае, когда продукты готовят для инъекции в виде суспензий, гелей или эмульсий, применение искусственных кросс-линкеров, известных в технике, не всегда позволяет получить поперечно сшитые продукты, имеющие удовлетворительную устойчивость к ферментативному расщеплению в сочетании с желаемыми реологическими свойствами препарата для инъекций.

Сущность изобретения

Поэтому в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения предложен способ получения поперечно сшитых полисахаридов. Способ включает взаимодействие по меньшей мере одного полисахарида, выбранного из амино-полисахарида, и/или амино-функционализированного полисахарида, и/или их сочетаний с по меньшей мере одним восстанавливающим сахаром с образованием поперечно сшитого полисахарида.

Более того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения по меньшей мере один полисахарид выбран из природного амино-полисахарида, синтетического амино-полисахарида, амино-гетерополисахарида, амино-гомополисахарида, амино-функционализированного полисахарида и его производных форм и сложных эфиров и солей, амино-функционализированной гиалуроновой кислоты и ее производных форм и сложных эфиров и солей, амино-функционализированного гиалуронана и его производных форм и сложных эфиров и солей, хитозана и его производных форм и сложных эфиров и солей, гепарина и его производных форм и сложных эфиров и солей, амино-функционализированных гликозаминогликанов и их производных форм и сложных эфиров и солей и любых их сочетаний.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения по меньшей мере один восстанавливающий сахар выбран из альдозы, кетозы, производного альдозы, производного кетозы, диозы, триозы, тетрозы, пентозы, гексозы, септозы, октозы, нанозы, декозы, глицерозы, треозы, эритрозы, ликсозы, ксилозы, арабинозы, рибозы, аллозы, альтрозы, глюкозы, фруктозы, маннозы, гулозы, идозы, галактозы и талозы, восстанавливающего моносахарида, восстанавливающего дисахарида, восстанавливающего трисахарида, восстанавливающего олигосахарида, производных форм олигосахаридов, производных форм моносахаридов, сложных эфиров моносахаридов, сложных эфиров олигосахаридов, солей моносахаридов, солей олигосахаридов, мальтозы, лактозы, целлобиозы, генциобиозы, мелибиозы, туранозы, трегалозы, изомальтозы, ламинарибиозы, маннобиозы и ксилобиозы, глицеральдегида, сорбозы, D-рибоза-5-фосфата, глюкозамина и их сочетаний.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, по меньшей мере один восстанавливающий сахар может быть выбран из правовращающей формы по меньшей мере одного восстанавливающего сахара, левовращающей формы по меньшей мере одного восстанавливающего сахара и смеси правовращающей и левовращающей форм по меньшей мере одного восстанавливающего сахара.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, взаимодействие включает инкубирование по меньшей мере одного полисахарида в растворе, содержащем по меньшей мере один растворитель и по меньшей мере один восстанавливающий сахар, с образованием поперечно сшитого полисахарида.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, раствор является забуференным раствором, содержащим по меньшей мере один буфер.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, растворитель является водным забуференным растворителем, содержащим по меньшей мере один буфер для регулирования pH раствора.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, растворитель является водным растворителем, содержащим по меньшей мере одну ионизируемую соль для регулирования ионной силы раствора.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, растворитель (растворители) включает по меньшей мере один растворитель, выбранный из группы, состоящей из органического растворителя, неорганического растворителя, полярного растворителя, неполярного растворителя, гидрофильного растворителя, гидрофобного растворителя, растворителя, смешивающегося с водой, не смешивающегося с водой растворителя и их сочетаний.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, растворитель включает воду и по меньшей мере один дополнительный растворитель, выбранный из гидрофильного растворителя, полярного растворителя, растворителя, смешивающегося с водой, и их сочетаний.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, растворитель выбран из группы, состоящей из воды, забуференного фосфатом солевого раствора, этанола, 2-пропанола, 1-бутанола, 1-гексанола, ацетона, этилацетата, дихлорметана, диэтилового эфира, гексана, толуола и их сочетаний.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, взаимодействие включает добавление по меньшей мере одного белка и/или полипептида, имеющего поперечно сшиваемые аминогруппы, к по меньшей мере одному полисахариду и по меньшей мере одному восстанавливающему сахару для формирования композиционной поперечно сшитой матрицы.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, по меньшей мере один белок и/или полипептид, имеющий поперечно сшиваемые аминогруппы, выбран из коллагена, белка, выбранного из надсемейства коллагена, белков внеклеточного матрикса, ферментов, структурных белков, выделенных из крови белков, гликопротеинов, липопротеинов, природных белков, синтетических белков, гормонов, факторов роста, белков, стимулирующих рост хряща, стимулирующих рост кости белков, внутриклеточных белков, внеклеточных белков, мембранных белков, эластина, фибрина, фибриногена и любых их сочетаний.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, коллаген выбран из природного коллагена, фибриллярного коллагена, фибриллярного ателопептидного коллагена, содержащего телопептид коллагена, лиофилизованного коллагена, коллагена, полученного из животных источников, коллагена человека, коллагена млекопитающего, рекомбинантного коллагена, пепсинизированного коллагена, восстановленного коллагена, бычьего ателопептидного коллагена, свиного ателопептидного коллагена, коллагена, полученного из видов позвоночных, рекомбинантного коллагена, генно-инженерного или модифицированного коллагена, коллагена типов I, II, III, V, XI, XXIV, фибрил-связанных коллагенов типов IX, XII, XIV, XVI, XIX, XX, XXI, XXII и XXVI, коллагенов типов VIII и X, коллагенов типа IV, коллагена типа VI, коллагена типа VII, коллагенов типа XIII, XVII, XXIII и XXV, коллагенов типа XV и XVIII, искусственно полученного коллагена, производимого генетически модифицированными эукариотическими или прокариотическими клетками или генетически модифицированными организмами, очищенного коллагена и восстановленного очищенного коллагена, частиц фибриллярного коллагена, фибриллярного восстановленного ателопептидного коллагена, коллагена, выделенного из клеточной культуральной среды, коллагена, полученного из генно-инженерных растений, фрагментов коллагена, протоколлагена и любых их сочетаний.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, взаимодействие включает добавление по меньшей мере одной добавки к по меньшей мере одному полисахариду и по меньшей мере одному восстанавливающему сахару для образования поперечно сшитой матрицы, содержащей по меньшей мере одну добавку.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, по меньшей мере одна добавка выбрана из фармакологических веществ, лекарств, белков, полипептидов, анестезирующих агентов, антибактериальных агентов, противомикробных агентов, противовирусных агентов, противогрибковых агентов, антимикозных агентов, противовоспалительных агентов, гликопротеинов, протеогликанов, гликозаминогликанов, различных компонентов внеклеточного матрикса, гормонов, факторов роста, трансформирующих факторов, рецепторов или рецепторных комплексов, природных полимеров, синтетических полимеров, ДНК, РНК, олигонуклеотидов, терапевтического агента, морфогенетических белков, мукопротеинов, мукополисахаридов, белков матрикса, факторов транскрипции, пептидов, генетического материала для генной терапии, нуклеиновой кислоты, химически модифицированной нуклеиновой кислоты, химерной конструкции ДНК/РНК, ДНК или РНК зондов, антисмысловой ДНК, антисмысловой РНК, гена, части гена, композиции, включающей природные или искусственно полученные олигонуклеотиды, плазмидной ДНК, космидной ДНК, вирусных и невирусных векторов, необходимых для стимуляции клеточного поглощения и транскрипции, хондроитин-4-сульфата, хондроитин-6-сульфата, кератансульфата, дерматансульфата, гепарина, гепарансульфата, гиалуронана, обогащенного лецитином внутритканевого протеогликана, декорина, бигликана, фибромодулина, лумикана, аггрекана, синдеканов, бета-гликана, версикана, центрогликана, серглицина, фибронектина, фиброгликана, хондроадгеринов, фибулинов, тромбоспондина-5, фермента, ингибитора фермента, антитела и любых их сочетаний.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, взаимодействие также включает добавление одной или нескольких живых клеток к по меньшей мере одному полисахариду и по меньшей мере одному восстанавливающему сахару до, во время или после указанной поперечной сшивки для образования поперечно сшитой матрицы, содержащей по меньшей мере одну живую клетку, включенную в матрицу.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, живые клетки выбраны из хондроцитов позвоночных, остеобластов, остеокластов, стволовых клеток позвоночных, эмбриональных стволовых клеток, стволовых клеток, выделенных из ткани взрослого, клеток-предшественников позвоночных, фибробластов позвоночных, клеток, генетически созданных для секреции одного или нескольких белков матрикса, гликозаминогликанов, протеогликанов, морфогенетических белков, факторов роста, факторов транскрипции, противовоспалительных агентов, белков, гормонов, пептидов, одного или нескольких типов живых клеток, созданных генной инженерией для экспрессии рецепторов к одной или нескольким молекулам, выбранным из группы, состоящей из белков, пептидов, гормонов, гликозаминогликанов, протеогликанов, морфогенетических белков, факторов роста, факторов транскрипции, противовоспалительных агентов, гликопротеинов, мукопротеинов и мукополисахаридов и любых их сочетаний.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, способ дополнительно включает подвергание поперечно сшитого полисахарида обработке, выбранной из сушки, лиофилизации, дегидратации, сушки при критической точке, формования, стерилизации, гомогенизации, обработки механическим сдвигом, облучения ионизирующим излучением, облучения электромагнитным излучением, смешивания с фармацевтически приемлемым носителем, насыщения добавкой и их сочетаний.

Предложен также, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, способ получения поперечно сшитых полисахаридов. Способ включает стадии взаимодействия полисахарида с одним или несколькими реагентами до образования производной формы полисахарида. Производная форма содержит одну или несколько аминогрупп и поперечную сшивку производного полисахарида с по меньшей мере одним восстанавливающим сахаром с образованием поперечно сшитого полисахарида.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, аминогруппы выбраны из первичных аминогрупп и вторичных аминогрупп.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, один или несколько реагентов включают карбодиимид.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, один или несколько реагентов включают карбодиимид в присутствии дигидразида адипиновой кислоты.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, карбодиимидом является гидрохлорид 1-этил-3-(диметиламинопропил)карбодиимида.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, по меньшей мере один восстанавливающий сахар выбран из альдозы, кетозы и их сочетаний.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, по меньшей мере один восстанавливающий сахар выбран из глицеральдегида, рибозы, эритрозы, арабинозы, сорбозы, фруктозы, глюкозы, D-рибоза-5-фосфата, глюкозамина, диозы, триозы, тетрозы, пентозы, гексозы, септозы, октозы, нанозы, декозы, глицерозы, треозы, ликсозы, ксилозы, аллозы, альтрозы, маннозы, гулозы, идозы, галактозы, талозы, восстанавливающего моносахарида, восстанавливающего дисахарида, восстанавливающего трисахарида, восстанавливающего олигосахарида, производных форм олигосахаридов, производных форм моносахаридов, сложных эфиров моносахаридов, сложных эфиров олигосахаридов, солей моносахаридов, солей олигосахаридов, мальтозы, лактозы, целлобиозы, генциобиозы, мелибиозы, туранозы, трегалозы, изомальтозы, ламинарибиозы, маннобиозы и ксилобиозы и их сочетаний.

Предложен также, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, способ получения композиционной поперечно сшитой матрицы. Способ включает поперечную сшивку с по меньшей мере одним восстанавливающим сахаром по меньшей мере одного полисахарида, выбранного из амино-полисахарида, амино-функционализированного полисахарида и их сочетаний, в присутствии по меньшей мере одного поперечно сшиваемого белка до образования композиционной поперечно сшитой матрицы.

И, наконец, предложены также, в соответствии с вариантами осуществления изобретения, поперечно сшитые полисахариды и композиционные матрицы, включающие полисахариды и один или несколько белков, полученные способами, описанными выше.

Краткое описание рисунков

Для того чтобы понять изобретение и понять, как оно может быть осуществлено на практике, несколько предпочтительных вариантов осуществления будут описаны только в виде неограничивающего примера со ссылкой на сопутствующие рисунки:

Фиг. 1 - это схематический график, представляющий УФ-видимый спектр амино-функционализированной гиалуроновой кислоты (AFHA), представленный пунктирной кривой, и представленный сплошной кривой спектр поперечно сшитой DL-глицеральдегидом AFHA, полученной в соответствии с вариантом осуществления способа по данному изобретению.

Фиг. 2 - это схематический график, представляющий УФ-видимый спектр поперечно сшитой D(-)-рибозой AFHA, представленный пунктирной кривой, поперечно сшитой D(-)-эритрозой AFHA, представленный сплошной кривой, и поперечно сшитой D(-)-арабинозой AFHA, представленный штриховой кривой, полученных в соответствии с вариантами осуществления способа по данному изобретению.

Фиг. 3 - это схематический график, представляющий УФ-видимый спектр несшитого поперечно хитозана, представленный сплошной кривой, поперечно сшитого D(-)-рибозой хитозана, представленный пунктирной кривой, и поперечно сшитого DL-глицеральдегидом хитозана, представленный штриховой кривой, полученных в соответствии с вариантами осуществления способа по данному изобретению.

Фиг. 4 - это схематический график, представляющий инфракрасный спектр Fourier Transform (FTIR) гиалуроновой кислоты, представленный штриховой кривой, AFHA, представленный пунктирной кривой, и поперечно сшитой DL-глицеральдегидом AFHA, представленный сплошной кривой, в соответствии с вариантами осуществления способа по данному изобретению.

Фиг. 5-7 представляют схематические графики, поясняющие результаты измерений реологических свойств шести различных составов полисахаридов на основе AFHA, поперечно сшитых при различных концентрациях DL-глицеральдегида в течение различных периодов времени в соответствии с вариантами осуществления способа по данному изобретению, в сравнении с реологическими свойствами некоторых коммерчески доступных матриц на основе гиалуроновой кислоты.

Фиг. 8 представляет схематический график, поясняющий результаты измерения набухаемости амино-функционализированной НА, поперечно сшитой при различных концентрациях DL-глицеральдегида в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения.

Фиг. 9 представляет схематический график, поясняющий результаты измерения набухаемости хитозана, поперечно сшитого при различных концентрациях DL-глицеральдегида в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения.

Фиг. 10 представляет схематический график, поясняющий результаты карбазолового анализа расщепления гиалуронидазой поперечно сшитой DL-глицеральдегидом амино-функционализированной НА и коммерчески доступного Perlane®.

Фиг. 11 представляет схематический график, поясняющий результаты карбазолового анализа фиг. 10, где величины поглощающей способности для Perlane® были умножены на десять, чтобы компенсировать 10-кратное разбавление исследуемых образцов Perlane®.

Фиг. 12 представляет схематический график, поясняющий % устойчивости к расщеплению гиалуронидазой in vitro типичного образца матрицы поперечно сшитой D(-)-фруктозой амино-функционализированной НА и Perlane® как функцию времени расщепления.

Подробное описание изобретения

Используемые здесь условные обозначения

Следующие условные обозначения используются в данной заявке.

Термин	Определение
мкл	микролитр
ADH	дигидразид адипиновой кислоты
AFHA	амино-функционализированная гиалуроновая кислота
AGE	преобладающие продукты гликозилирования
CH	хитозан
DI вода	деионизированная вода
EDC	гидрохлорид 1-этил-3-(диметиламинопропил)карбодиимида
FTIR	Fourrier Transform Infra-red
G	Калибр
HA	гиалуроновая кислота
Гц	Герц
ИК	инфракрасный
М	молярный
МДа	миллион Дальтон
мг	миллиграмм
мл	миллилитр
мМ	миллимолярный
Mw	молекулярная масса
Н	нормальный
Па	Паскаль
PBS	забуференный фосфатом солевой раствор
об/мин	оборотов в минуту

Данное изобретение относится к новому способу получения новых биосовместимых матриц на основе поперечно сшитого полисахарида и препаратам, имеющим превосходную устойчивость к ферментативному расщеплению in vivo и другие полезные реологические и/или биологические свойства. Способ базируется, наряду с прочим, на поперечной сшивке амино-полисахаридов (таких как, но без ограничения, хитозан) и/или амино-функционализированных полисахаридов (таких как, но без ограничения, амино-функционализированная гиалуроновая кислота) с восстанавливающими сахарами, такими как D(-)-рибоза, DL-глицеральдегид, D(-)-эритроза, D(-)-арабиноза и многие другие типы восстанавливающих сахаров, известные в технике. Также раскрыты примеры таких новых поперечно сшитых матриц.

Данное изобретение также относится к новому способу получения композиционных поперечно сшитых матриц, полученных поперечной сшивкой смесей одного или нескольких амино-полисахаридов, и/или одного или нескольких амино-функционализированных полисахаридов, и/или одного или нескольких белков (и/или полипептидов) с одним или несколькими восстанавливающими сахарами (в качестве кросс-линкера) для образования новых композиционных матриц на основе полисахарида/белка, и к препаратам, имеющим превосходные свойства устойчивости к ферментативному расщеплению in vivo и in vitro и другие полезные реологические и/или биологические свойства.

Термины "полисахарид" и "полисахариды" и их сопряженные формы используются здесь для определения какого-либо природного и/или искусственно полученного (и/или искусственно синтезированного) полисахарида или полисахаридов, включая любые химически модифицированные формы и/или производные такого полисахарида (полисахаридов) и включая, но без ограничения, сложные эфиры и соли таких полисахаридов или их производных форм.

Термины "амино-полисахарид" и "амино-полисахариды" и их сопряженные формы используются здесь для определения какой-либо формы полисахарида или полисахаридов, которые содержат одну или несколько аминогрупп, способных быть поперечно сшитыми восстанавливающим сахаром.

Термины "амино-функционализированный полисахарид" и "амино- функционализированные полисахариды" и их сопряженные формы используются здесь для определения любого полисахарида, который был химически модифицирован для присоединения к нему одной или нескольких химических групп, включая, наряду с прочим, одну или несколько аминогрупп, которые способны быть поперечно сшитыми восстанавливающим сахаром.

Таким образом, способы поперечной сшивки, описанные здесь, могут быть использованы, наряду с прочим, для поперечной сшивки природных амино-полисахаридов, синтетических амино-полисахаридов, амино-гетерополисахаридов, амино-гомополисахаридов, амино-функционализированных полисахаридов, гиалуроновой кислоты и ее производных форм, гиалуронана и его производных форм, хитозана и его производных форм, гепарина и его производных форм и различных их сочетаний. Раскрытые способы включают поперечную сшивку любых подходящих сложных эфиров и солей таких амино-полисахаридов и амино-функционализированных полисахаридов.

Специалистам в химии углеводов должно быть понятно, что другие типы содержащих аминогруппу полисахаридов и/или амино-функционализированных полисахаридов, которые не описаны в конкретных примерах и экспериментах здесь ниже, также могут быть поперечно сшиты способами, раскрытыми здесь, с получением разнообразных поперечно сшитых продуктов. Следует отметить, что поперечная сшивка таких амино-полисахаридов или амино-функционализированных полисахаридов с помощью восстанавливающих сахаров (или производных восстанавливающего сахара) включена в объем способов и продуктов по данному изобретению.

Любой подходящий восстанавливающий сахар может быть использован в качестве поперечно сшивающего агента в способах по данному изобретению. Сахар может быть моносахаридом, дисахаридом, имеющим восстанавливающий конец, трисахаридом, имеющим восстанавливающий конец, или тому подобным. Подходящие сахара включают альдозы и кетозы. Когда моносахарид используют в качестве кросс-линкера, он может быть триозой, тетрозой, пентозой, гексозой, гептозой, но моносахариды с более чем семью атомами углерода также могут быть использованы. Так, в число сахаров, которые могут быть использованы в новых способах поперечной сшивки по данному изобретению, входят глицероза, треоза, эритроза, луксоза, ксилоза, арабиноза, аллоза, альтоза, глюкоза, манноза, гулоза, идоза, галактоза, фруктоза, талоза или любая другая диоза, триоза, тетроза, пентоза, гексоза, септоза, октоза, наноза или декоза и их различные подходящие производные формы.

Восстанавливающие производные указанных моносахаридов или олигосахаридов, которые имеют активную альдегидную или кетогруппу, также могут быть использованы в качестве поперечно сшивающих агентов в данном изобретении.

Скорость реакции поперечной сшивки может зависеть от равновесной концентрации альдегидной или кетогруппы, присутствующей в форме с открытым кольцом конкретного используемого сахара, как известно в данной области. Однако существует возможность компенсировать медленную скорость реакции некоторых специфических сахаров простым увеличением времени реакции, как известно в данной области.

Эксперименты, описанные здесь ниже, являются неограничивающими примерами, демонстрирующими типичные реакции таких амино-полисахаридов и полисахаридов, синтетически функционализированных аминогруппами, с выбранными типичными восстанавливающими сахарами и описывающими усовершенствованную устойчивость к расщеплению и реологические свойства полученных матриц. Следует отметить, что следующие эксперименты даны только для примера и не предназначены для ограничения объема притязаний данного изобретения. Так, как должно быть очевидно для специалистов в этой области, полисахариды, функционализированные полисахариды, восстанавливающие сахара (используемые в качестве кросс-линкеров), условия реакции, составы реакционной смеси, температуры реакции, продолжительность реакции и химические, физические, реологические свойства и свойства биологической долговечности полученных поперечно сшитых матриц могут отличаться от тех, которые конкретно описаны в экспериментах, раскрытых здесь ниже.

Термин гиалуроновая кислота (НА) используется в следующем тексте как родовое наименование для обозначения и гиалуроновой кислоты как таковой, так и ее солей или смесей солей и, в особенности, солей гиалуроната.

Термин амино-функционализированная гиалуроновая кислота используется в следующем тексте как родовое наименование для обозначения гиалуроновой кислоты и ее солей или смесей солей, которые были дериватизированы так, чтобы они содержали части молекулы со свободной аминогруппой. Аминогруппы могут быть первичными аминогруппами и/или вторичными аминогруппами. Предпочтительным местом для введения части молекулы, содержащей аминогруппу, является карбоксильная группа полисахарида, но существует возможность вводить такую часть молекулы, содержащую аминогруппу, в другие сайты на кольце (кольцах) сахарида. Нет необходимости, чтобы амино-функционализация была полной, и некоторые карбоксильные группы (или другие места дериватизации, если используются) могут оставаться недериватизированными.

Термин амино-функционализированный полисахарид используется в следующем тексте как родовой термин, обозначающий какой-либо полисахарид, который содержит аминогруппы, которые могут взаимодействовать с альдегидной или кетогруппой поперечно сшивающего восстанавливающего сахара. Аминогруппы могут быть первичными и/или вторичными аминогруппами. Аминогруппы могут быть расположенными непосредственно на сахаридной кольцевой структуре (как в хитозане), но могут быть также частью группы, ковалентно связанной с одним или несколькими сайтами или химическими группами на кольцах сахара полисахаридной цепи.

Так, аминогруппа может располагаться непосредственно на кольце сахара, как в случае хитозана (как раскрыто подробно здесь далее), который не требует функционализирования и может быть непосредственно поперечно сшит с восстанавливающим сахаром через аминогруппу кольцевой основы. Следует отметить, что полимеры на основе частично ацетилированного хитина также могут быть поперечно сшиты с применением способа поперечной сшивки сахаром по данному изобретению, как может быть сшит и любой полисахарид, имеющий свободные аминогруппы (первичные или вторичные).

Отмечено, что в соответствии с результатами экспериментов, раскрытых здесь, добавление к поперечно сшивающей реакционной смеси полярного смешивающегося с водой растворителя, такого как, но без ограничения, этанол, может значительно повысить эффективность поперечной сшивки и имеет результатом усовершенствованную устойчивость к расщеплению продуктов реакции по сравнению с поперечной сшивкой в присутствии забуференного водного раствора без какого-либо полярного растворителя.

Хотя действительные механизмы реакции поперечной сшивки и химическая природа получаемых поперечно сшитых полисахаридов в настоящее время не вполне понятны, предполагается, что реакции могут быть в чем-то подобны (хотя не обязательно идентичны) классической реакции гликозилирования, в которой восстанавливающий сахар используют для поперечной сшивки молекул белка на основе реакции альдегидной или кетогруппы сахара с аминогруппами аминокислот белков так, как, например, со свободной аминогруппой лизина или аргинина или других аминокислот, присутствующих в цепи белка.

Такие поперечно сшивающие белок реакции восстанавливающих сахаров хорошо известны в данной области. Вероятно, что такая реакция поперечной сшивки белка протекает по меньшей мере частично через перегруппировку Амадори первоначального продукта реакции, приводящую к образованию желтоватых или коричневых конечных продуктов гликозилирования.

Хотя авторы данного изобретения не полностью охарактеризовали структуру поперечно сшитых полисахаридов, полученных в экспериментах, раскрытых в данной заявке, характерные пики поглощения в диапазоне 225-235 и 285-355 нанометров полученных поперечно сшитых полисахаридов могут быть свидетельством присутствия продуктов гликозилирования, по природе до некоторой степени подобных (но не обязательно идентичных) продуктам гликозилирования белка и конечным продуктам гликозилирования белка (AGE).

Материалы, используемые в экспериментах

Натриевую соль гепарина EP (Партия No. 9818030) получали от JUK Kraeber GmbH & Co, Hamburg, Germany.

Restylane® (лот номер 7349) и Restylane-Perlane (лот номер 7064) коммерчески доступны от Q-Med AB, Uppsala Sweden. Hylaform® Plus (лот номер R0409) коммерчески доступен от Genzyme Biosurgery (подразделение Genzyme Corporation) через их агента по продаже INAMED AESTHETICS, Ireland.

Гомогенизации Turrax осуществляли с помощью модели ULTRA TURRAX® T-25 (основная), коммерчески доступной от IKA®-WERKE, Germany, если не установлено иначе.

Все процедуры лиофилизации проводили с помощью модели сушилки FD 8 Freeze, коммерчески доступной от Heto Lab Equipment, Denmark. Температура конденсатора была -80°С. Температура хранения во время предварительного замораживания была -40°С. Температура хранения для лиофилизации была +30°С. Время предварительного замораживания было 8 часов и время лиофилизация было 24 часа. Вакуум во время лиофилизации был приблизительно 0,01 бар.

В таблице 1 ниже перечислены коммерческие источники материалов, используемых в экспериментах, описанных в данной заявке.

Таблица 1
Материал	Поставщик	Кат. №
Гидрохлорид N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида	Sigma	E7750
Дигидразид адипиновой кислоты	Sigma	A0638
Хитозан, средняя молекулярная масса	Aldrich	448877
D(-)-Арабиноза	Sigma	A3131
D(-)-Эритроза	Fluka	18934
DL-Глицеральдегид	Sigma	G5001
Цитохром С из бычьего сердца	Sigma	C2037
Дигидрат соли D-рибоза-5-фосфат динатрия	Sigma	83875
D(-)Фруктоза	Fluka	F0127
D(-)Рибоза	Sigma	R7500
D(+)Глюкоза	Sigma	49159
D(+)Сорбоза	Sigma	S4887
L(-)Сорбоза	Sigma	S3695
L(+)Фруктоза	Sigma	31140
Гидрохлорид D(+)глюкозамина	Sigma	G4875
Моногидрат мальтозы	Sigma	M5885
Моногидрат D(+)лактозы	Sigma	61340
1-Бутанол	Fluka	19430
1-Гексанол	Fluka	52840
2-Пропанол	Aldrich	32,047-1
Ацетон	Fluka	00585
Этилацетат	Fluka	45770
Дихлорметан	Sigma-Aldrich	443484
Диэтиловый эфир	Riedel de Haaen	32203
Этанол (абсолютный)	Merk	100983
Гексан	Fluka	52770
Толуол	Fluka	89682

Процедура I амино-функционализации HA

400 мг HA 150 (коммерчески доступной как продукт No. 2222003, гиалуронат натрия Pharma Grade 150 от NovaMatrix FMC Biopolymer, Oslo, Norway), имеющей молекулярную массу в диапазоне 1,4-1,8 МДа, или HA 80 (коммерчески доступной как продукт No. 2222002, гиалуронат натрия Pharma Grade 150 от NovaMatrix FMC Biopolymer, Oslo, Norway), имеющей молекулярную массу в диапазоне 0,62-1,15 МДа, растворяли в 350 мл DI воды, 7 грамм дигидразида адипиновой кислоты (ADH) добавляли к смеси. рH Полученного раствора доводили до 4,75 и раствор перемешивали в течение двух часов. 764 мг Гидрохлорида 1-этил-3-(диметиламинопропил)карбодиимида растворяли в 2,0 мл DI воды и добавляли к смеси и pH снова доводили до 4,75 при комнатной температуре. Реакцию отслеживали по изменению pH и постоянно доводили его до 4,75. После того, когда уже нельзя было обнаружить никакого изменения pH, реакционную смесь оставляли на дополнительный час или на ночь. После этого раствор переносили в диализную пробирку и подвергали диализу против DI воды до тех пор, когда уже никакого ADH не обнаруживали при диализе. Подвергнутый диализу раствор переносили в 3,5 литра 100% этанола, добавляли 2 грамма NaCl и смесь перемешивали в течение одного часа. Для того чтобы отделить осажденную модифицированную HA, раствор центрифугировали в течение 20 минут при 7000 об/мин и супернатант удаляли. Полученную амино-функционализированную HA (AFHA) хранили при 4°С до использования.

Следует отметить, что во всех экспериментах поперечной сшивки с использованием AFHA, описанных ниже, амино-функционализированная HA, полученная в результате функционализации HA 80, соответственно упоминается как AFHA80 здесь далее, и амино-функционализированная HA, полученная в результате функционализации HA 150, соответственно упоминается как AFHA I 150 здесь далее. Эти два материала амино-функционализированной HA (AFHA80 и AFHA I 150) использовали для всех экспериментов поперечной сшивки HA, раскрытых здесь ниже).

Процедуры поперечной сшивки HA

Во всех экспериментах, описанных здесь далее, взбалтывание осуществляли с помощью роторного миксера vortex™. Все центрифугирования (если конкретно не установлено иное) проводили с использованием центрифуги модели RC5C с ротором SORVALL SS-34, коммерчески доступным от SORVALL® Instruments DU PUNT, USA.

Каждый из следующих экспериментов, описанных ниже, обозначали так, что первый номер (со ссылкой на номер экспериментальной серии) следует за знаком косой черты (/), и затем указан диапазон действительных экспериментов, проведенных в серии. Например, ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ СЕРИЯ 32/1-3, ниже, включает следующие три эксперимента: эксперимент 32/1, эксперимент 32/2 и эксперимент 32/3. Такие обозначения соответственно используют во всем описании.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ СЕРИЯ 32/1-3

Приблизительно 5 мг AFHA80 растворяли в 1 мл DI воды и добавляли к 5 мл 100% этанола и взбалтывали в течение 1 минуты, после чего следующие различные количества глицеральдегида добавляли к смеси AFHA80 следующим образом:

а) 2 мг глицеральдегида, растворенного в 100 мкл DI воды (Эксперимент 32/1);

b) 4 мг глицеральдегида, растворенного в 200 мкл DI воды (Эксперимент 32/2);

c) 6 мг глицеральдегида, растворенного в 300 мкл DI воды (Эксперимент 32/3).

Полученную реакционную смесь взбалтывали в течение 1 минуты и помещали в инкубатор и вращали в течение 24 часов при 37°С. Потом раствор центрифугировали при 6000 об/мин в течение 20 минут, супернатант удаляли и 1 мл DI воды добавляли к остающемуся осадку. После 30 минут при комнатной температуре смесь центрифугировали снова при 6000 об/мин в течение 20 минут. Полученные поперечно сшитые продукты имели следующие характеристики:

a) Эксперимент 32/1): 500 мкл твердого геля.

b) (Эксперимент 32/2): Мягкий непрозрачный гель без фазового разделения между сшитой HA и водой (после 3 часов повторного центрифугирования получили 500 мкл прозрачного геля).

с) (Эксперимент 32/2): 800 мкл геля.

Эксперимент 33/1

Приблизительно 25 мг AFHA80 растворяли в 5 мл DI воды, добавляли к 25 мл 100% этанола и взбалтывали в течение 1 минуты. Раствор 10 мг DL-глицеральдегида, растворенного в 500 мкл DI воды, добавляли к смеси, и полученную смесь взбалтывали в течение 1 минуты, помещали в инкубатор и вращали в течение 24 часов при 37°С. После 6 часов вращения в инкубаторе дополнительные 5 мг глицеральдегида, растворенного в 250 мкл DI воды, добавляли к реакционной смеси, и смесь возвращали в инкубатор, чтобы завершить период инкубации. По окончании 24-часового инкубирования раствор центрифугировали при 6000 об/мин в течение 20 минут, супернатант удаляли и 40 мл DI воды и 2 мл буфера PBS (10 мМ) добавляли к осадку и оставляли при комнатной температуре на 6 часов. Смесь затем центрифугировали снова при 6000 об/мин в течение 20 минут. Полученным продуктом было 500 мкл твердого непрозрачного геля.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ СЕРИЯ 35/1-4

Приблизительно 5 мг AFHA80 растворяли в 1 мл DI воды и добавляли к 12 мл 100% этанола и взбалтывали в течение 1 минуты, после чего следующие различные количества DL-глицеральдегида добавляли следующим образом:

а) 1,5 мг DL-глицеральдегида, растворенного в 75 мкл DI воды (Эксперимент 35/1);

b) 3,0 мг DL-глицеральдегида, растворенного в 150 мкл DI воды (Эксперимент 35/2);

с) 4,5 мг DL-глицеральдегида, растворенного в 225 мкл DI воды (Эксперимент 35/3);

d) 6,0 мг DL-глицеральдегида, растворенного в 300 мкл DI воды (Эксперимент 35/4).

Полученные реакционные смеси взбалтывали в течение 1 минуты, помещали в инкубатор и вращали в течение 24 часов при 37°С. Спустя 24 часа растворы центрифугировали при 6000 об/мин в течение 20 минут, супернатант удаляли и 5 мл DI воды добавляли к каждому осадку. После 30 минут при комнатной температуре смеси центрифугировали снова при 6000 об/мин в течение 20 минут. Полученные поперечно сшитые продукты имели следующие характеристики:

a) (Эксперимент 35/1) 3,4 мл прозрачного геля.

b) (Эксперимент 35/2) 3,5 мл прозрачного геля.

с) (Эксперимент 35/3) 4,0 мл прозрачного геля.

d) (Эксперимент 35/4) 4,0 мл прозрачного геля.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ СЕРИЯ 37/4-6

Приблизительно 5 мг AFHA80 растворяли в 1 мл DI воды и добавляли к 10 мл 100% этанола. Смесь взбалтывали в течение 1 минуты, после чего следующие различные количества DL-глицеральдегида добавляли к смеси следующим образом:

а) 8 мг DL-глицеральдегида, растворенного в 400 мкл DI воды (Эксперимент 37/4);

b) 10 мг DL-глицеральдегида, растворенного в 500 мкл DI воды (Эксперимент 37/5);

c) 12 мг DL-глицеральдегида, растворенного в 600 мкл DI воды (Эксперимент 37/6).

Полученные реакционные смеси взбалтывали в течение 1 минуты и помещали в инкубатор и вращали в течение 24 часов при 37°С. По окончании периода инкубации растворы центрифугировали при 6000 об/мин в течение 20 минут, супернатант удаляли и 5 мл DI воды добавляли к каждому осадку. После 30 мин при комнатной температуре смеси центрифугировали снова при 6000 об/мин в течение 20 минут. Полученные поперечно сшитые продукты имели следующие характеристики:

a) (Эксперимент 37/4) 2,5 мл прозрачного геля;

b) (Эксперимент 37/5) 1,9 мл прозрачного геля;

c) (Эксперимент 37/6) 1,5 мл прозрачного геля.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ СЕРИЯ 38/1-3

Приблизительно 5 мг AFHA80 растворяли в 1 мл DI воды и добавляли к 10 мл 100% этанола и взбалтывали в течение 1 минуты, после чего следующие различные количества DL-глицеральдегида добавляли к смеси следующим образом:

а) 14 мг DL-глицеральдегида, растворенного в 700 мкл DI воды (Эксперимент 38/1);

b) 16 мг DL-глицеральдегида, растворенного в 800 мкл DI воды (Эксперимент 38/2);

c) 18 мг DL-глицеральдегида, растворенного в 900 мкл DI воды (Эксперимент 38/3).

Полученные реакционные смеси взбалтывали в течение 1 минуты, помещали в инкубатор и вращали в течение 24 часов при 37°С. Спустя 24 часа растворы центрифугировали при 6000 об/мин в течение 20 минут, супернатант удаляли и 5 мл DI воды добавляли к каждому из осадков. После 30 минут при 37°С смеси центрифугировали снова при 6000 об/мин в течение 20 минут. Полученные поперечно сшитые продукты имели следующие характеристики:

а) (Эксперимент 38/1) 1,0 мл прозрачного геля.

b) (Эксперимент 38/1) 0,75 мл прозрачного геля.

с) (Эксперимент 38/1) 0,50 мл прозрачного геля.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ СЕРИЯ 41/1-4

Приблизительно 5 мг AFHA I 150 растворяли в 5 мл DI воды, добавляли к 10 мл 100% этанола и взбалтывали в течение 1 минуты, после чего следующие различные количества DL-глицеральдегида добавляли к смеси следующим образом:

a) 6 мг DL-глицеральдегида, растворенного в 300 мкл DI воды (Эксперимент 41/1);

b) 8 мг DL-глицеральдегида, растворенного в 400 мкл DI воды (Эксперимент 41/2);

с) 10 мг DL-глицеральдегида, растворенного в 500 мкл DI воды (Эксперимент 41/3);

d) 12 мг DL-глицеральдегида, растворенного в 600 мкл DI воды (Эксперимент 41/4).

Полученные реакционные смеси взбалтывали в течение одной минуты, помещали в инкубатор и вращали в течение 24 часов при 37°С. Спустя 24 часа растворы центрифугировали при 6000 об/мин в течение 20 минут, супернатант удаляли и 20 мл DI воды добавляли к каждому из осадков. После 30 минут при 37°С смеси центрифугировали снова при 6000 об/мин в течение 20 минут. Никакого фазового разделения не наблюдалось в случаях a (Эксперимент 41/1), b (Эксперимент 41/2) и с (Эксперимент 41/3); 5 мл супернатанта могло быть удалено в случае d (Эксперимент 41/4). 50 мл 1 н. Раствора NaOH затем добавляли ко всем образцам и образцы снова центрифугировали и промывали дважды 40 мл буфера PBS (10 мМ, pH 7,36). Разбавленные поперечно сшитые продукты центрифугировали при 6000 об/мин в течение 20 мин после каждой стадии и супернатант удаляли. Результаты были следующие: в образцах a (Эксперимент 41/1), b (Эксперимент 41/2) и с (Эксперимент 41/3) никакого геля не оставалось. В образце d (Эксперимент 41/4) 5 мл прозрачного геля было получено.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ СЕРИЯ 42/1-3

Приблизительно 5 мг AFHA I 150 растворяли в 5 мл DI воды, добавляли к 40 мл 100% этанола и взбалтывали в течение 1 мин, после чего следующие различные количества DL-глицеральдегида добавляли к смеси следующим образом:

а) 16 мг DL-глицеральдегида, растворенного в 800 мкл DI воды (Эксперимент 42/1);

b) 20 мг DL-глицеральдегида, растворенного в 1000 мкл DI воды (Эксперимент 42/2);

c) 40 мг DL-глицеральдегида, растворенного в 2000 мкл DI воды (Эксперимент 42/3).

Полученные реакционные смеси взбалтывали в течение 1 минуты и помещали в инкубатор и вращали в течение 24 часов при 37°С. Спустя 24 часа растворы центрифугировали при 6000 об/мин в течение 20 минут, супернатанты удаляли и 40 мл DI воды добавляли к каждому из полученных осадков. После 30 минут при комнатной температуре каждую из смесей центрифугировали при 6000 об/мин в течение 20 минут. Полученные поперечно сшитые гели обнаруживали возрастающую вязкость геля от a) через b) до c) (т.е. гель, полученный в эксперименте 42/1, имел самую низкую вязкость из трех, гель, полученный в эксперименте 42/3, имел наивысшую вязкость из трех, и полученный в эксперименте 42/2 имел величину вязкости между наивысшей и самой низкой из трех образцов).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ СЕРИЯ 44/1-2

Приблизительно 5 мг AFHA80 растворяли в 5 мл DI воды, добавляли к 40 мл 100% этанола и взбалтывали в течение 1 мин, после чего следующие различные количества различных восстанавливающих сахаров в качестве кросс-линкеров добавляли к смеси следующим образом:

а) 44 мг DL-глицеральдегида, растворенного в 2 мл DI воды (Эксперимент 44/1);

b) 44 мг D(-)-рибозы, растворенной в 2 мл DI воды (Эксперимент 44/1).

Реакционные смеси взбалтывали в течение 1 минуты, помещали в инкубатор и вращали в течение 24 часов при 37°С (Эксперимент 44/1) и в течение одиннадцати (11) дней при 37°С (Эксперимент 44/2). По окончании периода инкубации каждую из реакционных смесей центрифугировали при 6000 об/мин в течение 20 мин, супернатант удаляли и 40 мл физиологического раствора NaCl (0,9%) добавляли к каждому из полученных осадков. Смеси оставляли на 30 минут при комнатной температуре и центрифугировали при 6000 об/мин в течение 20 минут. Результаты были следующие: a) (Эксперимент 44/1) получен мягкий прозрачный гель, b) (Эксперимент 44/2) получен гель не совсем белого, желтоватого оттенка.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ СЕРИЯ 53/1-3

Приблизительно 50 мг AFHA I 150 растворяли в 2 мл DI воды. 100 мг DL-глицеральдегида растворяли в 2 мл DI воды. Два раствора смешивали и экструдировали пять раз через шприц без иглы и дважды через иглу 18G. Смесь в конце экструдировали через иглу 18G в следующие количества этанола:

а) 20 мл 100% этанола (Эксперимент 53/1);

b) 30 мл 100% этанола (Эксперимент 53/2);

с) 40 мл 100% этанола (Эксперимент 53/3).

Каждую из полученных реакционных смесей для поперечной сшивки помещали в инкубатор и вращали в течение 24 часов при 37°С. По окончании периода инкубации каждый из растворов центрифугировали при 6000 об/мин в течение 20 минут. Супернатанты удаляли и 20 мл физиологического раствора NaCl (0,9%) добавляли к каждому из полученных осадков. Смеси затем оставляли на три часа при 37°С и центрифугировали при 6000 об/мин в течение 20 минут.

ЭКСПЕРИМЕНТ 54/1

Приблизительно 50 мг AFHA I 150 растворяли в 4 мл DI воды, содержащей 150 мг DL-глицеральдегида. Смесь повторно экструдировали через иглу 22G (шесть раз) и затем экструдировали через иглу 18G в 40 мл 100% этанола, помещали в инкубатор и вращали в течение 24 часов при 37°С. После инкубации раствор центрифугировали при 6000 об/мин в течение 20 минут, супернатант удаляли и 20 мл физиологического раствора NaCl (0,9%) добавляли к осадку. Полученную смесь оставляли на два часа при 37°С и смесь затем центрифугировали при 6000 об/мин в течение 20 минут.

ЭКСПЕРИМЕНТ 55/1

Приблизительно 50 мг AFHA I 150 растворяли в 4 мл DI воды, содержащей 150 мг DL-глицеральдегида. Смесь повторно экструдировали через иглу 22G (шесть раз) и затем экструдировали через иглу 18G в смесь 35 мл 100% этанола и 5 мл DI воды. Реакционную смесь помещали в инкубатор и вращали в течение 24 часов при 37°С. После периода инкубации смесь центрифугировали при 6000 об/мин в течение 20 минут, супернатант удаляли и 20 мл физиологического раствора NaCl (0,9%) добавляли к осадку. После двух часов при 37°С смесь центрифугировали при 6000 об/мин в течение 20 минут. Полученный белый материал не обнаруживал поглощения воды.

ЭКСПЕРИМЕНТ 60/1

Приблизительно 50 мг AFHA I 150 растворяли в 4 мл DI воды, содержащей 300 мг DL-глицеральдегида, и встряхивали в течение 30 минут при 50°С. Реакционную смесь затем экструдировали через шприц (без иглы) в 40 мл 100% этанола и полученную смесь помещали на водяную баню и взбалтывали в течение шести часов при 50°С. Смесь затем центрифугировали при 6000 об/мин в течение 20 мин, супернатант удаляли и 40 мл физиологического раствора NaCl (0,9%) вместе с 2 мл буферного раствора PBS (10 мМ, pH 7,36) добавляли к осадку. Смесь затем центрифугировали при 6000 об/мин в течение 20 минут. Полученным продуктом реакции было 2,8 мл геля.

ЭКСПЕРИМЕНТ 61/1

Приблизительно 50 мг AFHA I 150 растворяли в 4 мл DI воды, содержащей 300 мг DL-глицеральдегида, и смесь взбалтывали в течение 60 минут при 50°С. Смесь затем экструдировали через шприц (без иглы) в 40 мл 100% этанола и полученную смесь помещали на водяную баню и взбалтывали в течение пяти часов при 50°С. После инкубации смесь центрифугировали при 6000 об/мин в течение 20 минут, супернатант удаляли и 40 мл физиологического раствора NaCl (0,9%) вместе с 2 мл буферного раствора PBS (10 мМ, pH 7,36) добавляли к осадку. Смесь затем центрифугировали при 6000 об/мин в течение 20 минут.

ЭКСПЕРИМЕНТ 62/1

Приблизительно 50 мг AFHA I 150 растворяли в 4 мл DI воды, содержащей 300 мг DL-глицеральдегида, и взбалтывали в течение 10 минут при комнатной температуре. Смесь выпускали через шприц в 40 мл 100% этанола, помещали на водяную баню и взбалтывали в течение 24 часов при 50°С. Потом раствор центрифугировали при 6000 об/мин в течение 20 минут, супернатант удаляли и 40 мл физиологического раствора NaCl (0,9%) вместе с 2 мл буферного раствора PBS (10 мМ, pH 7,36) добавляли к осадку. Смесь затем центрифугировали при 6000 об/мин в течение 20 минут. Полученным продуктом был 1 мл непрозрачного геля.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ СЕРИЯ 65/3-5

Приблизительно 50 мг AFHA I 150 растворяли в 4 мл DI воды, содержащей:

a) 100 мг DL-глицеральдегида (Эксперимент 65/3);

b) 200 мг DL-глицеральдегида (Эксперимент 65/4);

c) 300 мг DL-глицеральдегида (Эксперимент 65/5).

Полученные реакционные смеси экструдировали четыре раза через иглу 2OG и каждую из реакционных смесей экструдировали через шприц без иглы в 40 мл 100% этанола и помещали на нагревательную баню и взбалтывали в течение трех (3) часов при 50°С и затем помещали в инкубатор и вращали в течение шестнадцати (16) часов при 37°С. Каждую из полученных реакционных смесей затем центрифугировали при 6000 об/мин в течение 20 минут, супернатанты удаляли и 40 мл физиологического раствора NaCl (0,9%) вместе с 2 мл буферного раствора PBS (10 мМ, pH 7,36) добавляли к каждому из полученных осадков. Смеси затем центрифугировали снова при 6000 об/мин в течение 20 минут. Полученные продукты реакции имели следующий вид:

а) (Эксперимент 65/3) 3,5 мл непрозрачного геля;

b) (Эксперимент 65/3) 2,5 мл непрозрачного геля;

с) (Эксперимент 65/3) 2,0 мл непрозрачного геля.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ СЕРИЯ 67/1-2

Приблизительно 50 мг AFHA I 150 растворяли в 4 мл DI воды, содержащей 50 мг DL-глицеральдегида. Материал смешивали в шприце и выпускали в 40 мл 100% этанола. Смесь помещали в инкубатор и вращали в течение следующих периодов:

а) 2 дня при 37°С. (Эксперимент 67/1);

b) 3 дня при 37°С. (Эксперимент 67/2).

После периода инкубации растворы центрифугировали при 9000 об/мин в течение 20 минут, супернатант удаляли и 40 мл физиологического раствора NaCl (0,9%) вместе с 2 мл буферного раствора PBS (10 мМ, pH 7,36) добавляли к каждому из осадков. Смеси затем центрифугировали снова при 9000 об/мин 5 в течение 20 минут. Полученными продуктами реакции были: a) 2 мл непрозрачного геля (Эксперимент 67/1) и b) 1,6 мл непрозрачного геля (Эксперимент 67/2).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ СЕРИЯ 67/4-6

Приблизительно 50 мг AFHA I 150 растворяли в 4 мл DI воды, содержащей:

a) 300 мг D(-)-рибозы (Эксперимент 67/4);

b) 300 мг D(-)-арабинозы (Эксперимент 67/5);

c) приблизительно 150 мг D(-)-эритрозы (Эксперимент 67/6).

Три смеси, каждую, смешивали в шприце экструдированием несколько раз через иглу 20G и затем каждую экструдировали через иглу 2OG в 40 мл 100% этанола. Смеси затем помещали в инкубатор и вращали в течение 15 дней при 37°С. После инкубации смеси центрифугировали при 9000 об/мин в течение 20 минут, супернатант удаляли и 40 мл физиологического раствора NaCl (0,9%) вместе с 2 мл буферного раствора PBS (10 мМ, pH 7,36) добавляли к осадкам и смесь центрифугировали снова при 9000 об/мин в течение 20 минут. Полученные продукты реакции показали следующие свойства:

а) (Эксперимент 67/4) Нет поглощения воды - желтоватые волокна.

b) (Эксперимент 67/5) Прозрачный гель.

с) (Эксперимент 67/6) Нет поглощения воды - белые волокна.

ЭКСПЕРИМЕНТ 72/1

Приблизительно 100 мг AFHA I 150 растворяли в 4 мл DI воды, содержащей 100 мг DL-глицеральдегида. Полученную реакционную смесь экструдировали четыре раза через иглу 18G и затем экструдировали дважды через иглу 21G. Смесь разделяли на две равные порции. Каждую из двух порций экструдировали через иглу 21G в 40 мл 100% этанола. Полученные смеси помещали в инкубатор и вращали в течение трех дней при 37°С. После периода инкубации 5 мл физиологического раствора NaCl (0,9%) добавляли к каждой из двух смесей и раствор центрифугировали при 9000 об/мин в течение 20 минут. Супернатанты удаляли и 40 мл физиологического раствора NaCl (0,9%) вместе с 2 мл буферного раствора PBS (10 мМ, pH 7,36) добавляли к каждому из полученных осадков. Смеси затем центрифугировали при 9000 об/мин в течение 20 минут и полученные осадки объединяли. Эксперимент имел результатом суммарный (объединенный) объем 2,1 мл непрозрачного геля.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ СЕРИЯ 75/1,2

100 мг DL-глицеральдегида растворяли в 7 мл DI воды. Суспензию 100 мг AFHA I 150 в 1,5 мл 100% этанола добавляли к приготовленному раствору DL-глицеральдегида. Полученную смесь гомогенизировали экструзией (три раза) через иглу 18G и разделяли на две равные порции. Каждую из двух порций экструдировали в 40 мл 100% этанола. Смеси затем помещали в инкубатор и вращали в течение 3 дней при 37°С. Потом 5 мл физиологического раствора NaCl (0,9%) добавляли к каждой из двух смесей и растворы центрифугировали при 9000 об/мин в течение 20 минут. Супернатанты удаляли и 40 мл физиологического раствора NaCl (0,9%) вместе с 2 мл буферного раствора PBS (10 мМ, pH 7,36) добавляли к каждому из полученных осадков. Две смеси затем центрифугировали снова при 9000 об/мин в течение 20 минут и два осадка объединяли.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ СЕРИЯ 75/3,4

80 мг DL-глицеральдегида растворяли в 7 мл DI воды. Суспензию 100 мг AFHA I 150 в 2 мл 100% этанола добавляли в приготовленный раствор DL-глицеральдегида. Полученную смесь гомогенизировали экструзией (три раза) через иглу 18G и разделяли на две равные порции. Каждую из двух порций раздельно экструдировали в 40 мл 100% этанола. Смеси затем помещали в инкубатор и вращали в течение 3 дней при 37°С. Потом 5 мл физиологического раствора NaCl (0,9%) добавляли к каждой из двух реакционных смесей и смеси центрифугировали при 9000 об/мин в течение 20 минут. Супернатанты удаляли и 40 мл физиологического раствора NaCl (0,9%) вместе с 2 мл буферного раствора PBS (10 мМ, pH 7,36) добавляли к каждому из полученных осадков. Осадки затем центрифугировали снова при 9000 об/мин в течение 20 минут и полученные осадки объединяли.

ЭКСПЕРИМЕНТ 77/1

90 мг DL-глицеральдегида растворяли в 14 мл DI воды. Суспензию 100 мг AFHA I 150 в 5 мл 100% этанола добавляли к приготовленному раствору DL-глицеральдегида. Полученную реакционную смесь гомогенизировали экструзией (три раза) через иглу 18G и разделяли на две равные порции. Каждую из порций добавляли в 40 мл 100% этанола. Полученные смеси помещали в инкубатор и вращали в течение 3 дней при 37°С. Потом 5 мл физиологического раствора NaCl (0,9%) добавляли к каждой из смесей и смеси центрифугировали при 9000 об/мин в течение 20 минут. Супернатанты удаляли и 40 мл физиологического раствора NaCl (0,9%) вместе с 2 мл буферного раствора PBS (10 мМ, pH 7,36) добавляли к каждому из полученных осадков и смешивали. Смеси центрифугировали снова при 9000 об/мин в течение 20 минут и полученные осадки объединяли.

Процедуры поперечной сшивки хитозана:

Буфер фибриллирования, используемый в экспериментах, готовили следующим образом: 6,5 литров DI воды помещали в 10-литровый стеклянный сосуд. 11,3 Грамма NaOH (для конечной концентрации 0,04 M) и 252 грамма Na₂HPO₄·2H₂O (для конечной концентрации 0,2 M) растворяли в DI воде. pH Доводили до 11,2 10 н. NaOH. Объем раствора дополняли до 7 литров DI водой. Конечный pH доводили (с помощью NaOH) до диапазона pH 11,20-11,30.

ЭКСПЕРИМЕНТ 9/1

Приблизительно 181,5 мг хитозана растворяли в 9,6 мл 0,1 н. HCl. 14 мг DL-глицеральдегида растворяли в 2,5 мл DI воды и смешивали с раствором хитозана. Смесь взбалтывали в течение 1 минуты и 1 мл буфера фибриллирования и 9,6 мл 100% этанола медленно добавляли к смеси хитозан/DL-глицеральдегид при постоянном перемешивании. Реакционную смесь помещали в инкубатор и вращали в течение 24 часов при 37°С. В конце инкубации раствор, содержащий 28 мг DL-глицеральдегида, растворенного в 1,4 мл DI воды, добавляли к смеси и полученную смесь оставляли в инкубаторе и вращали в течение дополнительных 24 часов при 37°С. Смесь затем центрифугировали при 7000 об/мин в течение 15 минут, супернатант удаляли и полученный осадок промывали 30 мл 1 н. HCl и затем 30 мл DI воды. Каждая стадия промывания включала центрифугирование образца, для того чтобы удалить избыток жидкости. Полученный осадок имел консистенцию плотного геля.

ЭКСПЕРИМЕНТ 12/1

Шесть различных растворов глицеральдегида готовили следующим образом:

а) 20 мг DL-глицеральдегида в 2,5 мл DI воды;

b) 40 мг DL-глицеральдегида в 2,5 мл DI воды;

с) 60 мг DL-глицеральдегида в 2,5 мл DI воды;

d) 80 мг DL-глицеральдегида в 2,5 мл DI воды;

e) 100 мг DL-глицеральдегида в 2,5 мл DI воды.

Каждый из полученных растворов DL-глицеральдегида a-e раздельно смешивали с раствором, приготовленным растворением 196 мг хитозана в 10 мл 0,1 н. HCl. Каждую из полученных шести реакционных смесей взбалтывали в течение 1 минуты. К каждой из шести смесей добавляли 1 мл буфера фибриллирования медленно при постоянном перемешивании с последующим добавлением 15 мл смеси 70% этанол/DI вода (об./об.) также медленно при постоянном перемешивании. Реакционную смесь затем помещали в инкубатор и вращали в течение 24 часов при 37°С. После 24 часов инкубации к реакционной смеси медленно добавляли 5 мл буфера PBS и 2,5 мл буфера фибриллирования, сопровождая взбалтыванием. Смеси затем повторно инкубировали при 37°С. Во время второй инкубации смесь извлекали из инкубатора дважды, взбалтывали и затем возвращали в инкубатор (один и два часа после добавления PBS и буфера фибриллирования). Смеси затем оставляли в инкубаторе и вращали. Общее время инкубации при 37°С было 48 часов. После завершения инкубации шесть образцов (a-e) центрифугировали при 7000 об/мин в течение 15 минут. Супернатанты удаляли и продукт промывали 30 мл 1 н. HCl, а затем 30 мл DI воды. Каждая стадия промывания включала центрифугирование образца, для того чтобы удалить избыток растворителя. Все пять полученных образцов имели желтоватый цвет (который был сильнее, чем первоначальный желтоватый цвет непрореагировавшего раствора хитозана), вероятно, благодаря образованию продукта гликозилирования. Четкое фазовое разделение в наблюдаемой гелевой фазе было обнаружено только в образцах a и b.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ СЕРИЯ 35/1-4

Следующие четыре различных раствора DL-глицеральдегида были приготовлены:

a) 15 мг DL-глицеральдегида, растворенного в 75 мкл PBS (Эксперимент 35/1);

b) 30 мг DL-глицеральдегида, растворенного в 150 мкл PBS (Эксперимент 35/2);

c) 45 мг DL-глицеральдегида, растворенного в 225 мкл PBS (Эксперимент 35/3);

d) 60 мг DL-глицеральдегида, растворенного в 300 мкл PBS (Эксперимент 35/4).

Каждый из указанных четырех растворов DL-глицеральдегида a-d по отдельности смешивали с раствором приблизительно 20 мг хитозана, растворенного в 1 мл 0,1 н. HCl, и нейтрализовали (до pH 7,0) с помощью 0,1 н. HCl. Каждую из полученных четырех реакционных смесей взбалтывали в течение 1 минуты и 12 мл 100% этанола добавляли к каждой взбалтываемой реакционной смеси при постоянном перемешивании. Полученные реакционные смеси затем помещали в инкубатор и вращали в течение 24 часов при 37°С. После завершения периода инкубации реакционные смеси центрифугировали при 7000 об/мин в течение 15 минут. Супернатанты удаляли и полученные осадки, каждый, промывали 10 мл 1 н. HCl с последующим промыванием 5 мл DI воды. Каждая стадия промывания включала центрифугирование образца, для того чтобы удалить избыток растворителя. Никакого фазового разделения между водой и хитозановым гелем не наблюдалось ни в одном из четырех образцов a-d (экспериментов 37/1, 37/2, 37/3 и 37/4, соответственно).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ СЕРИЯ 38/1-6 и 39/1-4

Приблизительно 20 мг хитозана растворяли в 1 мл 0,1 н. HCl и нейтрализовали с помощью 0,1 н. NaCl. Десять различных растворов DL-глицеральдегида готовили следующим образом:

a) 80 мг глицеральдегида растворяли в 400 мкл PBS (Эксперимент 38/1);

b) 100 мг DL-глицеральдегида растворяли в 500 мкл PBS (Эксперимент 38/2);

c) 120 мг DL-глицеральдегида растворяли в 600 мкл PBS. (Эксперимент 38/3);

d) 160 мг DL-глицеральдегида растворяли в 800 мкл PBS (Эксперимент 38/4);

e) 200 мг DL-глицеральдегида растворяли в 1000 мкл PBS (Эксперимент 38/5).

f) 240 мг DL-глицеральдегида растворяли в 1200 мкл PBS (Эксперимент 38/6);

g) 300 мг DL-глицеральдегида растворяли в 1500 мкл PBS
(Эксперимент 39/1);

h) 350 мг DL-глицеральдегида растворяли в 1750 мкл PBS (Эксперимент 39/2);

i) 400 мг DL-глицеральдегида растворяли в 2000 мкл PBS (Эксперимент 39/3);

j) 500 мг DL-глицеральдегида растворяли в 2500 мкл PBS (Эксперимент 39/4).

Каждый из растворов DL-глицеральдегида a-j затем раздельно смешивали с 1 мл раствора хитозана, содержащего приблизительно 20 мг хитозана, растворенного в 1 мл 0,1 н. HCl, и нейтрализовали (до pH 7,0), используя 0,1 н. HCl. Каждую реакционную смесь взбалтывали в течение 1 минуты и 10 мл 100% этанола добавляли к каждой из реакционных смесей при постоянном перемешивании. Реакционные смеси затем помещали в инкубатор и вращали в течение 24 часов при 37°С. После завершения периода инкубации реакционные смеси центрифугировали при 7000 об/мин в течение 15 минут, супернатанты удаляли и полученные осадки, каждый, промывали 10 мл 1 н. HCl с последующим промыванием 5 мл DI воды (для экспериментов 38/1-6, выше) или 10 мл DI воды (для экспериментов 39/1-4, выше). Каждая стадия промывания включала центрифугирование образца, для того чтобы удалить избыток растворителя. В конечных продуктах реакции из экспериментов 38/1-6 никакого фазового разделения между водой и поперечно сшитым хитозановым гелем не наблюдалось. В конечных продуктах реакции 39/1-4 фазовое разделение на супернатант и хитозановый гель наблюдалось после центрифугирования. Наблюдалось изменение цвета продуктов реакции из экспериментов 38/1-6 и 39/1-4 от не совсем белого до желтоватого с сопутствующим снижением поглощения воды полученным поперечно сшитым хитозановым гелем по мере возрастания концентраций кросс-линкера (DL-глицеральдегида).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ СЕРИЯ 40/1-3

В этих экспериментах условия были точным повторением эксперимента 39, описанного выше, за исключением того, что только части g, i и j осуществляли со следующими концентрациями DL-глицеральдегида:

g) 300 мг DL-глицеральдегида растворяли в 1500 мкл PBS (Эксперимент 40/1);

i) 400 мг DL-глицеральдегида растворяли в 2000 мкл PBS (Эксперимент 40/2);

j) 500 мг DL-глицеральдегида растворяли в 2500 мкл PBS (Эксперимент 40/3).

Остальные условия реакции осуществляли точно как в ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ СЕРИИ 39/1-4, которая подробно описана здесь выше.

Полученные осадки использовали для измерения набухаемости продуктов (результаты показаны на фиг. 9).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ СЕРИЯ 44/3-4

а) 56 мг DL-глицеральдегида растворяли в 500 мкл DI воды (Эксперимент 44/3).

b) 56 мг D(-)-рибозы растворяли в 500 мкл DI воды (Эксперимент 44/4).

Каждый из растворов a и b, выше, раздельно смешивали с раствором хитозана, приготовленным растворением приблизительно 100 мг хитозана в 5 мл 0,1 н. HCl и нейтрализацией раствора с использованием 0,1 н. NaCl. Каждую из двух полученных реакционных смесей взбалтывали в течение 1 минуты и смешивали с 40 мл 100% этанола. Реакционные смеси помещали в инкубатор и вращали в течение 24 часов при 37°С (Эксперимент 44/3) или в течение 12 дней при 37°C (Эксперимент 44/4). После завершения двух различных периодов инкубации реакционные смеси центрифугировали при 7000 об/мин в течение 15 минут, супернатанты удаляли и осадки промывали 40 мл 1 н. HCl с последующим промыванием 10 мл DI воды. Каждая стадия промывания включала центрифугирование образца, для того чтобы удалить избыток растворителя. Оба эксперимента имели результатом мягкий гель. Полученный в эксперименте 44/3 поперечно сшитый DL-глицеральдегидом гель имел более яркий желтоватый цвет, чем цвет поперечно сшитого D(-)-рибозой геля, полученного в эксперименте 44/4.

Спектроскопическая характеристика поперечно сшитых полисахаридов

Теперь в отношении фиг. 1-4. На графиках, приводимых на фиг. 1-3, по вертикальной оси дана поглощающая способность образца и по горизонтальной оси длина волны в нм. На графике, приведенном на фиг. 4, по вертикальной оси дана поглощающая способность образца и по горизонтальной оси дано волновое число (в единицах см^-1).

Фиг. 1 является схематическим графиком, представляющим видимый УФ-спектр амино-функционализированной гиалуроновой кислоты (AFHA) (представленный штриховой кривой 10) и поперечно сшитой DL-глицеральдегидом AFHA (представленный сплошной кривой 20), полученной в соответствии с вариантом осуществления способа по данному изобретению. Пунктирная кривая представляет спектр образца амино-функционализированной HA (AFHA I 150, полученной, как подробно раскрыто здесь выше), и сплошная кривая представляет спектр поперечно сшитого DL-глицеральдегидом продукта, полученного в эксперименте 72/1, который описан здесь выше. В противоположность образцу AFHA I 150 образец поперечно сшитого полисахарида обнаруживает сильную поглощающую способность в диапазоне 225-235 нм и 285-355, что может указывать на образование продуктов гликозилирования в реакции поперечной сшивки.

Фиг. 2 является схематическим графиком, представляющим видимый УФ-спектр поперечно сшитой D(-)-рибозой AFHA (представленный штриховой кривой 30), поперечно сшитой D(-)-эритрозой AFHA (представленный сплошной кривой 32) и поперечно сшитой D(-)-арабинозой AFHA (представленный пунктирной кривой 34), полученных в соответствии с вариантами осуществления способа по данному изобретению. Образец поперечно сшитой D(-)-рибозой HA был получен из образца эксперимента 67/1. Образец поперечно сшитой D(-)-эритрозой HA был получен из образца эксперимента 67/6. Образец поперечно сшитой D(-)-арабинозой HA был получен из образца эксперимента 67/2.

Сдвиги пиков, вероятно, являются результатом различных восстанавливающих сахаров, которые использовали для поперечной сшивки НА. Каждый сахар имеет свою собственную специфическую длину цепи и конформацию, которая имеет влияние на конечные продвинутые продукты гликозилирования (AGE), образующиеся в реакции.

Фиг. 3 является схематическим графиком, представляющим видимый УФ-спектр несшитого поперечно хитозана (представленный сплошной кривой 40), поперечно сшитого D(-)-рибозой хитозана (представленный штриховой кривой 42) и поперечно сшитого DL-глицеральдегидом хитозана (представленный пунктирной кривой 44), полученных в соответствии с вариантами осуществления способа по данному изобретению. Образец несшитого поперечно хитозана (кривая 40) был получен от Aldrich, как указано в таблице 1 здесь выше. Образец поперечно сшитого D(-)-рибозой хитозана (кривая 42) был получен из образца эксперимента 44/4. Образец поперечно сшитого DL-глицеральдегидом хитозана (кривая 44) был получен из образца эксперимента 44/3.

В противоположность образцу с немодифицированным (несшитым поперечно) хитозаном два образца хитозана, поперечно сшитого D(-)-рибозой и DL-глицеральдегидом, обнаруживали усовершенствованную поглощающую способность около 290 нм (возможно, указывающую типичную поглощающую способность предполагаемых продуктов гликозилирования и, возможно, AGE).

Фиг. 4 является схематическим графиком, представляющим инфракрасный спектр (FTIR) (Fourrier Transform Infra-red spectra) гиалуроновой кислоты (представленный пунктирной кривой 46), AFHA, представленный штриховой кривой 48, и поперечно сшитой DL-глицеральдегидом AFHA, представленный сплошной кривой 50, в соответствии с вариантами осуществления способа по данному изобретению.

Пунктирная кривая представляет ИК-спектр гиалуроновой кислоты (HA150). Штриховая кривая иллюстрирует ИК-спектр амино-функционализированной HA (AFHA I 150). Сплошная кривая представляет спектр образца поперечно сшитой DL-глицеральдегидом HA, полученной в эксперименте 33/1. ИК-спектр на фиг. 4 показывает диапазон поглощающей способности карбоксильных групп (COO) и перекрывание этой поглощающей способностью в диапазоне 1610-1550 см^-1 и 1420-1300 см^-1 поглощающей способности амидных и аминогрупп (1650 см^-1 и 1560 см^-1, соответственно), которая может изменяться до более высоких или более низких волновых чисел в зависимости от их окружения. В дополнение, поглощающая способность в диапазоне 1740-1700 см^-1 появляется после поперечной сшивки. Обычно поглощающая способность карбоновых кислот, а также поглощающая способность амидов и аминокислот находятся в указанном диапазоне длины волны (1740-1700 см^-1). Так как указанные функциональные группы присутствуют в конечной поперечно сшитой НА, трудно провести различия между ними. Как правило, значительные изменения спектра поглощения могут наблюдаться для продуктов реакции поперечной сшивки, раскрытых здесь, что решительно подтверждает модификацию и химическую реакцию во время применяемых процедур амино-функционализации и поперечной сшивки и образование продуктов гликозилирования.

Физическая характеристика поперечно сшитых полисахаридов

Все характеристики поперечно сшитых полисахаридов, полученных в экспериментах, описанных здесь выше, получали, используя стандартные методы, на крутильном вискозиметре модели HAAKE RheoStress 600, коммерчески доступном от Thermo Electron Corporation GmbH, Germany. Для всех измерений использовали ротор модели PP 20 Ti PR с покровной пластиной для измерений модели MPC20/S QF. Измерения осуществляли при температуре 23°С.

Все реологические испытания проводили методом колебательных измерений. 400 мкл испытуемого материала помещали между двумя разными пластинами вискозиметра. Синусоидальную нагрузку прилагали ко всем образцам при частоте в диапазоне между 0,01 и 10 Гц. Полученные величины комплексной вязкости [η*] даны в таблице 2 ниже. Выборочные результаты реологических измерений также проиллюстрированы более подробно на фиг. 5-7.

Таблица 2
№ эксперимента или наименование продукта	Комплексная вязкость [η*] в Па при частоте генерации 0,01 Гц
53/1	248 (неэкструдированный) 387 (экструдированный через иглу 20G)
53/2	526 (неэкструдированный) 643 (экструдированный через иглу 20G)
53/3	929 (неэкструдированный) 483 (экструдированный через иглу 20G)
54/1	1094 653 (экструдированный через иглу 20G)
60/1	2197
61/1	1554
62/1	2765
65/3	2689
65/4	1663
65/5	623
67/1	1333 (неэкструдированный) 2391 (экструдированный 4 раза через иглу 27G)
67/2	5599 (неэкструдированный) 7036 (экструдированный 5 раз через иглу 27G) 6727 (когда экструдирован 2 раза через иглу 30G)
72/1	2279 3873 (20 часов при 37°С)
75/1	8926
75/2	6606
75/3	6721
75/4	4415
77/1	2279 5226 (24 часа при 37°С) 5436 (48 часов при 37°С) 6863 (20 дней при 37°С)
Restylane® лот: 7349	2216
Perlane® лот: 7064	2419
Hylaform® лот: R0409	614

Следует отметить, что, когда несколько измеренных величин [η*] представлено в правой колонке таблицы 2, первая указанная величина представляет результат измерения образца конечного продукта реакции, как непосредственно взятого от конечного осадка (или непосредственно взятого из шприца коммерческого продукта для образцов Restylane®, Perlane® и Hylaform®). Другие измеренные величины [η*], указанные (внутри того же ряда) для того же образца того же эксперимента, показывают результаты, полученные от того же самого образца, который был дополнительно обработан или экструдированием образца через иглу (как указано подробно в скобках после числовой величины), или дополнительным инкубированием образца в течение конкретного периода времени при 37°С (точный период времени инкубирования указан в скобках после числовой величины).

Что касается фиг. 5-7, то они представляют схематические графики, иллюстрирующие результаты измерений реологических свойств различных составов полисахарида на основе AFHA, поперечно сшитого различными концентрациями DL-глицеральдегида в течение различных периодов времени, в сравнении с реологическими свойствами некоторых коммерчески доступных матриц на основе гиалуроновой кислоты. На фиг. 5-7 вертикальная ось представляет комплексную вязкость [η*] в Па, и горизонтальная ось представляет частоту колебаний в Гц.

На фиг. 5 заштрихованными кружочками нанесены экспериментальные данные, полученные для поперечно сшитой матрицы из эксперимента 53/3 (которая была поперечно сшита 100 мг глицеральдегида в течение 24 часов при 37°C). Заштрихованные квадратики представляют экспериментальные данные, полученные для поперечно сшитой матрицы из эксперимента 54/1 (которая была поперечно сшита 150 мг DL-глицеральдегида в течение 24 часов при 37°C). Заштрихованные треугольники представляют экспериментальные данные, полученные для поперечно сшитой матрицы из эксперимента 62/1 (которая была поперечно сшита 300 мг DL-глицеральдегида в течение 24 часов при 37°C). Незаштрихованные кружочки представляют экспериментальные данные, полученные для коммерчески доступного Perlane® (лот: 7064) (действительные числовые величины смотри в таблице 2).

Как можно видеть на графике фиг. 5, увеличение концентрации DL-глицеральдегида в сходных условиях реакции значительно увеличивает вязкость полученного поперечно сшитого полисахарида. Кроме того, поперечно сшитый полисахарид, полученный в эксперименте 62/1 (в котором 300 мг DL-глицеральдегида использовали в поперечно сшивающей смеси), имеет величины комплексной вязкости значительно выше, чем у коммерчески доступного Restylane®-Perlane® на основе гиалуроновой кислоты для величин частот ниже 0,1 Гц.

На фиг. 6 заштрихованные кружочки представляют экспериментальные данные для поперечно сшитой матрицы из эксперимента 67/1 (которая была поперечно сшита 50 мг DL-глицеральдегида в течение 48 часов при 37⁰C). Заштрихованные квадратики представляют экспериментальные данные, полученные для поперечно сшитой матрицы из эксперимента 67/2 (которая была поперечно сшита 50 мг DL-глицеральдегида в течение 72 часов при 37°C). Незаштрихованные кружочки представляют экспериментальные данные, полученные для коммерчески доступного Perlane® (лот: 7064) (действительные числовые величины смотри в таблице 2).

Как можно видеть из фиг. 6, когда время инкубации реакции поперечной сшивки AFHA увеличивают от 48 часов до 72 часов, величины комплексной вязкости полученного поперечно сшитого полисахарида на основе НА значительно увеличиваются с увеличением продолжительности реакции поперечной сшивки. Более того, поперечно сшитый полисахарид, полученный в эксперименте 67/2 (в котором осуществляли 72-часовую реакцию поперечной сшивки с использованием 50 мг DL-глицеральдегида в поперечно сшивающей смеси), имеет величины комплексной вязкости значительно выше, чем у коммерчески доступного Restylane®-Perlane® на основе гиалуроновой кислоты для величин частот ниже 0,1 Гц.

На фиг. 7 заштрихованные ромбические символы представляют экспериментальные данные, полученные для поперечно сшитой матрицы из эксперимента 77/1 (которая была поперечно сшита 40 мг DL-глицеральдегида в течение трех дней при 37°С). Незаштрихованные кружочки представляют экспериментальные данные, полученные для коммерчески доступного Perlane® (лот: 7064). Незаштрихованные квадратики представляют экспериментальные данные, полученные для коммерчески доступного Restylane® (лот: 7349). Незаштрихованные треугольники представляют экспериментальные данные, полученные для коммерчески доступного Hylaform® Plus лот номер R0409 (действительные числовые величины смотри в таблице 2).

Как можно видеть из фиг. 7, когда величины комплексной вязкости трех коммерчески доступных выдавливаемых из шприца гелей на основе гиалуроновой кислоты и полисахарида на основе поперечно сшитой DL-глицеральдегидом HA из эксперимента 77/1 сравнивают, измеренные величины комплексной вязкости постоянно и значительно выше для поперечно сшитого материала, полученного в эксперименте 77/1 в диапазоне частот колебаний 0,1-0,01 Гц. Например, при 0,01 Гц комплексная вязкость поперечно сшитого материала, полученного в эксперименте 77/1, равна более чем двукратной комплексной вязкости, измеренной для Restylane®-Perlane® лот No. 7064, более чем трехкратной комплексной вязкости, измеренной для Restylane® - лот No. 7349, и более чем девятикратной комплексной вязкости, измеренной для Hylaform® -Plus лот No. R0409.

Специалист в данной области оценит по достоинству, что такое увеличение величин вязкости может выгодно коррелировать с усовершенствованием подтягивающей и укрепляющей способности наполнителя, которые могут быть особенно желательны в материалах, используемых для пластической хирургии и в косметических целях. Хотя раскрытые здесь усовершенствованные гели имеют такие превосходные величины вязкости, тем не менее, они все еще способны легко выдавливаться через иглы настолько малые, как игла 3OG.

Анализы устойчивости к ферментативному расщеплению

Анализы устойчивости к расщеплению проводили, используя расщепление гиалуронидазой и метод анализа с применением уроновой кислоты и карбазола, который описан в Carbohydrate Analysis: A Practical Approach, 2nd ed.: M.F. Chaplin и J.F. 20 Kennedy, IRL Press at Oxford University Press, UK, 1994, (ISBN 0-19-963449-1P) pp. 324, который включен в настоящее описание ссылкой во всей его полноте для всех целей.

Результаты экспериментов расщепления гиалуронидазой образцов из некоторых указанных выше экспериментов даны на фиг. 10, ниже. Два эксперимента были проведены:

ПЕРВЫЙ ЭКСПЕРИМЕНТ РАСЩЕПЛЕНИЯ

1a) Расщепление поперечно сшитой HA

Пять образцов по 200 мкл поперечно сшитой амино-функционализированной HA, полученной в эксперименте 75/3, каждый, смешивали с 250 мкл раствора NaCl (0,9%) и 60,8 единицами гиалуронидазы, растворенной в 50 мкл DI воды. Все образцы инкубировали при 37°С. Образцы отбирали последовательно через часовые интервалы после начала расщепления, гомогенизировали взбалтыванием материала в течение 1 минуты и центрифугировали при 13000 об/мин в течение 5 мин в той же центрифуге Heraeus "biofuge pico" кат. № 75003280, используя ротор Heraeus # 3325B (центрифуга и ротор коммерчески доступны от Kendro Laboratory Products, Germany). 250 мкл полученных супернатантов использовали для проведения карбазолового анализа.

1b) Расщепление Perlane® лот No.7064

Пять образцов по 200 мкл Perlane® (лот No. 7064), каждый, смешивали с 250 мкл раствора NaCl (0,9%) и 60,8 единицами гиалуронидазы, растворенной в 50 мкл DI воды, и образцы инкубировали при 37°С. Образцы отбирали последовательно через 1-часовые интервалы после начала расщепления. Изъятые образцы гомогенизировали взбалтыванием материала в течение 1 минуты и центрифугировали при 13000 об/мин в течение 5 мин в той же центрифуге Heraeus "biofuge pico". 250 мкл полученных супернатантов использовали для проведения карбазолового анализа.

Согласно процедуре карбазолового анализа, поглощающую способность измеряли при 525 нм для каждого образца. Из-за слишком интенсивной цветной реакции в случае Perlane® образец необходимо было разбавить до 1:10, используя борированную серную кислоту. Образцы через два часа инкубации пришли в негодность в обоих случаях (экспериментальный продукт 75/3 и Perlane®) из-за слишком высокой температуры во время карбазоловой процедуры и поэтому не представлены на графике фиг. 10.

Теперь, что касается фиг. 10, то это - схематический график, иллюстрирующий результаты карбазолового анализа расщепления гиалуронидазой поперечно сшитой DL-глицеральдегидом амино-функционализированной HA и коммерчески доступного Perlane®.

Вертикальная ось графика на фиг. 10 представляет поглощающую способность испытуемых образцов при длине волны 525 нм, и горизонтальная ось представляет время в часах от начала испытания расщепления. Учитывая тот факт, что образцы Perlane® (данные которых представлены заштрихованными квадратиками на фиг. 10) были разбавлены в десять раз перед считыванием поглощающей способности (из-за неожиданно высокой поглощающей способности неразбавленных образцов), тогда как поглощающую способность других образцов амино-функционализированной HA, полученной в эксперименте 75/3 (данные которой представлены заштрихованными кружочками на фиг. 10), считывали с образцов, таких, какими они были (без разбавления), очевидно, что образцы поперечно сшитой амино-функционализированной HA, полученной в эксперименте 75/3, имели значительно более высокую (по меньшей мере в семь раз выше) устойчивость к расщеплению гиалуронидазой, чем устойчивость, проявленная Perlane®.

Что касается фиг. 11, это - схематический график, иллюстрирующий результаты карбазолового анализа фиг. 10, в котором величины поглощающей способности Perlane® (схематически представленные заштрихованными квадратиками на фиг. 11) были умножены на десять, чтобы компенсировать 10-кратное разбавление испытуемых образцов Perlane®. Величины поглощающей способности образцов амино-функционализированной HA, полученной в эксперименте 75/3, схематически представлены заштрихованными кружочками на фиг. 11. Величины поглощающей способности образцов Perlane®, полученных в эксперименте 75/3, представлены заштрихованными кружочками на фиг. 11.

Хотя хорошо известно, что обычно невозможно получить точную величину поглощающей способности простым умножением поглощающей способности, полученной для разбавленного образца, это было сделано просто для того, чтобы дать приблизительное представление о разнице между величинами поглощающей способности поперечно сшитой амино-функционализированной HA, полученной в эксперименте 75/3, и таковыми для Perlane®. Так, величины, представленные на фиг. 11, являются очень грубой аппроксимацией только для целей пояснения и не могут дать точного представления об истинной разнице поглощающих способностей двух материалов.

ВТОРОЙ ЭКСПЕРИМЕНТ РАСЩЕПЛЕНИЯ

0,1439 мг поперечно сшитой HA или 0,1507 мг Perlane® (лот No. 7064) по отдельности смешивали с 250 мкл раствора NaCl (0,9%) и 60,8 единицами гиалуронидазы, растворенной в 50 мкл DI воды. Две полученные смеси для реакции расщепления инкубировали при 37°С. После 4 часов инкубирования два образца гомогенизировали взбалтыванием материала в течение 1 минуты и центрифугировали при 13000 об/мин в течение 5 мин в центрифуге Heraeus Biofuge pico. Супернатанты удаляли из обоих образцов и остальную (расщепленную) массу образца определяли для каждого из подвергнутых расщеплению образцов. 99,5% поперечно сшитой амино-функционализированной HA, полученной в эксперименте 75/3, и 9,3% Perlane® (Lot No. 7064), оставалось в виде осадка после центрифугирования и удаления супернатанта. Эти результаты решительно подтверждают значительно более высокую (in vitro) устойчивость к расщеплению гиалуронидазой амино-функционализированной HA, полученной в эксперименте 75/3, по сравнению с коммерческим образцом Perlane®.

Высокая устойчивость к расщеплению гиалуронидазой in vitro поперечно сшитого сахаром полисахаридного материала, полученного согласно раскрытым здесь способам поперечной сшивки, указывает на то, что материал подобным образом может проявлять высокую устойчивость к биоразложению in vivo, которая очень полезна в матрицах, используемых в качестве наполнителей или объемных агентов для приращения ткани в обычных и применяемых в эстетических целях процедурах лечения, в особенности, когда это может увеличить продолжительность жизни имплантата и может снизить частоту необходимых применяемых в эстетических целях процедур, снижая таким образом общую стоимость лечения и число и/или частоту необходимых процедур или инъекций, имея в результате повышенную комфортность для пациента.

Испытания разбухания образца

Из-за наличия избыточного количества этанола во время процесса поперечной сшивки поперечно сшитая сахаром амино-функционализированная HA появляется в ее дегидратированной форме. По сравнению с ее гидратированной формой объем дегидратированной формы поперечно сшитой НА незначительный. После описанных процедур промывания (в которых продукты реакции повторно гидратируются при окончательном промывании (например, в 5 мл DI воды в эксперименте 35)) полученный гель переносили в стандартные пробирки для испытания и определяли объем геля (в мл).

Теперь, что касается фиг. 8-9. Фиг. 8 представляет схематический график, иллюстрирующий результаты измерения набухаемости аминофункционализированной HA, поперечно сшитой с использованием различных концентраций DL-глицеральдегида в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения.

Схематическая столбчатая диаграмма фиг. 8 показывает результаты поглощения воды (набухания) образцов поперечно сшитой DL-глицеральдегидом амино-функционализированной гиалуроновой кислоты, полученной в экспериментах 35/2, 35/4, 37/4, 37/5, 37/6, 38/1, 38/2 и 38/3 (представлены столбиками 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, и 66 фиг. 8, соответственно). Самый левый столбик 50 графика фиг. 8 представляет результат гидратации AFHA80 в количестве, подобном количеству, используемому в экспериментах поперечной сшивки, но без использования DL-глицеральдегида (этот результат представляет образец несшитой поперечно AFHA80). Для каждого столбика графика фиг. 8 количество (в мг) DL-глицеральдегида, использованного в поперечной сшивке каждого образца, указано на горизонтальной оси графика. Объем (в мл) испытуемого образца после гидратации (промыванием) и центрифугирования представлен на вертикальной оси как количественное отображение вызванного водой набухания образца после удаления этанола из реакционной смеси промыванием. Результаты на фиг. 8 показывают последовательное более высокое набухание образца, которое является максимальным у образца несшитой поперечно AFHA80 и явно последовательно снижается по мере возрастания количества кросс-линкера (DL-глицеральдегида) в реакционной смеси.

Фиг. 9 является схематическим графиком, иллюстрирующим результаты измерения набухаемости хитозана, поперечно сшитого при различных концентрациях DL-глицеральдегида в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения. Схематическая столбчатая диаграмма фиг. 9 показывает результаты поглощения воды (набухания) образцов поперечно сшитого DL-глицеральдегидом хитозана, полученных в экспериментах 40/1, 40/2 и 40/3 (представлены столбиками 62, 64 и 66, фиг. 9, соответственно). Самый левый столбик 60 графика фиг. 9 представляет результат гидратации несшитого поперечно хитозана в количестве, подобном количеству, используемому в ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ СЕРИИ 40/1-3 поперечной сшивки, но без использования DL-глицеральдегида (образец несшитого поперечно хитозана). Количество (в мг) DL-глицеральдегида, использованного для поперечной сшивки образцов хитозана, указано на горизонтальной оси графика. Объем (в мл) образца после гидратации (промыванием) и центрифугирования представлен на вертикальной оси как количественное отображение вызванного водой набухания образца после удаления этанола из реакционной смеси промыванием. Результаты фиг. 9 показывают последовательное более высокое набухание образца, которое является максимальным для образца несшитого поперечно хитозана и явно последовательно снижается, когда количество кросс-линкера (DL-глицеральдегида) в реакционной смеси возрастает (от 300 мг через 400 мг до 500 мг в примерах, поясняемых на фиг. 9).

Композиционные матрицы, полученные поперечной сшивкой хитозана и коллагена

Фибриллярный коллаген получали, как описано подробно в патенте США 6682760, включенном в настоящее описание ссылкой во всей его полноте для всех целей. Фибриллированный коллаген концентрировали центрифугированием (4500 об/мин).

ЭКСПЕРИМЕНТ 1

Три различных пробирки для испытания готовили так, что каждая содержала 140 мг фибриллированного коллагена, добавленного к смеси 14,5 мл 10 мМ буфера PBS (pH 7,36), 5 мл буфера фибриллирования (приготовленного, как раскрыто подробно здесь выше), 35 мл 100% этанола и 100 мг D(-)-рибозы, растворенной в 500 мкл буфера PBS. Реакционные смеси взбалтывали.

Три различных раствора хитозана a, b и с готовили следующим образом:

a) 13,5 мг хитозана растворяли в 2,5 мл 0,1 н. HCl;

b) 27 мг хитозана растворяли в 5,0 мл 0,1 н. HCl;

с) 54 мг хитозана растворяли в 10,0 мл 0,1 н. HCl.

Каждый из растворов a, b и с по каплям медленно добавляли к одной из смесей коллаген/D(-)-рибоза в пробирках для испытания при постоянном перемешивании. Реакционные смеси взбалтывали в течение 1 минуты и вращали в инкубаторе при 37°С в течение 12 дней. По окончании периода инкубации смеси центрифугировали в течение 15 минут при 5000 об/мин. Все полученные продукты реакции имели пастообразную консистенцию. С увеличением концентраций хитозана желтоватый цвет продуктов также постепенно изменялся от не совсем белого до глубокого желтого. В случае с) конгломераты поперечно сшитого хитозана обнаружены внутри пасты.

ЭКСПЕРИМЕНТ 2

Три различных пробирки для испытания готовили так, что каждая содержала 140 мг фибриллированного коллагена, добавленного к смеси 17,5 мл 10 мМ буфера PBS, 5 мл буфера фибриллирования, 17,5 мл 100% этанола и 33 мг DL-глицеральдегида, растворенного в 300 мкл 10 мМ буфера PBS. Реакционные смеси взбалтывали.

Три различных раствора хитозана a, b и с готовили следующим образом:

a) 13,5 мг хитозана растворяли в 2,5 мл 0,1 н. HCl;

b) 27 мг хитозана растворяли в 5,0 мл 0,1 н. HCl;

с) 54 мг хитозана растворяли в 10,0 мл 0,1 н. HCl.

Каждый из растворов хитозана a, b и с, выше, по каплям медленно добавляли к одной из реакционных смесей коллаген/DL-глицеральдегид в пробирках для испытания при постоянном перемешивании. После дополнительного взбалтывания в течение 1 минуты реакционные смеси вращали в инкубаторе при 37°С в течение 24 часов. По окончании периода инкубации смеси центрифугировали в течение 15 минут при 5000 об/мин. Все полученные продукты реакции имели пастообразную консистенцию. Когда концентрация хитозана увеличивалась, желтоватый цвет продуктов постепенно усиливался от не совсем белого до ярко желтого. В случае c) конгломераты поперечно сшитого хитозана обнаружены внутри пасты.

ЭКСПЕРИМЕНТ 7/1

Пять различных пробирок для испытания готовили так, что каждая содержала 108 мг фибриллированного коллагена, добавленного к смеси 9,8 мл 100% этанола и 14 мг DL-глицеральдегида, растворенного в 700 мкл буфера фибриллирования, и взбалтывали. Пять смесей коллаген/DL-глицеральдегид вращали в течение 6 часов в инкубаторе при 37°С.

Следующие пять растворов хитозана также готовили:

a) 53 мг хитозана растворяли в 3,2 мл 0,1 н. HСl;

b) 75,6 мг хитозана растворяли в 4,5 мл 0,1 н. HСl;

с) 107,5 мг хитозана растворяли в 6,4 мл 0,1 н. HСl;

d) 141 мг хитозана растворяли в 8,4 мл 0,1 н. HСl;

е) 161,3 мг хитозана растворяли в 9,6 мл 0,1 н. HСl.

Каждый из растворов a, b, c, d и e медленно добавляли по каплям в одну из пяти пробирок для испытания, содержащих смеси коллаген/DL-глицеральдегид, описанные здесь выше. После дополнительного взбалтывания в течение 1 минуты смеси снова помещали в инкубатор и вращали в течение 24 часов при 37°С. После завершения второго периода инкубации смеси центрифугировали в течение 15 мин при 5000 об/мин.

Все полученные поперечно сшитые продукты имели пастообразную консистенцию. При увеличении концентраций хитозана желтоватый цвет продуктов постепенно усиливался от не совсем белого до ярко-желтого. Образец c) инкубировали при 50°С в течение 6 часов в избыточном количестве 6 н. NaOH, для того чтобы растворить несшитый поперечно коллаген. После стадий трех промываний (в DI воде) и центрифугирования образец подвергали гидролизу HСl и анализировали прибором для анализа аминокислот (в коммерческой лаборатории), для того чтобы обнаружить гидроксипролин (представляющий коллаген), ковалентно связанный с хитозаном. Гидроксипролин был обнаружен в образцах.

ЭКСПЕРИМЕНТ 7/2

Три различных пробирки для испытания готовили так, что каждая содержала 108 мг фибриллированного коллагена, добавленного к смеси 9,8 мл 100% этанола и 14 мг DL-глицеральдегида, растворенного в 700 мкл буфера фибриллирования, и взбалтывали.

Следующие три раствора хитозана a, b и с также готовили:

a) 53 мг хитозана растворяли в 3,2 мл 0,1 н. HСl;

b) 107,5 мг хитозана растворяли в 6,4 мл 0,1 н. HСl;

с) 161,3 мг хитозана растворяли в 9,6 мл 0,1 н. HСl.

Каждый из растворов a, b и c медленно добавляли по каплям в одну из трех пробирок для испытания, содержащих смеси коллаген/DL-глицеральдегид, при постоянном перемешивании. После дополнительного взбалтывания в течение 1 минуты смеси вращали в течение 24 часов в инкубаторе при 37°С. После окончания периода инкубации смеси центрифугировали в течение 15 мин при 5000 об/мин. Все полученные продукты реакции имели пастообразную консистенцию. С увеличением концентраций хитозана желтоватый цвет продуктов постепенно усиливался от не совсем белого до ярко-желтого.

Амино-функционализация гепарина

500 мг натриевой соли гепарина EP (Партия No. 9818030) растворяли в 300 мл DI воды. 3,0 г Дигидразида адипиновой кислоты (ADH) добавляли к смеси. рH Полученного раствора доводили до 4,75 и раствор перемешивали до тех пор, пока не получали гомогенный раствор. 400 мг Гидрохлорида 1-этил-3-(диметиламинопропил)карбодиимида растворяли в 2,0 мл DI воды и добавляли к смеси и pH снова доводили до 4,75 при комнатной температуре. Реакцию отслеживали путем мониторинга pH, который постоянно доводили до 4,75. Реакционную смесь оставляли на ночь при перемешивании. Раствор затем переносили в диализную пробирку и подвергали чередующемуся диализу против DI воды и против смеси DI вода/этанол (4:1 об./об.) до тех пор, когда уже никакого ADH не обнаруживали при диализе. Полученную натриевую соль амино-функционализированного гепарина EP (гепарин-M) хранили при 4°С до использования.

Процедура II амино-функционализации НА

2,4 г HA 150 (гиалуронат натрия Pharma Grade 150, коммерчески доступен как продукт No. 2222003 от NovaMatrix FMC Biopolymer, Oslo, Norway), имеющего молекулярную массу в диапазоне 1,4-1,8 МДа, растворяли в 2,0 л DI воды и к смеси добавляли 7,0 г дигидразида адипиновой кислоты (ADH). рH Полученного раствора доводили до pH 4,75 и раствор перемешивали до тех пор, пока не получали гомогенный раствор. 760 мг Гидрохлорида 1-этил-3-(диметиламинопропил)карбодиимида растворяли в 10,0 мл DI воды и добавляли к смеси и pH снова доводили до 4,75 при комнатной температуре. Реакцию отслеживали по изменению pH, который постоянно доводили до pH 4,75. Когда никакого изменения pH уже не наблюдалось, реакционную смесь оставляли на дополнительный час или на ночь. Раствор затем переносили в диализную пробирку и подвергали чередующемуся диализу против DI воды и против смеси DI вода/этанол (4:1 об./об.) до тех пор, когда уже никакого ADH не обнаруживали при диализе. Подвергнутый диализу раствор переносили в 3,5 литра 100% этанола, 5 г NaСl добавляли и смесь перемешивали в течение одного часа. Для того чтобы отделить осажденную модифицированную HA, раствор центрифугировали в течение 20 минут при 7000 об/мин и супернатант удаляли. Полученную амино-функционализированную HA (AFHA II) хранили при 4°С до использования.

Процедура III амино-функционализации НА

2,5 г HA 150 (гиалуронат натрия Pharma Grade 150, коммерчески доступен как продукт No. 2222003 от NovaMatrix FMC Biopolymer, Oslo, Norway), имеющего молекулярную массу в диапазоне 1,4-1,8 МДа, растворяли в 2,0 л DI воды и к смеси добавляли 3,4 г дигидразида адипиновой кислоты (ADH). рH Полученного раствора доводили до pH 4,75 и раствор перемешивали до тех пор, пока не получали гомогенный раствор. 400 мг Гидрохлорида 1-этил-3-(диметиламинопропил)карбодиимида растворяли в 10,0 мл DI воды и добавляли к смеси, и pH снова доводили до 4,75 при комнатной температуре. Реакцию отслеживали по изменению pH, который постоянно доводили до pH 4,75. Когда никакого изменения pH уже не наблюдалось, реакционную смесь оставляли на дополнительный час или на ночь. Раствор затем переносили в диализную пробирку и подвергали чередующемуся диализу против DI воды и против смеси DI вода/этанол (4:1 об./об.) до тех пор, когда уже никакого ADH не обнаруживали при диализе. Подвергнутый диализу раствор переносили в 3,5 литра 100% этанола, 5 г NaСl добавляли и смесь перемешивали в течение одного часа. Для того чтобы отделить осажденную модифицированную HA, раствор центрифугировали в течение 20 минут при 7000 об/мин и супернатант удаляли. Полученную амино-функционализированную HA (AFHA III) хранили при 4°С до использования.

Процедура IV амино-функционализации НА

2,4 г HA 150 (гиалуронат натрия Pharma Grade 150, коммерчески доступен как продукт No. 2222003 от NovaMatrix FMC Biopolymer, Oslo, Norway), имеющего молекулярную массу в диапазоне 1,4-1,8 МДа, растворяли в 350 мл DI воды, к смеси добавляли 5,0 г дигидразида адипиновой кислоты (ADH). рH Полученного раствора доводили до pH 4,75 и раствор перемешивали до тех пор, пока не получали гомогенный раствор. 500 мг Гидрохлорида 1-этил-3-(диметиламинопропил)карбодиимида растворяли в 10,0 мл DI воды и добавляли к смеси, и pH снова доводили до 4,75 при комнатной температуре. Реакцию отслеживали по изменению pH и постоянно доводили его до pH 4,75. Когда никакого изменения pH уже не наблюдалось, реакционную смесь оставляли на дополнительный час или на ночь. Затем раствор переносили в диализную пробирку и подвергали чередующемуся диализу против DI воды и против смеси DI вода/этанол (4:1 об./об.) до тех пор, когда уже никакого ADH не обнаруживали при диализе. Подвергнутый диализу раствор переносили в 3,5 литра 100% этанола, 5 г NaСl добавляли и смесь перемешивали в течение 1 часа. Для того чтобы отделить осажденную модифицированную HA, раствор центрифугировали в течение 20 минут при 7000 об/мин и супернатант удаляли. Полученную амино-функционализированную HA (AFHA IV) хранили при 4°С до использования.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ СЕРИЯ 03/105/1-6

Две отдельные идентичные суспензии, каждая из которых содержала 152 мг AFHA I 150 в 6 мл 100% этанола, готовили.

Раствор, содержащий 900 мг D(-)-сорбозы, растворенной в 9 мл DI воды, добавляли к первой суспензии AFHA I 150 путем введения раствора кросс-линкера (D(-)-сорбозы) под суспензию AFHA I 150 и взбалтывания до получения гомогенной смеси. Полученную реакционную смесь разделяли на три равные порции 1, 2 и 3, и каждую из полученных порций помещали в инкубатор и вращали при 37°С следующим образом:

В эксперименте 03/105/1 порцию 1 инкубировали в течение шести (6) дней.

В эксперименте 03/105/2 порцию 2 инкубировали в течение двенадцати (12) дней.

В эксперименте 03/105/3 порцию 3 инкубировали в течение восемнадцати (18) дней.

Раствор, содержащий 900 мг D(-)-фруктозы, растворенной в 9 мл DI воды, добавляли ко второй суспензии AFHA I 150 путем введения раствора кросс-линкера (D(-)-фруктозы) под суспензию AFHA I 150 и взбалтывания до достижения гомогенной смеси. Полученную реакционную смесь разделяли на три равные порции 4, 5 и 6 и каждую из полученных порций помещали в инкубатор и вращали при 37°С следующим образом:

В эксперименте 03/105/4 порцию 4 инкубировали в течение шести (6) дней.

В эксперименте 03/105/5 порцию 5 инкубировали в течение двенадцати (12) дней.

В эксперименте 03/105/6 порцию 6 инкубировали в течение восемнадцати (18) дней.

После завершения инкубации реакционных смесей 1-6 выше 40 мл DI воды добавляли к каждой из реакционных смесей 1-6 и смеси центрифугировали при 9000 об/мин в течение 20 минут. Супернатанты удаляли и 40 мл физиологического раствора NaСl (0,9%) вместе с 2 мл буферного раствора PBS (10 мМ, pH 7,36) добавляли к каждому из полученных осадков и смешивали. Смеси центрифугировали снова при 9000 об/мин в течение 20 минут. Измеренные величины комплексной вязкости осадков, полученных в экспериментах 03/105/1, 03/105/1, 03/105/2, 03/105/3, 03/105/4, 03/105/5 и 03/105/6, и краткое описание некоторых наблюдаемых характеристик осадков суммированы в таблице 5 здесь далее.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ СЕРИЯ 03/114/1-4

Эксперимент 03/114/1

Приготавливали суспензию, содержащую 50 мг AFHA I 150 в 2 мл 100% этанола. Раствор 50 мг D(-)-фруктозы в 1,5 мл DI воды добавляли к суспензии путем введения раствора кросс-линкера под суспензию AFHA I 150 и взбалтывали до достижения гомогенной смеси. Полученную смесь выливали в 40 мл 100% этанола. Реакционную смесь помещали в инкубатор и вращали в течение двух (2) дней при 37°С. После завершения инкубации к реакционной смеси добавляли 40 мл DI воды и смесь центрифугировали при 9000 об/мин в течение 10 минут.

Эксперимент 03/114/2

Эксперимент осуществляли, как описано для эксперимента 03/114/1 выше, за исключением того, что реакционную смесь инкубировали с вращением в течение четырех (4) дней.

Эксперимент 03/114/3

Эксперимент осуществляли, как описано для эксперимента 03/114/1 выше, за исключением того, что 50 мг D(-)-сорбозы использовали вместо D(-)-фруктозы.

Эксперимент 03/114/4

Эксперимент осуществляли, как описано для эксперимента 03/114/3 выше, за исключением того, что реакционную смесь инкубировали с вращением в течение четырех (4) дней вместо двух дней.

Величины комплексной вязкости, определенные для полученных осадков из экспериментов 03/114/1, 03/114/2, 03/114/3 и 03/114/4, и краткое описание некоторых наблюдаемых характеристик осадков сведены в таблицу 5 здесь далее.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ СЕРИЯ 03/140/1-4

Эксперимент 03/140/1

Приготавливали суспензию, содержащую 50 мг AFHA I 150 в 1 мл 100% этанола. Раствор кросс-линкера готовили растворением 300 мг D(-)-рибозы в 2,0 мл DI воды. Раствор кросс-линкера помещали под суспензию AFFA I 150 и пробирку для испытания взбалтывали до образования гомогенной смеси. Смесь затем выливали в 40 мл 100% этанола. Полученную реакционную смесь помещали в инкубатор и вращали в течение 5 дней при 37°С. По окончании периода инкубации 40 мл DI воды добавляли к реакционной смеси и полученную смесь центрифугировали при 7000 об/мин в течение 20 минут. Полученный осадок промывали 40 мл физиологического раствора NaСl (0,9%), смешанного с 2 мл буферного раствора PBS (10 мМ, pH 7,36), и центрифугировали при 7000 об/мин в течение 20 минут. Осадок затем гомогенизировали экструзией один раз через иглу 18G и затем один раз через иглу 21G и выдерживали в 40 мл физиологического раствора NaСl (0,9%) в течение 6 часов, и затем центрифугировали при 7000 об/мин в течение 30 минут. Осадок фильтровали, используя фильтровальную бумагу Whatman® No. 4 (коммерчески доступна как кат. номер 1004 320 от Whatman, USA), и инкубировали при 37°С в течение трех дней.

Эксперимент 03/140/2

Эксперимент осуществляли, как описано для эксперимента 03/140/1 выше, за исключением того, что раствор кросс-линкера включал 50 мг D(+)-сорбозы, растворенной в 2,0 мл DI воды.

Эксперимент 03/140/3

Эксперимент осуществляли, как описано для эксперимента 03/140/1 выше, за исключением того, что раствор кросс-линкера включал 50 мг L(+)-фруктозы, растворенной в 2,0 мл DI воды.

Эксперимент 03/140/4

Эксперимент осуществляли, как описано для эксперимента 03/140/1 выше, за исключением того, что раствор кросс-линкера включал 300 мг D(+)глюкозы, растворенной в 2,0 мл DI воды, и осадок не фильтровали, используя фильтровальную бумагу.

Величины комплексной вязкости, определенные для полученных осадков из экспериментов 03/140/1, 03/140/2, 03/140/3 и 03/140/4, и краткое описание некоторых наблюдаемых характеристик осадков сведены в таблицу 5 здесь далее.

ЭКСПЕРИМЕНТ 03/140/6

Приготавливали суспензию, содержащую 50 мг AFHA I 150 в 1 мл 100% этанола. Раствор кросс-линкера готовили растворением 300 мг дигидрата динатриевой соли D-рибоза-5-фосфата в 2,0 мл DI воды. Суспензию AFHA I 150 смешивали с раствором кросс-линкера путем введения раствора кросс-линкера под слой суспензии AFHA I 150 и взбалтывания до достижения гомогенной смеси. Полученную смесь выливали в 40 мл 100% этанола. Реакционную смесь затем помещали в инкубатор и вращали в течение 5 дней при 37°С. По окончании периода инкубации к реакционной смеси добавляли 40 мл DI воды и полученную смесь взбалтывали и центрифугировали при 7000 об/мин в течение 5 минут. Супернатант удаляли и осадок промывали дважды 40 мл физиологического раствора NaСl (0,9%), смешанного с 2 мл буферного раствора PBS (10 мМ, pH 7,36), и центрифугировали при 7000 об/мин в течение 5 минут. Величины комплексной вязкости, определенные для полученных осадков, и краткое описание некоторых наблюдаемых характеристик осадков сведены в таблицу 5 здесь далее.

Результаты эксперимента 03/140/6 демонстрируют, что применение восстанавливающих сахаров для поперечной сшивки амино-функционализированных полисахаридов не ограничивается применением просто восстанавливающих сахаров, и что различные производные восстанавливающих сахаров могут быть также успешно использованы для получения поперечно сшитых полисахаридных матриц и композиционных матриц по данному изобретению.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ СЕРИЯ 03/110/1-4

Эксперимент 03/110/1

Готовили суспензию, содержащую 50 мг AFHA I 150 в 5 мл 100% этанола. Суспензию смешивали с раствором кросс-линкера, содержащим 160 мг DL-глицеральдегида, растворенного в 8 мл DI воды, путем введения раствора кросс-линкера под суспензию и взбалтывания до достижения гомогенной смеси. 6,5 мл Полученной смеси выливали в 40 мл 100% этанола и взбалтывали. Полученную реакционную смесь помещали в инкубатор и вращали в течение одного дня при 37°С. По окончании периода инкубации к смеси добавляли 40 мл DI воды и 2 мл буферного раствора PBS (10 мМ, pH 7,36) с перемешиванием и полученную смесь центрифугировали при 9000 об/мин в течение 20 минут для получения осадка.

Эксперимент 03/110/2

Эксперимент осуществляли, как описано для эксперимента 03/110/1 выше, за исключением того, что 40 мл 1-гексанола использовали вместо 40 мл 100% этанола.

Эксперимент 03/110/3

Эксперимент осуществляли, как описано для эксперимента 03/110/1 выше, за исключением того, что 40 мл 1-бутанола использовали вместо 40 мл 100% этанола.

Эксперимент 03/110/4

Эксперимент осуществляли, как описано для эксперимента 03/110/1 выше, за исключением того, что 40 мл 2-пропанола использовали вместо 40 мл 100% этанола.

Величины комплексной вязкости, определенные для полученных осадков из экспериментов 03/110/4, 03/110/4, 03/110/4 и 03/110/4, и краткое описание некоторых наблюдаемых характеристик осадков сведены в таблицу 5 здесь далее.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ СЕРИЯ 03/131/2-5

Эксперимент 03/131/2

Готовили суспензию, содержащую 50 мг AFHA I 150 в 2 мл 100% этанола. Суспензию смешивали с раствором кросс-линкера, содержащим 140 мг DL-глицеральдегида, растворенного в 6 мл DI воды, путем введения раствора кросс-линкера под суспензию и взбалтывания до достижения гомогенной смеси. 3,5 мл Полученной смеси выливали в 40 мл этилацетата и полученную реакционную смесь помещали в инкубатор и вращали в течение одного дня при 37°С. По окончании периода инкубации к смеси добавляли 40 мл физиологического раствора NaСl (0,9%) с перемешиванием и полученную смесь центрифугировали при 7000 об/мин в течение 20 минут и супернатант удаляли для получения осадка.

Эксперимент 03/131/3

Эксперимент осуществляли, как описано для эксперимента 03/131/2 выше, за исключением того, что 40 мл ацетона (диметилкетон) использовали вместо 40 мл этилацетата.

Эксперимент 03/131/4

Эксперимент осуществляли, как описано для эксперимента 03/131/2 выше, за исключением того, что 40 мл 1-гексанола использовали вместо 40 мл этилацетата.

Эксперимент 03/131/5

Готовили суспензию, содержащую 50 мг AFHA I 150 в 2 мл 100% этанола. Суспензию смешивали с раствором кросс-линкера, содержащим 140 мг DL-глицеральдегида, растворенного в 6 мл DI воды, путем введения раствора кросс-линкера под суспензию и взбалтывания до достижения гомогенной смеси. 8,0 мл Полученной смеси выливали в 40 мл толуола, и полученную реакционную смесь помещали в инкубатор и вращали в течение шести (6) дней при 37°С. По окончании периода инкубации толуол вымывали добавлением 30 мл 100% этанола к реакционной смеси, смешиванием и центрифугированием при 7000 об/мин в течение 20 минут. Промывание этанолом и центрифугирование повторяли два и более раз. Полученный осадок промывали три раза смесью 25 мл DI воды и 20 мл физиологического раствора NaСl (0,9%) и центрифугированием при 7000 об/мин в течение 20 мин. Конечную стадию промывания осуществляли повторным суспендированием осадка в 40 мл физиологического раствора NaСl (0,9%), смешанного с 2 мл буферного раствора PBS (10 мМ, pH 7,36), и центрифугированием при 7000 об/мин в течение 20 минут. Супернатант удаляли и осадок сохраняли для испытания.

Величины комплексной вязкости, определенные для полученных осадков из экспериментов 03/1310/2, 03/131/3, 03/131/4 и 03/131/5, и краткое описание некоторых наблюдаемых характеристик осадков сведены в таблицу 5 здесь далее.

ЭКСПЕРИМЕНТ 03/146/2

Готовили суспензию 100 мг AFHA I 150 в 2 мл 100% этанола. 100 мг DL-глицеральдегида растворяли в 40,0 мл буферного раствора PBS (10 мМ, pH 7,36). Суспензию AFHA I 150 смешивали с раствором кросс-линкера путем введения раствора кросс-линкера под суспензию AFHA I 150 и взбалтывания до достижения гомогенной смеси. Полученную смесь помещали в инкубатор и вращали в течение 1 дня при 37°С. По окончании периода инкубации смесь центрифугировали при 10000 об/мин в течение 15 минут, супернатант удаляли, осадок повторно суспендировали в 40 мл DI воды и полученную суспензию оставляли на 12 часов при комнатной температуре. Смесь затем центрифугировали при 7000 об/мин в течение 10 минут и осадок промывали дважды повторным суспендированием в 40 мл физиологического раствора NaСl (0,9%), смешанного с 2 мл буферного раствора PBS (10 мМ, pH 7,36), смешиванием и центрифугированием при 7000 об/мин в течение 10 минут. Полученный осадок помещали в инкубатор на 3 дня при температуре 37°С. Величины комплексной вязкости, определенные для полученного осадка, и краткое описание некоторых наблюдаемых характеристик осадков сведены в таблицу 5 здесь далее.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ СЕРИЯ 05/08/2-4

Эксперимент 05/08/2

Готовили суспензию, содержащую 50 мг AFHA I 150 в 2 мл 100% этанола. 100 мг DL-глицеральдегида растворяли в 3 мл DI воды. Суспензию AFHA I 150 смешивали с раствором кросс-линкера путем введения раствора кросс-линкера под суспензию AFHA I 150 и взбалтывания до достижения гомогенной смеси. 5,0 мл Полученной смеси выливали в 40 мл дихлорметана и полученную реакционную смесь помещали в инкубатор и вращали в течение одного (1) дня при 37°С. По окончании периода инкубации к материалу добавляли 35 мл буферного раствора PBS (10 мМ, pH 7,36) и смешивали и полученную суспензию центрифугировали при 7000 об/мин в течение 15 минут и супернатант удаляли. Осадок сохраняли для испытания.

Эксперимент 05/08/3

Эксперимент осуществляли, как описано для эксперимента 05/098/2 выше, за исключением того, что 40 мл гексана использовали вместо 40 мл дихлорметана.

Эксперимент 05/08/4

Готовили суспензию, содержащую 50 мг AFHA I 150 в 2 мл 100% этанола. 100 мг DL-глицеральдегида растворяли в 3 мл DI воды. Суспензию AFHA I 150 смешивали с раствором кросс-линкера, помещая раствор кросс-линкера под суспензию AFHA I 150 и взбалтывая до достижения гомогенной смеси. 5,0 мл Полученной смеси выливали в 40 мл диэтилового эфира и полученную реакционную смесь помещали на водяную баню и взбалтывали в течение 2 дней при 30°С. В конце периода инкубации на водяной бане к полученному материалу добавляли 35 мл буферного раствора PBS (10 мМ, pH 7,36) и смешивали, чтобы суспендировать материал. Полученную суспензию центрифугировали при 7000 об/мин в течение 15 минут и супернатант удаляли. Конечную стадию промывания проводили с 40 мл буферного раствора PBS (10 мМ, pH 7,36). Смесь затем центрифугировали при 20000 об/мин в течение 45 минут и супернатант удаляли.

Величины комплексной вязкости, определенные для осадков, полученных в экспериментах 05/08/2, 05/08/3 и 05/08/4, и некоторые наблюдаемые характеристики осадков сведены в таблицу 5 здесь далее.

Дополнительные примеры композиционных матриц, включающих HA

Свиной фибриллярный коллаген готовили, как описано подробно в патенте США 6682760.

ЭКСПЕРИМЕНТ 03/94/2

Готовили суспензию 80 мг AFHA I 150 в 5 мл 100% этанола. Раствор кросс-линкера включал 40 мг DL-глицеральдегида, растворенного в 2,5 мл DI воды. Суспензию AFHA I 150 смешивали с раствором кросс-линкера путем введения раствора кросс-линкера под суспензию AFHA I 150. Дополнительно 0,4 мл раствора источника фибриллированного коллагена (имеющего концентрацию 35 мг/мл буфера фибриллирования) добавляли к смеси и полученную смесь взбалтывали до получения гомогенной смеси. Полученную смесь добавляли в 40 мл 100% этанола. Полученную реакционную смесь помещали в инкубатор и вращали в течение 3 дней при 37°С. По окончании периода инкубации смесь центрифугировали при 9000 об/мин в течение 20 минут и супернатант удаляли. Оставшийся осадок промывали 40 мл DI воды и центрифугировали при 20000 об/мин в течение 30 минут. Полученный осадок объединяли с 25 мл физиологического раствора NaCl (0,9% NaCl) и гомогенизировали с использованием turrax при 24000 об/мин в течение 1 минуты. Гомогенизированную смесь центрифугировали при 9000 об/мин в течение 20 минут и супернатант удаляли. Полученный осадок сохраняли для испытания. Величины комплексной вязкости, определенные для полученного осадка, и краткое описание некоторых наблюдаемых характеристик осадка полученной композиционной матрицы сведены в таблицу 5 здесь далее.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ СЕРИЯ 04/37/23-29

Суспензию AFHA I 150 в 100% этаноле готовили согласно таблице 3. DL-глицеральдегид растворяли в 1,0 мл DI воды в количестве, указанном в таблице 3 ниже. Суспензию AFHA I 150 медленно добавляли при непрерывном взбалтывании в 2,0 мл раствора фибриллированного свиного коллагена (имеющего концентрацию 35 мг коллагена на мл буфера фибриллирования), общее количество коллагена в каждом эксперименте дано в таблице 3. После этого 1 мл раствора кросс-линкера добавляли к смеси коллаген/AHFA и объединенную смесь гомогенизировали с использованием turrax при 24000 об/мин в течение 0,5 минуты до получения гомогенной смеси. Гомогенизированную смесь добавляли в 40 мл 100% этанола. Полученную реакционную смесь помещали в инкубатор и вращали в течение ночи при 37°С. По окончании периода инкубации супернатант удаляли. Материал промывали один раз 40 мл DI воды и центрифугировали при 6000 об/мин в течение 15 минут и дважды 40 мл буферного раствора PBS (10 мМ, рН 7,36) с центрифугированием при 6000 об/мин в течение 15 минут. Действительные количества материалов, используемых при получении различных реакционных смесей для экспериментов 04/37/23, 04/37/24, 04/37/25, 04/37/26, 04/37/27, 04/37/28 и 04/37/29, и экспериментально определенные величины комплексной вязкости сведены в таблицу 3 ниже.

ЭКСПЕРИМЕНТЫ 04/39/30, 04/41/31, 04/44/32, 04/48/34, 04/52/35 и 04/52/36

Готовили суспензию AFHA I 150 в 100% этаноле. Состав суспензии для каждого эксперимента подробно указан в таблице 3 здесь далее. DL-глицеральдегид (используемый в качестве кросс-линкера) растворяли в 1,0 мл DI воды в количестве, указанном в таблице 3. Суспензию AFHA I 150 смешивали с количеством фибриллированного свиного коллагена, суспендированного в 2 мл буферного раствора PBS (10 мМ, рН 7,36), путем медленного добавления с взбалтыванием раствора коллагена к раствору AHFA. Количество фибриллированного коллагена, использованное в каждом эксперименте, указано в таблице 3. Раствор кросс-линкера (DL-глицеральдегида) затем добавляли к смеси коллаген/AHFA с перемешиванием. Полученные реакционные смеси для всех экспериментов гомогенизировали с использованием turrax при 24000 об/мин в течение 0,5 минуты до получения гомогенной смеси. 40 мл 100% этанола добавляли к каждой из полученных реакционных смесей. Полученные смеси помещали в инкубатор и вращали в течение ночи при 37°С. После окончания периода инкубации супернатанты удаляли.

Каждый из полученных осадков промывали один раз 40 мл DI воды и центрифугировали при 6000 об/мин в течение 15 минут и затем промывали дважды 40 мл буферного раствора PBS (10 мМ, рН 7,36) и центрифугировали при 6000 об/мин в течение 15 минут. Каждый из промытых осадков затем смешивали с 25 мл физиологического раствора NaCl и гомогенизировали с использованием turrax при 24000 об/мин в течение 0,5 минуты. После гомогенизации с использованием turrax каждую гомогенизированную смесь центрифугировали при 6000 об/мин в течение 15 минут и супернатант удаляли. Полученные осадки испытывали. Комплексную вязкость каждого из полученных осадков определяли, как подробно раскрыто здесь далее. Количества материалов, использованных при получении различных реакционных смесей, и экспериментально определенные величины комплексной вязкости сведены в таблицу 3.

Таблица 3
Номер эксперимента	Количество AFHA I 150 [мг]	Количество этанола [мл]	Количество коллагена [мг]	Количество DL-глицеральдегида [мг]	Комплексная вязкость при 0,01 Гц [Па·с]
04/37/23	6,0	0,2	50,0	50,0	1382
04/37/24	10,0	0,4	50,0	50,0	2313
04/37/25	18,5	0,7	50,0	50,0	1403
04/37/26	33,3	1,3	50,0	50,0	3023
04/37/27	56,4	2,3	50,0	50,0	2041
04/37/28	86,8	3,5	50,0	50,0	2738
04/37/29	112,6	4,5	50,0	50,0	2154
04/44/32	160,0	4,0	40,0	240,0	3478
04/41/31	100,0	3,0	11,1	100,0	4744
04/48/34	185,3	1,3	9,7	278,0	4035
04/52/35	100,0	2,0	0,0	150,0	6451
04/52/36	100,0	2,0	42,3	150,0	5417

ЭКСПЕРИМЕНТ 04/55/1

Готовили суспензию 150 мг AFHA IV 150 в 2 мл 100% этанола. 150 мг D(-)-фруктозы растворяли в 5,0 мл фибриллированного свиного коллагена (имеющего концентрацию приблизительно 3 мг коллагена на мл раствора буфера фибриллирования). Суспензию AFHA I 150 смешивали с суспензией фибриллированный коллаген/D(-)-фруктоза с непрерывным взбалтыванием. Полученную смесь гомогенизировали с использованием turrax при 24000 об/мин в течение 0,5 минуты до получения гомогенной смеси. Гомогенизированную смесь добавляли в 35 мл 100% этанола и 0,5 мл уксусной кислоты (10% об./об.). Полученную реакционную смесь помещали в инкубатор и вращали в течение 6 часов при 37°С. По окончании периода инкубации супернатант удаляли. Оставшийся осадок смешивали с 25 мл физиологического раствора NaCl и гомогенизировали с использованием turrax при 24000 об/мин в течение 0,5 минуты. Гомогенизированную смесь центрифугировали при 6000 об/мин в течение 15 минут и супернатант удаляли. Полученный осадок промывали один раз 40 мл DI воды и центрифугировали при 6000 об/мин в течение 15 минут и затем промывали дважды 40 мл буферного раствора PBS (10 мМ, рН 7,36) и центрифугировали при 6000 об/мин в течение 15 минут. Осадок инкубировали в течение 3 дней при 37°С.

Величина комплексной вязкости, экспериментально определенная для полученного осадка, и краткое описание некоторых наблюдаемых характеристик осадка сведены в таблицу 5 здесь далее.

ЭКСПЕРИМЕНТ 03/145/2

Готовили суспензию, содержащую 150 мг AFHA I 150 в 2 мл 100% этанола. 105 мг DL-Глицеральдегида и 5,0 мг цитохрома С из бычьего сердца растворяли в 3,0 мл DI воды. Суспензию AFHA I 150 смешивали с раствором кросс-линкера и белка путем введения раствора кросс-линкера под суспензию AFHA I 150 и взбалтывания до достижения гомогенной смеси. Взболтанную смесь добавляли к 40 мл этанола. Полученную смесь помещали в инкубатор и вращали в течение 2 дней при 37°С. В конце периода инкубации супернатант удаляли и полученный материал промывали три раза повторным суспендированием в 40 мл физиологического раствора NaСl, взбалтыванием и центрифугированием при 7000 об/мин в течение 10 минут. Полученный осадок гомогенизировали последовательной экструзией (один раз через иглу) через иглы 18G, 22G и 25G. После экструзии материал промывали 40 мл физиологического раствора NaСl (0,9%) и центрифугировали при 7000 об/мин в течение 10 минут. Величины комплексной вязкости, определенные для полученного осадка, и краткое описание некоторых наблюдаемых характеристик полученного осадка сведены в таблицу 5 здесь далее.

Результаты эксперимента 03/145/2 демонстрируют, что белки, иные, чем коллаген, могут быть успешно поперечно сшиты с амино-функционализированными полисахаридами путем гликозилирования. Они также демонстрируют, что белки, которые существенно отличаются от коллагена, могут быть использованы при формировании композиционных поперечно сшитых матриц по данному изобретению.

Формирование таких гликозилированных матриц белок/амино-полисахарид может быть полезно не только для модификации реологических свойств получаемых композиционных матриц путем выбора различных белков, но может быть также применимо для преимущественного введения биологически активных белков (таких как, но без ограничения перечисленными, ферменты и стимулирующие рост или ингибирующие рост белки, различные сигнальные белки и пептиды и тому подобное) в матрицы.

ЭКСПЕРИМЕНТ 03/146/1

Готовили суспензию, содержащую 150 мг AFHA I 150 в 2 мл 100% этанола. 105 мг DL-глицеральдегида и 3 мл гепарина-M (приблизительно 40 мг) растворяли в 3,0 мл DI воды. Суспензию AFHA I 150 смешивали с раствором кросс-линкера, содержащим гепарин, путем введения раствора кросс-линкера под суспензию AFHA I 150 и взбалтывания до достижения гомогенной смеси.

Смесь добавляли в 40 мл 100% этанола. Полученную реакционную смесь помещали в инкубатор и вращали в течение 2 дней при 37°С. В конце периода инкубации супернатант удаляли и полученный материал промывали дважды путем смешивания с 40 мл физиологического раствора NaСl (0,9%), объединенного с 2 мл буферного раствора PBS (10 мМ, pH 7,36), взбалтывания и центрифугирования при 7000 об/мин в течение 10 минут. Полученный осадок гомогенизировали последовательной экструзией через иглы 18G, 22G и 25G (один раз на иглу) и помещали в инкубатор при 37°С на 3 дня. Полученный материал был сметанообразным, но устойчивым непрозрачным гелем.

Величины комплексной вязкости, определенные для полученных осадков, и краткое описание некоторых наблюдаемых характеристик осадков сведены в таблицу 5 здесь далее.

Результаты эксперимента 03/146/1 демонстрируют, что поперечная сшивка восстанавливающими сахарами может быть применима для различных смесей различных амино-полисахаридов и аминo-функционализированных полисахаридов (которые содержат аминогруппы, способные быть поперечно сшитыми восстанавливающими сахарами) и их производных. Такие смешанные поперечно сшитые матрицы могут быть полезны, потому что есть возможность контролировать и модифицировать физические, химические и биологические свойства таких смешанных мембран путем регулирования конкретных типов и/или соотношения различных полисахаридов в сшитой матрице.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ СЕРИЯ 05/02/1-2

Эксперимент 05/02/1

Готовили суспензию, содержащую 150 мг AFHA II 150 в 2 мл 100% этанола. Раствор, содержащий 50 мг DL-глицеральдегида, растворенного в 10 мл DI воды, смешивали с раствором AFHA II 150 путем введения раствора кросс-линкера под суспензию и взбалтывания до достижения гомогенной смеси. Полученную смесь выливали в 40 мл 100% этанола. Полученную реакционную смесь помещали в инкубатор и вращали в течение 5 часов при 37°С. По окончании периода инкубации супернатант удаляли и оставшийся осадок промывали 35 мл DI воды и центрифугировали при 7000 об/мин в течение 10 минут. Полученный осадок промывали дважды 40 мл физиологического раствора NaСl, смешанного с 2 мл буферного раствора PBS (10 мМ, pH 7,36), повторно суспендировали и центрифугировали при 7000 об/мин в течение 10 минут. В результате получали около 30 мл мягкого прозрачного геля. Этот гель промывали четыре (4) раза повторным суспендированием в 15 мл 100% этанола и центрифугированием при 10000 об/мин в течение 30 минут. Полученный осадок переносили в 35 мл 100% этанола, смешивали с 0,5 мл раствора уксусной кислоты (10% в DI воде) и смесь помещали в инкубатор при 37°С и вращали в течение 24 часов. В конце инкубации супернатант удаляли. Оставшийся материал промывали DI водой и оставляли при 37°С на один час. Образец затем центрифугировали при 10000 об/мин в течение 30 минут. Полученный осадок промывали 40 мл физиологического раствора NaСl, смешанного с 2 мл буферного раствора PBS (10 мМ, pH 7,36), взбалтывали и центрифугировали при 10000 об/мин в течение 15 минут. Осадок гомогенизировали последовательным продавливанием через иглу 18G, 2OG, 22G, 25G, 27G и 3OG, промывали 40 мл физиологического раствора NaСl, смешанного с 2 мл буферного раствора PBS (10 мМ, pH 7,36), взбалтывали и центрифугировали при 10000 об/мин в течение 5 минут. Осадок переносили в шприц и инкубировали в течение 3 дней при 37°С. После инкубации материал подвергали испытанию для определения комплексной вязкости.

Эксперимент 05/02/2

Эксперимент осуществляли, как описано для эксперимента 05/02/1 здесь выше, за исключением того, что используемый раствор кросс-линкера включал 100 мг D(-)-фруктозы, растворенной в 10 мл DI воды. Первая стадия инкубации давала 40 мл мягкого прозрачного геля.

Величины комплексной вязкости, определенные для конечных осадков, полученных в экспериментах 05/02/1 и 05/02/2, и краткое описание некоторых наблюдаемых характеристик осадков сведены в таблицу 5 здесь далее.

ЭКСПЕРИМЕНТ 05/15/1

Готовили суспензию 150 мг AFHA III 150 в 2 мл 100% этанола. Раствор кросс-линкера включал 150 мг D(-)-фруктозы, растворенной в 10 мл DI воды.

Суспензию AFHA III 150 смешивали с раствором кросс-линкера путем введения раствора кросс-линкера под суспензию AFHA III 150 и взбалтывания до достижения гомогенной смеси. Полученную смесь выливали в 40 мл 100% этанола. Реакционную смесь затем помещали в инкубатор и вращали в течение 12 часов при 37°С и затем в течение дополнительных двух (2) дней при комнатной температуре. В конце инкубации супернатант удаляли. Оставшийся материал промывали 40 мл DI воды, смешанной с 2 мл буферного раствора PBS (10 мМ, pH 7,36), и центрифугировали при 8000 об/мин в течение 15 минут. Полученный осадок промывали 30 мл физиологического раствора NaСl, смешанного с 2 мл буферного раствора PBS (10 мМ, pH 7,36), взбалтывали и центрифугировали при 10000 об/мин в течение 15 минут. Образец фильтровали, используя фильтровальную бумагу Whatman® No. 113 (кат. номер 1113 320). После фильтрования образец инкубировали при 37°С в течение 3 дней и испытывали. Эксперимент давал около 4,0 мл слегка непрозрачного геля. Величины комплексной вязкости, определенные для конечных осадков, полученных в эксперименте 05/15/1, и краткое описание некоторых наблюдаемых характеристик осадка сведены в таблицу 5 здесь далее.

ЭКСПЕРИМЕНТ 05/18/1

Готовили суспензию 150 мг AFHA III 150 в 2 мл 100% этанола.

В качестве кросс-линкера использовали 150 мг D(-)-фруктозы, растворенной в 7 мл DI воды. Суспензию AFHA III 150 смешивали с раствором кросс-линкера путем введения раствора кросс-линкера под суспензию AFHA III 150 и взбалтывания до достижения гомогенной смеси. Смесь выливали в 40 мл 100% этанола, смешанного с 0,5 мл уксусной кислоты (10% в DI воды). Полученную смесь помещали в инкубатор и вращали в течение 12 часов при 37°С и затем в течение двух (2) дополнительных дней при комнатной температуре. После инкубации супернатант удаляли. Оставшийся материал промывали 40 мл DI воды, смешанной с 2 мл буферного раствора PBS (10 мМ, pH 7,36), и центрифугировали при 8000 об/мин в течение 15 минут. Полученный осадок промывали 30 мл физиологического раствора NaСl, смешанного с 2 мл буферного раствора PBS (10 мМ, pH 7,36), взбалтывали и центрифугировали при 10000 об/мин в течение 15 минут. Образец фильтровали, используя фильтровальную бумагу Whatman® No. 113, и гомогенизировали продавливанием через иглу калибра 18. После гомогенизации образец инкубировали при 37°С в течение 3 дней. Величины комплексной вязкости, определенные для полученных осадков, и краткое описание некоторых наблюдаемых характеристик осадков сведены в таблицу 5 здесь далее.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ СЕРИЯ 05/22/1-4

Готовили четыре суспензии (суспензии 1-4), каждая из которых содержала 75 мг AFHA IV 150 в 2 мл 100% этанола. Два различных раствора кросс-линкера затем готовили следующим образом:

A. 220 мг D(-)-фруктозы растворяли в 7 мл DI воды.

B. 140 мг D(-)-фруктозы растворяли в 7 мл DI воды.

Cуспензии AFHA IV 150 образцов 1 и 3 (из экспериментов 05/22/1 и 05/22/3, соответственно), каждую, смешивали с 3,5 мл раствора кросс-линкера A, и суспензии AFHA IV 150 образцов 2 и 4 (из экспериментов 05/22/2 и 05/22/4, соответственно) смешивали с 3,5 мл раствора кросс-линкера B.

Смешивание при получении всех четырех образцов осуществляли добавлением раствора кросс-линкера к суспензии AFHA IV 150 при непрерывном взбалтывании до достижения гомогенной смеси.

Образцы номер 1 и 2 (из экспериментов 05/22/1 и 05/22/2, соответственно) гомогенизировали с использованием turrax при 24000 об/мин в течение 0,5 минуты. Каждую из четырех смесей отдельно выливали в 40 мл 100% этанола. Полученные четыре реакционные смеси помещали в инкубатор и вращали в течение 2 дней при 37°С. После инкубации супернатанты удаляли. Оставшиеся осадки, каждый, промывали 40 мл физиологического раствора NaCl, смешанного с 2 мл буферного раствора PBS (10 мМ, рН 7,36), и центрифугировали при 3000 об/мин (центрифуга: Kubota KS-8000, swinging bucket rotor RS 3000/6, Stainless steel bucket 53592) в течение 5 минут. Полученные четыре осадка, каждый, промывали 40 мл физиологического раствора NaCl, смешанного с 2 мл буферного раствора PBS (10 мМ, рН 7,36), взбалтывали и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 минут. Полученные четыре осадка инкубировали при 37°С в течение 3 дней. Величины комплексной вязкости, определенные для осадков, полученных в экспериментах 05/22/1, 05/22/2, 05/22/1 и 05/22/2, и краткое описание некоторых наблюдаемых характеристик осадков сведены в таблицу 5 здесь далее.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ СЕРИЯ 05/23/1,2

Готовили две суспензии 75 мг AFHA IV 150 в 2 мл 100% этанола. 70 мг D(-)-фруктозы растворяли в 5 мл DI воды.

Каждую суспензию AFHA IV 150 объединяли с 2,5 мл раствора кросс-линкера добавлением раствора кросс-линкера во время взбалтывания суспензии AFHA IV 150, чтобы получить гомогенную смесь.

Образец номер 2 гомогенизировали с использованием turrax при 24000 об/мин в течение 0,5 минуты. Каждую смесь добавляли в 40 мл этанола. Полученные смеси переносили в инкубатор и вращали в течение 2 дней при 37°С. Потом супернатант удаляли. Остатки промывали 40 мл физиологического раствора NaCl вместе с 2 мл буферного раствора PBS (10 мМ, рН 7,36) и центрифугировали при 3000 об/мин (центрифуга: Kubota KS-8000, swinging bucket rotor RS 3000/6, Stainless steel bucket 53592) в течение 5 минут. Полученный осадок промывали 40 мл физиологического раствора NaCl вместе с 2 мл буферного раствора PBS (10 мМ, рН 7,36), взбалтывали и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 минут. Образцы затем инкубировали при 37°С в течение 3 дней. Величины комплексной вязкости, определенные для полученных осадков, и краткое описание некоторых наблюдаемых характеристик осадков сведены в таблицу 5 здесь далее.

Анализы устойчивости к ферментативному расщеплению

Анализы устойчивости к расщеплению осуществляли с использованием расщепления гиалуронидазой и метода анализа уроновая кислота/карбазол, который описан в: Carbohydrate Analysis: A Practical Approach, 2nd ed.: M.F. Chaplin и J.F. Kennedy, IRL Press at Oxford University Press, UK, 1994, (ISBN 0-19-963449-1P) pp.324, который включен в настоящее описание ссылкой во всей его полноте для всех целей.

Результаты экспериментов расщепления гиалуронидазой материалов из некоторых раскрытых выше экспериментов даны на фиг. 10. Проводили два эксперимента расщепления:

1a) Расщепление поперечно сшитой HA

Пять образцов приблизительно по 100 мкл поперечно сшитой амино-функционализированной HA, полученной в эксперименте 05/02/02 (имеющих концентрацию 25,6 мг AFHA II 150, поперечно сшитой D(-)-фруктозой, на мл), каждый, смешивали с 500 мкл буферного раствора PBS (10 мМ, pH 7,36) и 10 единицами гиалуронидазы, растворенной в 10 мкл DI воды. Все образцы инкубировали при 37°С. Точные объемы образцов даны во втором столбце таблицы 4A ниже. Образцы отбирали со стадии инкубации через последовательные одночасовые интервалы после начала расщепления, каждый удаленный образец гомогенизировали взбалтыванием материала в течение одной минуты и центрифугировали при 13000 об/мин в течение 15 мин в центрифуге Heraeus "biofuge pico" (кат. № 75003280, с использованием ротора Heraeus # 3325B, центрифуга и ротор коммерчески доступны от Kendro Laboratory Products, Germany). 25 мкл Полученного супернатанта и 225 мкл буферного раствора PBS (10 мМ, pH 7,36) использовали для проведения карбазолового анализа. Результаты испытания расщепления поперечно сшитой HA сведены в таблицу 4A.

1b) Расщепление Perlane® лот No.7576

Пять образцов приблизительно по 100 мкл Perlane® (лот No. 7576), имеющих концентрацию 20 мг/мл, каждый, смешивали с 500 мкл буферного раствора PBS (10 мМ, pH 7,36) и 10 единицами гиалуронидазы, растворенной в 10 мкл DI воды, и образцы инкубировали при 37°С. Точные объемы образцов даны во втором столбце таблицы 4В, ниже. Образцы отбирали со стадии инкубации через последовательные одночасовые интервалы после начала расщепления. Каждый из удаленных образцов гомогенизировали взбалтыванием материала в течение одной минуты и центрифугировали при 13000 об/мин в течение 15 мин в той же центрифуге Heraeus "biofuge pico". 25 мкл Полученных супернатантов и 225 мкл буферного раствора PBS (10 мМ, pH 7,36) использовали для проведения карбазолового анализа. Согласно процедуре карбазолового анализа поглощающую способность измеряли при 525 нм для каждого образца.

Что касается фиг. 12, то это - схематический график, иллюстрирующий % устойчивости к расщеплению гиалуронидазой in vitro типичного образца матрицы поперечно сшитой D(-)-фруктозой амино-функционализированной HA из эксперимента 05/02/02 и коммерчески доступного образца Perlane® как функции времени расщепления (в часах). Вертикальная ось графика фиг. 12 представляет устойчивость к расщеплению гиалуронидазой (количество HA, оставшейся после указанного времени расщепления, от исходных количеств HA при времени 0, выраженное в процентах от исходного количества НА), и горизонтальная ось представляет время расщепления в часах. На фиг. 12 кривая 70 представляет результаты расщепления для матрицы, полученной в эксперименте 05/02/02, и кривая с меткой 72 представляет результаты расщепления для Perlane® (лот No. 7576). Из графика фиг. 12 можно видеть, что матрица, полученная в эксперименте 05/02/02, имеет устойчивость к расщеплению гиалуронидазой, которая намного превосходит устойчивость испытанного коммерческого образца Perlane®.

Например, после 5 часов расщепления практически весь Perlane® расщепляется, тогда как приблизительно 68% образца матрицы, полученной в эксперименте 05/02/02, остаются нерасщепленными. Результаты испытания расщепления Perlane® также сведены в таблицу 4B.

Таблица 4A
Время расщепления [часы]	Объем образца [мкл]	Масса HA в образце [мг]	Количество расщепленной HA [мг]	Количество остаточной HA [мг]	Устойчивость к расщеплению гиалуронидазой [%]
0	97,5	2,5	0,0	2,5	100,0
1	94,5	2,4	0,0	2,4	100,0
2	102,3	2,6	0,2	2,4	93,7
3	103,4	2,6	0,4	2,2	85,1
4	96,5	2,5	0,7	1,8	71,2
5	99,0	2,5	0,8	1,7	68,3

Таблица 4B
Время расщепле-ния [часы]	Объем образца Perlane [мкл]	Масса Perlane в образце [мг]	Количество расщеплен-ного Perlane [мг]	Количество остаточного Perlane [мг]	Устойчивость к расщепле- нию гиалуронидазой [%]
0	117,5	2,4	0,5	1,9	79,4
1	111,5	2,2	1,8	0,5	20,5
2	91,7	1,8	1,7	0,1	5,0
3	108,1	2,2	2,2	0,0	0,0
4	98,5	2,0	1,9	0,0	1,8
5	108,1	2,2	2,3	0,0	0,0

Таблица 5
Номер эксперимента	Комплексная вязкость [η*] в Паскалях (при частоте генерации 0,01 Гц)	Вид полученного материала
03/105/1	4673	Плотный гель
03/105/2	8288	Желтоватый плотный гель
03/105/3	___	Желтоватый, твердые гранулы
03/105/4	___	Плотный материал
03/105/5	___	Плотный материал
03/105/6	___	Плотный материал
03/114/1	7069	Непрозрачный гель
03/114/2	6436	Непрозрачный гель
03/114/3		Непрозрачный гель
03/114/4	6761	Непрозрачный гель
03/140/1	72	Прозрачный гель (1,5 мл)
03/140/2	3691	Желтоватый гель (1,5 мл)
03/140/3	2384	Желтоватый гель (1,5 мл)
03/140/4	9	Мягкий гель (3,7 мл)
03/140/6	3135	Мягкий непрозрачный гель (1,2 мл)
03/110/1	___	Мягкий гель (5,5 мл)
03/110/2	___	Твердые желтые пластины
03/110/3	___	Очень плотный гель (0,5 мл)
03/110/4	___	Плотный гель
03/131/2	___	Плотный желтый гель (0,5 мл)
03/131/3	34	Гель (3,2 мл)
03/131/4	___	Негомогенный желтый гель (0,8 мл)
03/131/5	543	Гель (4,5 мл)
03/146/2	100	Мягкий гель (0,9 мл)
05/08/2	11	Мягкий гель с непрозрачными частицами (5 мл)
05/08/3	6	Мягкий гель с непрозрачными частицами (1 мл)
05/08/4	24,8	Мягкий гель (10 мл)
03/94/2	7740	Плотный гель (0,8 мл)
04/55/1	1524	Гомогенный белый плотный гель (5 мл)
03/145/2	20230	Красно-коричневый плотный гель (3,7 мл)
03/146/1	17870	Непрозрачный плотный гель (2,7 мл)
05/02/1	7810	Светло-желтый непрозрачный гель (4,5 мл)
05/02/2	11540	Светло-желтый прозрачный гель (4,5 мл)
05/15/1	1326	Слегка мутный гель (4,5 мл)
05/18/1	45	Мягкий гель (7,5 мл)
05/22/1	21	Мягкий гель (6 мл)
05/22/2	83	Мягкий гель (5 мл)
05/22/3	55	Мягкий гель (6 мл)
05/22/4	6	Мягкий гель (5 мл)
05/23/1	10	Мягкий гель
05/23/1	0,2	Жидкий гель
05/22/1	21	Мягкий гель (6 мл)
05/22/2	83	Мягкий гель (5 мл)
05/22/3	55	Мягкий гель (6 мл)
05/22/4	6	Мягкий гель (5 мл)
05/23/1	10	Мягкий гель
05/23/2	0,2	Жидкий гель
09/95/1	2220	Не совсем белый гель
09/95/2	2098	Не совсем белый гель
09/95/3	2562	Не совсем белый гель
09/95/4	4496	Не совсем белый гель
09/102/1	573	Не совсем белый гель
09/102/2	253	Непрозрачный гель
09/102/3	47	Непрозрачный гель
09/102/4	6934	Не совсем белый гель
09/102/5	2321	Непрозрачный гель
09/102/6	1038	Непрозрачный гель

Эксперимент 05/82/1

150 мг AFHA II 150 растворяли в 440 мл DI воды и раствор переносили в круглодонную колбу. 10 мг D(-)-фруктозы растворяли в 10 мл солевого раствора. Полученный раствор смешивали с раствором AFHA II 150 и полученную смесь медленно выпаривали при вращении колбы в вакууме. Концентрированную смесь (приблизительно 2 мл) инкубировали в течение 2 дней при 37°С в легком вакууме. По окончании периода инкубации 30 мл солевого раствора добавляли к содержимому колбы и вращали в течение 1 часа без вакуума. Полученный гель удаляли, фильтровали через бумажный фильтр Whatman (No. 113) и доводили до конечного объема 6 мл разбавлением геля солевым раствором. Материал затем последовательно экструдировали через иглы 16G, 18G, 2OG, 21G и 22G. Каждую стадию экструзии повторяли три раза. Полученные частицы были желтоватыми и имели плотную консистенцию.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ СЕРИЯ 09/95/1-4

Эксперимент 09/95/1

Готовили водный образец раствора AFHA II 150 (1 мг/мл), содержащий общее количество 200 мг AFHA II 150. 1,2 мл Раствора фибриллированного свиного коллагена (16,5 мг/мл) добавляли к образцу. 100 мг D(-)-фруктозы, растворенной в 10 мл солевого раствора, затем добавляли к смеси коллаген/AFHA II 150. Полученную смесь перемешивали в течение 1 мин при 800 об/мин турбинной мешалкой (модель R 1312, коммерчески доступна от IKA®-Werke, GmbH & Co., Germany), переносили в лоток из нержавеющей стали и лиофилизировали. После лиофилизации образец покрывали смесью этанол/DI вода (90:10 об./об.) и инкубировали при 37°С в течение 6 часов. После инкубации материал промывали три раза смесью этанол/DI вода (90:10 об./об.), растворитель удаляли осушением образца и образец сушили лиофилизацией. 2 мл Солевого раствора добавляли к лиофилизованному материалу и смесь инкубировали в течение 3 дней при 37°С. По окончании периода инкубации образец экструдировали через иглу 16G, добавляли 4 мл солевого раствора и материал экструдировали снова через иглу 18G и 20G.

Эксперимент 09/95/2

Эксперимент осуществляли, как описано для эксперимента 09/95/1 выше, за исключением того, что количество используемой D(-)-фруктозы было 130 мг.

Эксперимент 09/95/3

Эксперимент осуществляли, как описано для эксперимента 09/95/1 выше, за исключением того, что количество использованной D(-)-фруктозы было 160 мг.

Эксперимент 09/95/4

Эксперимент осуществляли, как описано для эксперимента 09/95/1 выше, за исключением того, что количество использованной D(-)-фруктозы было 100 мг и коллаген не добавляли (этот эксперимент был контролем для AFHA II 150, поперечно сшитой без коллагена).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ СЕРИЯ 09/102/1-6

Водный раствор AFHA II 150 (при концентрации 2,85 мг/мл DI воды) использовали для получения образца, содержащего общее количество 300 мг AFHA II 150. 1,8 мл Раствора фибриллированного коллагена (имеющего концентрацию 16,5 мг коллагена на мл буфера фибриллирования) добавляли к образцам 2-5 (из экспериментов 09/102/2-5, соответственно). 1,8 мл буфера фибриллирования добавляли к образцу 1 вместо раствора коллагена (контроль без коллагена - эксперимент 09/102/1). 5,0 мл Раствора D(-)-фруктозы в солевом растворе (имеющего концентрацию 40 мг D(-)-фруктозы на мл солевого раствора) добавляли к каждому из шести образцов и образцы перемешивали. Все полученные реакционные смеси перемешивали в течение 1 минуты при 800 об/мин турбинной мешалкой, переносили в отдельные лотки из нержавеющей стали и лиофилизировали. После лиофилизации образцы 1, 2 и 3 (из экспериментов 09/102/1, 09/102/2 и 09/102/3, соответственно) покрывали смесью этанол/DI вода (90:10 об./об.) и инкубировали при 37°С в течение 6 часов. Каждый из образцов l, 2 и 3 (из экспериментов 09/102/1, 09/102/2 и 09/102/3, соответственно) промывали три раза смесью этанол/DI вода (90:10 об./об.), растворитель удаляли осушением образцов и образцы сушили лиофилизацией. Образцы 4, 5 и 6 (из экспериментов 09/102/4, 09/102/5 и 09/102/6, соответственно) не промывали.

2 мл солевого раствора добавляли к каждому из образцов 1-6 и все образцы инкубировали в течение 3 дней при 37°С. После инкубации все образцы экструдировали один раз через иглу 16G. 4 мл Солевого раствора добавляли к каждому из экструдированных образцов и каждый из образцов последовательно экструдировали один раз через иглу 18G и один раз через иглу 20G. Подробные количества материалов и условия реакции, использованные в каждом из экспериментов ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ СЕРИИ 09/102/1-6, даны в таблице 6 ниже.

Таблица 6
Номер экспери- мента	Количество AFHA II 150 [мг]	Объем добавленного фибриллиро-ванного коллагена [мл]	Количество D(-)фруктозы в солевом растворе (40 мг/мл)	Инкубация при 37°C в смеси этанола и солевого раствора (90:10)	3 цикла промывания в смеси этанола и солевого раствора (90:10)	Инкубация при 37°C в 2 мл солевого раствора (дни)
09/102/1	150	0,0 мл	200 мг	6 часов	да	3
09/102/2	150	1,8 мл	200 мг	6 часов	да	3
09/102/3	150	3,6 мл	200 мг	6 часов	да	3
09/102/4	150	0,0 мл	200 мг	-	нет	3
09/102/5	150	1,8 мл	200 мг	-	нет	3
09/102/6	150	3,6 мл	200 мг	-	нет	3

Некоторые свойства гелей, полученных в экспериментах 09/102/1-6, даны в таблице 5 выше.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ СЕРИЯ 11/40/1,2

Хитозановая основа, использованная в экспериментах 11/40/1 и 11/40/2, описанных ниже, коммерчески доступна как Protasan UP B 80/200 от NovaMatrix FMC Biopolymer, Oslo, Norway.

Эксперимент 11/40/1

Готовили водный раствор AFHA II 150 (1,0 мг/мл), содержащий 300 мг AFHA II 150. Раствор, содержащий 30 мг хитозана, растворенного в 0,1 M HСl (pH 5 - доводили добавлением буфера фибриллирования), и 330 мг D(-)-фруктозы, растворенной в 10 мл солевого раствора, добавляли к раствору AFHA II 150 с перемешиванием. Смесь перемешивали в течение 1 минуты при 800 об/мин турбинной мешалкой, переносили в лоток из нержавеющей стали и лиофилизовали. После лиофилизации образец покрывали смесью этанол/DI вода (90:10 об./об.) и инкубировали при 37°С в течение 6 часов. Полученный материал промывали три раза смесью этанол/DI вода (90:10 об./об.), растворитель удаляли осушением и образец сушили лиофилизацией. 4 мл Солевого раствора добавляли к лиофилизованному материалу и материал инкубировали в течение 3 дней при 37°С. В конце инкубации образец экструдировали через иглу 16G, 8 мл солевого раствора добавляли и смесь снова последовательно экструдировали через иглу 18G и 20G.

Эксперимент 11/40/2

Эксперимент осуществляли, как описано для эксперимента 11/40/1 здесь выше, за исключением того, что раствор AFHA II 150 смешивали с 60 мг хитозана, растворенного в 0,1 M HСl (pH 5 - доводили добавлением буфера фибриллирования), и 360 мг D(-) фруктозы, растворенной в 10 мл солевого раствора. Полученный материал был гелем, имеющим плотную консистенцию и не совсем белый/желтый цвет.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ СЕРИЯ 11/40/3-5

Эксперимент 11/40/3

Готовили водный раствор AFHA II 150 (1,0 мг/мл), содержащий 300 мг AFHA II 150. Раствор 1,1 миллимоль (237 мг) гидрохлорида D(+)-глюкозамина растворяли в 10 мл солевого раствора, смешивали с водным раствором AFHA II 150. Смесь перемешивали в течение 1 минуты при 800 об/мин турбинной мешалкой, переносили в лоток из нержавеющей стали и лиофилизовали. После лиофилизации образец покрывали смесью этанол/DI вода (90:10 об./об.) и инкубировали при 37°С в течение 6 часов. Полученный материал промывали три раза смесью этанол/DI вода (90:10 об./об.), растворитель удаляли осушением и образец сушили лиофилизацией. 4 мл солевого раствора добавляли к лиофилизованному материалу и материал инкубировали в течение 3 дней при 37°С. В конце инкубации образец экструдировали через иглу 16G, 8 мл солевого раствора добавляли и смесь снова последовательно экструдировали через иглу 18G и 20G. Полученный материал был гелем, имеющим плотную консистенцию и не совсем белый/желтый цвет.

Эксперимент 11/40/4

Эксперимент проводили, как описано для эксперимента 11/40/3 здесь выше, за исключением того, что в качестве восстанавливающего сахара использовали 396 мг (1,1 миллимоль) моногидрата мальтозы (вместо гидрохлорида глюкозамина). Полученный материал был гелем, имеющим плотную консистенцию и не совсем белый/желтый цвет.

Эксперимент 11/40/5

Эксперимент проводили, как описано для эксперимента 11/40/3 здесь выше, за исключением того, что в качестве восстанавливающего сахара использовали 396 мг (1,1 миллимоль) моногидрата D(+)-лактозы (вместо гидрохлорида D(+)-глюкозамина). Полученный материал был гелем, имеющим плотную консистенцию и не совсем белый/желтый цвет.

Следует отметить, что, хотя ограниченное число типов восстанавливающих сахаров использовали в типичных экспериментах, раскрытых здесь выше, многие другие типы редуцирующих сахаров и/или производных восстанавливающих сахаров могут быть использованы в качестве кросс-линкеров для получения поперечно сшитых матриц по данному изобретению. Такие восстанавливающие сахара могут включать, но без ограничения перечисленными, альдозу, кетозу, диозу, триозу, тетрозу, пентозу, гексозу, септозу, октозу, нанозу, декозу, глицерозу, треозу, эритрозу, ликсозу, ксилозу, арабинозу, рибозу, аллозу, альтрозу, глюкозу, фруктозу, маннозу, гулозу, идозу, галактозу, талозу, восстанавливающий моносахарид, восстанавливающий дисахарид, восстанавливающий трисахарид, восстанавливающий олигосахарид, мальтозу, лактозу, целлобиозу, генциобиозу, мелибиозу, туранозу, трегалозу, изомальтозу, ламинарибиозу, маннобиозу и ксилобиозу, глицеральдегид, сорбозу и их сочетания.

Другими типами восстанавливающих сахаров, которые могут быть использованы для получения поперечно сшитых матриц по данному изобретению, являются восстанавливающие сахара и производные восстанавливающих сахаров, раскрытые наряду с прочими в патентах США 5955438, 6346515 и 6682760 и в опубликованной международной патентной заявке WO 2003/049669, которые включены в настоящее описание ссылкой во всей их полноте и для всех целей.

Кроме того, следует отметить, что в соответствии с вариантом осуществления изобретения подходящие производные восстанавливающих сахаров могут быть также использованы для поперечной сшивки матриц по данному изобретению, такие производные могут включать, но без ограничения указанным, D-рибоза-5-фосфат, глюкозамин и любой другой тип других производных восстанавливающих сахаров, известных в технике. Сложные эфиры и соли указанных восстанавливающих сахаров и их производных также могут быть использованы по отдельности или в любом подходящем сочетании с раскрытыми выше типами восстанавливающих сахаров.

Еще следует отметить, что в соответствии с дополнительными вариантами осуществления данного изобретения используемый восстанавливающий сахар (сахара) может быть правовращающей, левовращающей и смесью правовращающей и левовращающей форм. Рацемические смеси одного или нескольких восстанавливающих сахаров также могут быть использованы. Кроме того, восстанавливающие сахара, которые содержат один или несколько асимметричных (хиральных) атомов углерода, также могут быть использованы в способах и матрицах по данному изобретению, включая различные оптически активные изомерные формы (энантиомеры) и/или любые смеси и их сочетания.

Специалисту должно быть понятно, что в соответствии с дополнительным вариантом осуществления данного изобретения более чем один восстанавливающий сахар может быть использован для поперечной сшивки амино-полисахаридов и/или амино-функционализированных полисахаридов, и/или любой смеси различных амино-полисахаридов и/или амино-функционализированных полисахаридов, и/или любой смеси амино-полисахаридов и/или амино-функционализированных полисахаридов с одним или несколькими белками (и/или любыми желательными добавками). Например, в соответствии с неограничивающим примером, AHFA I 150 поперечно сшита смесью D(-)-рибозы и D(+)-сорбозы. Подобным образом, в соответствии с другим вариантом осуществления изобретения, смесь хитозана и АHFA I 150 может быть поперечно сшита в смеси, содержащей мальтозу, глюкозу и фруктозу. В еще одном типичном варианте осуществления смесь AHFA, коллагена и гепарина может быть поперечно сшита смесью кросс-линкеров, включающей рибозу, глюкозамин и D-рибоза-5-фосфат. Эти варианты осуществления даны для примера, и многие другие варианты и модификации возможны путем изменения числа и типов восстанавливающих сахаров, включенных в состав поперечно сшивающей реакционной смеси.

Специалисту должно быть понятно, что хотя в конкретных реакциях поперечной сшивки, раскрытых здесь выше, использован ограниченный ассортимент типичных растворителей и смесей растворителей, многие модификации и изменения могут быть сделаны в системах растворителей, используемых в реакциях поперечной сшивки по данному изобретению. Так, реакции поперечной сшивки, используемые для формирования матриц по данному изобретению, могут быть осуществлены в водных растворах, забуференных водных растворах, растворах, содержащих воду и/или водный забуференный раствор и один или несколько органических растворителей, неводных растворах, включающих один или несколько неводных растворителей, и тому подобном. Как можно видеть из реальных экспериментов, раскрытых здесь выше, используемые неводные растворители могут быть полярными, и/или гидрофильными, и/или смешивающимися с водой растворителями, но могут также включать различные неполярные, негидрофобные растворители и растворитель (растворители), который является по существу смешивающимся с водой. В принципе, любой тип системы растворителей, включающей любой растворитель или комбинации растворителей, может быть использован для осуществления реакций поперечной сшивки из данных реакций при условии разумного подхода к выбору растворителей.

Например, растворители предпочтительно (но не обязательно) не должны содержать слишком химически реакционноспособные группы или части молекул, которые могут вредно влиять или мешать реакциям поперечной сшивки (за исключением случаев, когда вмешивающиеся побочные реакции не являются нежелательными или являются фактически приемлемыми или даже желательными). Подобно этому, следует осторожно подходить к выбору используемого растворителя (растворителей), чтобы избежать нежелательного денатурирования каких-либо белков и/или полипептидов, которые должны быть поперечно сшиты вместе с амино-полисахаридами и/или амино-функционализированными полисахаридами. Имея в виду такие предосторожности, почти любой тип растворителя или смеси растворителей может быть использован для осуществления реакций поперечной сшивки по данному изобретению.

Таким образом, матрицы по данному изобретению могут быть сформированы поперечной сшивкой любого подходящего сочетания амино-полисахаридов и/или амино-функционализированных полисахаридов, и/или любой смеси различных амино-полисахаридов и/или амино-функционализированных полисахаридов, и/или любой смеси амино-полисахаридов и/или амино-функционализированных полисахаридов с одним или несколькими белками любым желательным сочетанием восстанавливающих сахаров и/или производных восстанавливающих сахаров. Все такие сочетания и изменения, разумеется, входят в объем данного изобретения. Применение таких различных сочетаний может быть выгодным для тонкой регулировки химических, и/или физических, и/или реологических, и/или биологических свойств полученных поперечно сшитых матриц, чтобы адаптировать матрицы для любого желательного применения. Свойства полученных матриц могут, таким образом, зависеть, наряду с прочим, от числа и свойств используемых амино-полисахаридов и/или амино-функционализированных полисахаридов, числа и типа используемых белков (если их используют), числа и типа поперечно сшивающих восстанавливающих сахаров и свойств любой другой добавки, включенной в матрицу. Следует также отметить, что на свойства матрицы могут также оказать воздействие условия реакции, температура реакции, pH, используемый тип растворителя или растворителей и наличие или отсутствие каких-либо добавок, представленных в реакционной смеси и/или добавленных к матрицам после поперечной сшивки.

Следует отметить, что растворитель (растворители), используемый при поперечной сшивке реакционной смеси, может включать по меньшей мере одну ионизируемую соль (такую как, но без ограничения указанным, NaСl, используемый в солевых растворах в экспериментах 09/95/1 и в экспериментах 09/102/1-6, или PBS, используемый в экспериментах 2, 12/1 и 37/1-3 и в других экспериментах, которые подробно раскрыты здесь выше). Ионизируемая соль (соли) может быть применима для регулирования ионной силы указанного раствора и может быть полезной при осуществлении способов формирования композиционных матриц, включающих белки, в случаях, когда белки чувствительны к ионной силе реакционного раствора. Следует отметить, что любая подходящая ионизируемая соль(соли), известная в технике, может быть использована для регулирования ионной силы реакционного раствора, как это хорошо известно в технике. Некоторые неограничивающие примеры ионизируемых солей, которые могут быть использованы, включают различные соли щелочных металлов, галогениды щелочных металлов, различные сульфаты и/или фосфаты металлов, различные соли аммония и тому подобное, как это известно в технике. Однако любой другой подходящий тип ионизируемой соли (солей), известный в технике, также может быть использован в реакциях поперечной сшивки по данному изобретению.

Следует отметить, что продукты новых реакций поперечной сшивки, описанных здесь выше, могут быть использованы для получения разнообразных матриц на основе различных поперечно сшитых полисахаридов и композиционных матриц на основе полисахарид/белок. Такие матрицы могут быть получены как таковые или могут быть соответствующе обработаны (путем подходящего применения шаблонов и/или сжатия, и/или сушки, и/или лиофилизации, и/или любого другого способа, известного в технике для формирования твердых или полутвердых изделий из таких матриц), чтобы предоставить твердые формы матриц в любой желательной конфигурации и/или любую форму препарата для инъекций, включающую, но без ограничения, пригодные для введения инъекций и не вводимые инъекцией суспензии матричных частиц, микросфер, микрочастиц любого желательного размера и формы. Твердые формы матриц могут включать, но без ограничения указанным, пластины, трубки, мембраны, губки, чешуйки, гели, шарики, микросферы, микрочастицы и другие родственные геометрические формы, изготовленные из любых типов матриц на основе полисахарида, раскрытых здесь выше (включая, но без ограничения, композиционные матрицы полисахарид/белок), которые могут быть получены поперечной сшивкой с использованием методов гликозилирования по данному изобретению.

Следует отметить, что продукты новых реакций поперечной сшивки, описанных здесь выше (включая и поперечно сшитые сахаром полисахариды, и поперечно сшитые сахаром композиционные матрицы белок/полисахарид), могут быть дополнительно переработаны, и/или обработаны, и/или модифицированы путем подвергания поперечно сшитых матриц дополнительной обработке и/или одной или нескольким технологическим стадиям. Такие обработки и/или модификации могут включать, но без ограничения указанным, сушку, лиофилизацию, дегидратацию, сушку при критической точке, формование в форме (чтобы получить формованные изделия), стерилизацию, гомогенизацию (чтобы модифицировать или усовершенствовать свойства текучести и пригодности для инъекции матриц), обработку механическим сдвигом (чтобы модифицировать реологические свойства и облегчить введение инъекцией), облучение ионизирующим излучением (в целях стерилизации и/или для осуществления дополнительных поперечных связей и/или для других целей), облучение электромагнитным излучением (в целях стерилизации и/или для осуществления дополнительных поперечных связей и/или для других целей), смешивание с фармацевтически приемлемым носителем (таким как, например, для получения препарата для инъекций для увеличения объема ткани и/или для приращения ткани и/или других целей), стерилизацию термическими средствами (автоклавирование и тому подобное), стерилизацию химическими средствами (такую как, но без ограничения, стерилизация с применением пероксида водорода, озона, этиленоксида и тому подобного), насыщение добавкой и/или любое сочетание таких технологических стадий.

Кроме того, любые подходящие сочетания раскрытых выше дополнительных обработок и технологических стадий могут быть использованы в любой подходящей последовательности, чтобы обеспечить любые желательные модифицированные, и/или высушенные, и/или формованные изделия и/или препараты новых поперечно сшитых сахаром матриц, раскрытых здесь. Все описанные выше методы обработки хорошо известны в технике и поэтому не описываются здесь подробно.

Дополнительно следует отметить, что композиционные матрицы по данному изобретению не ограничиваются применением какого-либо конкретного типа коллагена. Скорее, любой желательный тип коллагена, включая, но без ограничения перечисленным, природный коллаген, фибриллярный коллаген, фибриллярный ателопептидный коллаген, содержащий телопептид коллаген, лиофилизованный коллаген, коллаген, полученный из животных источников, коллаген человека, коллаген млекопитающего, рекомбинантный коллаген, пепсинизированный коллаген, восстановленный коллаген, бычий ателопептидный коллаген, свиной ателопептидный коллаген, коллаген, полученный из видов позвоночных, генетически сконструированный или модифицированный коллаген, коллаген типов I, II, III, V, XI, XXIV, фибрилл-связанные коллагены типов IX, XII, XIV, XVI, XIX, XX, XXI, XXII и XXVI, коллагены типов VIII и X, коллагены типа IV, коллаген типа VI, коллаген типа VII, коллагены типа XIII, XVII, XXIII и XXV, коллагены типа XV и XVIII, искусственно полученный коллаген, производимый генетически модифицированными эукариотическими или прокариотическими клетками или генетически модифицированными организмами, очищенный коллаген и восстановленный очищенный коллаген, частицы фибриллярного коллагена, фибриллярный восстановленный ателопептидный коллаген, коллаген, выделенный из клеточной культуральной среды, коллаген, выделенный из генетически сконструированных растений, фрагменты коллагена, протоколлаген и любые сочетания перечисленных выше типов коллагена, может быть использован для формирования композиционных матриц по данному изобретению, как раскрыто здесь выше.

Специалисту должно быть понятно, что композиционные матрицы, раскрытые в данной заявке, не ограничиваются применением коллагена и цитохрома C, как экспериментально продемонстрировано здесь выше. Скорее, композиционные матрицы по данному изобретению могут включать матрицы, включающие в дополнение к амино-полисахаридам и/или амино-функционализированным полисахаридам любой подходящий тип белка (белков) и/или полипептиды (природные или синтетические), которые могут быть поперечно сшиты с амино-полисахаридами и/или амино-функционализированными полисахаридами одним или несколькими кросс-линкерами восстанавливающими сахарами и/или кросс-линкером производным восстанавливающего сахара. Такой поперечно сшиваемый белок или полипептид может включать, но без ограничения перечисленным, коллаген, белок, выбранный из надсемейства коллагена, белки внеклеточного матрикса, ферменты, структурные белки, выделенные из крови белки, гликопротеины, липопротеины, природные белки, синтетические белки, гормоны, факторы роста, белки, стимулирующие рост хряща, белки, стимулирующие рост кости, внутриклеточные белки, внеклеточные белки, мембранные белки, эластин, фибрин, фибриноген и различные их сочетания.

В соответствии с одним аспектом данного изобретения, поперечно сшитые полисахаридные матрицы по данному изобретению могут быть приготовлены в виде подходящих составов для инъекций с подходящими фармацевтическими добавками и/или фармацевтически приемлемым носителем (носителями) или без них. Такие препараты для инъекций могут быть упакованы в соответствующий шприц (с подходящей иглой или без нее). Такие предварительно заполненные, предварительно стерилизованные шприцы могут быть применимы для разнообразных косметических и медицинских целей, таких как, но без ограничения указанным, применение для разглаживания морщин, приращение ткани, увеличение объема ткани и тому подобное.

Согласно дополнительному варианту осуществления изобретения, матрицы по данному изобретению могут быть химически, и/или физически, и/или биологически модифицированы агентами и веществами, такими как, но без ограничения перечисленным, фармакологические препараты, лекарства, белки, полипептиды, анестезирующие средства, антибактериальные агенты, противомикробные агенты, противовирусные агенты, противогрибковые агенты, антимикозные агенты, противовоспалительные агенты, гликопротеины, протеогликаны, гликозаминогликаны, различные компоненты внеклеточного матрикса, гормоны, факторы роста, трансформирующие факторы, рецепторы или рецепторные комплексы, природные полимеры, синтетические полимеры, ДНК, РНК, олигонуклеотиды, терапевтические агенты, морфогенетические белки, мукопротеины, мукополисахариды, белки матрикса, факторы транскрипции, пептиды, генетический материал для генной терапии, нуклеиновая кислота, химически модифицированная нуклеиновая кислота, химерная конструкция ДНК/РНК, ДНК или РНК зонды, антисмысловая ДНК, антисмысловая РНК, ген, часть гена, композиция, включающая природно или искусственно полученные олигонуклеотиды, плазмидная ДНК, космидная ДНК, вирусные и невирусные векторы, необходимые для стимулирования клеточного поглощения и транскрипции, хондроитин-4-сульфат, хондроитин-6-сульфата, кератансульфат, дерматансульфат, гепарин, гепарансульфат, гиалуронан, обогащенный лецитином внутритканевый протеогликан, декорин, бигликан, фибромодулин, лумикан, аггрекан, синдеканы, бета-гликан, версикан, центрогликан, серглицин, фибронектин, фиброгликан, хондроадгерины, фибулины, тромбоспондин-5, фермент, ингибитор фермента, антитело и любыми сочетаниями указанных выше материалов и/или любым другим модифицирующим свойства агентом или веществом, известным в технике. Такие агенты или вещества могут быть добавлены к матрицам после завершения поперечной сшивки. Дополнительно или в качестве варианта агент(ы) или вещество (вещества) могут быть добавлены в реакционную смесь перед поперечной сшивкой, и реакция поперечной сшивки может быть затем осуществлена в присутствии агента (агентов) или вещества (веществ), чтобы внедрить и/или связать поперечными связями агент(ы) или вещество (вещества) внутри сформированной поперечно сшитой матрицы, чтобы изменить свойства матрицы.

Такие добавленные вещества могут быть ковалентно связаны с полисахаридной матрицей любыми подходящими поперечно сшивающими агентами, как это хорошо известно в технике. В качестве варианта или дополнительно, такие модифицирующие вещества могут быть включены в реакционную смесь во время процессов поперечной сшивки, описанных здесь, и могут быть таким образом захвачены матрицей или включены в матрицы на основе поперечно сшитых полисахаридов или композиционных матриц.

Специалисту должно быть понятно, что описанные здесь поперечно сшитые матрицы могут быть дополнительно модифицированы воздействием на матрицы любыми химическими или биологическими модификаторами, известными в технике. Например, некоторые или все свободные функциональные группы, такие как, но без ограничения указанными, аминогруппы, и/или карбоксигруппы, и/или гидроксильные группы, остающиеся на компонентах поперечно сшитой матрицы после поперечной сшивки, могут быть химически или ферментативно обработаны, чтобы химически ввести другие химические группы или части молекул (такие как, но без ограничения указанными, аминогруппы, и/или карбоксигруппы, и/или гидроксильные группы, и/или нитрогруппы, и/или хлор-, и/или бром- и/или йодгруппы, и/или пероксогруппы, и/или периодгруппы, и/или перхлоргруппы, и/или любые другие химические группы, и/или химические части молекул и тому подобное), чтобы дополнительно модифицировать такие группы для того, чтобы дополнительно регулировать свойства матрицы. Примеры таких возможных модификаций после поперечной сшивки могут включать, но без ограничения указанным, этерификацию свободных гидроксильных или карбоксигрупп, присутствующих на главной цепи полисахарида поперечно сшитой матрицы или на главной цепи белка любой включающей поперечно сшитый белок или полипептид композиционной матрицы, ацетилирование любых свободных аминогрупп на главных цепях полисахарида, или полипептида, или любой другой тип известных в технике реакций химической или ферментативной модификации функциональных групп. Химия таких модификаций хорошо известна в технике и поэтому не раскрывается здесь подробно.

Такие модификации функциональных групп могут быть применимы для дополнительной модификации и тонкого регулирования свойств матрицы (таких как, но без ограничения указанными, гидрофобность, гидрофильность, результирующий заряд при различных выбранных величинах pH, пористость матрицы, способность матрицы абсорбировать воду, устойчивость к ферментативному расщеплению in vivo и/или in vitro и тому подобное), чтобы адаптировать матрицу для конкретных желательных применений. Следует принимать во внимание, что, если матрицы, которые модифицируют, предназначаются для применений, которые требуют биосовместимости, необходимо проявлять осторожность при выборе химических групп, подвергаемых модификации, и учитывать характер любых химических групп, которые вводят в структуру матриц, чтобы гарантировать достаточную степень биосовместимости. Однако в других применениях матриц, которые не требуют высокой степени биосовместимости, многие из групп, перечисленных выше, и любых других химических групп, известных в технике (таких как, но без ограничения указанными, азогруппы, азидогруппы, нитрозогруппы и тому подобные), могут быть введены в структуру матрицы, чтобы обеспечить дополнительную модификацию структуры и свойств матрицы.

В соответствии с дополнительным вариантом осуществления матрицы по данному изобретению, живые клетки могут быть добавлены к любым поперечно сшитым матрицам, описанным здесь выше или полученным с применением раскрытых здесь способов. Живые клетки могут быть добавлены во время или после поперечной сшивки, чтобы сформировать поперечно сшитую матрицу, содержащую одну или несколько разновидностей клеток, включенных или внедренных в матрицу.

В соответствии с дополнительным вариантом осуществления матрицы по данному изобретению, живыми клетками, включенными в матрицу, могут быть хондроциты позвоночных, остеобласты, остеокласты, стволовые клетки позвоночных, эмбриональные стволовые клетки, стволовые клетки, выделенные из ткани взрослого, клетки-предшественники позвоночных, фибробласты позвоночных, клетки, генетически сконструированные для секреции одного или нескольких белков матрикса, гликозаминогликанов, протеогликанов, морфогенетических белков, факторов роста, факторов транскрипции, противовоспалительных агентов, белков, гормонов, пептидов, один или несколько типов живых клеток, сконструированных для экспрессии рецепторов к одной или нескольким молекулам, выбранным из группы, состоящей из белков, пептидов, гормонов, гликозаминогликанов, протеогликанов, морфогенетических белков, факторов роста, факторов транскрипции, противовоспалительных агентов, гликопротеинов, мукопротеинов и мукополисахаридов. Сочетания нескольких типов различных клеток также могут быть включены в матрицы по данному изобретению.

В соответствии с различными вариантами осуществления данного изобретения, поперечно сшитые матрицы на основе полисахарида, полученные способами по данной заявке, могут быть подходящими для различных применений, таких как, но без ограничения указанным, матричные настилы, применимые в тканевой инженерии (для in vivo и in vitro применений), системы с регулируемым высвобождением фармакологических веществ и биологических агентов (биологически активных белков, генов, генных векторов и тому подобного), мембраны для направленной регенерации мягкой и костной ткани, вводимые инъекцией и/или имплантируемые объемные агенты, и/или протезные устройства для приращения ткани и/или косметического применения (такого как, но без ограничения указанным, препараты для инъекций для разглаживания морщин и для других косметических и эстетических целей), оболочки для закрепления на месте природных, и/или реконструированных, и/или искусственных органов, заполняющий материал для получения искусственных тканей или органов, таких как, но без ограничения указанным, искусственная молочная железа, и в качестве компонента композиционных материалов, содержащих поперечно сшитые полисахариды по данному изобретению, объединенные с другими природными или искусственными полимерными структурами, материалами и/или матрицами, или с другими природными или синтетическими органическими и неорганическими соединениями, и/или полимерами, и/или сочетаниями всех указанных выше веществ.

Специалисту должно быть понятно, что, хотя буфером, используемым во многих реакциях и препаратах образцов, раскрытых выше, был забуференный фосфатом солевой раствор (PBS), это не является обязательным для осуществления на практике изобретения. Так, многие различные типы буферов и/или забуференных растворов и забуференных растворителей могут быть использованы для осуществления процедур получения материала и/или реакций поперечной сшивки для получения матриц на основе полисахарида и/или композиционных матриц на основе полисахарид/белок по данному изобретению. Например, другие типичные буферы, которые могут быть использованы в препаратах и реакциях поперечной сшивки по данному изобретению, могут включать, но без ограничения указанным, буфер лимонная кислота/цитрат, 2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота (MES), 2-бис(2-гидроксиэтил)амино-2-(гидроксиметил)-1,3-пропандиол (BIS-TRIS), пиперазин-N,N'-бис(2-этансульфоновая кислота) (PIPES), 3-(N-морфолино)пропансульфоновая кислота (MOPS), 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновая кислота (HEPES) и многие другие типы буферов, известных в технике. Однако при выборе буферных составов необходимо позаботиться о том, чтобы буферы не включали активные химические группы или части молекул, которые могут вмешиваться в реакции поперечной сшивки, описанные здесь выше. Такие буферы и соображения, учитываемые при их выборе для применения, хорошо известны в технике и широко описаны в литературе, и поэтому не раскрываются здесь подробно.

1. Способ получения поперечно сшитых полисахаридов, включающий взаимодействие по меньшей мере одного полисахарида, выбранного из амино-полисахарида, амино-функционализированного полисахарида, содержащих одну или более аминогрупп, которые способны быть поперечно сшитыми восстанавливающим сахаром, и их сочетаний с по меньшей мере одним восстанавливающим сахаром с образованием поперечно сшитого полисахарида.

2. Способ по п.1, где указанный по меньшей мере один полисахарид выбран из природного амино-полисахарида, синтетического амино-полисахарида, амино-гетерополисахарида, амино-гомополисахарида, амино-функционализированных полисахаридов и их производных форм и сложных эфиров и солей, амино-функционализированной гиалуроновой кислоты и ее производных форм и сложных эфиров и солей, амино-функционализированного гиалуронана и его производных форм и сложных эфиров и солей, хитозана и его производных форм и сложных эфиров и солей, амино-функционализированного гепарина и его производных форм и сложных эфиров и солей, амино-функционализированных гликозаминогликанов и их производных форм и сложных эфиров и солей и любых их сочетаний.

3. Способ по п.1, где указанный по меньшей мере один восстанавливающий сахар выбран из альдозы, кетозы, производного альдозы, производного кетозы и любых их сочетаний.

4. Способ по п.1, где указанный по меньшей мере один восстанавливающий сахар выбран из диозы, триозы, тетрозы, пентозы, гексозы, септозы, октозы, нанозы, декозы и их сочетаний.

5. Способ по п.1, где указанный по меньшей мере один восстанавливающий сахар выбран из глицерозы, треозы, эритрозы, ликсозы, ксилозы, арабинозы, рибозы, аллозы, альтрозы, глюкозы, фруктозы, маннозы, гулозы, идозы, галактозы и талозы.

6. Способ по п.1, где указанный по меньшей мере один восстанавливающий сахар выбран из восстанавливающего моносахарида, восстанавливающего дисахарида, восстанавливающего трисахарида, восстанавливающего олигосахарида, производных форм олигосахаридов, производных форм моносахаридов, сложных эфиров моносахаридов, сложных эфиров олигосахаридов, солей моносахаридов, солей олигосахаридов и любых их сочетаний.

7. Способ по п.6, где указанный восстанавливающий дисахарид выбран из группы, состоящей из мальтозы, лактозы, целлобиозы, генциобиозы, мелибиозы, туранозы, трегалозы, изомальтозы, ламинарибиозы, маннобиозы и ксилобиозы.

8. Способ по п.1, где указанный по меньшей мере один восстанавливающий сахар выбран из глицеральдегида, рибозы, эритрозы, арабинозы, сорбозы, фруктозы, глюкозы, D-рибоза-5-фосфата, глюкозамина и их сочетаний.

9. Способ по п.1, где указанный по меньшей мере один восстанавливающий сахар выбран из правовращающей формы указанного по меньшей мере одного восстанавливающего сахара, левовращающей формы указанного по меньшей мере одного восстанавливающего сахара и смеси правовращающей и левовращающей форм указанного по меньшей мере одного восстанавливающего сахара.

10. Способ по п.1, где указанное взаимодействие включает инкубирование указанного по меньшей мере одного полисахарида в растворе, содержащем по меньшей мере один растворитель и указанный по меньшей мере один восстанавливающий сахар, до образования указанного поперечно сшитого полисахарида.

11. Способ по п.10, где указанный раствор является забуференным раствором, содержащим по меньшей мере один буфер.

12. Способ по п.10, где указанный по меньшей мере один растворитель является водным забуференным растворителем, содержащим по меньшей мере один буфер для регулирования рН указанного раствора.

13. Способ по п.10, где указанный по меньшей мере один растворитель является водным растворителем, включающим по меньшей мере одну ионизируемую соль для регулирования ионной силы указанного раствора.

14. Способ по п.10, где указанный по меньшей мере один растворитель содержит по меньшей мере один растворитель, выбранный из группы, состоящей из органического растворителя, неорганического растворителя, полярного растворителя, неполярного растворителя, гидрофильного растворителя, гидрофобного растворителя, растворителя, смешивающегося с водой, не смешивающегося с водой растворителя и их сочетаний.

15. Способ по п.10, где указанный по меньшей мере один растворитель содержит воду и по меньшей мере один дополнительный растворитель, выбранный из гидрофильного растворителя, полярного растворителя, растворителя, смешивающегося с водой, и их сочетаний.

16. Способ по п.10, где указанный по меньшей мере один растворитель выбран из группы, состоящей из воды, забуференного фосфатом солевого раствора, этанола, 2-пропанола, 1-бутанола, 1-гексанола, ацетона, этилацетата, дихлорметана, диэтилового эфира, гексана, толуола и их сочетаний.

17. Способ по п.1, где указанное взаимодействие также включает добавление по меньшей мере одного белка, выбранного из коллагена и цитохрома С, к указанному по меньшей мере одному полисахариду и указанному по меньшей мере одному восстанавливающему сахару для образования композиционной поперечно сшитой матрицы.

18. Способ по п.17, где указанный коллаген выбран из природного коллагена, фибриллярного коллагена, фибриллярного ателопептидного коллагена, содержащего телопептид коллагена, лиофилизованного коллагена, коллагена, полученного из животных источников, коллагена человека, коллагена млекопитающего, рекомбинантного коллагена, пепсинизированного коллагена, восстановленного коллагена, бычьего ателопептидного коллагена, свиного ателопептидного коллагена, коллагена, полученного из видов позвоночных, генетически сконструированного или модифицированного коллагена, коллагена типов I, II, III, V, XI, XXIV, фибрил-связанных коллагенов типов IX, XII, XIV, XVI, XIX, XX, XXI, XXII и XXVI, коллагенов типов VIII и X, коллагенов типа IV, коллагена типа VI, коллагена типа VII, коллагенов типа XIII, XVII, XXIII и XXV, коллагенов типа XV и XVIII, искусственно полученного коллагена, производимого генетически модифицированными эукариотическими или прокариотическими клетками или генетически модифицированными организмами, очищенного коллагена и восстановленного очищенного коллагена, частиц фибриллярного коллагена, фибриллярного восстановленного ателопептидного коллагена, коллагена, выделенного из клеточной культуральной среды, коллагена, полученного из генетически сконструированных растений, фрагментов коллагена, протоколлагена и любых их сочетаний.

19. Способ по п.1, где указанное взаимодействие включает добавление по меньшей мере одной добавки к указанному по меньшей мере одному полисахариду и указанному по меньшей мере одному восстанавливающему сахару для образования поперечно сшитой матрицы, содержащей указанную по меньшей мере одну добавку.

20. Поперечно сшитый полисахарид, полученный способом по п.1.

21. Способ получения поперечно сшитых полисахаридов, содержащий стадии:
взаимодействия полисахарида с одним или несколькими реагентами до образования производной формы указанного полисахарида, причем указанная производная форма представляет собой амино-полисахарид или амино-функционализированный полисахарид, содержащие одну или более аминогрупп, которые способны быть поперечно сшитыми восстанавливающим сахаром, и
поперечной сшивки указанного производного полисахарида с по меньшей мере одним восстанавливающим сахаром до образования поперечно сшитого полисахарида.

22. Способ по п.21, где указанные аминогруппы выбраны из первичных аминогрупп и вторичных аминогрупп.

23. Способ по п.21, где указанный один или несколько реагентов содержат карбодиимид.

24. Способ по п.21, где указанный один или несколько реагентов содержат карбодиимид в присутствии дигидразида адипиновой кислоты.

25. Способ по п.23, где указанный карбодиимид является гидрохлоридом 1-этил-3-(диметиламинопропил)карбодиимида.

26. Способ по п.21, где указанный по меньшей мере один восстанавливающий сахар выбран из альдозы, кетозы и их сочетаний.

27. Способ по п.21, где указанный по меньшей мере один восстанавливающий сахар выбран из глицеральдегида, рибозы, эритрозы, арабинозы, сорбозы, фруктозы, глюкозы, D-рибоза-5-фосфата, глюкозамина, диозы, триозы, тетрозы, пентозы, гексозы, септозы, октозы, нанозы, декозы, глицерозы, треозы, ликсозы, ксилозы, аллозы, альтрозы, маннозы, гулозы, идозы, галактозы, талозы, восстанавливающего моносахарида, восстанавливающего дисахарида, восстанавливающего трисахарида, восстанавливающего олигосахарида, производных форм олигосахаридов, производных форм моносахаридов, сложных эфиров моносахаридов, сложных эфиров олигосахаридов, солей моносахаридов, солей олигосахаридов, мальтозы, лактозы, целлобиозы, генциобиозы, мелибиозы, туранозы, трегалозы, изомальтозы, ламинарибиозы, маннобиозы и ксилобиозы и их сочетаний.

28. Способ получения композиционной поперечно сшитой матрицы, включающий поперечную сшивку с по меньшей мере одним восстанавливающим сахаром по меньшей мере одного полисахарида, выбранного из амино-полисахарида, амино-функционализированного полисахарида, содержащих одну или более аминогрупп, которые способны быть поперечно сшитыми восстанавливающим сахаром, и их сочетаний, в присутствии по меньшей мере одного поперечно сшиваемого белка, выбранного из коллагена и цитохрома С, до образования указанный композиционной поперечно сшитой матрицы.

29. Поперечно сшитая композиционная матрица, полученная способом по п.28.