Мутантная форма пероксидазы хрена

Изобретение относится к области биохимии. Представлена мутантная пероксидаза хрена, характеризующаяся аминокислотной последовательностью, соответствующей аминокислотной последовательности пероксидазы хрена дикого типа с заменой остатка фенилаланина в положении 142 на остаток тирозина. Изобретение позволяет снизить предел обнаружения пероксидазы хрена в ходе анализа. 3 ил., 1 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к области генной и белковой инженерии и может быть использовано в анализах различного назначения, основанных на определении пероксидазной активности.

Пероксидаза катализирует окисление люминола в присутствии пероксида водорода с испусканием света. Такая реакция используется в биолюминесцентных методах анализа. В настоящее время наиболее распространенной пероксидазой для таких анализов является пероксидаза из корней хрена (Kricka L.J. (2000) Application of bioluminescence and chemiluminescence in biomedical sciences. Methods Enzymol. 305, 333-345).

Рекомбинантная пероксидаза хрена может производиться в подходящих рекомбинантных растениях (хрен, томаты, кукуруза) в виде гетерогенно-гликозилированной формы за счет суперпродукции. Также известна негликозилированная рекомбинантная пероксидаза хрена, полученная путем экспрессии в клетках Е.соli. В таком случае выход активной пероксидазы составляет порядка 50%.

Техническая задача, решаемая настоящим изобретением, состоит в получении нового белка, а именно мутантной формы рекомбинантной пероксидазы хрена, у которой стабильность в хемилюминесцентной реакции окисления люминола значительно выше, чем у рекомбинантной немутантной формы этого фермента.

Технический результат, получаемый при использовании полученной мутантной формы рекомбинантной пероксидазы хрена, состоит в значительном снижении предела обнаружения пероксидазы хрена в ходе анализа, что обеспечит коммерциализацию его как более стабильного реагента применительно к хемилюминесцентным методам анализа.

Для достижения указанного технического результата предложено ввести нуклеотидную замену в последовательность кДНК, кодирующую аминокислотную последовательность пероксидазы хрена, в результате чего происходит замена остатка фенилаланина в положении 142 в аминокислотной последовательности фермента на остаток тирозина (фиг.1). В таком случае получаемая мутантная пероксидаза хрена сохраняет исключительно высокую стабильность в реакции хемилюминесцентного окисления люминола, в то время как активность в реакции люминесценции существенно не уменьшается.

Сущность изобретения заключается в следующем. Введение нуклеотидных замен в гене пероксидазы хрена, обеспечивающих замену Phe142Tyr в аминокислотной последовательности фермента, осуществляют с использованием одного из известных специалистам методов направленного мутагенеза. Для последующей трансформации используют полученные плазмиды с введенными нуклеотидными заменами и рекомбинантные штаммы E.coli. Следующим этапом является культивирование трансформированных клеток E.coli до середины логарифмической фазы роста, после чего добавляют индуктор экспрессии гена пероксидазы и продолжают культивирование в течение 3 часов. Для выделения пероксидазы из телец включения полученную биомассу разрушают ультразвуком, центрифугируют, отмывают примесные белки солевым раствором, и солюбилизируют в мочевине. После чего проводят процедуру реактивации солюбилизированной пероксидазы, т.н. рефолдинг. Для этого готовят рефолдинг-среду, содержащую гемин, хлорид кальция и другие компоненты для обеспечения искусственного фолдинга активного фермента. По окончании реактивации рефолдинг-среду концентрируют с использованием ультрафильтрации или любого другого метода, позволяющего уменьшить объем раствора. Полученный препарат очищают с использованием хроматографии, в частности гель-фильтрации. Полученный препарат характеризуется RZ=1,9, удельной активностью по ABTS 1000 Е/мг (табл. 1) и аминокислотной последовательностью, изображенной на фиг. 2.

Сущность разработанного технического решения в дальнейшем будет раскрыта с использованием примера получения и примера использования мутантной формы пероксидазы хрена.

Пример 1.

Направленный мутагенез и получение мутантной пероксидазы хрена с заменой Phe142Thr

Для получения мутантной пероксидазы хрена с заменой Phe142Thr использовали плазмиду pSA 261, содержащую синтетический ген пероксидазы хрена дикого типа. Создание гена и плазмид описано в Европейском патенте ЕР 0299682, 1988 г.

Мутанты пероксидазы хрена получали методом направленного мутагенеза одноцепочечной ДНК. Для проведения сайт-специфического мутагенеза исходная плазмида pSA 261 была рестрицирована HpaI и XbaI, и фрагмент гена пероксидазы размером 0,7kb выделен и клонирован в фаговый вектор М13ВМ20 по сайтам XbaI и HincII.

Для достраивания второй цепи ДНК был применен набор фирмы Amersham для сайт-специфичного мутагенеза и олигонуклеотидные праймеры, несущие точечные мутации. Для получения мутации Phe142Tyr были синтезированы праймеры:

5'-AAATCTACCGGCGCCATATTTCACTCTACCACAAC-3' - прямой и 5'-GTTGTGGTAGAGTGAAATATGGCGCCGGTAGATTT-3' - обратный, имеющие в области мутации сайт рестрикции Bsp119-I, обеспечивающий первичную селекцию мутанта. После достраивания второй цепи ДНК, исходная первая цепь была разрушена, а новая вторая упакована в фаги и высеяна. Отбор фагов осуществлен по появлению или соответственно исчезновению сайтов рестрикции, и ДНК мутантных фагов рестрицирована по NruI и XbaI и клонирована в плазмиду pSA 261, рестрицированную по тем же сайтам.

Отбор клонов с плазмидой, несущей мутацию, осуществляли рестрикционным анализом. Плазмиды были выделены в препаративном количестве и проанализированы рестрикцией BspHI, Bsp119-I и SacI.

Для проведения секвенирования больший SacI фрагмент гена пероксидазы (0,7 kb) клонирован в фаг М13 и считан в двух направлениях. Оба праймера были синтезированы на синтезаторе 380В фирмы Allpied Biosystems, и конечные конструкции были секвенированы на секвенаторе 370А той же фирмы, используя Taq-полимеразу и меченые красителями праймеры. Полученная плазмида, содержащая мутацию, была использована для трансформации штамма E.coli JM 109.

Для получения биомассы клеток с рекомбинантной мутантной пероксидазой хрена единичную колонию трансформированных клеток Е. coli JM 109 помещали в 3 мл среды 2YT (16 г/л бактотриптона, 10 г/л дрожжевого экстракта и 5 г/л хлорида натрия, рН 7,0) в присутствии 40 мкг/мл ампициллина в течение ночи при 37°С и 180 об/мин. Далее из этой пробирки отбирали 1 мл культуральной жидкости и помещали в 200 мл той же среды, находящейся в качалочной колбе объемом 1 л. Культивирование проводили при 37°С и 100 об/мин. Клетки доращивали до начала логарифмической фазы и затем проводили индукцию экспрессию гена пероксидазы добавлением в среду ИПТГ (Изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид) до конечной концентрации 0,2 мМ. Далее температуру понижали до 34°С и культивировали клетки в течение 3 часов. Биомассу собирали центрифугированием при 5000 g на центрифуге фирмы "Eppendorf" 5403. Затем клетки ресуспендировали в 2 М растворе NaCl, содержащем 10 мМ дитиотреитола (ДТТ), и разрушали ультразвуком в течение 10 мин при 22 кГц. Смесь после разрушения оставляли на 1,5 ч при комнатной температуре, и затем повторяли обработку ультразвуком. Надосадочную жидкость удаляли, осадок промывали 10 мл 0,05 М буфера Трис-HCl, рН 8,5, и солюбилизировали в 10 мл 6 М мочевины, содержавшей 1 мМ ДТТ (дитиотреитол). Солюбилизированный апобелок (95% чистоты) приливали по каплям к среде для рефолдинга (100 мл) и инкубировали при 4°. Среда для рефолдинга содержала оптимизированные концентрации мочевины (2 М), окисленного глутатиона (0,7 мМ), ДТТ (0,1 мМ), а также 5 мМ СаСl2, 5 мкМ гемина, 5% глицерина в 50 мМ буфере Трис-HCl, рН 8,5. В процессе инкубации измеряли активность по АБТС. После прекращения роста активности раствор фермента концентрировали в 30 раз на ячейке Amicon объемом 50 мл через мембрану YM-10. Полученный концентрированный раствор фермента наносили порциями по 3 мл на колонку Toyopearl HW 55 уравновешенным 50 мМ буфером Трис-HCl, рН 8,5. Фракции с RZ>2,7 отбирали, а остальные активные фракции подвергали концентрированию и повторной гельфильтрации. Фракции, содержащие активный фермент, объединяли и концентрировали. Чистота полученных препаратов контролировалась значением RZ и электрофоретически. Сравнение данных электрофореограмм очищенных рекомбинантных пероксидазы хрена дикого типа и мутантной формы Phe142Tyr в присутствии белков-маркеров молекулярного веса выявило чистоту порядка 95% и молекулярный вес 36 кДа для обеих форм.

Пример 2.

Свойства мутантной пероксидазы хрена и фермента дикого типа в реакции хемилюминесцентного окисления люминола.

Свойства нового мутанта пероксидазы хрена Phe142Tyr сравнивали с таковыми для рекомбинантной пероксидазы хрена дикого типа. Оптимальные условия катализа окисления люминола не отличаются для обеих форм пероксидазы хрена, а стабильность сигнала в случае мутанта значительно выше (фиг. 3), что обеспечивает более высокую чувствительность определения.

Таблица 1.
Выделение мутантной формы пероксидазы хрена Phe142Tyr.
Стадия очистки Общий белок, мг Общая активность, Е Удельная активность, Е/мг Выход по активности, % Степень очистки, разы Реакти-вация, % RZ
Солюбилизация в 6М мочевине 13 - 0 0 - - -
Реактивация 13 2730 210 100 1 - 0,8
Ультрафильтрация 10 2730 270 100 1,3 - 1,18
Гель-фильтрация 2,3 2100 910 77 4,3 - 1,73
Ультрафильтрация 2,3 2100 910 77 4,3 - 1,73
Гель-фильтрация 1,9 1900 1000 70 4,8 12 1,9

Мутантная пероксидаза хрена, характеризующаяся аминокислотной последовательностью, соответствующей аминокислотной последовательности пероксидазы хрена дикого типа с заменой остатка фенилаланина в положении 142 на остаток тирозина.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии. .

Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано в медицине при определении наследственной предрасположенности к развитию заболеваний, ассоциированных с носительством полиморфных вариантов гена тиоредоксинредуктазы-1.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано в медицине при определении наследственной предрасположенности к развитию заболеваний, ассоциированных с носительством полиморфных вариантов гена пероксиредоксина-1.

Изобретение относится к биотехнологии, к способу получения полиненасыщенных жирных кислот в семени трансгенного растения. .

Изобретение относится к области биохимии. .

Изобретение относится к области генной и белковой инженерии. .

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой клетку мицелиального гриба, принадлежащего к роду Penicillium, трансформированную плазмидой. .

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения L-аминокислоты с использованием бактерии рода Escherichia, причем бактерия модифицирована таким образом, что активность алкогольдегидрогеназы, кодируемой геном adhE, у этой бактерии увеличена.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой мутантную пероксидазу табака, характеризующуюся аминокислотной последовательностью, соответствующей аминокислотной последовательности пероксидазы табака Nicotiana tabacum, в которой остаток треонина в положении 151 замещен остатком триптофана.

Изобретение относится к области биотехнологии

Изобретение относится к области биохимии

Изобретение относится к области генной инженерии и может быть использовано для детекции D-аминокислот в сложных образцах и в процессах ферментативного синтеза оптически активных веществ, альфа-кетокислот, цефалоспориновых антибиотиков и других органических соединений с использованием оксидаз. Получены новые мутантные формы оксидазы D-аминокислот из дрожжей Trigonopsis variabilis. В качестве исходного фермента использована мутантная оксидаза D-аминокислот из дрожжей Trigonopsis variabilis с заменой Cys108Phe. Предложенные новые мутантные формы отличаются тем, что аминокислотный остаток фенилаланина в положении, соответствующем положению 54 в последовательности вышеуказанной оксидазы D-аминокислот, замещен одним из следующих остатков - тирозина или серина. Изобретение позволяет получить мутантные оксидазы D-аминокислот, характеризующиеся улучшенными по сравнению с исходным мутантом и соответствующим ферментом дикого типа каталитическими свойствами. 2 н.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл., 4 пр.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложена клетка мицелиального гриба Penicillium canescens со снятой катаболитной репрессией и арабинозной индукцией, продуцирующая ксиланазу и лакказу. Клетка трансформирована плазмидой, содержащей промотор гена bgaS, лидерный пептид bgaS, фрагмент ДНК, кодирующий ксиланазу, терминатор bgaS, ген β-лактамазы и репликон pMB1, и плазмидой, содержащей промотор гена bgaS, лидерный пептид bgaS, фрагмент ДНК, кодирующий лакказу, терминатор bgaS, ген β-лактамазы и репликон pMB1. Предложен также способ ферментного препарата ксиланазы и лакказы с использованием указанной клетки Penicillium canescens. Группа изобретений обеспечивает повышение выхода целевых ферментов. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 9 ил., 3 табл., 4 пр.

Изобретение относится к области генной инженерии и может быть использовано в процессах синтеза оптически активных соединений или физиологически активных веществ, детекции формиата, а также для получения стрессоустойчивых растений. Изобретение представляет собой четыре новые мутантные формы растительной формиатдегидрогеназы (ФДГ). В первом из предложенных мутантных белков природный остаток фенилаланина в положении, соответствующем положению 290 в последовательности формиатдегидрогеназы из сои Glycine max, заменен на остаток аланина. Во второй мутантной форме фермента этот же природный остаток фенилаланина 290 заменен на остаток тирозина, в третьей - на остаток треонина и в четвертой - на остаток глутамина. Изобретение позволяет получить формиатдегидрогеназы, обладающие улучшенными свойствами по сравнению как с ферментом дикого типа, так и с ранее описанными его мутантными формами 4 н.п. ф-лы, 2 табл., 5 пр.

Изобретение относится к области генной инженерии и представляет собой две новые мутантные формы растительной формиатдегидрогеназы (ФДГ), обладающие повышенной термостабильностью по сравнению с исходным белком. В мутантных белках природный остаток аланина в положении, соответствующем положению 267 в исходной последовательности формиатдегидрогеназы из сои Glycine max, заменен на остаток метионина. Кроме того, в одном из мутантов доподнительно природный остаток изолейцина в положении 272 заменен на остаток валина. Изобретение позволяет получить формиатдегидрогеназы с повышенной температурной стабильностью. 2 н.п. ф-лы, 2 табл., 4 пр.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и представляет собой очищенную рекомбинантную уратоксидазу (уриказу), характеризующуюся содержанием тетрамеров и октамеров 95% и более от общего количества её молекул. Изобретение также раскрывает очищенный препарат указанной уратоксидазы, обладающий сниженной иммуногенностью, конъюгат указанной уратоксидазы с полиэтиленгликолем или полиэтиленоксидом, используемый для снижения уровней мочевой кислоты в ткани или жидкости организма млекопитающего, очищенные фрагменты указанной уратоксидазы, фармацевтическую композицию, содержащую указанную уратоксидазу, и способ очистки указанной уратоксидазы с сохранением её уриколитической активности, включающий выделение и удаление агрегатов уриказы крупнее октамеров. Настоящее изобретение позволяет получить препараты уратоксидазы со сниженной иммуногенностью. 8 н. и 15 з.п. ф-лы, 6 ил., 6 пр.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к изолированной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий дельта-9-элонгазной активностью, а также к очищенному полипептиду, обладающему дельта-9-элонгазной активностью, кодируемому вышеуказанной изолированной молекулой нуклеиновой кислоты. Раскрыты вектор экспрессии, содержащий вышеуказанную изолированную молекулу нуклеиновой кислоты, а также клетка-хозяин, трансгенное растение и трансгенное семя, его содержащие. Изобретение позволяет эффективно получать масла, обогащенные ненасыщенными полимерными жирными кислотами. 8 н. и 10 з.п. ф-лы, 9 ил., 9 табл., 6 пр.
Наверх