Способ быстрого определения типа крови человека ав0/rh/mn и тест-набор для него
Изобретение относится к способам быстрого определения типа человеческой крови AB0/Rh/MN и тест-набор для него. Тест-набор состоит из полоски для анализа, раствора для промывания и приспособлений для отбора крови. Полоска для анализа состоит из прокладки для промывания, прокладки для нанесения, упругой прокладки, адсорбирующей прокладки, водоустойчивой липкой ленты и полиэфирной пластинки в качестве подложки, где прокладка для промывания, прокладка для нанесения, упругая прокладка и адсорбирующая прокладка, образующие полоску для анализа, выполнены из пористого полимерного материала, имеющего подходящий размер пор, чтобы пропустить по меньшей мере один эритроцит. Сущность способа: подлежащий анализу образец крови наносят на полоску для анализа, предварительно покрытую антителами анти-А или анти-В, или анти-М, или анти-N, промывающий раствор наносят каплями на один конец полоски для анализа и затем определяют группу крови в образце крови по наличию агглютинировавших эритроцитов, оставшихся на местах реакции. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 5 ил., 4 пр.
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к способу быстрого определения групп человеческой крови AB0/Rh/MN и тест-набору для него.
Предшествующий уровень техники
Типирование крови представляет собой общепринятый технический прием для определения группы красных клеток (эритроцитов) крови человека согласно соответственно системе АВ0 с четырьмя различными группами: A, B, AB и 0, согласно системе Rh (резус-фактор) и системе групп крови МN. Обычная процедура идентификации группы крови состоит в смешивании подлежащих определению эритроцитов с реагентом, содержащим специфичные для группы крови антитела, и после осуществления реакции в определении группы крови эритроцитов путем наблюдения появления агглютинации эритроцитов. Такая процедура включает, во-первых, выделение эритроцитов из сыворотки пациента, затем смешивание подходящего количества эритроцитов с соответствующими тестовыми растворами, помещенными в пробирку или на предметное стекло (содержащими сыворотку соответственно анти-A, анти-B, анти-D, анти-M или анти-N), по усмотрению добавление реагентов, способствующих иммунной реакции, инкубацию реакционных смесей, затем центрифугирование и перемешивание реакционных смесей с последующим наблюдением появления агглютинации эритроцитов.
Например, если агглютинация происходит в присутствии реагента анти-A, но не происходит в присутствии реагента анти-B, тогда образец крови идентифицируется как группа крови A. Если агглютинация эритроцитов происходит в присутствии реагента анти-B, но никакой агглютинации не наблюдается в присутствии реагента анти-A, тогда образец крови идентифицируется как группа крови B. Если агглютинация эритроцитов происходит как в присутствии реагента анти-A, так и в присутствии реагента анти-B, тогда образец крови идентифицируется как группа крови AB. Если никакой реакции агглютинации не происходит в присутствии реагента анти-A или в присутствии реагента анти-B, тогда образец крови идентифицируется как группа крови 0. Если агглютинация эритроцитов происходит в присутствии реагента анти-D, тогда образец соответствует Rh-положительной группе крови (положительной по резус-фактору), в ином случае это Rh-отрицательная группа крови. Для системы групп крови MN образец может быть обозначен как принадлежащий к группе крови М, N или MN, в соответствии с наличием агглютинации эритроцитов.
Существующие технологии, используемые для определения групп крови человека AB0/Rh/MN, можно разделить на два типа. Первый тип основан на обнаружении антигена группы крови, связанного с клеточной мембраной, и включает анализ солевой агглютинации эритроцитов, анализ нейтрализации, анализ адсорбции, анализ диссоциации и реакцию смешанной агглютинации. Второй тип основан на прямом обнаружении свободного антигена группы крови и включает реакцию совместной агглютинации и радиоиммунный анализ.
В настоящее время общепринятым является использование анализа солевой агглютинации эритроцитов, причем группа испытуемой крови определяется по агглютинации эритроцитов, индуцированной связыванием известных антител IgM или IgG с антигеном группы крови на поверхности свежих эритроцитов. Эта процедура широко используется для определения группы крови (типирования крови) для переливания крови в клинике. Однако для этой процедуры требуются соответствующие реагенты, которые нужно хранить при пониженной температуре, и, кроме того, полученный результат трудно подтвердить.
Другие процедуры определения группы крови имеют различные недостатки. Например, анализ нейтрализации проводится в течение длительного времени и имеет низкую чувствительность. Для проведения анализа диссоциации и реакции смешанной агглютинации требуется высокая квалификация операторов, оптимизация каждого определения сложна, и их чувствительность низка. Реакция совместной агглютинации включает для определения группы крови в исследуемом образце сенсибилизацию белка А клеток Staphylococcus aureus (SPA) антителами IgG с последующим наблюдением агглютинации Staphylococcus aureus, причем для этой процедуры необходим сложный режим хранения реагентов. Радиоиммунный анализ и ELISA имеют высокую чувствительность, но требуют длительного времени проведения теста и поэтому непригодны для одиночных образцов или для определения на месте.
В итоге для обычно используемых способов клинического определения группы крови характерны различные проблемы - такие, как длительное время проведения, большие затраты труда, субъективный результат с большими отклонениями и возможность загрязнения примесями. Поэтому необходимо существенно улучшить существующие способы определения групп крови.
Сущность изобретения
Одна из задач настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить способ определения групп человеческой крови AB0/Rh/MN, включающий следующие этапы: капельное нанесение подлежащего определению образца крови на полоску для анализа (тестовую полоску), предварительно покрытую антителами к группам крови анти-A или анти-B, или анти-D, или анти-M, или анти-N, нанесение по каплям промывающего раствора на один конец полоски так, чтобы перенести вместе с промывающим раствором неагглютинировавшие эритроциты вдоль полоски прочь от места нанесения, при этом позволить агглютинировавшим с антителами эритроцитам остаться на месте нанесения, затем определение группы крови в испытуемом образце в соответствии с присутствием агглютинировавших эритроцитов на месте нанесения.
Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения объем образца крови, нанесенного капельно на полоску для анализа, может быть всего лишь 1-10 мкл. Указанный промывающий раствор - это 10 мМ фосфатно-буферный солевой раствор (PBS), солевой физиологический раствор или иной изотонический раствор. Указанный подлежащий определению образец крови наносится каплей на прокладку для нанесения на полоске для анализа.
Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения способ иммобилизации антител к группам крови может быть основан, например, на физической адсорбции или на химической сшивке.
Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения указанным подлежащим определению образцом крови могут быть эритроциты или цельная кровь, или суспензия эритроцитов или цельная кровь, разбавленные изотоническим раствором - таким, как солевой физиологический раствор или фосфатно-буферный солевой раствор. Кроме того, указанный образец крови включает частично гемолизированный образец крови и обогащенный липидом образец крови.
Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения результаты анализа могут быть определены визуально или с помощью устройства для регистрации фото- или электрического сигнала.
Вкратце, образец крови вступает в контакт и реагирует с прокладкой для нанесения, на которой иммобилизованы антитела к соответствующей группе крови, то есть образец крови претерпевает реакцию иммунологического связывания с соответствующими антителами на прокладке для нанесения. После промывания раствором для промывания образец крови, претерпевший реакцию иммунологического связывания, остается на прокладке, и место нанесения имеет выраженный красный цвет, тогда как образец крови, не претерпевший реакции иммунологического связывания, отмывается промывающим раствором с прокладки для нанесения, и поэтому на месте нанесения красное окрашивание отсутствует. Таким образом, группу крови AB0/Rh/MN в образце крови можно определить по наличию иммунологической реакции между эритроцитами в образце и антителами к группе крови, что устанавливается по появлению красного вещества на прокладке для нанесения вследствие иммунной реакции между эритроцитами и антителами к соответствующей группе крови.
Другая цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить тест-набор, используемый для осуществления указанного выше способа определения, который состоит из полоски для анализа, раствора для промывания и приспособления для отбора крови, причем полоска для анализа состоит из прокладки для промывания, прокладки для нанесения, упругой прокладки (подушечки), адсорбирующей прокладки, водоустойчивой липкой ленты и полиэфирной пластинки в качестве подложки.
Краткое описание рисунков
Фиг.1 показана типичная полоска для быстрого определения групп крови AB0 в тест-наборе для определения групп крови согласно настоящему изобретению.
Фиг.2 показана деталировка, дополнительно иллюстрирующая полоску для быстрого определения групп крови АВ0 в тест-наборе для определения групп крови согласно настоящему изобретению, которая включает прокладку для промывания 1, водоустойчивую липкую ленту 2, прокладку для нанесения 3 с зафиксированными на ней антителами к группе крови, упругую прокладку 4, адсорбирующую прокладку 5 и полиэфирную пластинку в качестве подложки 6.
Фиг.3 показана типичная полоска для быстрого определения группы крови Rh в тест-наборе согласно настоящему изобретению, которая содержит прокладку для промывания 1, водоустойчивую липкую ленту 2, прокладку для нанесения 3 с зафиксированными на ней антителами анти-D, упругую прокладку 4 и адсорбирующую прокладку 5.
Фиг.4 показана типичная полоска для быстрого определения групп крови MN в тест-наборе для определения групп крови согласно настоящему изобретению
Фиг.5 показана схема реакции после нанесения капли позитивного образца крови на прокладку из стекловолокна с фиксированными на ней антителами к группе крови, где 1 обозначает эритроциты, 2 обозначает антитела к группе крови, а 3 обозначает прокладку для нанесения из стекловолокна.
Детальное описание изобретения
Настоящее изобретение имеет отношение в способу быстрого определения групп крови AB0/Rh/MN в подлежащем анализу образце человеческой крови и тест-набору для него.
В первом аспекте настоящее изобретение предоставляет способ определения групп крови AB0/Rh/MN в подлежащем анализу образце человеческой крови, включающий следующие этапы: капельное нанесение подлежащего определению образца крови на полоску для анализа с предварительно фиксированными на ней антителами к группам крови анти-A или анти-B, или анти-D, или анти-M, или анти-N, нанесение по каплям промывающего раствора на один конец полоски так, чтобы перенести неагглютинировавшие эритроциты вместе с промывающим раствором вдоль полоски прочь от места нанесения, при этом позволить агглютинировавшим с антителами эритроцитам остаться на месте нанесения, затем определение группы крови в испытуемом образце в соответствии с присутствием агглютинировавших эритроцитов на месте реакции.
Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения указанным подлежащим определению образцом крови могут быть эритроциты или цельная кровь, или суспензия эритроцитов или цельная кровь, разбавленные изотоническим раствором - таким, как солевой физиологический раствор или фосфатно-буферный солевой раствор (PBS). Кроме того, указанный образец крови может включать частично гемолизированный образец крови и обогащенный липидом образец крови.
Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения объем образца крови, нанесенного каплей на полоску для анализа, не превышает 10 мкл. Указанный промывающий раствор - это 10 мМ фосфатно-буферный солевой раствор, солевой физиологический раствор или иные растворы.
Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения способ фиксирования антител к группам крови может быть основан, например, на физической адсорбции или на химической сшивке.
В следующем аспекте настоящее изобретение предоставляет тест-набор, используемый для осуществления указанного выше способа определения, который состоит из полоски для анализа, раствора для промывания и приспособления для отбора крови, причем полоска для анализа состоит из прокладки для промывания, прокладки для нанесения, упругой прокладки, адсорбирующей прокладки, водоустойчивой липкой ленты и полиэфирной пластинки в качестве подложки (см. фиг.1).
Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения указанные прокладка для промывания, прокладка для нанесения, упругая прокладка и адсорбирующая прокладка могут быть сделаны из пористых полимерных материалов с порами определенного размера - таких, как стекловолокно, в которых размер пор позволяет проходить сквозь них по меньшей мере одиночному эритроциту. Что касается выбранного материала, прокладку для промывания, прокладку для нанесения и упругую прокладку иногда одинаково называют прокладкой из стекловолокна.
Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения подлежащий анализу образец крови наносят капельно на прокладку для нанесения, а указанный раствор для промывания наносят на прокладку для промывания. Прокладка для нанесения - это пористая подложка с фиксированными на ней антителами к группе крови. Кроме того, способ фиксирования антител к группам крови может быть основан, например, на физической адсорбции или на химической сшивке.
Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения указанным образцом крови может быть частично гемолизированный образец крови или обогащенный липидом крови образец крови.
Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения результаты анализа могут быть определены визуально или с помощью устройства для регистрации и прочтения фотографического или электрического сигнала. Конкретно, при использовании набора согласно настоящему изобретению процедура определения групп человеческой крови AB0/Rh/MN включает:
1) Прямое или непрямое фиксирование антител к группам человеческой крови AB0/Rh/MN на прокладке для нанесения 3 (фиг.2): фиксирование антител к группе крови на прокладке из стекловолокна с определенным размером пор с использованием физической адсорбции или химической сшивки. Выбор физического или химического способа фиксирования мало влияет на биологическую активность антител. Кроме того, фиксированные антитела дополняют защищающим белок агентом, который может быть выбран из группы, состоящей из бычьего сывороточного альбумина, сыворотки теленка, пептона, сахарозы, поливинилпирролидона и их комбинации.
Разбавление моноклональных антител с высоким титром к группам человеческой крови AB0/Rh/MN 5 мМ фосфатно-буферным солевым раствором до нужного титра, добавление защитного агента для облегчения фиксирования и сохранности антител на прокладке из стекловолокна. В разбавленный раствор антител может быть добавлен усилитель реакции, чтобы способствовать последующей иммунной реакции. Нанесение разбавленных антител на предварительно активированную прокладку из стекловолокна в соотношении 1,5 мл раствора антител на прокладку из стекловолокна размером 5 см×5 см, сушка при 37°C и последующее хранение в герметичной емкости.
2) Капельное нанесение испытуемого образца на прокладку для нанесения 3, затем нанесение раствора для промывания на прокладку для промывания 2 (см. фиг.3). После нанесения образца и нанесения раствора для промывания происходит реакция иммунологического связывания и предъявляется результат.
3) После завершения реакции и дополнительного промывания определение группы крови в испытуемом образце по наличию окрашенного красным цветом остатка на прокладке для нанесения.
В случае полоски для анализа для определения групп крови АВ0, если после промывки по завершении реакции на прокладке для нанесения, содержащей антитела анти-A, остается значительное количество красного вещества, это указывает на то, что образец крови захвачен антителами анти-A и посредством этого между ними осуществляется реакция агглютинации (то есть положительная реакция); если на прокладке для нанесения, содержащей антитела анти-A, не остается заметного количества красного вещества, это означает, что между образцом крови и антителами анти-A реакция агглютинации не происходит (то есть реакция отрицательная); если на прокладке для нанесения, содержащей антитела анти-B, при промывке после завершения реакции остается значительное количество красного вещества, это указывает на то, что между образцом крови и антителами анти-B происходит реакция агглютинации; если на прокладке для нанесения, содержащей антитела анти-B, при промывке после завершения реакции не остается заметного количества красного вещества, это указывает на то, что между образцом крови и антителами анти-B реакция агглютинации не происходит. Таким образом, можно установить, что, согласно результатам испытания, образец крови, который дает реакцию агглютинации с антителами и анти-A, и анти-B, принадлежит к группе крови АВ; образец крови, который дает реакцию агглютинации только с антителами анти-A, принадлежит к группе крови А; образец крови, который дает реакцию агглютинации только с антителами анти-B, принадлежит к группе крови В; и образец крови, который не дает реакцию агглютинации с антителами анти-A или анти-B, принадлежит к группе крови 0.
В случае полоски для анализа для определения группы крови Rh, если после промывки по окончании реакции на прокладке для нанесения, содержащей антитела анти-D, остается значительное количество красного вещества, это указывает на то, что между образцом крови и антителами анти-D происходит реакция агглютинации; если же на прокладке для нанесения, содержащей антитела анти-D, не остается заметного количества красного вещества, это указывает на то, что между образцом крови и антителами анти-D реакция агглютинации не происходит. Таким образом, можно установить, что согласно результатам испытания образец крови, который дает реакцию агглютинации с антителами анти-D, принадлежит к Rh-положительной группе крови; тогда как образец крови, который не дает реакцию агглютинации с антителами анти-D, принадлежит к Rh-отрицательной группе крови.
В случае полоски для анализа для определения групп крови MN, если после промывки по окончании реакции на прокладке для нанесения, содержащей антитела анти-M, остается значительное количество красного вещества, это указывает на то, что образец крови захватывается антителами анти-M, в результате чего между ними происходит реакция агглютинации; если на прокладке для нанесения, содержащей антитела анти-M, не остается заметного количества красного вещества, это указывает на то, что между образцом крови и антителами анти-M реакция агглютинации не происходит; если на прокладке для нанесения, содержащей антитела анти-N, остается значительное количество красного вещества, это указывает на то, что между образцом крови и антителами анти-N происходит реакция агглютинации. Таким образом, можно установить, что согласно результатам испытания образец крови, который дает реакцию агглютинации с антителами и анти-М, и анти-N, принадлежит к группе крови MN; образец крови, который дает реакцию агглютинации только с антителами анти-M, принадлежит к группе крови М; а образец крови, который дает реакцию агглютинации только с антителами анти-N, принадлежит к группе крови N.
Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения указанная полоска для быстрого анализа состоит из подложки, прокладки для промывания, прокладки для нанесения, упругой прокладки, адсорбирующей прокладки и водоустойчивой липкой ленты. Прокладку для промывания, прокладку для нанесения, упругую прокладку, адсорбирующую прокладку и водоустойчивую липкую ленту последовательно накладывают на подложку. Край прокладки для нанесения перекрывает край прокладки для промывания, край упругой прокладки перекрывает край прокладки для нанесения, край адсорбирующей прокладки перекрывает край упругой прокладки, а водоустойчивую липкую ленту помещают на перекрывающиеся края прокладки для промывания и прокладки для нанесения так, чтобы предотвратить избыточное вытекание промывающего раствора из прокладки для нанесения. Подложка может быть выполнена (но не ограничивается этим) из полиэфирного материала.
Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения термин «фиксирование антител» эквивалентен термину «иммобилизация антител» и означает фиксирование (иммобилизацию) антител анти-A, или анти-B, или анти-D, или анти-M, или анти-N на подложке - такой, как прокладка из стекловолокна с определенным размером пор или на другой подложке с таким же размером пор, например, путем физической адсорбции или химической сшивки. Перед фиксированием антитела могут быть разбавлены в определенном соотношении, исходя из титра антител, так, чтобы получить необходимую концентрацию, которую можно использовать. Антитела могут быть зафиксированы на прокладке из стекловолокна (прокладке для нанесения), например, путем замачивания или равномерного нанесения, или распыления, затем они могут быть подвергнуты сушке из замороженного состояния или иной сушке. Указанные антитела могут быть предварительно обработаны глутаровым альдегидом в качестве сшивающего агента.
Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения указанным подлежащим анализу образцом крови могут быть эритроциты или цельная кровь, или суспензия эритроцитов, разбавленная изотоническим раствором - таким, как 10 мМ фосфатно-буферный солевой раствор (PBS) и солевой физиологический раствор (разбавление обычно до 2-50%). Для тест-набора согласно настоящему изобретению может быть также применим образец крови, частично гемолизированный или обогащенный липидом крови.
Подлежащий анализу образец цельной крови или клеток крови, разбавленный или неразбавленный, может быть нанесен на прокладку для нанесения с фиксированными на ней антителами к группе крови, после осуществления реакции иммунологического связывания прокладку для нанесения промывают раствором для промывания. Указанный раствор для промывания может быть 10 мМ фосфатно-буферным солевым раствором (PBS) или иным раствором. После осуществления иммунной реакции наличие агглютинировавших эритроцитов может быть легко установлено визуально или же результаты испытания образцов в смеси могут быть считаны с помощью устройства для регистрации и прочтения оптического или электрического сигнала.
Для определения групп крови АВ0 операции согласно настоящему способу могут быть осуществлены на двух полосках для анализа, которые раздельно и параллельно сформированы на одной и той же полиэфирной пластинке-подложке и на которых на прокладке для нанесения зафиксированы антитела к группам крови соответственно анти-A или анти-B.
Для определения групп крови MN операции согласно настоящему способу могут быть осуществлены на двух полосках для анализа, которые раздельно и параллельно сформированы на одной и той же полиэфирной пластинке-подложке и на которых на прокладке для нанесения зафиксированы антитела к группам крови соответственно анти-M или анти-N.
Тест-набор для быстрого определения групп крови AB0/Rh/MN согласно настоящему изобретению применим для скрининга групп крови в банке крови, полевых сборах крови и самостоятельного определения на дому групп крови ABO/Rh/MN. Быстрая и достоверная идентификация группы крови может быть достигнута при использовании быстрой иммунной реакции и простого способа считывания результатов. Настоящий способ легко осуществим, и нет необходимости ни в каких дополнительных реагентах - таких, как реагент с антиглобулином к человеческим белкам. В настоящем способе объем наносимого образца крови может быть не более 10 мкл, и общая длительность может не превышать 2 минут.
Способ быстрого определения групп человеческой крови AB0/Rh/MN согласно настоящему изобретению и тест-набор для него основаны на принципе иммунной хроматографии, в которой определение группы крови осуществляется по наличию красного вещества вследствие агглютинации эритроцитов в ходе реакции антигенов вещества группы крови с антителами. Настоящий способ легко осуществить, и он позволяет избежать различных недостатков, присущих существующим в данной области способам определения групп крови. Настоящий способ пригоден для анализа либо одиночного образца, либо многих образцов, особенно для определения групп крови AB0/Rh/MN в пункте сбора крови и при домашнем самостоятельном определении групп крови. В сочетании с подходящим устройством данный способ может быть использован для периодического быстрого популяционного скрининга групп крови AB0/Rh/MN в банке крови.
Примеры
Нижеследующие примеры предназначены для дополнительной иллюстрации настоящего изобретения, и эти примеры никоим образом не будут ограничивать настоящее изобретение. Любые изменения и модификации настоящего изобретения, сделанные специалистами в данной области, попадут в область охвата, содержащуюся в приложенной формуле, без отклонения от духа настоящего изобретения.
Пример 1: Приготовление полосок для анализа в тест-наборе для определения групп крови АВ0 и этапы их определения
(1) Фиксирование антител к группам крови (антитела анти-A, анти-B) на прокладке для нанесения:
Моноклональные антитела анти-A и анти-B с высоким титром (полученные от компании Changchun Brother Biotech Co., Ltd) были соответственно разбавлены 5 мМ фосфатно-буферным солевым раствором до 1 мл с конечным титром 64. К раствору разбавленных антител добавляли защитный раствор для фиксирования антител, состоящий из 5% бычьего сывороточного альбумина, 5% сахарозы, 5% ПВП (поливинилпирролидон) и 5% сыворотки теленка в PBS, так, чтобы способствовать фиксированию и сохранению антител на прокладке из стекловолокна. Разбавленные антитела напыляли на предварительно активированную прокладку из стекловолокна в соотношении 1,5 мл разбавленных антител на прокладку из стекловолокна размером 5 см×5 см, затем антитела высушивали при 37°C и хранили в герметичной упаковке.
(2) Сборка полосок для быстрого определения:
Прокладку для промывания из стекловолокна шириной 20 мм помещали на центр полиэфирной пластинки-подложки шириной приблизительно 5-10 см, затем по обеим сторонам последовательно накладывали прокладку для нанесения шириной 10 мм, упругую прокладку и адсорбирующую прокладку шириной 30 мм, и, наконец, перекрывающуюся часть прокладки для промывания и прокладки для нанесения фиксировали водоустойчивой липкой лентой так, чтобы наложенные прокладки не сползали и чтобы раствор для промывания не распределялся по поверхности. После этого полиэфирную подложку с наложенными на нее указанными прокладками разрезали на полоски шириной 5 мм и получали таким образом полоски для анализа длиной приблизительно 5-10 см и шириной приблизительно 5 мм (см. фиг.1 и 2).
(3) Анализ образца:
На прокладку для нанесения полоски для анализа наносили капельно 5 мкл образца цельной крови. После нанесения испытуемого образца на прокладку для промывания 2 медленно и с постоянной скоростью наносили пять капель раствора для промывания. После хроматографии раствора для промывания наблюдали цвет прокладки для нанесения. Если на прокладке для нанесения 3 остается значительное количество красного вещества, это указывает на положительную реакцию; если на прокладке для нанесения 3 не остается заметного количества красного вещества, это указывает на отрицательную реакцию. В сочетании со знанием о взаимосвязи антител групп крови АВ0 и реакции эритроцитов легко определить группу крови в испытуемом образце. В качестве альтернативы, красный остаток на прокладке для нанесения может быть определен с помощью системы регистрации фотосигналов или электрических сигналов, тогда результаты могут быть получены автоматически, что позволит проводить периодически быстрый скрининг (просмотр) групп крови АВ0 в образцах крови.
Пример 2: Приготовление полосок для анализа в тест-наборе для определения групп крови Rh и этапы их определения
(1) Фиксирование антител к группам крови (антитела анти-D) на прокладке для нанесения
Моноклональные антитела анти-D (полученные от фирмы MILLIPORE Corp.) были разбавлены 5 мМ фосфатно-буферным солевым раствором до 1 мл с конечным титром 32. К раствору разбавленных антител добавляли защитный раствор для фиксирования антител, состоящий из 5% альбумина, 5% сахарозы, 5% ПВП и 5% сыворотки теленка в PBS, так, чтобы способствовать фиксированию и сохранению антител на подложке из стекловолокна. Затем добавляли усилитель реакции (2% Твин 20 и 2% Тритон Х-100 в PBS), чтобы способствовать последующей иммунной реакции. Разбавленные антитела разбрызгивали на предварительно активированную прокладку из стекловолокна в соотношении 1,5 мл разбавленных антител на прокладку из стекловолокна размером 5 см×5 см, затем антитела высушивали при 37°С и хранили в герметичной упаковке (см. фиг.3).
Остальные этапы были такими же, как при приготовлении полосок для анализа в наборе для определения групп крови АВ0 и при проведении этапов определения.
Пример 3: Приготовление полосок для анализа в тест-наборе для определения групп крови MN человека и этапы их определения
Приготовление полосок для анализа в тест-наборе для определения групп человеческой крови MN и этапы их определения такие же, как при приготовлении полосок для анализа в тест-наборе для определения группы человеческой крови Rh и в этапах определения, за исключением того, что фиксированные на тестовой полоске антитела были заменены на антитела анти-M и анти-N (см. фиг.4).
Пример 4: Сравнение настоящего способа определения групп крови с существующими общепринятыми способами
Авторы провели определение групп крови у 1500 индивидуумов из основной популяции (доноры крови) с двойной шифровкой, используя общепринятые способы определения групп крови параллельно с предложенным способом определения и тест-набором для него. Результаты показывают, что результаты определения настоящим способом на 100% согласуются с результатами, полученными известным способом, основанным на агглютинации эритроцитов в суспензии. Более того, настоящий способ может быть применен к более широкому диапазону образцов - таких, как частично гемолизированные образцы крови и образцы крови, обогащенные липидом. Далее настоящий способ позволяет избавиться от недостатков, присущих существующему обычному способу клинической идентификации групп крови, - таких, как длительность операций, большие затраты труда, субъективность результатов с большой разницей результатов у разных операторов и возможность загрязнений.
1. Набор для осуществления способа определения групп крови человека AB0/Rh/MN, состоящий из полоски для анализа, раствора для промывания и приспособлений для отбора крови, где полоска для анализа состоит из прокладки для промывания, прокладки для нанесения, упругой прокладки, адсорбирующей прокладки, водоустойчивой липкой ленты и полиэфирной пластинки в качестве подложки, где прокладка для промывания, прокладка для нанесения, упругая прокладка и адсорбирующая прокладка, образующие полоску для анализа, выполнены из пористого полимерного материала, имеющего подходящий размер пор, чтобы пропустить по меньшей мере один эритроцит.
2. Набор по п.1, где образец крови наносят капельно на прокладку для нанесения с фиксированными на ней антителами к группе крови, а изотонический раствор для промывания наносят капельно на прокладку для промывания, затем наблюдают наличие агглютинировавших эритроцитов на прокладке для нанесения таким образом, чтобы определить группу крови в образце крови.
3. Способ определения групп крови человека AB0/Rh/MN с использованием набора по п.1, включающий стадии, на которых: капельно наносят образец крови на полоску для анализа, предварительно покрытую антителами анти-А, или анти-В, или анти-D, или анти-М, или анти-N, капельно наносят раствор для промывания на один конец полоски для анализа так, чтобы удалить неагглютинировавшие эритроциты вместе с раствором для промывания с места нанесения, и при этом позволить агглютинировавшим с антителами эритроцитам остаться на месте нанесения, и затем определяют группу крови в этом образце в соответствии с присутствием агглютинировавших эритроцитов на месте реакции.
4. Способ по п.3, где образцом крови могут быть эритроциты или цельная кровь, или же эритроциты или цельная кровь, разбавленные физиологическим солевым раствором или изотоническим фосфатно-буферным солевым раствором.
5. Способ по п.3, где образец крови может включать образец крови, частично гемолизированный или обогащенный липидами.
6. Способ по п.3, где антитела фиксированы на полоске для анализа с помощью физической адсорбции или химической сшивки.
7. Способ по п.3, где наличие агглютинации в месте реакции может быть определено визуально или путем использования устройства, регистрирующего оптический сигнал или электрический сигнал.
