Индикаторная полоска для жидкости и способ
Изобретение относится к биотехнологии. Предложена индикаторная полоска для количественного определения анализируемого вещества в жидкости и способ количественного определения с ее использованием. Индикаторная полоска включает электродный слой и подложку, содержащую канал на ней. Канал содержит первую зону, вторую зону и третью зону, которые расположены последовательно. Первое антитело локализовано в первой зоне. Сахарид и пероксидаза локализованы в первой или второй зоне. Второе антитело, предназначенное для распознавания антигенной детерминанты, отличающейся от антигенной детерминанты того же антигена, распознаваемого первым антителом, иммобилизировано во второй зоне. Реагент подложки, включающий сахаридоксидазу, локализован в третьей зоне. 2 н. и 19 з.п. ф-лы, 10 ил.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Область технического применения
Настоящее изобретение относится к индикаторным полоскам для жидкости и, в частности, к индикаторной полоске для жидкости для количественного анализа биологической жидкости.
2. Описание связанной области техники
В традиционных количественных биохимических анализах обычно используется специфический фермент, который реагирует со специфическим анализируемым веществом, а затем обнаруживается изменение химического или электрического свойства реагирующих веществ или продуктов реакции. Общепринятым, например, является определение концентрации глюкозы в биологической жидкости путем определения изменения электрического напряжения или электрического тока, которое вызывается пероксидом водорода, образующимся в реакции глюкозы в биологической жидкости с глюкооксидазой, которая иммобилизированна на растворенных кислородных электродах. Затем вычисляется концентрация пероксида водорода, а затем для известной концентрации глюкооксидазы определяется концентрация глюкозы в биологической жидкости. Поскольку количество пероксида водорода, приводящее к изменению электрического напряжения или тока, относительно невелико, электрохимические анализы, такие как анализ, описанный выше, являются эффективными, если объем биологической жидкости невелик и определение происходит быстро. Однако такой анализ требует специфических ферментов для получения пероксида, который определяется, и поэтому он применим только для количественного анализа малых молекул, таких как глюкоза, холестерин, мочевина, креатинин и т.д.
Другой известный подход заключается в использовании уникальной способности иммунологических молекул к распознаванию, а также специфичному связыванию биологических молекул. Например, традиционный твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), который, как правило, проводится в 96-луночном планшете, отличается тем, что концентрация анализируемого вещества (т.е. антигена) определяется по интенсивности обнаруживаемого сигнала, который возникает в результате реакции между анализируемым веществом, соответствующими иммунологическими молекулами, ферментами и соответствующими реагентами. Однако пользователям обычно приходится осуществлять трудоемкий этап промывки на каждой стадии анализа для отмывки несвязанных и неспецифично связанных молекул с целью предотвращения неблагоприятного исхода анализа или в случае возникновения ложноположительных результатов.
С развитием технологий к настоящему времени, иммунологические аналитические испытания проводятся при помощи индикаторных полосок для жидкости, содержащих микрожидкостные каналы, позволяющие упростить или даже избежать сложные и неоднократные операции промывки, которые традиционно требуются в анализе после каждой стадии реакции. Однако неудобство известных индикаторных полосок для жидкости заключается в необходимости добавления вручную в индикаторную полоску для жидкости необходимых для реакции реагентов и подложек. Реагенты или подложки, требуемые для традиционных полосок, склонны к деградации при комнатной температуре или под действием света после длительного хранения, что приводит к погрешностям в анализе. Соответственно, такие реагенты необходимо хранить в специфических условиях, таких как, например, охлаждение или отсутствие доступа света. Следовательно, традиционные индикаторные полоски для жидкости, тем не менее, не удобны для применения и хранения.
Кроме того, традиционные индикаторные полоски для жидкости с каналами или микрожидкостными каналами имеют и другие недостатки. Поскольку указанные каналы или микрожидкостные каналы, как правило, ограничены непоглощающим материалом, а вязкость образца жидкости, который подвергается анализу, обычно высока для образцов, в основном состоящих из белков или углеводов, часть образца жидкости склонна к прилипанию к поверхности канала и не вступает в реакцию. Такой сценарий, в случае его реализации, не только приводит к неблагоприятной потере образца жидкости, подвергаемого анализу, но также пагубно влияет на точность количественных анализов.
Кроме того, традиционная индикаторная полоска для жидкости может способствовать течению образца жидкости посредством микрожидкостных каналов так, чтобы образец жидкости доставлялся в область реакции при помощи капиллярной силы, которая приводится в действие конструкциями указанных каналов. Другой альтернативный подход к доставке образца жидкости включает приложение движущей силы, например, посредством средств нагнетания, в момент введения образца жидкости в канал для перемещения по каналу в область реакции. Однако любой из вышеупомянутых подходов обладает тенденцией к возникновению пузырьков воздуха после введения образца жидкости в канал. Эти пузырьки как большие, так и малые блокируют канал и приводят к ошибочным результатам анализа.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Для устранения вышеупомянутых недостатков настоящее изобретение раскрывает индикаторную полоску для жидкости для количественного анализа образцов жидкости. Индикаторная полоска для жидкости содержит подложку, которая содержит, по меньшей мере, один канал. Канал содержит первую зону для вмещения образца жидкости, вторую зону и третью зону. Зоны расположены последовательно. Кроме того, канал содержит первое антитело, сахарид, пероксидазу, второе антитело и реагент подложки. Первое антитело локализовано в первой зоне для распознавания анализируемого вещества в образце жидкости. Сахарид и пероксидаза локализуются в первой зоне или во второй зоне. Второе антитело иммобилизировано во второй зоне для распознавания того же анализируемого вещества, которое распознается первым антителом. Тем не менее, второе антитело и первое антитело сконфигурированы для распознавания различных антигенных детерминант анализируемого вещества. Реагент подложки локализован в третьей зоне. Реагент подложки включает сахаридоксидазу. При введении образца жидкости в канал, первое антитело, сахарид и пероксидаза будут течь наряду с образцом жидкости. Часть общего количества пероксидазы, первого антитела и анализируемого вещества будет совместно связываться со вторым антителом и, таким образом, удерживаться во второй зоне. Несвязанная пероксидаза будет течь в третью зону наряду с образцом жидкости. Сахарид будет окисляться сахаридоксидазой с образованием пероксида водорода (Н2О2). Затем пероксид водорода будет реагировать с пероксидазой в третьей зоне, генерируя электрический сигнал.
Таким образом, первой целью настоящего изобретения является создание индикаторной полоски для жидкости, содержащей, главным образом, реагенты и материалы, требуемые для реакции в отсутствие сложных этапов.
Другая цель изобретения заключается в создании индикаторной полоски для жидкости, где реагенты и материалы, требуемые для реакции и содержащиеся в данной полоске, находятся преимущественно в сухом виде, и, таким образом, индикаторная полоска для жидкости может храниться в течение относительно длительного периода времени перед использованием, и в предотвращении погрешностей анализа, связанных с деградацией реагирующих веществ.
Другая цель настоящего изобретения заключается в создании индикаторной полоски для жидкости, которая является совместимой с существующим способом электрохимического обнаружения и имеет преимущества за счет быстроты обнаружения, высокой специфичности и высокой чувствительности.
Настоящее изобретение также раскрывает способ обнаружения для определения образца жидкости. Способ обнаружения включает следующие этапы. (1) Обеспечение образцом жидкости, содержащим анализируемое вещество. (2) Создание подложки. Подложка содержит, по меньшей мере, один канал, который включает первую зону, предназначенную для вмещения образца жидкости, вторую зону, предназначенную для доставки образца жидкости, и третью зону, где образец вступает в реакцию. Зоны расположены последовательно. Подложка также включает первое антитело, сахарид, пероксидазу, второе антитело и реагент подложки. Первое антитело локализовано в первой зоне для распознавания анализируемого вещества в образце жидкости. Сахарид и пероксидаза могут быть локализованы в первой или второй зоне. Второе антитело иммобилизировано во второй зоне для распознавания анализируемого вещества в образце жидкости. Второе антитело и первое антитело сконфигурированы для распознавания различных антигенных детерминант одного и того же анализируемого вещества в образце жидкости. Реагент подложки локализован в третьей зоне и включает сахаридоксидазу. (3) Введение образца жидкости в первую зону для того, чтобы позволить первому антителу, сахариду и пероксидазе течь наряду с образцом жидкости. (4) Связывание анализируемого вещества с первым антителом, вторым антителом и частью общего количества пероксидазы так, чтобы они удерживались во второй зоне. Сахарид, несвязанное первое антитело и несвязанная пероксидаза будут течь в третью зону наряду с образцом жидкости, где сахарид будет оксиляться сахаридоксидазой с образованием пероксида водорода (Н2О2). Образующийся пероксид водорода будет реагировать с пероксидазой, поступающей в третью зону, и, таким образом будет генерироваться электрический сигнал. (5) Обнаружение генерируемого электрического сигнала.
Таким образом, еще одной целью настоящего изобретения является создание способа обнаружения для количественного анализа, в котором используется индикаторная полоска для жидкости, содержащая, главным образом, реагирующие вещества и материалы, необходимые для реакции, так, чтобы результат анализа можно было бы получить путем непосредственного обнаружения сигнала реакции в отсутствие этапов, включающих сложные операции.
Другая цель настоящего изобретения заключается в создании способа обнаружения для количественного анализа, где используется индикаторная полоска для жидкости, в которой большая часть реагирующих веществ и материалов, необходимых для реакции, хранится в сухом виде так, чтобы индикаторную полоску для жидкости можно было бы хранить в течение относительно длительного периода времени перед использованием, и в предотвращении погрешностей анализа, связанных с деградацией реагирующих веществ.
Другая цель настоящего изобретения заключается в создании способа обнаружения, совместимого с существующими способами электрохимического обнаружения и обладающего преимуществами за счет быстроты обнаружения, высокой специфичности и высокой чувствительности.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Изобретение, а также предпочтительный способ его применения, другие цели и преимущества будут более понятны при отсылке к нижеследующему подробному описанию иллюстративных вариантов его осуществления при их прочтении в сочетании с сопроводительными иллюстрациями, где:
фиг.1А - перспективный вид индикаторной полоски для жидкости согласно первому варианту осуществления настоящего изобретения;
фиг.1В - схематическая иллюстрация, показывающая распределение реагирующих материалов в канале индикаторной полоски для жидкости по фиг.1;
фиг.1C-1E - схематические иллюстрации, показывающие изменения в распределении реагирующих материалов в канале индикаторной полоски для жидкости по фиг.1;
фиг.1F-1H - схематические иллюстрации, показывающие альтернативное изменение распределения реагирующих материалов в канале индикаторной полоски для жидкости по фиг.1;
фиг.1I - перспективный вид в разрезе индикаторной полоски для жидкости по фиг.1; и
фиг.2 - блок-схема способа определения согласно второму варианту осуществления настоящего изобретения.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Несмотря на то, что настоящее изобретение предлагает индикаторную полоску для жидкости и способ обнаружения с ее использованием, физические и химические принципы их биологического применения достаточно известны средним специалистам в данной области, и поэтому нет необходимости в их детальном обсуждении в данном описании. В то же время сопроводительные иллюстрации, к которым в нижеследующем описании делается отсылка, предусматриваются только с иллюстративными целями, и поэтому нет необходимости в приведении их в масштабе.
На фиг.1А представлен перспективный вид индикаторной полоски для жидкости согласно первому варианту осуществления настоящего изобретения. Индикаторная полоска 1 для жидкости включает подложку 10 и электродный слой 19, подложка 10 содержит предусматриваемый на ней канал 11. Канал 11 содержит первую зону 111, вторую зону 112 и третью зону 113. Зоны располагаются последовательно. Первая зона 111 предназначена для введения в нее образца жидкости.
На фиг.1В представлена схематическая иллюстрация, которая показывает распределение реагирующих материалов в канале 11 индикаторной полоски 1 для жидкости. Первая зона 111 содержит первое антитело 1111, сахарид 1112 и пероксидазу 1113. Вторая область 112 содержит иммобилизированное в ней второе антитело 1121. В частности, первое антитело 1111 и второе антитело 1121 сконфигурированы таким образом, чтобы они различали различные антигенные детерминанты одного и того же анализируемого вещества 1101 в образце жидкости. Так, первое антитело 1111 и второе антитело 1121 могут представлять собой как моноклональные антитела (mAb), так и поликлональные антитела (рАЬ) при условии, что первое антитело 1111 и второе антитело 1121 не будут конкурировать друг с другом за один и тот же антиген и, таким образом, препятствовать распознаванию антигена. Кроме того, первое антитело 1111, как и второе антитело 1121, может представлять собой полное антитело, антигенсвязывающий фрагмент (Fab-фрагмент) или находиться в форме одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv). Реагент 1132 подложки, который включает сахаридоксидазу 1133, локализован в третьей зоне 113. Пероксидаза 1113 может представлять собой HRP (пероксидазу хрена), АР (аскорбатпероксидазу) или водород-пероксидазу. В соответствии с одной из особенностей настоящего изобретения, сахарид 1112 предпочтительно представляет собой глюкозу, в то время как сахаридоксидаза представляет собой глюкооксидазу.
На фиг.1C-1Е представлены схематические иллюстрации, которые показывают изменение распределения реагирующих материалов в канале 11 индикаторной полоски 1 для жидкости на разных стадиях реакции. На фиг.1C, после того, как образец жидкости, содержащий анализируемое вещество 1101, вводится в канал 11, первое антитело 1111 распознает анализируемое вещество 1101 и связывается с ним. Поскольку первое антитело 1111, сахарид 1112 и пероксидаза 1113 не иммобилизированы в первой зоне 111, первое антитело 1111, анализируемое вещество 1101, связанное с первым антителом 1111, пероксидаза 1113 и сахарид 1112 будут течь наряду с образцом жидкости во вторую зону 112.
На фиг.1D, после того, как образец жидкости достигает второй зоны 112, второе антитело 1121 связывается с анализируемым веществом 1101, и, таким образом, образуется связанный комплекс, включающий первое антитело 1111, анализируемое вещество 1101 и второе антитело 1121. Второе антитело 1121 иммобилизировано во второй зоне 112. Соответственно, первое антитело 1111, связанное с анализируемым веществом 1101, которое, в свою очередь, связано со вторым антителом 1121, а также пероксидаза 1113, конъюгированная с первым антителом 1111, будут удерживаться во второй зоне 112. Тем не менее, сахарид 1112, который течет наряду с образцом жидкости во вторую зону 112, продолжает течь в третью зону 113 наряду с образцом жидкости и вместе с несвязанным первым антителом 1111, а также пероксидазой 1113, которая коньюгирована с несвязанным первым антителом 1111.
На фиг.1Е сахарид 1112, несвязанное первое антитело 1111 и пероксидаза 1113, конъюгированная с несвязанным первым антителом 1111, текут в третью зону 113. Затем сахарид 1112 реагирует с сахаридоксидазой 1133, внедренной в третью зону 113, образуя пероксид водорода (Н2О2). Полученный пероксид водорода реагирует с пероксидазой 1113, прибывающей в третью область 113, и генерирует электрический сигнал, который затем испускается электродами и электрическими схемами на электродном слое 19, после чего детектируется внешним прибором.
В результате, путем определения интенсивности генерируемого электрического сигнала, определяется концентрация фермента, вовлекаемого в реакцию. Иными словами, путем определения интенсивности генерируемого электрического сигнала определяется количество пероксидазы 1113, поступающей в третью зону 113 и вовлекаемой в реакцию. Кроме того, пероксидаза 1113 в ходе изготовления индикаторной полоски 1 для жидкости применяется в постоянном количестве, поэтому легко можно определить количество пероксидазы 1113, которая удерживается во второй зоне 112, путем простого вычитания ([Количество пероксидазы 1113, удерживаемой во второй зоне 112]=[общее количество пероксидазы 1113] - [количество пероксидазы, текущей в третью зону 113]). Поскольку количество пероксидазы 1113, удерживаемой во второй зоне 112, изменяется непосредственно с концентрацией анализируемого вещества 1101 в образце жидкости, можно, через количество пероксидазы 1113, удерживаемой во второй зоне 112, вычислить концентрацию анализируемого вещества 1101 в образце жидкости и, таким образом, выполнить количественный анализ.
Перед реакцией первое антитело 1111 и пероксидаза 1113 предпочтительно непосредственно конъюгируются друг с другом, как изображено на фиг.1В. В альтернативном варианте, первое антитело 1111 может конъюгироваться с биотином, в то время как пероксидаза 1113 конъюгируется с авидином. Биотин и авидин прочно связываются с образованием АВ-комплекса. Таким образом, когда первое антитело 1111 удерживается во второй зоне 112, оно также заставляет некоторое количество пероксидазы 1113 оставаться с ним во второй зоне 112. Авидин также можно заменить на стрептавидин или нейтравидин.
На фиг.1F-1Н представлены схематические иллюстрации, показывающие различные другие способы распределения реагирующих материалов в канале 11 индикаторной полоски 1 для жидкости перед реакцией. В соответствии с идеей настоящего изобретения, в индикаторной полоске 1 для жидкости согласно настоящему изобретению, сахарид 1112 и пероксидаза 1113 вместо того, чтобы располагаться в первой зоне 111, могут, в качестве альтернативы, быть локализованы во второй зоне 112.
На фиг.1F показано, что первое антитело 1111 и пероксидаза 1113 локализованы в первой зоне 111, в то время как сахарид 1112 наносится во второй зоне 112. В данном способе первое антитело 1111 и пероксидаза 1113 могут, как описано выше, напрямую конъюгироваться друг с другом или, соответственно, связываться с биотином и авидином с образованием АВ-комплекса в ходе реакции. Распределение других реагирующих материалов, таких как второе антитело 1121, реагент 1132 подложки и сахаридоксидаза 1133, осуществляется способом, изображенным на фиг.1В. В такой конфигурации, после того, как образец жидкости протекает через вторую зону 112, сахарид 1112 также увлекается в третью зону 113, позволяя осуществиться реакции, описанной на фиг.1С-1Е. Поэтому распределение реагирующих материалов на различных стадиях реакции происходит так, как изображено на фиг.1С-1Е, и здесь опущено.
Другой способ распределения реагирующих материалов изображен на фиг.1G. Первое антитело 1111 локализовано в первой зоне 111, в то время как пероксидаза 1113 и сахарид 1112 локализованы во второй зоне 112. Еще один способ распределения реагирующих материалов изображен на фиг.1Н. Первое антитело 1111 и сахарид 1112 локализованы в первой зоне 111, в то время как пероксидаза 1113 локализована во второй зоне 112. Распределения других реагирующих материалов в обоих вышеописанных способах осуществляются так же, как показано на фиг.1В, а распределение реагирующих материалов на различных стадиях реакции аналогично изображенному на фиг.1C-1Е, и поэтому повторяющееся описание здесь опущено.
На фиг.1I представлен вид индикаторной полоски 1 для жидкости в сечении вдоль линии А-А по фиг.1А. Согласно фиг.1I, в нижней части первой зоны 111 предусматривается волоконный слой 1110, а первое антитело (пронумерованное 1111 на фиг.1В) нанесено на волоконный слой 1110 так, чтобы после введения образца жидкости в первую зону 111 первое антитело (пронумерованное 1111 на фиг.1В) увлекалось образцом жидкости во вторую зону 112. Второй нитроцеллюлозный слой 1120 и третий нитроцеллюлозный слой 1130 предусматриваются, соответственно, в нижних частях второй зоны 112 и третьей зоны 113. Второе антитело (пронумерованное 1121 на фиг.1В) иммобилизируется во втором нитроцеллюлозном слое 1120, а реагент 1132 подложки внедряется в третий нитроцеллюлозный слой 1130.
Второй нитроцеллюлозный слой 1120 и третий нитроцеллюлозный слой 1130 могут представлять собой мембраны из нитроцеллюлозы, которые наслаиваются на нижние части, соответственно, второй зоны 112 и третьей зоны 113.
Другим предпочтительным подходом к нанесению слоев нитроцеллюлозы на нижние части второй зоны 112 и третьей зоны 113 является заливка раствора нитроцеллюлозы на обе нижние части второй зоны 112 и третьей зоны 113 и последующий процесс сушки (воздушной сушки или лиофилизации). Соответственно, второй нитроцеллюлозный слой 1120 и третий нитроцеллюлозный слой 1130, которые сформированы при помощи указанного процесса, имеют структуры матриц, содержащих полости. Канал 11, содержащий нитроцеллюлозные слои, изготовленные при помощи процесса литья согласно настоящему изобретению, отличается от традиционного микрожидкостного канала. Кроме того, с целью уменьшения капиллярной силы, как вторая зона 112, так и третья зона 113, предпочтительно, имеют ширину не менее 0,3 мм. Подложка 10, предпочтительно, изготавливается из биологически совместимого материала. Для оптимизации результата процесса литья, канал 11, предпочтительно, имеет шероховатость поверхности (Ra) в интервале 3-50 мкм. Нитроцеллюлозный слой 1120, предпочтительно, имеет среднюю толщину, которая равна средней толщине нитроцеллюлозного слоя 1130. Кроме того, канал 11 также может включать четвертую зону (не показана), которая содержит слой нитроцеллюлозы, который формируется в ее нижней части и также имеет структуру матрицы, содержащей полости для размещения избытка жидкости из образца.
Для приготовления раствора нитроцеллюлозы порошок нитроцеллюлозы смешивается с растворителем, содержащим сложные эфиры и кетоны. Объемное отношение порошка нитроцеллюлозы к растворителю, содержащему сложные эфиры и кетоны, предпочтительно составляет 1:9. Кроме того, когда нитроцеллюлозный слой 1120 формируется при помощи вышеописанного процесса литья, в структуре матрицы, содержащей полости, нитроцеллюлозного слоя 1120 формируется второе антитело 1121 путем впрыскивания реакционного раствора, содержащего второе антитело 1121, в нитроцеллюлозный слой 1120 и последующего процесса сушки, поэтому второе антитело 1121 остается во втором нитроцеллюлозном слое 1120 в виде порошка.
В дополнение к вышеописанному подходу, в котором второе антитело 1121 формируется после сушки нитроцеллюлозных слоев, альтернативный подход заключается в первоначальном смешивании раствора, включающего второе антитело 1121, с раствором нитроцеллюлозы, а затем - в заливке смешанного раствора в нижнюю часть второй зоны 112 и последующим процессом сушки. Таким образом, второй нитроцеллюлозный слой 1120 формируется в нижней части второй зоны 112, где второе антитело 1121 остается в структуре матрицы, содержащей полости, и высушивается до порошкообразного состояния.
Подходы, сходные с созданием второго нитроцеллюлозного слоя 1120 со вторым антителом 1121, можно реализовать для создания третьего нитроцеллюлозного слоя 1130, содержащего реагент 1132 подложки. Третий нитроцеллюлозный слой 1130 может формироваться предварительно с последующим добавлением в него реагента 1132 подложки, или реагент 1132 подложки может смешиваться с раствором нитроцеллюлозы с последующим нанесением смешанного раствора на нижнюю часть третьей зоны 113 и, таким образом, формирования третьего нитроцеллюлозного слоя 1130 и реагента 1132 подложки. Похожие подробности здесь опущены.
В дополнение к описанному выше первому варианту осуществления изобретения, настоящее изобретение в качестве второго варианта осуществления изобретения также предусматривает способ обнаружения для анализа образца жидкости. Индикаторная полоска для жидкости, реализуемая во втором варианте осуществления изобретения, в значительной мере, аналогична первому варианту осуществления изобретения, поэтому сходные подробности, касающиеся индикаторной полоски для жидкости, будут здесь опущены, а все номера ссылок для обозначения компонентов индикаторной полоски для жидкости следует относить к фиг.1В-1Н.
Фиг.2 представляет собой блок-схему способа обнаружения согласно второму варианту настоящего изобретения. Этапы способа обнаружения согласно настоящему изобретению описаны ниже.
Этап 21: Обеспечение образцом жидкости, содержащим анализируемое вещество 1101 (показанное на фиг.1В).
Этап 22: Создание подложки 10, содержащей, по меньшей мере, один канал 11, который включает первую зону 111, вторую зону 112 и третью зону 113. Эти зоны располагаются последовательно. Первая зона 111 позволяет вводить в нее образец жидкости и содержит первое антитело 1111. Вторая зона 112 содержит второе антитело 1121, иммобилизованное внутри нее. Первое антитело 1111 и второе антитело 1121 сконфигурированы для распознавания различных антигенных детерминант анализируемого вещества 1101 в образце жидкости. Так, первое антитело 1111 и второе антитело 1121 могут представлять собой моноклональные антитела или поликлональные антитела при условии, что первое антитело 1111 и второе антитело 1121 не будут конкурировать друг с другом за один и тот же антиген и, таким образом, препятствовать распознаванию антигена. Реагент 1132 подложки, который включает сахаридоксидазу 1133, локализован в третьей зоне 113. Пероксидаза 1113 может представлять собой HRP (пероксидазу хрена), АР (аскорбатпероксидазу) или водород-пероксидазу. Сахарид 1112, предпочтительно, представляет собой глюкозу, в то время как сахаридоксидаза 1133 представляет собой глюкооксидазу. Кроме того, сахарид 1112 и пероксидаза 1113 распределяются по каналу 11 таким же способом, как способ, описанный в первом варианте осуществления изобретения (с отсылкой к фиг.1В, 1F, 1G и 1Н).
Этап 23: Введение образца жидкости в первую область 111 канала 11 так, чтобы образец жидкости тек по каналу 11 последовательно через первую зону 111, вторую зону 112 и третью зону 113 и, таким образом, доставлял первое антитело 1111, сахарид 1112 и пероксидазу 1113 в канал 11 для течения через него.
Этап 24: После введения анализируемое вещество 1101 будет течь наряду с образцом жидкости во вторую зону 112. Таким образом, второе антитело 1121 будет связываться с анализируемым веществом 1101 и, таким образом, образуется связанный комплекс, включающий первое антитело 1111, анализируемое вещество 1101, и второе антитело 1121. Второе антитело 1121 иммобилизировано во второй области 112. Соответственно, первое антитело 1111, которое связано с анализируемым веществом 1101, анализируемое вещество 1101, которое связано со вторым антителом 1121, и пероксидаза, которая конъюгируется с первым антителом 1111, будут удерживаться во второй зоне 112. Образец жидкости непрерывно доставляет сахарид 1112, несвязанное первое антитело 1111 и несвязанную пероксидазу 1113 в третью зону 113. В третьей зоне 113 сахарид 1112 под каталитическом действием сахаридоксидазы 1133 образует пероксид водорода. Пероксид водорода затем реагирует с пероксидазой 1113, поступающей в третью зону 113, и генерирует электрический сигнал, который затем испускается электродами и электрическими схемами на электродном слое 19 подложки и обнаруживается внешним прибором.
Этап 25: Обнаружение электрического сигнала, генерируемого на этапе 24. В результате определения интенсивности генерируемого электрического сигнала, определяется концентрация фермента, вовлеченного в реакцию. Иными словами, определяя интенсивность генерируемого электрического сигнала, определяется количество пероксидазы 1113, поступающей в третью зону 113 и вовлекаемой в реакцию. Кроме того, поскольку пероксидаза 1113 внедряется в индикаторную полоску 1 для жидкости в ходе ее изготовления в постоянном количестве, можно легко определить количество пероксидазы 1113, которая удерживается во второй зоне 112 путем простого вычитания ([Количество пероксидазы 1113, удерживаемой во второй зоне 112]=[общее количество пероксидазы 1113] -[количество пероксидазы, текущей в третью зону 113]). Поскольку количество пероксидазы 1113, удерживаемой во второй зоне 112, изменяется непосредственно с концентрацией анализируемого вещества 1101 в образце жидкости, можно, через количество пероксидазы 1113, удерживаемой во второй зоне 112, вычислить концентрацию анализируемого вещества 1101 в образце жидкости и, таким образом, выполнить количественный анализ.
В соответствии со способом обнаружения согласно настоящему изобретению, предпочтительная конфигурация первого антитела 1111 и пероксидазы 1113, выбор первого антитела 1111 и пероксидазы 1113, предпочтительные категории первого антитела 1111, второго антитела 1112 и пероксидазы 1113, предпочтительные конструкции канала 11, конфигурация и способ изготовления нитроцеллюлозных слоев, состав и предпочтительное соотношение компонентов раствора нитроцеллюлозы, а также состав и способы изготовления реагирующих материалов сходны с описанными в первом варианте осуществления изобретения, и поэтому данные подробности здесь опущены.
Настоящее изобретение описано путем отсылки к предпочтительным вариантам, и, как следует понимать, варианты осуществления изобретения не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения. Более того, поскольку раскрытые здесь обязательные составные части описания изобретения должны быть легко понятны и могут быть осуществлены средним специалистом в данной области, все эквивалентные изменения или модификации, которые не отступают от концепции настоящего изобретения, должны охватываться прилагаемой формулой изобретения.
1. Индикаторная полоска для количественного определения анализируемого вещества в жидкости, содержащая электродный слой и подложку, имеющую на ней, по меньшей мере, один канал, где канал содержит расположенные последовательно первую зону, вторую зону и третью зону, и первая зона используется для введения в нее образца жидкости, отличающаяся тем, что
в нижней части первой зоны предусмотрен волоконный слой;
в нижних частях второй и третьей зон предусмотрен нитроцеллюлозный слой;
при этом индикаторная полоска содержит:
первое антитело, локализованное в первой зоне и внедренное в волоконный слой, для распознавания анализируемого вещества в образце жидкости;
сахарид, локализованный в первой или второй зоне;
пероксидазу, локализованную в первой или второй зоне;
второе антитело, иммобилизированное во второй зоне и иммобилизированное в нитроцеллюлозном слое, для распознавания анализируемого вещества в образце жидкости, где второе антитело и первое антитело сконфигурированы для распознавания различных антигенных детерминант анализируемого вещества в образце жидкости; и реагент подложки, локализованный в третьей зоне, внедренный в нитроцеллюлозный слой и содержащий сахаридоксидазу;
где при введении образца жидкости, содержащего анализируемое вещество, в канал первое антитело, сахарид и пероксидаза текут наряду с образцом жидкости, а затем часть пероксидазы связывается с первым антителом, анализируемым веществом и вторым антителом, так чтобы они удерживались во второй зоне, позволяя оставшейся части пероксидазы течь наряду с образцом жидкости к третьей зоне, сахарид прибывает в третью зону и подвергается каталитическому действию сахаридоксидазы, образуя пероксид водорода, после чего пероксид водорода реагирует с пероксидазой, прибывающей в третью зону, и, таким образом, генерируется электрический сигнал.
2. Индикаторная полоска по п.1, отличающаяся тем, что первое антитело и пероксидаза локализованы в первой зоне и конъюгируются друг с другом.
3. Индикаторная полоска по п.1, отличающаяся тем, что первое антитело дополнительно конъюгируется с биотином, а пероксидаза конъюгируется с молекулой, которая выбирается из группы, состоящей из авидина, стрептавидина и нейтравидина.
4. Индикаторная полоска по п.1, отличающаяся тем, что пероксидаза выбирается из группы, которая состоит из пероксидазы хрена, аскорбатпероксидазы и водород-пероксидазы.
5. Индикаторная полоска по п.1, отличающаяся тем, что сахарид представляет собой глюкозу, а сахаридоксидаза представляет собой глюкооксидазу.
6. Индикаторная полоска по п.1, отличающаяся тем, что нитроцеллюлозный слой содержит структуру матрицы, содержащей полости, и изготовлен путем заливки раствора нитроцеллюлозы на нижние части второй и третьей зон и последующего процесса сушки.
7. Индикаторная полоска по п.6, отличающаяся тем, что второе антитело находится в виде порошка и сформировано в структуре матрицы, содержащей поры, нитроцеллюлозного слоя во второй зоне путем смешивания реакционного раствора, содержащего второе антитело, с раствором нитроцеллюлозы и последующего процесса сушки так, чтобы раствор нитроцеллюлозы образовывал нитроцеллюлозные слои, а второе антитело оставалось в нитроцеллюлозном слое второй зоны в виде порошка.
8. Индикаторная полоска по п.6, отличающаяся тем, что реагент подложки находится в виде порошка и сформирован в структуре матрицы, содержащей поры, нитроцеллюлозного слоя в третьей зоне путем впрыскивания реакционного раствора реагента подложки в нитроцеллюлозный слой третьей зоны и последующего процесса сушки.
9. Индикаторная полоска по п.6, отличающаяся тем, что реагент подложки находится в виде порошка и сформирован в структуре матрицы, содержащей поры, нитроцеллюлозного слоя третьей зоны путем смешивания реакционного раствора, содержащего реагент подложки, с раствором нитроцеллюлозы и последующего процесса сушки так, чтобы раствор нитроцеллюлозы образовывал нитроцеллюлозные слои, а реагент подложки оставался в нитроцеллюлозном слое третьей зоны в виде порошка.
10. Индикаторная полоска по п.6, отличающаяся тем, что вторая зона и третья зона имеют ширину, по меньшей мере, 0,3 мм.
11. Индикаторная полоска по п.6, отличающаяся тем, что канал также содержит четвертую зону, в ее нижней части также предусмотрен нитроцеллюлозный слой для размещения избытка жидкости из образца, а указанная нитроцеллюлоза содержит матрицу, содержащую полости.
12. Способ количественного определения анализируемого вещества в жидкости, который включает этапы, на которых:
предоставляют образец жидкости, который содержит анализируемое вещество;
предоставляют индикаторную полоску, содержащую электродный слой и подложку, имеющую, по меньшей мере, один канал, который включает расположенные последовательно первую зону, вторую зону и третью зону, где первая зона допускает введение в нее образца жидкости; при этом в нижней части первой зоны предусматривают волоконный слой, в нижних частях второй и третьей зон предусматривают нитроцеллюлозный слой; при этом индикаторная полоска содержит:
первое антитело, локализованное в первой зоне и внедренное в волоконный слой, для распознавания анализируемого вещества в образце жидкости;
сахарид, локализованный в первой или второй зоне;
пероксидазу, локализованную в первой или второй зоне;
второе антитело, иммобилизированное во второй зоне и иммобилизированное в нитроцеллюлозном слое, для распознавания анализируемого вещества в образце жидкости, где второе антитело и первое антитело сконфигурированы для распознавания различных антигенных детерминант анализируемого вещества в образце жидкости; и
реагент подложки, локализованный в третьей зоне, внедренный в нитроцеллюлозный слой и включающий сахаридоксидазу;
вводят образец жидкости в первую зону канала, что заставляет первое антитело, сахарид и пероксидазу течь вместе с образцом жидкости;
осуществляют связывание анализируемого вещества, первого антитела, второго антитела и части пероксидазы друг с другом и их удержание во второй зоне;
осуществляют течение сахарида, несвязанного первого антитела и другой части оставшейся несвязанной пероксидазы в третью зону наряду с образцом жидкости так, чтобы сахарид подвергался каталитическому действию сахаридоксидазы и образовывал пероксид водорода;
позволяют пероксидазе прибыть в третью зону и реагировать с пероксидом водорода с целью генерирования электрического сигнала; и
обнаруживают генерируемый электрический сигнал.
13. Способ по п.12, отличающийся тем, что первое антитело и пероксидаза локализованы в первой зоне и конъюгируются друг с другом.
14. Способ по п.12, отличающийся тем, что первое антитело дополнительно конъюгируется с биотипом, а пероксидаза конъюгируется с молекулой, выбранной из группы, состоящей из авидина, стрептавидина и нейтравидина.
15. Способ по п.12, отличающийся тем, что пероксидазу выбирают из группы, которая состоит из HRP (пероксидазы хрена), АР (аскорбатпероксидазы) и водород-перокидазы.
16. Способ по п.12, отличающийся тем, что сахарид представляет собой глюкозу, а сахаридоксидаза представляет собой глюкооксидазу.
17. Способ по п.12, отличающийся тем, что нитроцеллюлозный слой изготавливают путем заливки раствора нитроцеллюлозы на нижние части второй и третьей зон и последующего процесса сушки.
18. Способ по п.17, отличающийся тем, что реагент подложки находится в виде порошка и сформирован в структуре матрицы, содержащей поры, нитроцеллюлозного слоя третьей зоны путем впрыскивания реакционного раствора реагента подложки в нитроцеллюлозный слой третьей зоны и последующего процесса сушки.
19. Способ по п.17, отличающийся тем, что реагент подложки находится в виде порошка и сформирован в структуре матрицы, содержащей поры, нитроцеллюлозного слоя третьей зоны путем смешивания реакционного раствора, содержащего реагент подложки, с раствором нитроцеллюлозы и последующего процесса сушки так, чтобы раствор нитроцеллюлозы образовывал нитроцеллюлозные слои, а реагент подложки оставался в нитроцеллюлозном слое третьей зоны в виде порошка.
20. Способ по п.17, отличающийся тем, что вторая зона и третья зона имеют ширину не менее чем 0,3 мм.
21. Способ по п.17, отличающийся тем, что канал также содержит четвертую зону, и в ее нижней части также предусмотрен нитроцеллюлозный слой для размещения избытка жидкости из образца, а указанная нитроцеллюлоза содержит матрицу, содержащую полости.
