Вакцина ассоциированная против ньюкаслской болезни, реовирусного теносиновита и метапневмовирусной инфекции птиц инактивированная эмульсионная
Владельцы патента RU 2480238:
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") (RU)
Изобретение относится к ветеринарии и касается вакцины ассоциированной против ньюкаслской болезни (НБ), реовирусного теносиновита (РВТ) и метапневмовирусной инфекции (МПВИ) птиц инактивированной эмульсионной, содержащей активное вещество и целевую добавку. В качестве целевой добавки вакцина содержит масляный адъювант марки Montanide ISA-70 VG. Изобретение обеспечивает индукцию у привитой птицы высокого уровня антител к возбудителям НБ, РВТ и МПВИ через 28 суток после применения, который сохраняется в течение 12 месяцев и трансовариально передается потомству. 6 з.п. ф-лы, 7 пр., 7 ил., 5 табл.
Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, касается ассоциированной вакцины инактивированной эмульсионной, которая может быть использована для специфической профилактики болезней птиц, индуцируемых вирусами ньюкаслской болезни (НБ), реовирусного теносиновита (РВТ) и метапневмовирусной инфекции (МПВИ) птиц.
Мировая тенденция конца XX, начала XXI в.в. в птицеводстве - это эпоха превращения домашних мелкотоварных хозяйств в крупномасштабное высокопродуктивное производство. Такая ситуация породила уникальные изменения биоэкологической ниши, окружающей выращиваемое поголовье, и, в частности, привела к чрезвычайно спрессованной во времени трансформации спектра вирусных инфекций, повсеместно поражающих домашнюю птицу. За этот период появились вновь, антигенно обновились или существенно усилили вирулентность более десяти возбудителей, став причиной весьма опасных инфекционных болезней птиц. Среди хорошо известных, например, вирусов НБ или болезни Марека (БМ) особое место заняли возбудители РВТ и МПВИ. Именно эти этиологические агенты, действуя порознь, или, как правило, в ассоциации наносят катастрофический с экономической точки зрения ущерб промышленному птицеводству. При этом ущерб становится более ощутимым, когда эти заболевания поражают племенное ядро или стада кур - несушек (1-6).
Эффективность предупреждения указанных заболеваний во всем мире связывают главным образом с применением живых и инактивированных вакцин. При этом вакцинопрофилактика до последнего времени остается единственным фундаментально проработанным методическим приемом для эффективного противостояния инфекционным болезням при крупномасштабном выращивании птицы.
Однако каждый тип вакцин, используемых для специфической профилактики вышеуказанных заболеваний у птиц, имеет преимущества и недостатки. Преимущество живых вакцин состоит в технологичности и в возможности использования массовых методов применения при вакцинации. К недостаткам живых вакцин относятся формирование нестабильной иммунной реакции у птиц, развитие различного рода осложнений, таких как повышенная реактогенность, развитие иммуносупрессии, а иногда и гибели птиц при воздействии неблагоприятных условий содержания и наличия сопутствующих инфекций, а также возможны проблемы воспроизводства, длительная персистенция и выделение вакцинного вируса во внешнюю среду.
В промышленном птицеводстве широкое применение нашли сорбированные на гидроокиси алюминия (ГОА) или масляные на основе эмульсии обратного типа инактивированные вакцины, обладающие существенными преимуществами по сравнению с живыми вакцинными препаратами. Прежде всего следует отметить их высокую безопасность и безвредность, возможность стандартизации дозированного введения специфического антигена, стабильность основных биологических свойств, возможность создания системного, напряженного и продолжительного иммунологического эффекта (7).
Известна вакцина против НБ птиц инактивированная эмульсионная, содержащая в качестве активного вещества авирулентный очищенный антигенный материал из штамма "Ла Сота" вируса НБ, полученного в 9÷12 -суточных эмбрионах SPF - кур с инфекционной активностью не ниже 8,0 Ig ЭИД50/см3 до инактивации и титром гемагглютинирующей активности (ГА - активность) в экстраэмбриональной жидкости не ниже 1:256, и в качестве целевой добавки масляный адъювант в эффективном соотношении (8, 9).
Известна вакцина против РВТ птиц инактивированная эмульсионная, содержащая в качестве активного вещества авирулентный очищенный антигенный материал из штамма "1133" реовируса птиц, полученного в культуре клеток фибробластов эмбрионов SPF - кур (ФЭК) с инфекционной активностью не ниже 7,0 Ig ТЦД50/см3 до инактивации, и в качестве целевой добавки масляный адъювант в эффективном соотношении (10÷13).
Известна вакцина против МПВИ птиц инактивированная эмульсионная, содержащая в качестве активного вещества авирулентный очищенный антигенный материал из метапневмовируса птиц серотипа А, полученного в перевиваемой культуре клеток почки зеленой африканской мартышки (Vero) с инфекционной активностью не ниже 6,0 Ig ТЦД50/см3 до инактивации, и в качестве целевой добавки масляный адъювант в соотношении, мас.%: 70,0:30,0 соответственно (14).
Известна вакцина против МПВИ птиц инактивированная эмульсионная, содержащая в качестве активного вещества авирулентный очищенный антигенный материал из штамма "PVO3-B №-127 ДЕП" метапневмовируса птиц, полученного в перевиваемой культуре клеток Vero, с инфекционной активностью не ниже 7,0 Ig ТЦД50/см3 до инактивации, и в качестве целевой добавки масляный адъювант в соотношении мас.%: 70,0:30,0 соответственно (15, 16).
Применение моновалентных инактивированных вакцин в птицеводстве ограничено необходимостью одновременной вакцинации против нескольких инфекций в короткий промежуток времени (как правило, в пределах 80÷100 - суточного возраста), коротким производственным сроком использования птицы, а также ограниченным мышечным пространством для одновременной инъекции нескольких препаратов. Кроме того, многократное повторение индивидуального способа вакцинации приводит к повышению трудовых затрат, увеличению сроков образования иммунитета у птиц, способствует возникновению стрессовых явлений и осложнений.
Указанные недостатки частично устранены разработкой и применением в птицеводстве ассоциированных инактивированных вакцин, имеющих в составе разнообразное количественное и качественное соотношение антигенов.
Известна вакцина ассоциированная против НБ и МПВИ птиц инактивированная сорбированная, содержащая смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма "Ла Сота" вируса НБ и из штамма "PVO3-B" вируса МПВИ птиц, полученных культивированием в чувствительных биологических системах, и в качестве целевой добавки адъювант-сорбент ГОА в эффективном соотношении (16, 17).
Известна вакцина ассоциированная против НБ и РВТ птиц инактивированная эмульсионная, содержащая смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма "Ла Сота" вируса НБ и из штамма "1133" вируса РВТ птиц, полученных культивированием в чувствительных биологических системах, и масляный адъювант в эффективном соотношении (2, 18, 19).
Известна вакцина ассоциированная против НБ и МПВИ птиц инактивированная эмульсионная, содержащая смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма "Ла Сота" вируса НБ и из штамма "PVO3-B" вируса МПВИ птиц, полученных культивированием в чувствительных биологических системах, и масляный адъювант в эффективном соотношении (16, 17, 20, 21).
Наиболее близкой к предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина ассоциированная против НБ и МПВИ птиц инактивированная эмульсионная, содержащая смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма "Ла Сота" вируса НБ и из штамма "PVO3-B" вируса МПВИ птиц, полученных культивированием в чувствительных биологических системах, и масляный адъювант в эффективном соотношении (16, 17, 20, 21).
Общим существенным недостатком известных бивалентных инактивированных вакцин, в том числе вакцины - прототипа, является их недостаточно высокая эффективность вследствие ограниченности одновременной вакцинации против нескольких инфекций в короткий промежуток времени (как правило, в пределах 80÷100 - суточного возраста), коротким производственным сроком использования птицы, а также ограниченного мышечного пространства для одновременной инъекции нескольких препаратов. Кроме того, многократное повторение индивидуального способа вакцинации приводит к повышению трудовых затрат, увеличивает сроки образования иммунитета у птиц, способствует возникновению стрессовых явлений и осложнений.
Известно так же, что при изготовлении ассоциированных инактивированных вакцин с валентностью выше трех происходит значительное взаимное разведение содержащихся в них антигенных компонентов. В результате снижается их концентрация в прививном объеме препарата. При этом возможность повышения концентрации вирусов при помощи культивирования ограничена. В связи с этим одним из наиболее важных технологических показателей является определение минимальной концентрации антигенов и их оптимального соотношения в прививном объеме вакцины, что обеспечивало бы формирование напряженного иммунитета у кур. Немаловажным в производстве эмульсионных вакцин является выбор адъюванта, который обеспечивал бы стабильность вакцинной эмульсии, индукцию и персистенцию высоких титров антител у привитых птиц при отсутствии побочных эффектов в местах своего введения, а также удобство применения вакцины в производственных условиях. Поэтому проблема получения высокоэффективной ассоциированной вакцины инактивированной эмульсионной против основных возбудителей вирусных заболеваний птиц продолжает оставаться актуальной и является основным направлением исследований по созданию искомого препарата.
Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в получении вакцины ассоциированной инактивированной эмульсионной, создающей эффективную защиту восприимчивых птиц от заражения возбудителями НБ, РВТ и МПВИ. Основными показателями эффективности применения препарата являются защита племенных стад кур от НБ, а также создание ранней защиты цыплят с помощью материнского иммунитета от РВТ и МПВИ.
Технический результат от использования предложенного изобретения заключается в расширении арсенала высокоиммуногенных безвредных и ареактогенных ассоциированных вакцин инактивированных эмульсионных против возбудителей НБ, РВТ и МПВИ птиц, циркулирующих на территории Российской Федерации. Технический результат достигнут благодаря определению минимальной концентрации каждого антигена в прививном объеме препарата, минимальной инфекционной активности вирусов, входящих в состав предлагаемой вакцины, до инактивации и оптимального соотношения антигенных компонентов в вакцине, а также благодаря нахождению эффективного, удобного в технологическом плане и безопасного адъюванта.
Указанный технический результат достигнут созданием вакцины ассоциированной против НБ, РВТ и МПВИ птиц инактивированной эмульсионной, охарактеризованной следующей совокупностью признаков.
Согласно изобретению предлагаемая вакцина содержит в качестве активного вещества смесь из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма «Ла Сота» вируса НБ птиц, полученного в 9÷12 - суточных эмбрионах SPF - кур с инфекционной активностью не ниже 10,0 Ig ЭИД50/см3 до инактивации, из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма "1133" вируса РВТ птиц, полученного в культуре клеток ФЭК с инфекционной активностью не ниже 7,5 Ig ТЦД50/см3 до инактивации, из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма "1733" вируса РВТ птиц, полученного в культуре клеток ФЭК с инфекционной активностью не ниже 7,5 Ig ТЦД50/см3 до инактивации, и авирулентного очищенного антигенного материала из штамма "PVO3-B" метапневмовируса птиц, полученного в перевиваемой культуре клеток Vero, с инфекционной активностью не ниже 7,0 Ig ТЦД50/см3 до инактивации, взятых в объемном соотношении 0,3:0,6:0,6:1,5 соответственно и в количествах, обеспечивающих протективную иммуногенную активность каждого антигена в организме птицы после введения ей целевого препарата.
В качестве целевой добавки предлагаемая вакцина содержит масляный адъювант марки Montanide ISA-70 VG производства "Seppic" (Франция, стандарт ИСО 9001).
В предлагаемой вакцине активное вещество и целевая добавка объединены в соотношении, мас.%: 30,0:70,0 соответственно.
Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:
1. Вакцина ассоциированная против НБ, РВТ и МПВИ птиц инактивированная эмульсионная.
2. Активное вещество.
3. В качестве активного вещества смесь из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма "Ла Сота" вируса НБ птиц, сем. Paramyxoridae, подсемейства Parmyxovirinae, рода Avulavirus, серотипа 1, из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма "1133" вируса РВТ птиц сем. Reoviridae, рода Orthoreovirus, коллекция ФГУ "ВГНКИ" "1133-ДЕП", из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма "1733" вируса РВТ птиц сем. Reoviridae, рода Orthoreovirus, коллекция ФГУ "ВГНКИ" "1733"-116-ДЕП", и из авирулентного очищенного материала из штамма "PVO3-B №127-ДЕП" вируса МПВИ птиц, сем. Paramyxoviridae, подсемейства Pneumovirinae, рода Metapneumovirus, подтипа В, коллекция ФГУ "ВГНКИ" "PVO3-B №127-ДЕП", взятых в объемном соотношении 0,3:0,6:0,6:1,5 соответственно и в количествах, обеспечивающих протективную иммунногенную активность каждого антигена в организме птиц после введения им целевого препарата.
4. Целевая добавка.
5. В качестве целевой добавки масляный адъювант.
Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:
1. Вакцина ассоциированная против НБ и МПВИ птиц инактивированная эмульсионная.
2. Активное вещество.
3. Целевая добавка.
По сравнению с вакциной-прототипом существенные отличительные признаки предлагаемой вакцины заключаются в том, что в качестве активного вещества она содержит смесь из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма "Ла Сота" вируса НБ птиц сем. Paramyxoviridae, подсем. Paramyxovirinae, рода Avulavirus, серотипа 1, из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма "1133" вируса РВТ птиц сем. Reoviridae, рода Orthoreovirus, коллекция ФГУ "ВГНКИ " "1133-ДЕП", из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма "1733" вируса РВТ птиц сем. Reoviridae, рода Orthoreovirus, коллекция ФГУ "ВГНКИ" "1733"-116-ДЕП", и из авирулентного очищенного материала из штамма "PV03-B" вируса МПВИ птиц сем. Paramyxoviridae, подсемейства Pneumovirinae, рода Metapneumovirus, подтипа В, коллекция ФГУ "ВГНКИ" "PVO3-B №127-ДЕП", взятых в объемном соотношении 0,3:0,6:0,6:1,5 соответственно и в количествах, обеспечивающих иммуногенную активность каждого антигена в организме птицы после введения ей целевого препарата.
Предлагаемое изобретение характеризуется другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:
1. Авирулентный очищенный антигенный материал из штамма "Ла Сота" вируса НБ птиц, полученного в 9÷12 - суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью не ниже 10,0 Ig ЭИД50/см3 до инактивации, в количестве 3,0 мас.%.
2. Авирулентный очищенный антигенный материал из штамма "1133" вируса РТВ птиц, полученного в культуре клеток ФЭК с инфекционной активностью не ниже 7,5 Ig ТЦД50/см3 до инактивации, в количестве 6,0 мас.%.
3. Авирулентный очищенный антигенный материал из штамма "1733" вируса РТВ птиц, полученного в культуре клеток ФЭК с инфекционной активностью не ниже 7,5 Ig ТЦД50/см3 до инактивации, в количестве 6,0 мас.%.
4. Авирулентный очищенный антигенный материал из штамма "PVO3-B" метапневмовируса птиц, полученного в перевиваемой культуре клеток Vero с инфекционной активностью не ниже 7,0 Ig ТЦД50/см3 до инактивации, в количестве 15,0 мас.%.
5. Масляный адъювант в количестве не менее 70,0 мас.%.
6. Смесь из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма "Ла Сота" вируса НБ птиц, полученного в 9÷12 - суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью не ниже 10,0 Ig ЭИД50/см3 до инактивации, из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма "1133" вируса РТВ птиц, полученного в культуре клеток ФЭК с инфекционной активностью не ниже 7,5 Ig ТЦД50/см3 до инактивации, из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма "1733" вируса РТВ птиц, полученного в культуре клеток ФЭК с инфекционной активностью не ниже 7,5 Ig ТЦД50/см3 до инактивации, из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма "PVO3-B" метапневмовируса птиц, полученного в перевиваемой культуре клеток Vero, с инфекционной активностью не ниже 7,0 Ig ТЦД50/см3 до инактивации, и масляный адъювант в соотношении, мас.%.
| Антигенный материал из штамма "Ла Сота" вируса НБ птиц | 3,0 |
| Антигенный материал из штамма "1133" вируса РВТ птиц | 6,0 |
| Антигенный материал из штамма "1733" вируса РВТ птиц | 6,0 |
| Антигенный материал из штамма "PVO3-B" вируса МПВИ птиц | 15,0 |
| Масляный адъювант | до 100,0 |
Входящие в предлагаемую вакцину штаммы вирусов известны и являются производственными при изготовлении моновакцин (8÷16).
В результате проведенных исследований авторы определили важнейшие технологические показатели, позволившие создать препарат, в котором отсутствует конкуренция между антигенами, входящими в состав предлагаемой вакцины, а его иммуногенные свойства были сравнимы с таковыми после применения монопрепаратов.
В результате проведенной НИР и анализа литературы было решено в компонентном составе предлагаемой вакцины использовать два штамма вируса РВТ - «1133» и «1733». Это было сделано по нескольким причинам. Во-первых, было доказано, что совместное применение данных штаммов вызывает выработку более напряженного иммунитета у птиц против возбудителя РВТ, на что указывают результаты серологических исследований опытных сывороток крови (табл.3, фиг.1). Во-вторых, в результате использования в предлагаемой вакцине в качестве компонента РВТ двух антиген отличающихся штаммов РВТ повышается эффективность применяемой вакцины в отношении различных штаммов полевых возбудителей реовирусной инфекции (7).
Дополнительный технический результат от использования предлагаемого изобретения достигается за счет того, что для инактивации вирусосодержащих материалов используют аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ), что позволяет значительно снизить трудо- и энергозатраты на изготовление вакцины и повысить качество антигенных материалов.
Дополнительный технический результат от использования предлагаемого изобретения в части повышения антигенной и иммуногенной активности целевого продукта достигается также за счет использования в его составе масляного адъюванта Montanide ISA - 70 VG производства фирмы " SEPPIC" (Франция, стандарт ИСО 9001).
Сущность изобретения пояснена на графических материалах, на которых на:
фиг.1 представлено графическое изображение динамики образования поствакцинальных антител на антигенный компонент РВТ образцов предлагаемой вакцины, содержащих в своем составе различные комбинации штаммов вируса РВТ птиц;
фиг.2 представлено графическое изображение динамики образования поствакцинальных антител на антигенный компонент НБ птиц серии №1 предлагаемой вакцины;
фиг.3 - графическое изображение динамики образования поствакцинальных антител на антигенный компонент РВТ птиц серии №1 предлагаемой вакцины;
фиг.4 - графическое изображение динамики образования поствакцинальных антител на антигенный компонент МПВИ птиц серии №1 предлагаемой вакцины;
фиг.5 - графическое изображение динамики образования
поствакцинальных антител на антигенный компонент НБ птиц серии №2 предлагаемой вакцины;
фиг.6 - графическое изображение динамики образования поствакцинальных антител на антигенный компонент РВТ птиц серии №2 предлагаемой вакцины;
фиг.7 - графическое изображение динамики образования поствакцинальных антител на антигенный компонент МПВИ птиц серии №2 предлагаемой вакцины.
Используемый для изготовления предлагаемой вакцины штамм "Ла Сота" вируса НБ птиц характеризуется следующими признаками и свойствами.
Морфологические признаки
Вирус НБ птиц штамма " Ла Сота" относится к сем. Paramyxoviridae, подсем. Paramyxovirinae, роду Avulavirus, серотипу 1 и обладает одноцепочечным несегментированным РНК-геномом негативной полярности, состоящим более чем из 15000 нуклеотидов. Сферические, покрытые оболочкой вирионы имеют диаметр 150 нм и более с характерными поверхностными выступами длиной 8 нм. Есть филаментозные формы диаметром 60÷100 нм и варьирующей длины до нескольких микрометров. Нуклеокапсид имеет спиральный тип симметрии, РНП 12÷17 нм, длину до 1 мкм и жестко упорядоченную структуру. Встречаются вирионы, содержащие несколько нуклеокапсидов.
Антигенные свойства
Антигенная структура стабильна: 5÷7 полипептидов с молекулярной массой 35÷200 килодальтон, один или более поверхностных антигенов; один нуклеокапсидный антиген. Реплицируются в цитоплазме. Обладают геммагглютинирующими свойствами. Некоторые члены семейства имеют нейраминидазу и РНК-зависимую РНК-полимеразу. При вакцинации вирус индуцирует образование специфических антител. Титр гемагглютининов в экстраэмбриональной жидкости при культивировании в эмбрионах кур не ниже 1:256.
Биотехнологические характеристики
Вирус НБ проявляет высокую биологическую, иммуногенную и антигенную активность, культивируется в 9÷12 - суточных эмбрионах SPF-кур. Инфекционная активность в лиофилизованном виде не ниже 8,0 Ig ЭИД50/см3.
Устойчивость к внешним факторам
Штамм "Ла Сота" вируса НБ птиц чувствителен к эфиру, инактивируется при рН 3,0. Лиофилизованный вирус хранится при температуре минус 2÷40°С в течение 12 месяцев.
Дополнительные признаки и свойства
Свободен от бактериальной и грибной контаминации. Сохраняет инфекционную активность при температуре минус 20÷40°С в течение 12 месяцев, а в лиофилизованном виде при титровании в эмбрионах или в трахеальной органной культуре эмбрионов кур не ниже 6,5 Ig ЭИД50/см3.
Для получения антигенного материала из штамма "Ла Сота" вируса НБ птиц в качестве чувствительной биологической системы культивирования используют преимущественно 9÷12 - суточные эмбрионы SPF-кур. Полученный вирусосодержащий материал очищают от балластных примесей центрифугированием или любым другим известным методом.
Для инактивации вируса НБ птиц используют АЭЭИ, который добавляют в очищенную вирусосодержащую суспензию до концентрации 0,05-0,1%. Инактивацию вируса проводят при температуре 37±0,5°С и рН в пределах 7,0-7,6 в течение 24 часов. По окончании инактивации АЭЭИ нейтрализуют внесением в антигенный материал тиосульфата натрия. Для этого в охлажденную суспензию антигена добавляют 1М раствор тиосульфата натрия из расчета 10% к объему использованного АЭЭИ. Полученный антиген подвергают контролю на антигенную активность, авирулентность, стерильность и pH.
Для изготовления предлагаемой вакцины используют авирулентный очищенный антигенный материал из штамма "Ла Сота" вируса НБ птиц, полученного в 9÷12 - суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью не ниже 9,0 Ig ЭИД50/см3 до инактивации и ГА-активностью не ниже 1: 512, в количестве 3,0 мас.%.
Используемые для изготовления предлагаемой вакцины штаммы "1133" и "1733" вируса РВТ птиц относятся к семейству Reoviridae, роду Orthoreovirus, депонированы 14.07.1998 г. и 13.12.2001 г. соответственно в коллекцию штаммов микроорганизмов ФГУ "ВГНКИ" под регистрационными номерами "1133-ДЕП" и "1733"-116ДЕП" и характеризуются следующими признаками и свойствами.
Морфологические признаки
Реовирус не имеет оболочки, обладает икосаэдральной симметрией и двухкапсидной структурой. Вирусные частицы имеют диаметр около 75 нм и плотность в хлориде цезия 1,36÷1,37 г/см3. Вирусный геном состоит из 2-спиральной РНК и имеет фрагментарную структуру. По размеру геном можно разделить на три класса с 10 дискретными молекулярными видами.
Антигенные свойства
Реовирусы птиц обладают группоспецифическим антигеном. Его можно наблюдать в реакции диффузионной преципитации. Специфичность антигена серотипа можно определить в реакции нейтрализации. Нейтрализующие антитела определяются уже спустя 70 дней после инфицирования, а преципитирующие - приблизительно на вторую неделю. Исследованиями ин vivo и ин vitro была доказана способность реовирусов птиц вырабатывать интерферон.
Биотехнологические характеристики
Реовирусы хорошо растут в эмбрионах SPF-кур после инфицирования через желточный мешок или на хориоаллантоисную оболочку, при этом, гибель эмбрионов наступает через 3÷5 или 8 дней соответственно. Вирус способен расти в первичных куриных клеточных культурах легких, почек, печени, макрофагов и семенников эмбриона. Фибробласты куриного эмбриона также являются подходящей средой для роста вируса, но для этого часто приходится проводить адаптацию вируса. Доказано, что реовирус растет в таких клеточных линиях, как Vero, ВНК-21/13, почек кроликов, почек свиней, в клеточной линии японских перепелов и лимфобластоидных клетках кур.
Устойчивость к внешним факторам
Реовирусы не чувствительны к эфиру, слабо чувствительны к хлороформу. Они устойчивы к действию pH 3, перекиси водорода в течение 1 часа при комнатной температуре, 2% лизолу и 3% формалину. Кроме того, они устойчивы к метаболическим ингибиторам ДНК: актиномицину. Д, цитозинарабиноозиду и 5-фтор-2-дезоксиридину. Реовирусы устойчивы к нагреванию и способны находиться при температуре 60°С в течение 8÷10 часов. Инактивируются 70% этанолом, 0,5% органическим йодом и 5% раствором перекиси водорода.
Дополнительные признаки и свойства
Обладает антигенной активностью в составе инактивированной вакцины.
Патогенность - выражена.
Вирулентность - выражена.
Контагиозность - выражена.
Онкогенность - отсутствует.
Штаммы "1133" и "1733" реовируса свободны от контаминации бактериями, микоплазмами и другими гемагглютинирующими вирусами.
Для получения антигенных материалов из штаммов "1133" и "1733" вируса РВТ в качестве чувствительной системы культивирования используют преимущественно первичную культуру клеток ФЭК. Полученные вирусосодержащие материалы очищают от балластных примесей центрифугированием или любым другим известным методом.
Для инактивации вируса РВТ птиц используют АЭЭИ, который добавляют в очищенные вирусосодержащие суспензии до концентрации 0,1%. Инактивацию вируса проводят при температуре 37±0,5°С и pH 7,4÷7,6 в течение 24 часов. По окончании инактивации АЭЭИ нейтрализуют внесением в антигенный материал тиосульфата натрия. Для этого в охлажденные суспензии каждого антигена добавляют 2М раствора тиосульфата натрия из расчета 10% к объему использованного АЭЭИ. Полученные антигены подвергают контролю на антигенную активность, авирулентность, стерильность и pH.
Для изготовления предлагаемой вакцины используют авирулентные очищенные антигенные материалы из штаммов "1133"и "1733" вируса РВТ птиц, полученные в культуре клеток ФЭК с инфекционной активностью не ниже 7,5 Ig ТЦД50/см3 до инактивации в количестве не ниже 6,0 мас.% для каждого из штаммов.
Используемый для изготовления предлагаемой вакцины штамм "PVO3-B" вируса МПВИ птиц относится к семейству Paramixoviridae, роду Metapneumovirus, депонирован 22.11.2006 г. в коллекцию штаммов микроорганизмов ФГУ "ВГНКИ" под регистрационным номером "PVO3-B №127-ДЕП" и характеризуется следующими признаками и свойствами.
Морфологические признаки
Метапневмовирус птиц - это РНК-содержащий вирус, с несегментированным одноцепочечным негативным геномом (17÷20).
Вирус сложный, имеет комплексную структуру и покрыт липопротеиновой оболочкой, образующейся при выходе вириона. Образует сферические частицы, симметричные по спиральному типу, которые имеют размеры 80-200 нм. Оболочка напоминает бахрому, равномерно покрытую поверхностными выступами длиной 13÷15 нм, которые представляют собой шипы, их ширина равна 2÷3 нм у основания, максимальная - 3÷5 нм, расстояние между шипами равно 2÷3 нм.
Антигенные свойства
ГА-активность по отношению к эритроцитам кур, индеек, уток, свиней, крупного рогатого скота, мышей и морских свинок отсутствует. Метапневмовирусы обладают группоспецифичным антигеном. Специфичность антигена можно определить в реакции нейтрализации вируса в культурах органов или в культуре клеток Vero.
Биотехнологические характеристики
Вирус МПВИ размножается в культурах клеток 18 первичных и 11 перевиваемых линий, вызывая цитопатические изменения. Репродукция его в культуре тканей сопровождается уплотнением цитоплазмы клеток, появлением в них вакуолей и вирусных частиц. Через 40 часов в цитоплазме некоторых клеток обнаруживается множество малых аморфных эозинофильных включений, окруженных прозрачной зоной. В одной клетке может быть до 12 (и более) таких включений. Через 2 дня в зараженных культурах увеличивается количество клеток с пикнотическим ядром, а через 7 дней поражаются все клетки.
Согласно литературным данным субкультуры клеток по чувствительности к вирусам не уступают первичным культурам и являются более экономичными.
Устойчивость к внешним факторам
Вирус МПВИ птиц активен в пределах pH 4,5÷9, не устойчив к действию высоких температур. Так, при температуре 37°С через 24 часа титр инфекционности понижался до 1 Ig, а через 72 часа вирус полностью инактивировался. При температуре 50°С вирус разрушался через 6 часов. Вирус термочувствителен (к заморозке и оттаиванию), неустойчив при pH 3,0. При температуре 20°С инфекционная активность вируса снижалась до нуля за 4 недели, при 4°С - через 20 недель, а при минус 20°С и минус 70°С не снижалась и через 58 недель. При хранении сухого вируссодержащего материала при комнатной температуре в течение 7 суток вирус сохранял жизнеспособность и размножался в культуре клеток Vero. Большинство дезинфицирующих растворов при температуре 20°С в течение 10 мин полностью не разрушают вирус, кроме органических растворителей таких, как хлороформ и этиловый спирт концентрацией 30÷40%. Препараты, в состав которых входят различные органические кислоты, и препараты, содержащие разные альдегиды, были способны инактивировать вирус in vitro в пределах 15 мин при концентрации 0,5%. Дезинфектанты, такие, как соединения четырехзамещенного аммония, этанол, йодоформ, производные фенола, бигуанид и хлорная известь активно снижали жизнеспособность вируса. По последним данным, метапневмовирус птиц выживает до 72 часов на большинстве поверхностей разных предметов.
Дополнительные признаки и свойства
Обладает антигенной активностью в составе инактивированной вакцины.
Патогенность - выражена.
Вирулентность - выражена.
Контагиозность - выражена.
Онкогенность - отсутствует.
Штамм "PVO3-B" метапневмовируса птиц свободен от контаминации бактериями, микоплазмами и другими гемагглютинирующими вирусами.
Для получения антигенного материала из штамма "PVO3-B" вируса МПВИ в качестве чувствительной системы культивирования используют культуру клеток Vero. Полученный вирусосодержащий материал очищают от балластных примесей центрифугированием или любым другим известным методом.
Для инактивации вируса МПВИ используют АЭЭИ, который добавляют в очищенную вирусосодержащую суспензию до концентрации 0,1%. Инактивацию вируса проводят при температуре +37±0,5°С и pH 7,4÷7,6 в течение 24 часов. По окончании инактивации АЭЭИ нейтрализуют внесением в антигенный материал тиосульфата натрия. Для этого в охлажденную суспензию антигена добавляют 2М раствор тиосульфата натрия из расчета 10% к объему использованного АЭЭИ. Полученный антиген подвергают контролю на антигенную активность, авирулентность, стерильность и pH.
Для изготовления предлагаемой вакцины используют авирулентный очищенный антигенный материал из штамма "PVO3-B" вируса МПВИ, полученного в культуре клеток Vero с инфекционной активностью не ниже 7,0 Ig ТЦД50/см3 до инактивации, в количестве не ниже 15,0 мас.%.
Для изготовления предлагаемой вакцины полученные антигенные материалы из штамма "Ла Сота" вируса НБ птиц, из штамма "1133" вируса РВТ, из штамма "1733" вируса РВТ и из штамма "PVO3-B" вируса МПВИ птиц смешивают в объемном соотношении 0,3:0,6:0,6:1,5 соответственно и смесь тщательно эмульгируют с масляным адъювантом в весовом соотношении, мас.%: 30,0:70,0 соответственно. При этом для получения антигенной фазы препарата используют метод смешивания неодинаковых весовых объемов полученных антигенных материалов в соотношении, мас.%:
| Авирулентный очищенный антигенный материал | 3,0 |
| из штамма "Ла Сота" вируса НБ птиц, полученного | |
| в 9÷12- суточных эмбрионах SPF-кур | |
| с инфекционной активностью | |
| не ниже 10,0 Ig ЭИД50/см3 до инактивации | |
| Авирулентный очищенный антигенный материал | 6,0 |
| из штамма "1133 " вируса РВТ птиц, полученного в культуре | |
| клеток ФЭК с инфекционной активностью | |
| не ниже 7,5 Ig ТЦД50/см3 до инактивации | |
| Авирулентный очищенный антигенный материал | 6,0 |
| из штамма "1733 " вируса РВТ птиц, полученного в культуре | |
| клеток ФЭК с инфекционной активностью | |
| не ниже 7,5 Ig ТЦД50/см3 до инактивации | |
| Авирулентный очищенный антигенный материал | 15,0 |
| из штамма "PVO3-B" метапневмовируса птиц, | |
| полученного в перевиваемой культуре клеток | |
| Vero, с инфекционной активностью не ниже | |
| 7,0 Ig ТЦД50/см3 до инактивации |
Из масляных адъювантов целесообразно использовать масляный адъювант марки Montanide ISA-70 VG производства фирмы "SEPPIC" (Франция, стандарт ИСО 9001).
Содержание антигенов в предлагаемой вакцине в указанном выше соотношении является их эффективным количеством в препарате, обеспечивающим достижение технического результата.
Использование предлагаемого изобретения расширяет арсенал высокоиммуногенных безвредных и ареактогенных эмульсионных инактивированных ассоциированных вакцин против НБ, РВТ и МПВИ птиц, способных защищать взрослое поголовье птиц от заражения возбудителем НБ, а также индуцировать высокий уровень материнских антител у молодняка птиц и соответственно защитить его от заражения вирусами НБ, РВТ и МПВИ в первые дни жизни.
Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исполнения и использования.
Пример 1
Получение антигенного материала из штамма " Ла Сота" вируса НБ.
Для получения производственной расплодки вируса НБ птиц используют вирус производственного штамма "Ла Сота", репродуцированный в 9÷12 - суточных эмбрионах SPF-кур с титром инфекционной и ГА-активности не ниже 8,0 Ig ЭИД50/м3 и 1:1024 соответственно и хранившийся при температуре не выше минус 40°С в течение не более 90 суток. Посевной вирус размораживают при температуре (+18°С)÷(+24°С) и центрифугируют при 2500 об/мин в течение 10 минут. Надосадочную жидкость отбирают, разводят стерильным физиологическим раствором pH 7,2 из расчета 100000-200000 ЭИД50/см3 (1:10000).
Приготовленный таким образом вирусосодержащий материал используют для заражения 9÷10 - суточных эмбрионов SPF-кур. Вирусосодержащий материал вносят в аллантоисную полость в объеме 0,2 см3. Зараженные куриные эмбрионы инкубируют 72÷96 часов при температуре (+36°С)÷(+37°С) и относительной влажности 60÷70%. Овоскопию зараженных эмбрионов проводят ежедневно в течение 96 часов инкубации. По окончании инкубации эмбрионы помещают в холодильную камеру при температуре (+2°С)÷(+6°С) на 16÷18 часов для того, чтобы при вскрытии исключить попадание эритроцитов в алантоисно-эмбриональную жидкость. Перед вскрытием эмбрионы выдерживают 2÷3 часа при комнатной температуре до испарения конденсата (влаги) на скорлупе. После охлаждения куриные эмбрионы вскрывают, соблюдая правила асептики. ЭЭЖ от каждых 20÷30 эмбрионов собирают в стерильные флаконы вместимостью 200÷500 см3. Затем ЭЭЖ центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10÷15 минут для удаления эритроцитов. После центрифугирования вирусный материал сливают в 15÷20 - литровые бутыли. Из каждой бутыли берут пробу в количестве 1,0 см3 для определения титра гемагглютинина и биологической активности вируса НБ. Инфекционная активность вирусосодержащего материала, идущего на составление предлагаемой вакцины, должна быть не ниже 9,0 Ig ЭИД50/см3, а ГА-активность не ниже 1:512.
Полученный вирусный материал подвергают инактивации рабочим раствором АЭЭИ. Для этого предварительно вирусную суспензию нагревают в реакторе до температуры +37,0±0,5°С, а затем в нее добавляют 10%-ный раствор АЭЭИ (рабочий раствор) до конечной концентрации 0,05÷0,1%. После добавления инактиванта смесь перемешивают в течение 20÷30 минут и перекачивают в стерильный реактор.
Инактивацию вируса НБ проводят в течение 24 часов при температуре +37±0,5°С и периодическом перемешивании суспензии. По окончании инактивации полученный антигенный материал охлаждают до (+4°С)÷(+8°С) и хранят не более 60 суток. Из реактора отбирают пробу в количестве 200 см3 для определения титра вирусного антигена в РГА, контроля авирулентности, стерильности и pH.
Используемый для изготовления предлагаемой вакцины антиген вируса НБ должен быть стерильным и авирулентным, иметь титр ГА-активности не ниже 1:512 и pH в пределах 7,0÷7,6. Антигенный материал вируса НБ птиц, входящий в состав предлагаемой вакцины, считают полностью авирулентным, если:
- отсутствует гибель куриных эмбрионов в течение 2-х последовательных пассажей;
- капельная РГА с ЭЭЖ, полученной от куриных эмбрионов после 2-х последовательных пассажей, отрицательная.
Полученный антигенный материал используют в количестве 3,0 мас.% для изготовления эмульсионной формы предлагаемой вакцины.
Пример 2
Получение антигенного материала из штамма "1133" вируса РВТ птиц
Для получения производственной расплодки вируса РВТ птиц используют матровый вирус производственного штамма "1133", репродуцированного в монослойной культуре клеток ФЭК с титром инфекционной активности не ниже 7,5 Ig ТЦД50/см3. В качестве системы культивирования вируса используют выращенную в роллерных сосудах культуру клеток ФЭК с плотным монослоем 2÷3-суточного возраста. Для этого берут эмбрионы SPF-кур, из них готовят первично-трипсинизированную культуру клеток ФЭК в роллерных сосудах емкостью 3 литра. Роллерные сосуды с плотным выросшим монослоем клеток ополаскивают раствором Хенкса и вносят по 10 см3 производственной расплодки реовируса птиц из расчета 0,1 ТЦД50/кл. Роллерные сосуды с инфицированной культурой помещают в роллерный аппарат стеллажного типа с вращением кассет 10÷12 об/час при температуре +37±1°С на 1 час для контакта вируса с клетками. После этого в роллерные сосуды заливают поддерживающую среду ПСП рН 7,3÷7,4 с 2% инактивированной сывороткой КРС в объеме 300 см3. Срок культивирования вируса РВТ птиц от 2 до 3 суток. Для контроля культуры клеток оставляют незараженными 2 сосуда со сменой ростовой среды на поддерживающую в условиях, одинаковых с инфицированными. Через 48 часов инфицированную культуру просматривают под микроскопом. Отбирают сосуды, в которых отмечают ЦПД с поражением 80-90% клеточного монослоя, визуально просматривают на предмет контаминации бактериальной микрофлорой и грибками и замораживают при температуре минус 40°С. После однократного промораживания вирусосодержащую суспензию в роллерных сосудах оттаивают при комнатной температуре, стряхивая клетки с поверхности стекла сосудов. Оттаявшую суспензию сливают в 5-литровые бутыли и из каждой берут пробы высевов на стерильность и биологическую активность. До получения результатов контроля вирусосодержащий материал хранят при температуре +4°С не более 15 суток. После сбора вирусосодержащую суспензию подвергают первичной очистке путем центрифугирования. Центрифугирование проводят в течение 10÷15 минут при 1000 об/мин и температуре (+2°С)÷(+6°С). При этом ЭЭЖ освобождают от осколков скорлупы, клеток и эритроцитов. Очищенную вирусосодержащую суспензию сливают в стеклянные 20-литровые стерильные бутыли.
При активности реовируса не ниже 7,5 Ig ТЦД50/см3 стерильный вирусосодержащий материал используют для инактивации.
Инактивацию вируса РВТ птиц проводят 10%-ным водным раствором АЭЭИ. В предварительно нагретую до+37°С суспензию вируса добавляют раствор АЭЭИ до конечной концентрации 0,1%. Инактивацию вируса проводят в течение 24 часов при pH 7,4÷7,6 и температуре +37±0,5°С с периодическим перемешиванием суспензии. По окончании инактивации суспензию охлаждают до температуры (+4°С)÷(+8°С) и проводят нейтрализацию остаточного количества АЭЭИ путем добавления 2М раствора тиосульфата натрия до конечной концентрации 0,01М. Затем отбирают пробы для определения стерильности и полноты инактивации. Полученный антиген должен быть стерильным и авирулентным. Антигенный материал из штамма "1133" вируса РВТ птиц, входящий в состав предлагаемой вакцины, считают полностью авирулентным, если материал не проявляет ЦПД в третьем пассаже культуры клеток ФЭК. Полученный антиген хранят при температуре 4°С не более 30 суток.
Полученный антигенный материал используют в количестве не менее 6,0 мас.% при изготовлении эмульсионной формы предлагаемой вакцины.
Пример 3
Антигенный материал из штамма "1733" вируса РВТ птиц получают так, как описано в примере 2.
Полученный антигенный материал используют в количестве 6,0 мас.% при изготовлении эмульсионной формы предлагаемой вакцины.
Пример 4
Получение антигенного материала из штамма "PVO3-B" вируса МПВИ птиц.
Для получения производственной расплодки вируса МПВИ птиц используют матровый вирус производственного штамма "PVO3-B", репродуцированного в сформированном плотном монослое культуры клеток Vero 2÷3-суточного возраста с характерным морфологическим рисунком и титром инфекционной активности не ниже 7,0 Ig ТЦД50/см3.
При наработке одного цикла производственной серии метапневмовируса объемом 50 л берут 175 роллерных сосудов. Культуру клеток Vero просматривают под микроскопом, отбирают сосуды со сформированным плотным монослоем без признаков дегенерации клеток. Клетки должны быть блестящими с четко выраженными границами.
Монослой 3÷4-суточной культуры клеток Vero ополаскивают раствором Хенкса, рН 7,1÷7,2, содержащим 100 мкг/см3 канамицина, и инфицируют вирусом производственной расплодки в дозе 0,3÷0,5 ТЦД50/кл. Роллерные сосуды с инфицированной культурой клеток помещают в роллерный аппарат стеллажно-ярусного типа с вращением барабанов 10÷12 об/час при температуре +37,5±0,5°С на 1 час для контакта вируса с клетками. После этого в сосуды заливают поддерживающую среду ПСС, рН 7,3÷7,4, с 2% инактивированной сывороткой крови КРС в объеме 300 см3 на роллерный сосуд. Для контроля используют 2 сосуда: один - со сменой ростовой среды на поддерживающую (контроль среды), другой - без смены среды (контроль клеток).
Роллерные сосуды с инфицированной и контрольной культурой помещают в роллерный аппарат с вращением барабанов 10÷12 об/час при температуре +37,5±0,5°С. Срок культивирования пневмовируса птиц от 3 до 4 сут.
Через 72 часа инфицированную и контрольную культуру просматривают под микроскопом. Сосуды, в которых отмечают цитопатические изменения с поражением 70÷80% клеточного монослоя, отбирают, визуально просматривают на контаминацию бактериальной и грибной микрофлорой.
Отобранные сосуды замораживают при температуре минус 40,0±1,0°С на 24 часа.
После однократного промораживания вирусосодержащую суспензию в роллерных сосудах оттаивают при комнатной температуре, отбивая клетки льдинками с поверхности стекла сосудов.
Оттаявшую суспензию сливают в 5-литровые бутыли и из каждой берут пробы на стерильность и биологическую активность. Вирусосодержащий материал до получения результатов контроля хранят при температуре 4°С не более 10 сут. При активности метапневмовируса птиц не ниже 107,0 ТЦД50/см3 стерильный вирусосодержащий материал используют для инактивации.
Для инактивации метапневмовируса птиц используют АЭЭИ.
Химическая инактивация вируса птиц проходит при 0,2% концентрации АЭЭИ при температуре +37°С, рН среды 7,4÷7,6 в течение 24 часов.
Культуральный метапневмовирус осветляют низкоскоростным центрифугированием при 2000 об/мин (не менее 1000g) в течение 20 мин.
Рабочий раствор АЭЭИ готовят путем разбавления препарата стерильной дистиллированной водой до 10% концентрации; рН раствора доводят до 8,2÷8,3 раствором уксусной кислоты. Приготовление рабочего раствора АЭЭИ проводят за 20÷30 мин до внесения в вирусосодержащую суспензию.
В суспензию вируса, предварительно нагретую до температуры 37°С, добавляют 10% раствор АЭЭИ до конечной концентрации 0,2% и вносят мертиолят из расчета 1:10000. Инактивацию вируса проводят в течение 24 часов при pH 7,4÷7,6 и температуре +37,0±1,0°С с периодическим перемешиванием суспензии (3 мин через каждые 2 час).
По окончании инактивации суспензию охлаждают до температуры 4÷8°С и проводят нейтрализацию остаточного количества АЭЭИ путем добавления 2М раствора тиосульфата натрия до конечной концентрации 0,01 М (0,25%).
Затем отбирают пробы для определения стерильности и полноты инактивации. Полученный антиген должен быть стерильным и авирулентным.
Инактивированный антиген хранят при температуре 4°С не более 30 сут.
Полученный антигенный материал используют в количестве не менее 15,0 мас.% при изготовлении эмульсионной формы предлагаемой вакцины.
Пример 5
Приготовление предлагаемой вакцины
На первом этапе определяли количественные показатели специфических антигенов в составе предлагаемой вакцины. Благодаря исследованию взаимосвязей показателей ее иммунологического действия выявляли наиболее важные технологические величины. Определяли показатели необходимой концентрации инактивированных вирусов НБ, РВТ и МПВИ в составе предлагаемой вакцины, что, в свою очередь позволило установить критерии для величин инфекционных титров этих вирусов в производственных расплодках (ПР) до инактивации. Основные показатели представлены в таблице 1. Установлено, что для индукции у привитого поголовья минимального защитного уровня антител концентрация антигена вируса НБ птиц в 1 см3 предлагаемой вакцины должна иметь величину 8,48 Ig ЭИД50, вируса РВТ - 6,28 Ig ТЦД50 и вируса МПВИ - 6,17 Ig ТЦД50.
В дальнейшем на основании расчетных показателей определяли оптимальный антигенный компонентный состав предлагаемой вакцины. Для этого сопоставляли расчетные количественные величины для вирусов, используемых в составе ассоциированной вакцины с фактическими величинами ПР соответствующих вирусов. Схема компоновки антигенной фазы предлагаемой инактивированной вакцины представлена в таблице 2. При этом для получения антигенной фазы препарата использовали метод смешивания неодинаковых весовых объемов полученных антигенных материалов в соотношении, мас.%:
| Авирулентный очищенный антигенный материал | |
| из штамма "Ла Сота" вируса НБ птиц, полученного | |
| в 9÷12 - суточных эмбрионах SPF- кур с | |
| инфекционной активностью не ниже 10,0 Ig ЭИД50/см3 | |
| до инактивации | 3,0 |
| Авирулентный очищенный антигенный материал | |
| из штамма "1133" вируса РВТ птиц, полученного | |
| в культуре клеток ФЭК с инфекционной | |
| активностью не ниже 7,5 Ig ТЦД50/см3 до инактивации | 6,0 |
| Авирулентный очищенный антигенный материал |
из штамма "1733" вируса РВТ птиц, полученного
в культуре клеток ФЭК с инфекционной
| активностью не ниже 7,5 Ig ТЦД50/см3 до инактивации | 6,0 |
| Авирулентный очищенный антигенный материал | |
| из штамма "PVO3-B" метапневмовируса птиц, | |
| полученного в перевиваемой культуре клеток | |
| Vero, с инфекционной активностью | |
| не ниже 7,0 Ig ТЦД50/см3 до инактивации | 15,0 |
После контроля на стерильность и полноту инактивации полученные антигенные материалы из вирусов НБ, РВТ и МПВИ объединяли в объемном соотношении 0,3:0,6:0,6:1,5 соответственно в стерильном реакторе при температуре (+4°С)-(+8°С), перемешивали в течение 20÷30 минут с помощью пропеллерной мешалки. Реактор со смесью антигенов через систему трубопроводов подключали к проточной центрифуге ОТР-102 К-01. Центрифугу разгоняли до 15000÷17000 об/мин и в нее подавали антигенную смесь. После прохождения центрифуги очищенная суспензия поступала в стерильную промежуточную емкость, а из нее - на фильтровальную установку с элементами ЭПРС, где смесь антигенов дополнительно очищалась от белковых компонентов. После фильтрования очищенная антигенная смесь поступала в стерильный реактор - накопитель с температурой во внутренней полости (+4°С)-(+8°С).
Полученный антигенный материал тщательно эмульгировали с масляным адъювантом в соотношении, мас.%: 30,0:70,0 соответственно. В качестве целевой добавки использовали масляный адъювант марки Montanide ISA-70 VG производства фирмы "Seppic" (Франция, стандарт ИСО 9001).
Изготовление предлагаемой вакцины проводили в 2 стадии. На стадии получения предэмульсии в реактор со стерильным масляным адъювантом при включенной пропеллерной мешалке (250-300 об/мин) подавали необходимый объем смеси приготовленных инактивированных антигенов со скоростью 100÷120 литров в час. После подачи антигена в адъювант смесь продолжали перемешивать с той же скоростью в течение 60÷90 минут при температуре в пределах (+12°С)÷(+16°С).
На стадии получения эмульсии включали гомогенизатор "Silverson - 450 LS" и проводили эмульгирование смеси в течение 3 часов. Пропеллерная мешалка при этом не выключалась. Процесс эмульгирования проводили при температуре (+12°С)÷(+16°С). После окончания эмульгирования из реактора отбирали пробу вакцины, выдерживали ее при температуре (+2°С)÷(+8°С) в течение 1 суток и проводили контроль препарата на стерильность, безвредность, ареактогенность, антигенную активность, а также физических параметров эмульсии: тип эмульсии, вязкость и стабильность.
Предлагаемая вакцина имеет оптимальный компонентный состав, мас.%:
| Авирулентный очищенный антигенный материал | |
| из штамма "Ла-Сота" вируса НБ птиц, полученного | |
| в 9÷12 - суточных эмбрионах SPF-кур с | |
| инфекционной активностью | |
| не ниже 10,0 Ig ЭИД50/см3 до инактивации | 3,0 |
| Авирулентный очищенный антигенный материал | |
| из штамма "1133" вируса РВТ птиц, полученного | |
| в культуре клеток ФЭК с инфекционной | |
| активностью не ниже 7,5 Ig ТЦД50/см3 до инактивации | 6,0 |
| Авирулентный очищенный антигенный материал | |
| из штамма "1733" вируса РВТ птиц, полученного | |
| в культуре клеток ФЭК с инфекционной | |
| активностью не ниже 7,5 Ig ТЦД50/см3 до инактивации | 6,0 |
| Авирулентный очищенный антигенный материал | |
| из штамма "PVO3-B" метапневмовируса птиц, | |
| полученного в перевиваемой культуре клеток | |
| Vero с инфекционной активностью | |
| не ниже 7,0 Ig ТЦД50/см3 до инактивации | 15,0 |
| Масляный адъювант | до 100,0. |
Содержание антигенных материалов в предлагаемой вакцине в указанных выше пределах является их эффективным количеством в препарате, обеспечивающим достижение технического результата от использования изобретения.
Для проверки эффективности предлагаемого препарата были изготовлены 2 серии вакцины согласно изобретению, в составе которых использовали вирусные антигены с различной инфекционной активностью до инактивации.
Серия №1 вакцины ассоциированной против НБ, РВТ и МПВИ птиц инактивированной эмульсионной содержала, мас.%:
| Авирулентный очищенный антигенный материал | |
| из штамма "Ла-Сота" вируса НБ птиц, полученного | |
| в 9÷12 - суточных эмбрионах SPF-кур | |
| с инфекционной активностью | |
| 10,8 Ig ЭИД50/см3 до инактивации | 3,0 |
| Авирулентный очищенный антигенный | |
| материал из штамма "1133" вируса РВТ птиц, | |
| полученного в культуре клеток ФЭК | |
| с инфекционной активностью | |
| 7,5 Ig ТЦД50/см3 до инактивации | 6,0 |
| Авирулентный очищенный антигенный | |
| материал из штамма "1733" вируса РВТ птиц, | |
| полученного в культуре клеток ФЭК | |
| с инфекционной активностью | |
| 8,0 Ig ТЦД50/см3 до инактивации | 6,0 |
| Авирулентный очищенный антигенный материал | |
| из штамма "PVO3-B" метапневмовируса птиц, | |
| полученного в перевиваемой культуре клеток | |
| Vero с инфекционной активностью | |
| 7,5 Ig ТЦД50/см3 до инактивации | 15,0 |
| Масляный адъювант | до 100,0 |
Серия №2 вакцины ассоциированной против НБ, РВТ и МПВИ птиц инактивированной эмульсионной содержала, мас.%:
| Авирулентный очищенный антигенный | |
| материал из штамма "Ла Сота" вируса НБ птиц, | |
| полученного в 9÷12 - суточных эмбрионах SPF - кур | |
| с инфекционной активностью | |
| 11,0 Ig ЭИД50/см3 до инактивации | 3,0 |
| Авирулентный очищенный антигенный | |
| материал из штамма "1133" вируса РВТ птиц, | |
| полученного в культуре клеток ФЭК | |
| с инфекционной активностью | |
| 7,6 1д ТЦД50/см3 до инактивации | 6,0 |
| Авирулентный очищенный антигенный | |
| материал из штамма "1733" вируса РВТ птиц, | |
| полученного в культуре клеток ФЭК | |
| с инфекционной активностью | |
| 8,0 Ig ТЦД50/см3 до инактивации | 6,0 |
| Авирулентный очищенный антигенный материал | |
| из штамма "PVO3-B" метапневмовируса птиц, | |
| полученного в перевиваемой культуре клеток | |
| Vero с инфекционной активностью | |
| 7,8 Ig ТЦД50/см3 до инактивации | 15,0 |
| Масляный адъювант | до 100,0 |
Полученная вакцина представляет собой однородную эмульсию бело-розового цвета. Допускается отслоение в верхней части флакона слоя масла. При интенсивном встряхивании однородность содержимого легко восстанавливается.
Стерильность вакцины определяли в соответствии с ГОСТ 28085-89 "Препараты биологические. Методы биологического контроля стерильности". Сущность метода заключается в определении отсутствия роста бактериальной и грибковой микрофлоры в посевах из образцов вакцины на питательные среды.
Для проверки безвредности вакцину в объеме 1,0 см3 вводили 10 цыплятам подкожно в область средней трети шеи или внутримышечно в грудную мышцу. Вакцину считали безвредной, если все цыплята в течение 21 суток оставались живыми, без клинических признаков переболевания. При вскрытии птицы на месте введения вакцины не должно быть выраженной воспалительной реакции.
Антигенную активность полученного препарата определяли следующим образом. Прежде всего формировали опытную и контрольную группы цыплят по 10 голов в каждой. Цыплятам опытной группы вводили вакцину в объеме 0,7 см3 однократно подкожно в область средней трети шеи или внутримышечно в область груди. 10 интактных цыплят оставляли в качестве контроля. Сыворотки крови получали от всех цыплят опытной и контрольной групп до вакцинации и через 28 суток после прививки для выявления специфических антител.
Оценку антигенной активности предлагаемой вакцины по антигенному компоненту НБ птиц проводили в РТГА согласно "Методическим указаниям по определению уровня антител к вирусу НБ птиц в реакции торможения гемагглютинации (РТГА)" или методом ИФА согласно наставлению по применению соответствующего набора. Использовали индивидуальные сыворотки, полученные от цыплят контрольной и опытной групп до и после вакцинации.
Оценку антигенной активности предлагаемой вакцины по антигенному компоненту "реовирус" проводили в ИФА согласно "Методическим указаниям по определению уровня антител к реовирусу в ИФА". Исследовали индивидуальные сыворотки, полученные от цыплят контрольной и трех опытных групп до и после вакцинации. Три группы цыплят вакцинировали образцами, содержащими раздельно антигены штаммов "1133" и "1733", и образцом вакцины, содержащим смесь антигенов штаммов "1133" и "1733". Количественное содержание антигенов сохранялось во всех образцах. Контрольных цыплят не вакцинировали.
Установлено, что образец вакцины, содержащий смесь антигенов штаммов "1133" и "1733", индуцировал иммунный ответ у вакцинированных цыплят в 2 раза выше, чем образец вакцины, содержащий антиген штамма "1133", и на 10% выше, чем образец вакцины, содержащий антиген штамма "1733". Результаты исследований представлены в таблице 3 и на фиг.1.
Оценку антигенной активности предлагаемой вакцины по антигенному компоненту "метапневмовирус" проводили в ИФА согласно "Методическим указаниям по определению уровня антител к метапневмовирусу в ИФА". Исследовали индивидуальные сыворотки, полученные от цыплят контрольной и опытной групп до и после вакцинации.
Предлагаемую вакцину считали антигенно-активной, если через 28 суток после вакцинации не менее чем у 80% привитых цыплят титр антител составлял:
- к вирусу НБ птиц не ниже 5,0 log2 в РТГА;
- к реовирусу не ниже двух минимальных положительных значений в ИФА;
- к метапневмовирусу процент блокирования антител в ИФА не менее 40.
Стабильность эмульсии определяли методами центрифугирования образца вакцины, "быстрого старения" образца вакцины и определения гранулометрического состава препарата. Кинематическую вязкость вакцины определяли на вискозиметре ВПЖ-2 и выражали в мм2/сек. Полученная вакцина, содержащая в своем составе масляный адъювант марки Montanide ISA-70 VG, образующего тип эмульсии "вода-масло", имела относительную вязкость, не превышающую 200 мм2/сек.
При положительных результатах контроля полученную вакцину фасовали в стерильные флаконы объемом 250 см3 по 210 мл (300 доз).
Вакцина ассоциированная против НБ, РВТ и МПВИ птиц инактивированная эмульсионная предназначена для профилактики указанных заболеваний в неблагополучных и угрожаемых по данным заболеваниям хозяйствах различного направления выращивания птицы. Вакцинации подлежит клинически здоровая птица в возрасте 40÷120 суток, но не позднее чем за 1 месяц до начала яйцекладки. Перед применением вакцину выдерживают в помещении 6÷9 часов при температуре (+20°С)÷(+25°С). Вакцину вводят однократно подкожно в среднюю треть шеи или внутримышечно в область грудной мышцы в дозе 0,7 см3.
Через 28 суток после иммунизации птиц проводят контроль напряженности иммунитета к вирусам НБ, РВТ и МПВИ, исследуя не менее 25 проб сывороток крови в РТГА и/или в ИФА.
Вакцинация считается успешной, если не менее чем у 80% привитых птиц уровень антител составляет:
- к вирусу НБ не ниже 5,0 log2 в РТГА или не ниже двух минимальных положительных значений в ИФА с соответствующими тест-системами, зарегистрированными в РФ;
- к вирусу РВТ птиц не ниже двух минимальных положительных значений в ИФА с соответствующими тест-системами, зарегистрированными в РФ;
- к вирусу МПВИ процент блокирования антител в ИФА не менее 40 с соответствующими тест-системами, зарегистрированными в РФ.
Предлагаемая вакцина индуцирует у привитых птиц иммунный ответ к возбудителям НБ, РВТ и МПВИ через 28 суток после применения, который сохраняется в течение 12 месяцев и трансовариально передается потомству.
Пример 6
Проведены испытания антигенной и иммуногенной активности вакцины ассоциированной против НБ, РВТ и МПВИ птиц инактивированной эмульсионной (серия №1), изготовленной так, как описано в примере 5, и содержащей, мас.%:
| Авирулентный очищенный антигенный материал | |
| из штамма "Ла-Сота" вируса НБ птиц, полученного | |
| в 9÷12-суточных эмбрионах SPF-кур | |
| с инфекционной активностью | |
| 10,8 lg ЭИД50/см3 до инактивации | 3,0 |
| Авирулентный очищенный антигенный | |
| материал из штамма "1133" вируса РВТ птиц, | |
| полученного в культуре клеток ФЭК | |
| с инфекционной активностью | |
| 7,5 Ig ТЦД50/см3 до инактивации | 6,0 |
| Авирулентный очищенный антигенный | |
| материал из штамма "1733" вируса РВТ птиц, | |
| полученного в культуре клеток ФЭК | |
| с инфекционной активностью | |
| 8,0 Ig ТЦД50/см3 до инактивации | 6,0 |
| Авирулентный очищенный антигенный материал | |
| из штамма "PVO3-B" метапневмовируса птиц, | |
| полученного в перевиваемой культуре клеток | |
| Vero с инфекционной активностью | |
| 7,5 Ig ТЦД50/см3 до инактивации | 15,0 |
| Масляный адъювант | до 100,0 |
Испытание иммуногенной активности полученного препарата провели на 20 цыплятах в возрасте 70 суток, десять цыплят иммунизировали внутримышечно в прививном объеме 0,7 см3, а 10 цыплят оставили не вакцинированными в качестве контрольной группы. Отбор крови для получения сывороток осуществляли до вакцинации, через 14, 28 и 60 суток после ее проведения. Сыворотки крови исследовали методом РТГА на наличие антител к вирусу НБ и методом ИФА на наличие антител к вирусам РВТ и МПВИ. Результаты исследований титров антител по каждому антигенному компоненту серии №1 вакцины приведены в таблице 4.
Данные таблицы 4 свидетельствуют о том, что титры антител против НБ, РВТ и МПВИ у птиц через 28 суток значительно увеличивались по сравнению с исходными показателями и в несколько раз превышали требуемые минимальные титры ко всем антигенным компонентам вакцины и сохранялись на высоком уровне к 60 суткам наблюдений. Титры антител ко всем антигенным компонентам в контрольной группе оставались на примерно одном уровне в течение всего срока наблюдений (60 суток).
Результаты изучения динамики образования поствакцинальных антител на каждый антигенный компонент ассоциированной вакцины в графическом виде представлены на фиг.2÷4.
Данные, приведенные на фиг.2, свидетельствуют о том, что полученная вакцина обладает высокой антигенной активностью и вызывает у птиц формирование высоких титров антител к вирусу НБ птиц, причем прирост титров антител был постоянным в течение всего срока наблюдений и достигал максимального значения 11,4±0,73 log2 через 60 суток после прививки.
Данные, приведенные на фиг.3, свидетельствуют о том, что испытуемая вакцина продемонстрировала высокую антигенную активность. У привитых птиц регистрировали равномерный прирост титров антител к вирусу РВТ в течение всего срока наблюдения, которые достигали максимального значения 3657±471 через 60 суток после прививки.
Данные, приведенные на фиг.4, свидетельствуют о том, что испытуемая вакцина продемонстрировала высокую антигенную активность. У привитых птиц регистрировали равномерный прирост титров антител к вирусу МПВИ в течение всего срока наблюдения, которые достигали максимального значения 71,6% через 60 суток после прививки.
Предложенная вакцина вызывает формирование титров антител, которые значительно, более чем в 2 раза, превышали минимальные защитные титры, которые выражают протективную реакцию от соответствующих инфекций.
Через 60 суток после вакцинации во всех группах после диагностического убоя производили осмотр места введения вакцины, результатом которого явилось отсутствие в них остатков эмульсии, воспалительных изменений или участков некроза.
Таким образом, вакцина ассоциированная против НБ, РВТ и МПВИ птиц инактивированная эмульсионная обладает высокой иммуногенной и антигенной активностью в отношении всех 3 антигенных компонентов и безвредна для птиц.
Пример 7
Проведена проверка безвредности, реактогенности и иммуногенной активности вакцины ассоциированной против НБ, РВТ и МПВИ птиц инактивированной эмульсионной (серия №2), изготовленной так, как описано в примере 5, и содержащей мас.%:
| Авирулентный очищенный антигенный | |
| материал из штамма "Ла Сота" вируса НБ птиц, | |
| полученного в 9÷12-суточных эмбрионах SPF - кур | |
| с инфекционной активностью | |
| 11,0 Ig ЭИД50/см3 до инактивации | 3,0 |
| Авирулентный очищенный антигенный | |
| материал из штамма "1133" вируса РВТ птиц, | |
| полученного в культуре клеток ФЭК | |
| с инфекционной активностью | |
| 7,6 Ig ТЦД50/см3 до инактивации | 6,0 |
| Авирулентный очищенный антигенный | |
| материал из штамма "1733" вируса РВТ птиц, | |
| полученного в культуре клеток ФЭК | |
| с инфекционной активностью | |
| 8,0 Ig ТЦД50/см3 до инактивации | 6,0 |
| Авирулентный очищенный антигенный материал | |
| из штамма "PVO3-B" метапневмовируса птиц, | |
| полученного в перевиваемой культуре клеток | |
| Vero с инфекционной активностью | |
| 7,8 Ig ТЦД50/см3 до инактивации | 15,0 |
| Масляный адъювант | до 100,0 |
Проверку препарата на безвредность и реактогенность проводили на цыплятах кросса "Хайсекс-браун" в возрасте 70 суток. При однократном введении вакцины в дозе 1,0 см3 птицы оставались живыми и клинически здоровыми на протяжении 21 сут наблюдения. После убоя птиц в местах введения вакцины не было обнаружено признаков воспаления, участков некроза или следов нерассосавшейся вакцинной эмульсии.
Оценку иммуногенной активности препарата проводили на цыплятах кросса "Хайсекс-браун" в возрасте 70 суток. Вакцину вводили внутримышечно в грудные мышцы в прививном объеме 0,7 см3 цыплятам в количестве 10 голов, а еще 10 голов оставили не вакцинированными в качестве контроля. Для получения сывороток у подопытной и контрольной групп птиц отбирали кровь до вакцинации, через 14, 28 и 60 суток и исследовали на наличие титров антител к вирусу НБ с помощью РТГА и к вирусам РВТ и МПВИ с помощью ИФА. Вакцина ассоциированная считается иммуногенной, если через 28 суток не менее чем у 80% привитых птиц накопление антител к вирусам НБ, РВТ и МПВИ обнаруживается в следующих титрах:
- к вирусу НБ не ниже 5 log2 в РТГА, не ниже двух минимальных положительных значений в ИФА;
- к вирусу РВТ не ниже двух минимальных положительных значений в ИФА;
- к вирусу МПВИ процент блокирования антител в ИФА не менее 40.
Результаты испытаний приведены в таблице 5.
Данные, приведенные в таблице 5, свидетельствуют о том, что титры антител против НБ, РВТ и МПВИ через 28 суток значительно увеличивались по сравнению с исходными титрами, в несколько раз превышали требуемые минимальные титры ко всем антигенным компонентам вакцины и сохранялись на высоком уровне к 60 суткам наблюдений. Титры антител ко всем антигенным компонентам в контрольной группе оставались на одном уровне в течение всего срока наблюдений (60 суток).
Результаты изучения динамики образования поствакцинальных антител на каждый антигенный компонент ассоциированной вакцины в графическом виде представлены на фиг.5÷7.
Данные, приведенные на фиг.5, свидетельствуют о том, что полученная вакцина обладает высокой антигенной активностью и вызывает у птиц формирование высоких титров антител к вирусу НБ птиц, прирост титров антител был постоянным в течение всего срока наблюдений и достигал максимального значения 11,2±1,63 log2 через 60 суток после прививки.
Данные, приведенные на фиг.6, свидетельствуют о том, что испытуемая вакцина продемонстрировала высокую антигенную активность. У привитых птиц регистрировали равномерный прирост титров антител к вирусу РВТ в течение всего срока наблюдения, которые достигали максимального значения 3847±326 через 60 суток после прививки.
Данные, приведенные на фиг.7, свидетельствуют о том, что испытуемая вакцина продемонстрировала высокую антигенную активность. У привитых птиц регистрировали равномерный прирост титров антител к вирусу МПВИ в течение всего срока наблюдения, которые достигали максимального значения 86,6% через 60 суток после прививки.
Предложенная вакцина вызывает формирование титров антител, которые значительно, более чем в 2 раза, превышали минимальные защитные титры, которые выражают протективную реакцию от соответствующих инфекций.
По окончании срока наблюдений птиц убивали, вскрывали места введения вакцины и визуально оценивали их на наличие воспалительных реакций, очагов некроза и остатков вакцинной эмульсии. У всех птиц вакцинированной группы (10 голов) в толще мускулатуры, в месте введения вакцины не было обнаружено некротических очагов, признаков воспаления или присутствия остатков вакцинной эмульсии.
Таким образом, вакцина ассоциированная против НБ, РВТ и МПВИ птиц инактивированная эмульсионная является высокоиммуногенным препаратом, безопасна для птиц и может использоваться для вакцинации кур против НБ, РВТ и МПВИ.
Источники информации
1. Справочник ветеринарного врача птицеводческого предприятия. Т.1-2. - СПб., 1995 г.
2. Джавадов Э.Д. Вирус-индуцированные иммуносупрессии и способы их предупреждения в промышленном птицеводстве. // Автореферат дис. докт. вет. наук - М. - 2004. С.50.
3. Виноходов В.О. Синдром "опухшей головы" или введение в отоларингологию птиц // Ветеринария в птицеводстве. - 2003. - №1 (7). - С.14-27.
4. Борисова И.А. и Старов С.К. Пневмовирусная инфекция птиц // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир. - 2006. - Т.4. - С.281÷296.
5. Бессарабов Б.Ф., Лазуткина Е.А., Мельникова И.И. и Яковлев А.Г. Пневмовирусы птиц // Био-инфо. - 2007. - №5. - С.7÷9.
6. Борисова О.А. и Борисова И.А. Метапневмовирусная инфекция птиц // Обзор литературы. - Владимир: ФГУ "ВНИИЗЖ". - 2007. - 77 с.
7. Борисов В.В., Борисов А.В., Старов С.К. Особенности применения инактивированных вакцин в птицеводстве // БИО. - 2007. - №2. - С.37÷41.
8. Горшкова Т.К., Панферова С.М. и Воронина Г.А. Инактивированная вакцина против ньюкаслской болезни птиц из очищенного и концентрированного вируса // Акт. вопр. вет. вирусолог.: тез. докл. научн.-теорет. конф. мол. ученых, ноябрь 1990 г. - Владимир, 1990. - С.73÷74.
9. Сюрин В.Н. и 3 соавт. Вирусные болезни животных. - М.: ВНИТИБП, 1998. - С.213÷238.
10. Сюрин В.Н. и 3 соавт. Вирусные болезни животных. - М.: ВНИТИБП, 1998. - С.17÷19.
11. Пат. США №5525342; A61K 39/295, 39/15, 39/255, 39/215; 10.06.1996 г.
12. Пат. США №5833995, A61K 39/15, 10.11.1998 г.
13. Пат. США №6159472; A61K 39/00, 39/12, 39/15, 12.12.2000 г.
14. Сарбасов А.Б., Старов С.К., Борисов А.В. и 3 соавт. Изучение антигенных свойств пневмовируса птиц на цыплятах // Материалы Международной научной конференции, посвященной 45-летию ФГУ "ВНИИЗЖ" "Актуальные проблемы инфекционной патологии животных". - Владимир. - 30÷31 октября 2003 года. - С.354÷356.
15. Пронин А.С., Герасимова Н.И., Волкова М.А., Хлебовец З.Б. и Борисова И.А. Обоснование выбора подтипа пневмовируса птиц в качестве антигена инактивированной вакцины // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир: Издательство "Посад", 2006. - Т.4. - С.315÷328.
16. Борисова И.А. Разработка технологии изготовления и контроля инактивированной вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц // Автореферат дис. канд. биол. наук. - Владимир. - 2008. - 25 с.
17. Борисова И.А. Разработка технологии изготовления и контроля инактивированной вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц // Дис.…канд. биол. наук. -Владимир. - 2008. - 167 с.
18. Дубовой А.С., Джавадов Э.Д. и Полежаев Ф.И. Иммунитет у птицы, привитой поливалентной инактивированной эмульсионной вакциной "Авикрон" // Ветеринария. - 2004, №4. - С.13÷14.
19. Джавадов Э. Д., Дмитриева М.Е., Вихрева И.Н., Дубовой А.С. и Самусева Г.Н. Инактивированные вакцины серии "Авикрон " - эффективная профилактика болезней птиц в промышленном птицеводстве // Ветеринария. - 2009, №6. - С.13÷14.
20. Борисова И.А. Антигенная активность экспериментальной инактивированной эмульсионной вакцины против ньюкаслской болезни и пневмовирусной инфекции птиц // Ветеринарная патология. - 2006. - №4 (19). - С.144÷146.
21. Борисова И.А., Старев С.К. и Сарбасов А.Б. Изучение иммунобиологических свойств инактивированной эмульсионной вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц в производственных условиях // Ветеринарная патология. - 2007. - №4 (23). - С.137÷141.
| Таблица 1 | |||
| Показатели концентрации антигенов, входящих в состав предлагаемой вакцины | |||
| Антиген | Минимальный титр инфекционной активности производственной расплодки до инактивации, Ig ЭИД50/см3, Ig ТЦД50/см3 | Концентрация антигенов в 1 см3 предлагаемой вакцины, Ig ЭИД50/см3, Ig ТЦД50/см3 | |
| НБ штамм «Ла Сота» | 10,00 | 8,48 | |
| РВТ | штамм «1133» | 7,50 | 6,28 |
| штамм «1733» | 7,50 | 6,28 | |
| МПВИ штамм «PVO3-B» | 7,00 | 6,17 |
| Таблица 2 | |||
| Состав антигенной фазы предлагаемой вакцины | |||
| Антиген | НБ | РВТ | МПВИ |
| Объем | 0,3 | 0,6:0,6 | 1,5 |
| Разведение | 1:9 | 1:1,5 | 1:1 |
| Примечание: принимая 1 (единицу) за условный полный объем при равном объемном соотношении антигенов |
| Таблица 3 | |||||
| Динамика формирования поствакцинальных антител у цыплят после иммунизации образцами предлагаемой вакцины, содержащих в своем составе различные комбинации штаммов реовирусного теносиновита | |||||
| Образцы вакцин | Антигенный компонент | Титры антител к вирусу РВТ1 | |||
| срок после вакцинации, сут | |||||
| Д/В | 14 | 21 | 28 | ||
| 1 | РВТ шт."1133" | 722±256 | 1249±711 | 1677±552 | 1864±620 |
| 2 | РВТ шт."1733" | 722±256 | 1067±793 | 3115±1045 | 3319±833 |
| 3 | РВТ шт."1133"+"1733" | 722±256 | 1930±513 | 3246±667 | 3681±980 |
| контроль | 722±256 | 966±274 | 844±452 | 914±315 | |
|
1 - титры антител к вирусу РВТ в ИФА (М±m); Д/В - до вакцинации. |
| Таблица 4 | |||||
| Результаты испытаний иммуногенной активности серии №1 предлагаемой вакцины | |||||
| Антигенный компонент | Титры антител | ||||
| Протективные титры | Фактические титры, сут наблюдений | ||||
| Д/В | 14 | 28 | 60 | ||
| НБ (РТГА)1 | 5 log2 | 2,90±0,99 | 9,60±0,52 | 10,20±0,45 | 11,40±0,73 |
| Контроль | 2,90±0,99 | 2,70±0,67 | 2,80±0,79 | 2,20±1,55 | |
| РВТ (ИФА)2 | 2150 | 596±231 | 2797±343 | 3270±644 | 3657±471 |
| Контроль | 596±231 | 608±176 | 575±115 | 402±274 | |
| МПВИ (ИФА)3 | 40 | 3,3 | 42,7 | 66,8 | 71,6 |
| Контроль | 3,3 | 6,7 | 5,2 | 9,2 | |
| 1 - титры антител к вирусу НБ в РТГА, log2 (M±m); | |||||
| 2 - титры антител к вирусу РВТ в ИФА (М±m); | |||||
| 3 - средний процент блокирования антител к вирусу МПВИ в ИФА; | |||||
| Д/В - до вакцинации. |
| Таблица 5 | |||||
| Результаты оценки иммуногенной активности серии №2 предлагаемой вакцины | |||||
| Антигенный компонент | Титры антител | ||||
| Протективные титры | Фактические титры, сут наблюдений | ||||
| Д/В | 14 | 28 | 60 | ||
| НБ (РТГА)1 | 5 log2 | 1,80±1,25 | 9,30±0,72 | 10,50±0,95 | 11,20±1,63 |
| Контроль | 1,80±1,25 | 2,00±1,05 | 2,20±1,69 | 2,20±1,35 | |
| РВТ (ИФА)2 | 2150 | 148±108 | 2275±1267 | 3098±479 | 3847±326 |
| Контроль | 148±108 | 277±212 | 234±122 | 302±174 | |
| МПВИ (ИФА)3 | 40 | 2,1 | 40,7 | 81,8 | 86,6 |
| Контроль | 2,1 | 0,7 | 1,2 | 4,0 | |
| 1 - титры антител к вирусу НБ в РТГА, log2 (M±m); | |||||
| 2 - титры антител к вирусу РВТ в ИФА (М±m); | |||||
| 3 - средний процент блокирования антител к вирусу МПВИ в ИФА; | |||||
| Д/В - до вакцинации. |
1. Вакцина ассоциированная против ньюкаслской болезни (НБ), реовирусного теносиновита (РВТ) и метапневмовирусной инфекции (МПВИ) птиц инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество и целевую добавку, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества она содержит смесь из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма "Ла Сота" вируса НБ птиц сем. Paramyxoviridae, подсем. Paramyxovirinae, рода Avulavirus, серотипа 1, из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма "1133" вируса РВТ птиц сем. Reoviridae, рода Orthoreovirus, коллекция ФГУ "ВГНКИ" "1133 -ДЕП," из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма "1733" вируса РВТ птиц сем. Reoviridae, рода Orthoreovirus, коллекция ФГУ "ВГНКИ" “1733”-116-ДЕП,” и из авирулентного очищенного антигенного материала штамма "PVO3-B №127 ДЕП" вируса МПВИ птиц сем. Paramyxoviridae, подсемейства Pneumovirinae, рода Metapneumovirus, подтипа В, коллекция ФГУ "ВГНКИ" "PVO3-B №127 ДЕП", взятых в объемном соотношении 0,3:0,6:0,6:1,5 соответственно и в количествах, обеспечивающих протективную иммуногенную активность каждого антигена в организме птицы после введения ей целевого препарата.
2. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный очищенный антигенный материал из штамма "Ла Сота" вируса НБ птиц, полученного в 9÷12-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью не ниже 10,0 Ig ЭИД50/см3 до инактивации, в количестве 3,0 мас.%.
3. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный очищенный антигенный материал из штамма "1133" вируса РВТ птиц, полученного в культуре клеток ФЭК с инфекционной активностью не ниже 7,5 Ig ТЦД50/см3 до инактивации, в количестве 6,0 мас.%.
4. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный очищенный антигенный материал из штамма "1733" вируса РВТ птиц, полученного в культуре клеток фибробластов эмбрионов SPF-кур (ФЭК) с инфекционной активностью не ниже 7,5 Ig ТЦД50/см3 до инактивации, в количестве 6,0 мас.%.
5. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный очищенный антигенный материал из штамма "PVO3-B" вируса МПВИ птиц, полученного в культуре клеток Vero с инфекционной активностью не ниже 7,0 Ig ТЦД50/см3 до инактивации, в количестве 15,0 мас.%.
6. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что в качестве целевой добавки она содержит масляный адъювант в количестве не менее 70,0 мас.%.
7. Вакцина по любому из пп.1÷6, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества она содержит смесь из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма "Ла Сота" вируса НБ птиц, полученного в 9÷12-суточных эмбрионах SPF - кур с инфекционной активностью не ниже 10,0 Ig ЭИД50/см3 до инактивации, из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма "1133" вируса РВТ птиц, полученного в культуре клеток ФЭК с инфекционной активностью не ниже 7,5 Ig ТЦД50/см3 до инактивации, из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма "1733" вируса РВТ, полученного в культуре клеток ФЭК с инфекционной активностью не ниже 7,5 Ig ТЦД50/см3 до инактивации, и из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма "PVO3-B" вируса МПВИ, полученного в культуре клеток Vero с инфекционной активностью не ниже 7,0 Ig ТЦД50/см3 до инактивации, а в качестве целевой добавки масляный адъювант в соотношении, мас.%:
| Антигенный материал из штамма "Ла Сота" | |
| вируса НБ | 3,0 |
| Антигенный материал из штамма | |
| "1133" вируса РВТ | 6,0 |
| Антигенный материал из штамма | |
| "1733" вируса РВТ | 6,0 |
| Антигенный материал из штамма | |
| "PVO3-B" вируса МПВИ | 15,0 |
| Масляный адъювант | до 100,0. |
