Питательная среда для выделения, культивирования и определения гемолитических свойств бактерий из клинического материала

Изобретение относится к микробиологии, в частности к питательным средам, и может быть использовано в научно-исследовательской и практической работе для бактериологической диагностики бактерий. Питательная среда содержит ГМФ-агар, эритроцитарную массу из донорской крови человека, сыворотку крупного рогатого скота и дрожжевой экстракт в заданном соотношении. Изобретение позволяет повысить чувствительность среды к выделяемым микроорганизмам, улучшить ростовые свойства питательной среды и упростить способ ее приготовления.

 

Изобретение относится к микробиологии, в частности к питательным средам, может быть использовано в научно-исследовательской и практической работе для бактериологической диагностики бактерий, в том числе бронхолегочных патогенов, таких как: Streptococcus pneumoniae, Moraxella (Branchamella) catarrhalis, Streptococcus pyogenes, β-гемолитические Streptococcus spp., Staphylococcus aureus.

Болезни органов дыхания по официальным статистическим данным стабильно занимают в нашей стране первое место в структуре общей заболеваемости детей и подростков. Многие клинические формы респираторной патологии определяют уровень детской заболеваемости и младенческой смертности. Нередко бронхолегочные болезни, начавшись у детей, продолжаются в зрелом возрасте, приводят больных к инвалидности, а иногда - к драматическим исходам [10]. Поэтому важно совершенствование лабораторной диагностики воспалительных заболеваний дыхательной системы и ЛОР-органов, в том числе бактериальной этиологии у детей.

Выбор питательных сред для посева клинического материала от пациентов с воспалительными заболеваниями дыхательной системы и ЛОР-органов затруднен в связи с многочисленностью возбудителей и разнообразием клинического материала при данной патологии.

Известна питательная среда для посева и выделения Streptococcus pneumoniae, пропись которой разработана Катосовой Л.К. [1, 2], для которой в качестве агаровой основы можно использовать эритрит-агар, сухой питательный агар, ГРМ-агар №1 (содержит панкреатический гидролизат рыбной муки, сухой), ГРМ-агар (сухой), АГВ (агар Гивенталя-Ведьминой) с оптимальной рН среды - 7,2±0,2. После стерилизации агар охлаждают до температуры 45°C, добавляют 10% инактивированной лошадиной сыворотки, 3% эритроцитарной массы или 5% дефибринированной крови.

В готовую основу, в качестве которой могут быть использованы эритрит-агар, сухой питательный агар, ГРМ-агар №1, ГРМ-агар, агар Гивенталя-Ведьминой, приготовленную по прописи, указанной на этикетке, рН 7,2±0,2, охлажденную до 45°С, добавить:

1) 3% эритроцитарной массы (на 100 мл основы - 3 мл) или 5% дефибринированной крови;

2) 10% инактивированной лошадиной сыворотки (на 100 мл основы - 10 мл);

3) разлить в чашки Петри.

К недостаткам данной питательной среды следует отнести хорошие ростовые свойства в отношении только Streptococcus pneumoniae; использование лошадиной сыворотки для большинства практических лабораторий клинической микробиологии, особенно области, затруднительно, что в конечном итоге увеличивает себестоимость конечного продукта.

Известна питательная среда 5% кровяной агар для первичного выделения микроорганизмов и определения их гемолитических свойств, которая рекомендована Приказом Министерства Здравоохранения СССР №535 от 22 апреля 1985 года «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений» [9], как основная питательная среда для посева, отделяемого дыхательных путей стр.119 (отделяемое зева и носа; мокрота; содержимое бронхов, полученное при бронхоскопии или при отсасывании через трахеостому (у больных, находящихся на аппаратном дыхании); экссудаты; резецированные ткани и др.) и ЛОР-органов. Для приготовления данной среды, согласно приказу №535, в качестве основы используют сухой питательный агар. По прописи, указанной на этикетке, готовят 2% агар, рН 7,4-7,6. К расплавленному и охлажденному до 45°С агару, соблюдая правила асептики, добавляют 5% (5 мл крови на 100 мл питательной среды) дефибринированной бараньей, лошадиной или кроличьей крови, цитратной или дефибринированной крови человека без антибактериальных препаратов. Смесь тщательно перемешивают, чтобы не образовалась пена, и разливают в стерильные чашки Петри, предварительно подогретые в термостате, слоем 3-4 мм. Слой агара должен быть равномерно окрашен в красный цвет. Хранят не более двух недель в целлофановых мешках при 4-6°С.

К недостаткам данной питательной среды следует отнести: низкие ростовые свойства для прихотливых микроорганизмов, в частности для Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, β-гемолитических Streptococcus spp.

Прототипом заявляемой среды явилась питательная среда по Катосовой Л.К., где общим является основа - сухой питательный агар и добавление эритроцитарной массы. А отличительными признаками являются: добавление в нами предлагаемую среду сыворотки крупного рогатого скота и дрожжевого экстракта вместо 10% инактивированной лошадиной сыворотки. Прототип - один должен быть для составления формулы изобретения, возможно, ближайший аналог (прототип) - это питательная среда по прописи Катосовой Л.К. И если согласны с этим, то, пожалуйста, укажите Общие признаки и Отличительные признаки Вашей среды и среды по прототипу. А также нужен прототип для способа.

Для определения гемолитической активности бактерий ряд авторов рекомендует агар с сердечной вытяжкой (с добавлением крови, HiMedia, Heart Infusion Agar) [11], который используют для выделения и культивирования большого количества разнообразных микроорганизмов, в частности как основу для приготовления кровяного агара с 5% дефибринированной крови кролика, лошади или барана для определения гемолитической активности S.pneumoniae, S.pyogenes. Состав, г/л, включает:

Вытяжка говяжьего сердца 500,0

Триптоза 10,0

Натрия хлорид 5,0

Агар 15,0

рН 7,4±0,2

Известна также другая питательная среда для выявления гемолитической активности требовательных микроорганизмов - основа кровяного агара №2 (HiMedia, Blood Agar №2) [11]. Состав, г/л: пептон протеозный 15,0; вытяжка печеночная 2,5; экстракт дрожжевой 5,0; натрия хлорид 5,0; агар 15,0; рН 7,4±0,2. После стерилизации автоклавированием 15 мин при температуре 121°С охлаждают до 45-50°С и стерильно добавляют 7% стерильной крови барана, кролика, лошади или человека (без консервантов).

Известны ряд сред для выделения и культивирования пневмококка, такие как триптический перевар мяса по Хоттингеру [11], который содержит: 70-75% гидролизата мяса по Хоттингеру или казеина (1,8-2,0 г/л аминного азота); 20-25% гидролизата бычьих сердец (1,4-1,5 г/л аминного азота); 1,7-2,0% агара; воду дистиллированную 1000,0 мл; рН 7,6±0,1. Эту основу стерилизуют при 121°С 20 мин. Перед употреблением к расплавленной и охлажденной до 45°С среде добавляют 0,5% экстракта кормовых дрожжей (вместе с сывороткой или кровью).

К недостаткам вышеперечисленных питательных сред для определения гемолитической активности бактерий, выделения и культивирования пневмококка следует отнести их высокую себестоимость и использование дефицитных компонентов в приготовлении.

Технический результат - увеличить ростовые свойства питательной среды с одновременным снижением ее себестоимости, а также обеспечить доступность ее приготовления для практических лабораторий клинической микробиологии. В связи с тем что наиболее частыми бактериальными возбудителями воспалительных заболеваний дыхательной системы и ЛОР-органов внебольничной этиологии являются Streptococcus pneumoniae, Moraxella (Branchamella) catarrhalis, Streptococcus pyogenes, β-гемолитические Streptococcus spp., Staphylococcus aureus, Haemophilus unfluenzae [4, 8, 13, 14], мы предлагаем следующую питательную среду - кровяно-сывороточный агар - для выделения, культивирования и определения гемолитических свойств бактерий из клинического материала.

Указанный технический результат достигается тем, что предлагается следующее.

Питательная среда для выделения, культивирования и определения гемолитических свойств бактерий из клинического материала, содержащая ГМФ - агар, эритроцитарную массу из донорской крови человека, сыворотку крупного рогатого скота и дрожжевой экстракт при следующем количественном соотношении компонентов:

ГМФ - агар	- 100 мл
эритроцитарная масса из донорской крови человека	- 3 мл
сыворотка крупного рогатого скота	- 5 мл
дрожжевой экстракт	- 3 мл

Способ приготовления питательной среды для выделения, культивирования и определения гемолитических свойств бактерий из клинического материала, включает 3 этапа:

1) этап - приготовление дрожжевого экстракта: в 2 л дистиллированной воды растворяют 1 кг пекарских дрожжей, варят с момента закипания 1 ч. Затем необходимо разлить в стеклянные мерные колбы по 1 л, накрыть салфеткой и дать отстоятся при комнатной температуре до утра. На следующий день надосадочную жидкость переливают с помощью стерильных пипеток в стерильные мерные флаконы по 100 мл с ватно-марлевой пробкой (всего получается 1,5 л дрожжевого экстракта) и стерилизуют автоклавированием при 110,8°С (0,5 кг/см² [6]) 30 мин. После полного остывания флаконы с дрожжевым экстрактом можно хранить в холодильнике +2-+8°С до 1 месяца.

Прототипом способа приготовления дрожжевого экстракта явился способ, описанный в книге «Энтеробактерии», 1985 г., под редакцией Покровского В.И. [12]. Состав: 1. Дрожжи прессованные хлебные (лучше маточные) - 0,5 кг. 2. Вода дистиллированная - 1000 мл. Дрожжи измельчают и кипятят на слабом огне 1 ч, вновь размешивают, разливают во флаконы, стерилизуют при 121°С 30 мин. Готовый экстракт помещают в холодильник на 5-7 дней. Для приготовления сред используют надосадочную жидкость. Консервируют добавлением 0,5% хлороформа. Консервированный экстракт можно хранить при 4-10°С несколько месяцев.

Общим для обоих способов является растворение пекарских дрожжей в дистиллированной воде и кипячение в течение 1 ч, для приготовления в дальнейшем питательных сред используют надосадочную жидкость.

Отличительными признаками предлагаемого нами способа является: 1) после кипячения готовый экстракт разливают по мерным колбам и дают отстояться при комнатной температуре, после чего надосадочную жидкость переливают в мерные стерильные флаконы - это удобно с практической точки зрения, так как отсутствует возможность попадания осадка при добавлении дрожжевого экстракта в питательные среды; 2) стерилизация автоклавированием при 110,8°С (0,5 кг/см² [6]) 30 мин, в результате чего сводится к минимуму вредное влияние температурного фактора на питательные вещества, содержащиеся в дрожжевом экстракте; 3) мы не добавляем консервант - 0,5% хлороформ, в результате чего сводится к минимуму вредное влияние консерванта на питательные вещества, содержащиеся в дрожжевом экстракте, и в последующем нет ингибирующего действия на рост микроорганизмов на питательной среде с добавлением дрожжевого экстракта.

2) этап - приготовление основы из сухого питательного агара для культивирования микроорганизмов, рН 7,4-7,6 (ГМФ - агар, состав: гидролизат мяса ферментативный 15,0 г; натрий хлористый 9,0 г; агар 12,0 г. Готовая сухая среда, производитель ЗАО «Научно-исследовательский центр фармакотерапии», Санкт-Петербург), по прописи указанной на этикетке: 36,0 г ГМФ - агара размешивают в 1 л дистиллированной воды, кипятят 1-2 мин до полного расплавления агара. Фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в стерильные мерные флаконы и стерилизуют автоклавированием при 121°С (1,1 кг/см²) 15 мин. Среду охлаждают до 45-50°С, разливают в стерильные мерные флаконы по 100 мл с ватно-марлевой пробкой, рН основы 7,4-7,6. После полного остывания флаконы с дрожжевым экстрактом хранят в холодильнике +2-+8°С до 1 месяца.

3) этап - непосредственное приготовление питательной среды для выделения, культивирования и определения гемолитических свойств бактерий из клинического материала: 100 мл основы расплавить на водяной бане, затем к охлажденной до 45°С основе добавить, в условиях стерильного бокса, 5 мл сыворотки крупного рогатого скота, 3 мл эритроцитарной массы из крови человека и 3 мл дрожжевого экстракта. Смесь тщательно перемешивают, чтобы не образовалась пена. Затем среду (КСА) разлить стерильной пипеткой по 20 мл в стерильные чашки Петри (толщина агара должна быть 3-4 мм). Слой агара должен быть равномерно окрашен в красный цвет. Дать среде застыть и готовую среду хранить в условиях холодильника +2-+8°С в течение 2 недель в пакетах (для предотвращения высыхания).

Количественное соотношение компонентов питательной среды и ее рН обеспечивают чувствительность среды.

Увеличение ростовых свойств питательной среды обусловлено наличием в ней 1) дрожжевого экстракта, который является источником углерода и азота с повышенной питательной ценностью, источником витаминов группы В, витамина Д и других факторов роста - пуриновых и пиримидиновых оснований. Белок дрожжей сбалансирован по аминокислотному составу и по этому показателю близок к животному белку. Отличается высоким содержанием лизина, лейцина, изолейцина, аспарагиновой и глютаминовой кислот, а также незаменимых аминокислот - аргинина, гистидина, триптофана, тирозина, цистеина, фенилаланина, метионина, треонина [3, 8]; 2) сыворотки крупного рогатого скота, необходимой для роста Streptococcus pneumoniae и проявления им типичной морфологии и культуральных свойств: нежные полупрозрачные четко очерченные колонии диаметром около 1 мм или они могут быть плоскими с углублением в центре. Кроме того, сыворотка стимулирует образование капсул Streptococcus pneumoniae [5]; 3) эритроцитарной массы добавление, которой, во-первых, имеет диагностическое значение - определение гемолитических свойств микроорганизма (α, β, γ-гемолиз), во-вторых, обеспечивает эффективный рост Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, β-гемолитические Streptococcus spp., они не имеют цитохрома и утилизируют кислород атмосферы при помощи системы флавопротеина, в результате чего образуется перекись водорода, которую микроорганизмы самостоятельно не в состоянии обезвредить, так как не обладают каталазой [2].

Таким образом, полученные данные показали, что предлагаемая среда и способ ее приготовления позволяют выделить бактериологическим методом основные бронхолегочные патогены даже при малом количестве возбудителя в патологическом материале. Предлагаемая среда обладает лучшими ростовыми свойствами, чем в используемых в настоящее время средах, кроме этого, доступность компонентов ее производства не требует дефицитных препаратов, таких как лошадиная инактивированная сыворотка или дефибринированная баранья, лошадиная или кроличья кровь и др. Простота приготовления заявляемой среды позволяет использовать ее для выделения, культивирования и определения гемолитических свойств бактерий, в том числе бронхолегочных патогенов, таких как Streptococcus pneumoniae, Moraxella (Branchamella) catarrhalis, Streptococcus pyogenes, β-гемолитические Streptococcus spp., Staphylococcus aureus из клинического материала в лабораторных условиях при диагностике воспалительных заболеваний.

Авторы провели сравнительные исследования заявляемой среды кровяно-сывороточного агара (питательный агар для культивирования микроорганизмов, рН 7,4-7,6 (ГМФ - агар) - 100 мл + эритроцитарная масса из донорской крови человека - 3 мл + сыворотка крупного рогатого скота - 5 мл + дрожжевой экстракт - 3 мл), питательной среды по прописи Катосовой Л.К. (100 мл основы, приготовленной из сухого питательного агара по прописи, указанной на этикетке, рН 7,2±0,2 + 10 мл инактивированной лошадиной сыворотки + 3 мл эритроцитарной массы) и 5% кровяного агара согласно приказу №535 (100 мл основы - 2% агар, рН 7,4-7,6, приготовленной из сухого питательного агара по прописи, указанной на этикетке, + 5 мл крови дефибринированной крови).

Для биологического контроля питательных сред использовали культуру Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 и клинический материал от больных с воспалительными заболеваниями дыхательной системы и ЛОР-органов (мокрота, заднеглоточные и назофарингеальные мазки, бронхоальвеолярный лаваж, аспират трахеи, пунктаты пазух носа и плевральной полости, полученное при тимпаноцентезе содержимое среднего уха от больных детей). Все посевы культивировали при температуре 37°С в обычной атмосфере в течение 24-48 ч (до 48 ч, если при посеве клинического материала от больного на первые сутки роста микроорганизмов выявлено не было).

Для определения чувствительности сред готовилась микробная взвесь из суточной культуры Streptococcus pneumoniae ATCC 49619, соответствующая по плотности 0,5 по стандарту Мак-Фарланда (содержащую приблизительно 1,5×10⁸ КОЕ/мл), из полученной микробной взвеси готовили серию последовательных разведений 1:10. Затем на приготовленные чашки с соответствующим агаром высевали по 0,1 мл взвеси -5, -6, -7 разведении, содержащих соответственно 1×10³, 1×10², 1×10¹ КОЕ/мл. При хороших питательных свойствах среды должен отмечаться рост микроорганизмов из -6, -7 разведений [7].

Результаты исследований показали, что предлагаемый состав питательной среды имеет высокую чувствительность - выделение минимального количества Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 (до 10 колоний при высеве из -7 разведения), а предлагаемый способ приготовления полноценной среды в условиях практической лаборатории является простым и доступным для лабораторий любого уровня.

Кроме того, при исследовании 20 проб мокроты и 496 проб бронхоальвеолярного лаважа от больных детей с хроническими инфекционно-воспалительными заболеваниями (ХИВЗЛ) в период с января 2005 по апрель 2011 гг. S. pneumoniae и М. catarrhalis выделены в 18,8% и 10,6% случаев, соответственно, на заявляемой питательной среде, что можно использовать для диагностических целей. В 49,1% случаев при ХИВЗЛ была выделена Haemophilus influenzae на шоколадном агаре, при этом ее рост был отмечен на заявляемой среде на 2 сутки инкубации при 37°С, обычной атмосфере в виде точечных колоний без гемолиза.

При исследовании заднеглоточных и назофарингеальных мазков от детей на заявляемой среде также были выделены в 1 случае Neisseria meningitidis и в одном случае Corynebacterium diphtheriae.

Себестоимость заявляемой среды 680 руб/л.

Литература

1. Выделение, идентификация и определение чувствительности к антибиотикам Streptococcus pneumonia / Л.С.Страчунский, О.И.Кречикова, Р.С.Козлов, Т.М.Богданович, О.У.Стецюк, М.М.Суворов, Л.К.Катосова, Л.А.Вишнякова, М.Е.Фаустова // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2000. - Т.2, №1. С.88-98.

2. Козлов Р.С. Пневмококки: прошлое, настоящее и будущее. Смоленск: Смоленская государственная медицинская академия, 2005. - 128 с.

3. Козлов Ю.А. Питательные среды в медицинской микробиологии. Руководство по изготовлению питательных сред для микробиологических институтов и санитарно-бактериологических лабораторий. Государственное издательство медицинской литературы МЕДГИЗ, 1950, Москва. - 252 с.

4. Марри П.Р., Шей И.Р. Клиническая микробиология. Краткое руководство: пер. с англ. М.: Мир, 2006. - 425 с.

5. Медицинская микробиология. Под редакцией В.И.Покровского. - 3-е изд. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2005. - 768 с.

6. Методические указания по контролю работы паровых и воздушных стерилизаторов, утв. Минздравом СССР от 28.02.91, N 15/6-5.

7. МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам». - М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004. - 91 с.

8. Поляк М.С., Сухаревич В.И., Сухаревич М.Э. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии. СПб.: ЭЛБИ-СПб. - 2008. - 352 с.

9. Приказ МЗ СССР №535 от 22 апреля 1985 года «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений».

10. Пульмонология детского возраста: проблемы и решения. Под ред. Мизерницкого Ю.Л., Царегородцева А.Д. Выпуск 4. Москва, 2004. - 257 с.

11. Частная медицинская микробиология с техникой микробиологических исследований: учебное пособие. Под ред. Лабинской А.С., Блинковой Л.П., Ещиной А.С. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. - 600 с.

12. Энтеробактерии: Руководство для врачей / И.В.Голубева, В.А.Килесо, Б.С.Киселева и др. Под ред. В.И.Покровского. - М.: Медицина, 1985. - 321 с.

13. Essential procedures for clinical microbiology. Editor in chief, Henry D. Isenberg. Washington, DC 20005, 1998. 841 P.

14. Manual of clinical microbiology. Editor in chief, Patrick R. Murray. 7^th ed. Washington, DC 20005, 1999. 1773 P.

Питательная среда для выделения, культивирования и определения гемолитических свойств бактерий из клинического материала, содержащая ГМФ-агар, эритроцитарную массу из донорской крови человека, сыворотку крупного рогатого скота и дрожжевой экстракт при следующем количественном соотношении компонентов, мл:

ГМФ-агар	100
эритроцитарная масса из донорской крови человека	3
сыворотка крупного рогатого скота	5
дрожжевой экстракт	3