Способ получения антигена из сетарий для диагностики дирофиляриоза собак

Изобретение относится к области ветеринарии и касается способа получения антигена из сетарий. Способ включает проведение гомогенизации половозрелых гельминтов - Setaria labiato-papillosa вручную на холоде, экстрагирование белков гомогената в фосфатно-солевом буфере рН 7,2-7,4 в соотношении 1:10 в течение 48 часов при +4°С на магнитной мешалке, центрифугирование гомогената и отбор надосадочной жидкости при 15 тыс.об/мин и +4°С в течение 20 минут, надосадочную жидкость - экстракт дополнительно очищают гель-фильтрацией на колонке с сорбентом Superose 12 Prep Grade и скоростью потока натрий-фосфатного буфера (рН 6,0) - 30 мл/час, с последующим отбором антигеноактивных фракций посредством иммуноферментной реакции с помощью положительных и отрицательных при дирофиляриозе собак референс-сывороток. Фракции, содержащие антигенноактивные белковые компоненты и показавшие наилучшие результаты с референс-сыворотками объединяют, измеряют содержание белка и используют в качестве антигена в иммуноферментной реакции (ИФР) для диагностики дирофиляриоза собак. 1 табл.

 

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к иммунологической диагностике дирофиляриоза собак, и может быть использовано в медицине.

Возбудителем инвазии у собак являются виды Dirofilaria immitis и D. repens, широко распространенные во многих странах мира. D. immitis паразитирует в правом желудке сердца и легочной артерии, a D. repens локализуется в подкожной клетчатке. Они зарегистрированы и у человека, однако половой зрелости в организме человека дирофилярии не достигают и микрофилярий не выделяют.

Широкому распространению дирофиляриоза в последние годы способствует увеличение численности собак, значительная миграция людей вместе с животными, а также адаптация дирофилярии к различным условиям промежуточных хозяев.

Прижизненная диагностика затруднена и в основном базируется на обнаружении микрофилярий в крови и их идентификации. Однако при латентной форме и низкой интенсивности инвазии этот метод фактически не дает нужного эффекта, на вооружении нужно иметь иммунологические тесты, к числу которых относится иммуноферментная реакция (ИФР), позволяющая значительно расширить возможности прижизненной диагностики дирофиляриоза.

Иммунодиагностика дирофиляриоза у собак в основном базируется на выявлении циркулирующих в крови антигенов. В иммунотестах, основанных на выявлении циркулирующих в крови антител, используют экскреторно-секреторные антигены, фракционированные соматические экстракты как микрофилярий, так и взрослых дирофилярий.

Для прижизненной диагностики данной инвазии в Российской Федерации разработан способ получения очищенного соматического антигена из неполовозрелых особей D. repens /1/, который авторы использовали в иммуноферментной реакции для диагностики дирофиляриоза, вызываемого видом D. repens.

Однако имеются значительные трудности в получении гельминтного материала для приготовления диагностического антигена из дирофилярий, особенно вида D. immitis. Предлагаемый способ приготовления антигена основывается на фракционировании антигена-экстракта из половозрелых сетарий - Setaria labiato-papillosa. Сетарии, как и дирофилярий, относятся к подотряду Filariata и в белковом спектре содержат компоненты, идентичные в диагностическом аспекте антигенам из дирофилярий и способны выявлять антитела к дирофиляриям в крови животных.

Способ включает в себя следующие этапы:

1) Свежезамороженные половозрелые сетарии - Setaria labiato-papillosa подвергают ручной гомогенизации в фарфоровой ступке, используя также многократное замораживание и оттаивание для получения однородной гомогенной массы.

2) Экстрагирование белков проводят в фосфатно-солевом буферном растворе рН 7,2-7,4 в соотношении 1:10 в течение 48 часов при +4°С на магнитной мешалке. Полученную массу подвергают центрифугированию при 15 тыс.об/мин в течение 20 минут. Надосадочную жидкость - экстракт используют в качестве антигенного материала для фракционирования.

3) Фракционирование соматического экстракта из половозрелых сетарий проводят хроматографическим методом - гель-фильтрацией на колонке, заполненной Superose 12 Prep Grade, с применением натрий-фосфатного буфера (рН 6,0) и скоростью потока 30 мл/час. В полученных в процессе гель-фильтрации фракциях определяют содержание белка и устанавливают их антигенную активность в ИФР, используя референс-положительные и отрицательные при дирофиляриозе собак сыворотки. Выделенные таким способом в ходе исследования фракции, содержащие антигеноактивные белковые компоненты и способные выявлять антитела в сыворотке крови при дирофиляриозе, объединяют и используют в качестве диагностического антигена в ИФР при дирофиляриозе собак.

Пример 1. Исследования диагностической эффективности в ИФР фракционированного соматического антигена из сетарий с сыворотками из крови животных. Использовали сыворотки крови собак, больных дирофиляриозом - Dirofilaria immitis и D. repens, свободных от данной инвазии собак, а также с другими паразитами и непаразитарными патологиями. Кровь собак перед исследованием проверили на наличие микрофилярий классическим методом Кнотта /2/.

Результаты представлены в таблице.

Литература

1. Бескровная Ю.Г., Нагорный С.А., Васерин Ю.И., патент №2356575.

2. Knott J.I. Metod for making microfilaria surveus on day blood // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. - 1939. - v.33. - P.191-196.

Способ получения антигена из сетарий для диагностики дирофиляриоза собак, включающий гомогенизацию половозрелых гельминтов - Setaria labiato-papillosa, экстрагирование белков гомогената, центрифугирование гомогената и отбор надосадочной жидкости, отличающийся тем, что гомогенизацию проводят вручную на холоде, экстрагирование белков в фосфатно-солевом буфере рН 7,2-7,4 в соотношении 1:10 в течение 48 ч при +4°С на магнитной мешалке, полученную массу центрифугируют при 15 тыс.об/мин и +4°С в течение 20 мин, а надосадочную жидкость-экстракт дополнительно очищают гель-фильтрацией на колонке с сорбентом Superose 12 Prep Grade и скоростью потока натрий-фосфатного буфера (рН 6,0) - 30 мл/ч, с последующим отбором антигеноактивных фракций посредством иммуноферментной реакции с помощью положительных и отрицательных при дирофиляриозе собак референс-сывороток.