Пептид foxm1 и включающее его медицинское средство

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложены пептиды, выделенные из белка FOXM1, способные активировать цитотоксические (киллерные) Т-клетки человека посредством образования антигенпрезентирующего комплекса с молекулой HLA-A2. Рассмотрены композиции, содержащие пептиды по изобретению, применение пептида для получения средства для индукции иммунитета против рака, лечения и профилактики рака, а также для получения антител, селективно связывающих пептиды по изобретению. Описаны экзосома и выделенная антигенпрезентирующая клетка, презентирующие комплекс пептида по изобретению с молекулой HLA-A2, для индукции цитотоксических Т-клеток, способы индукции антигенпрезентирующей клетки и цитотоксической Т-клетки, а также способ повреждения раковых клеток, экспрессирующих FOXM1 и HLA-A2. Настоящее изобретение может найти дальнейшее применение в лечении опухолей, характеризующихся повышенной экспрессией FOXM1. 13 н. и 1 з.п. ф-лы, 2 пр., 1 ил., 1 табл.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новым пептидам, которые пригодны в качестве вакцин против типов рака, в высокой степени экспрессирующих вилкоголовый фактор с блоком M1 (FOXM1), таких как рак желчевыводящих путей, рак легких и рак поджелудочной железы, и к фармацевтическим средствам, включающим пептиды, для лечения и профилактики опухолей.

Известный уровень техники

Количество смертей от вариантов рака желчевыводящих путей (рака желчного пузыря и холангиокарциномы) в Японии растет и 16586 человек умерло от рака в 2005 г. В большинстве случаев рака желчевыводящих путей никаких субъективных симптомов на ранних стадиях не присутствует. По сравнению с типами рака, которые возникают внутри пищеварительного тракта, такими как рак желудка и рак ободочной кишки, точная визуализация и диагностическая визуализация рака желчевыводящих путей затруднена. Следовательно, раннее обнаружение рака желчевыводящих путей затруднено и часто рак уже прогрессировал и является неоперабельным при выявлении. Кроме хирургического вмешательства для лечения рака желчевыводящих путей проводят лучевую терапию и химиотерапию, но они не являются терапевтически эффективными и, таким образом, создание новых терапевтических методов является неотложной необходимостью.

Смертность от рака легких также увеличивается в Японии и 62063 человека умерли от рака в 2005 г. В настоящее время рак легких составляет 19,0% смертей от рака в Японии и он стал лидирующей причиной смерти от рака с 2000 г. Курение считается главной причиной возникновения рака легких. Кроме курения вдыхание асбеста или радона также рассматривается как причина рака легких. В качестве мер по предотвращению рака легких поощряется прекращение курения и осуществление медицинских осмотров. Однако, хотя она снижается, популяция курящих в Японии в 2005 г. все еще насчитывает приблизительно 30 миллионов. Более того, недавно было показано, что простой рентген грудной клетки и тестирование мокроты, широко применяемые при медицинских обследованиях, не эффективны для раннего выявления рака легких, и, следовательно, они не ведут к снижению смертности от рака. Учитывая представленное выше, предсказывается, что количество смертей от рака легких будет продолжать расти в будущем.

Симптомы рака легких включают кашель, мокроту с кровью, одышку и боль в груди, но в большинстве случаев на ранних стадиях симптомы отсутствуют. Когда появляются симптомы, во многих случаях рак уже прогрессировал. Следовательно, более половины больных являются неоперабельными при первичном обнаружении рака, и он рассматривается как один из неподатливых типов рака. Скорость восстановления после операции не настолько хороша как при других типах рака, и суммарный пятилетний коэффициент выживаемости после хирургического вмешательства мал и составляет только 50%. В последние годы пятилетний коэффициент выживаемости для ранних стадий рака легких повышается благодаря достижениям комплексного лечения с помощью лучевой терапии, химиотерапии и тому подобного с использованием в качестве главного лечения хирургической резекции; однако, улучшение терапевтических эффектов в случае прогрессировавшего рака легких недостаточно и создание новых терапевтических стратегий является неотложной необходимостью.

Количество смертей от рака поджелудочной железы также увеличивается в Японии и 22927 человека умерло от рака в 2005 г. В настоящее время рак поджелудочной железы составляет 7,0% смертей от рака в Японии и занимает пятое место после рака легких, рака желудка, рака ободочной кишки и рака печени. Не существует симптомов, специфичных для рака поджелудочной железы, и во многих случаях, когда появляются симптомы, рак уже прогрессировал. Даже в настоящее время при наличии достижений в диагностической визуализации 40% всех больных раком поджелудочной железы в Японии относятся к прогрессирующим случаям болезни с отдаленными метастазами, и многие больные, как обнаружено, обладают неоперабельным местно прогрессирующим раком. Следовательно, суммарный пятилетний коэффициент выживаемости больных составляет 5% или менее и прогноз после диагноза является очень плохим. Из-за трудности диагностики заболеваемость раком поджелудочной железы как причина смерти от рака постепенно повышается, особенно в промышленно развитых странах. Хотя в настоящее время осуществляется комплексное лечение с помощью лучевой терапии, химиотерапии и тому подобного с использованием в качестве основного лечения хирургической резекции, не существует решающего улучшения терапевтических эффектов, и создание новых терапевтических стратегий является неотложной необходимостью. Различные факторы, такие как привычки образа жизни, включая курение, ожирение, диету, употребление алкоголя и употребление кофе, а также хронический панкреатит, диабет, генетические факторы и тому подобное, как предполагается, связаны с причинами возникновения рака поджелудочной железы.

С другой стороны, последние разработки в молекулярной биологии и иммунологии опухолей показали, что цитотоксические (киллерные) Т-клетки и хелперные Т-клетки узнают пептиды, образованные при деградации белков, которые специфически и в высокой степени экспрессируются в раковых клетках и которые презентируются на поверхности раковых клеток или антигенпрезентирующих клеток с помощью молекул HLA, и вызывают иммунологическую реакцию с разрушением раковых клеток. Более того, многие опухолевые белки-антигены и производные от них пептиды, которые стимулируют такую иммунологическую реакцию для борьбы с раком, идентифицированы, и антигенспецифическая терапия опухолей применяется клинически.

Молекула класса I HLA экспрессируется на поверхности всех имеющих ядро клеток организма. Она связывается с пептидом, появляющимся в результате внутриклеточной деградации белков, продуцируемых в цитоплазме или ядре, и экспрессирует пептид на клеточной поверхности. На поверхности нормальной клетки с молекулами класса I HLA связаны пептиды, происходящие от нормальных аутологичных белков, и они не узнаются и не разрушаются Т-клетками иммунной системы. С другой стороны, в процессе превращения в рак раковые клетки иногда экспрессируют большое количество белков, которые почти не экспрессируются или незначительно экспрессируются в нормальных клетках. Когда молекулы класса I HLA связываются с пептидами, возникшими в результате внутриклеточной деградации белков, специфически и в высокой степени экспрессирующихся в раковых клетках, и затем экспрессируют пептиды на поверхности раковых клеток, Т-клетки-киллеры узнают и разрушают только раковые клетки. С помощью введения таких специфичных для рака антигенов или пептидов индивидууму раковые клетки могут быть разрушены, и рост раковой опухоли может быть подавлен без вреда для нормальных клеток. Это называется иммунотерапией рака с использованием канцероспецифичных антигенов. Молекулы класса II HLA экспрессируются главным образом на поверхности антигенпрезентирующих клеток. Молекулы связываются с пептидами, происходящими от канцероспецифичных антигенов, которые возникают в результате внутриклеточной деградации канцероспецифичных антигенов, включенных в антигенпрезентирующие клетки после поступления из внеклеточного окружения, и затем экспонируют пептиды на поверхности клеток. Хелперные Т-клетки, которые их узнают, активируются и индуцируют или усиливают иммунную реакцию против опухолей с помощью продукции различных цитокинов, которые активируют другие иммунокомпетентные клетки.

Соответственно, если разрабатывается иммунотерапия, которая направлена на антигены, специфически и в высокой степени экспрессирующиеся при типах рака, такая терапия может эффективно уничтожать только типы рака, не вызывая какого-либо вредного эффекта в нормальных аутологичных органах. Предполагается также, что терапия может быть полезна для любых больных с терминальной стадией рака, к которым не могут быть применены другие способы лечения. Кроме того, с помощью введения канцероспецифичного антигена и пептида в виде вакцины заранее индивидуумам с высоким риском развития рака развитие рака может быть предотвращено.

Авторы настоящего изобретения сначала провели широкий геномный анализ экспрессии генов на 27648 генах человека с использованием микроматриц кДНК для исследования экспрессионных профилей этих генов в 25 случаях рака внутрипеченочных желчных протоков и в различных нормальных органах, включая органы в эмбриональной стадии. В результате авторы настоящего изобретения раскрыли, что вилкоголовый фактор с блоком m1 (FOXM1) (GenBank No. поступления NM_202003) в высокой степени экспрессировался в тканях во многих случаях рака внутрипеченочных желчных протоков. Сходно с этим и в дополнение к раку внутрипеченочных желчных протоков FOXM1, как обнаружено, в высокой степени экспрессируется почти во всех случаях рака легких, рака мочевого пузыря и рака поджелудочной железы. Более того, высокая экспрессия FOXM1 была обнаружена в 40% или более случаев широкого спектра типов рака, таких как рак шейки матки, рак яичников, злокачественная лимфома, рак молочной железы, рак желудка, рак пищевода, рак простаты, гепатоцеллюлярная карцинома, рак ободочной кишки и хронический миелоидный лейкоз. Эти факты предполагают, что FOXM1 может служить в качестве канцероспецифического антигена при различных типах рака. FOXM1 экспрессируется в эмбриональной печени и в нормальных органах взрослого человека, он незначительно экспрессируется в органах пищеварительного тракта, таких как желудок, тонкий кишечник и толстый кишечник, тимусе и семенниках; однако, уровень экспрессии существенно ниже по сравнению с опухолевыми участками.

Примеры документов, указывающих на то, что FOXM1 относится к возникновению рака и регуляции клеточной пролиферации, включают непатентные документы 1-10. Однако ни один из этих документов не описывает использование FOXM1 в качестве вакцины против рака.

[Непатентный документ 1] Yoshida Y, Wang I-C, Yoder HM, Davidson NO, Costa RH.: The forkhead box Ml transcription factor contributes to the development and growth of mouse colorectal cancer. Gastroenterology 132: 1420-1431, 2007.

[Непатентный документ 2] Gusarcova GA, Wang I-C, Major ML, Kalinichenko VV, Ackerson T, Petrovi V, Costa RH.: A cell-penetrating ARF peptide inhibitor of FOXM1 in mouse hepatocellular carcinoma treatment. J. Clin. Invest. 117: 99-111, 2007.

[Непатентный документ 3] Radhakrishnan SK, Bhat UG, Hughes DE, Wang I-C, Costa RH, Gartel AL.: Identification of a chemical inhibitor of the oncogenic transcription factor forkhead box Ml. Cancer Res. 66: 9731-9735, 2006.

[Непатентный документ 4] Takahashi К, Furukawa С, Takano A, Ishikawa N, Kato T, Hamaya S, Suzuki C, Yasui W, Inai K, Sone S, Ito T, Nishimura H, Tsuchiya E, Nakamura Y, Daigo Y.: The neuromedin U-growth hormone secretagogue receptor 1b/neurotensin receptor 1 oncogenic signaling pathway as a therapeutic target for lung cancer. Cancer Res. 66: 9408-9419, 2006.

[Непатентный документ 5] Kim I-M, Ackerson Т, Ramakrishna S, Tretiakova M, Wang I-C, Kalin TV, Major ML, Gusarova GA, Yoder HM, Costa RH, Kalinichenko VV.: The forkhead box ml transcription factor stimulates the proliferation of tumor cells during development of lung cancer. Cancer Res. 66: 2153-2161, 2006.

[Непатентный документ 6] Wonsey DR, Folletie M.: Loss of the forkhead transcription factor FoxM1 causes centrosome amplification and mitotic catastrophe. Cancer Res. 65: 5181-5189, 2005.

[Непатентный документ 7] Obama K, Ura K, Li M, Katagiri T, Tsunoda T, Nomura A, Satoh S, Nakamura Y, Furukawa Y: Genome-wide analysis of gene expression in human intrahepatic cholangiocarcinoma. Hepatology 41: 1339-1348, 2005.

[Непатентный документ 8] Laoukili J, Kooistra MRH, Bras A, Kauw J, Kerkhoven RM, Morrison A, Clevers H, Medema RH.: Foxm1 is required for execution of the mitotic programme and chromosome stability. Nature Cell Biol. 7: 126-136, 2005.

[Непатентный документ 9] Kalinichenko VV, Major M, Wang X, Petrovic V, Kuechle J, Yoder HM, Shin B, Datta A, Raychaudhuri P, Costa RH.: Foxm1b transcription factor is essential for development of hepatocellular carcinomas and is negatively regulated by the p19^ARF tumor suppressor. Genes Dev. 18: 830-850, 2004.

[Непатентный документ 10] Wang X, Kiyokawa H, Dennewitz MB, Costa RH.: The forkhead box mlb transcription factor is essential for hepatocyte DNA replication and mitosis during mouse liver regeneration. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 16881-16886, 2002.

Раскрытие изобретения

[Задачи, решаемые изобретением]

Целью настоящего изобретения является разработка способов осуществления иммунотерапии, которая подавляет рост рака путем повышения противоракового иммунитета больных раком, в качестве нового терапевтического метода лечения метастазирующего или неподатливого типов рака, лечение которых с помощью хирургического вмешательства, химиотерапии и лучевой терапии затруднено, которые осуществляются в качестве терапевтических методов для рака желчевыводящих путей, рака легких, рака поджелудочной железы и тому подобного. Более конкретно, целью настоящего изобретения является идентификация пептидов, которые происходят от белков, в высокой степени и специфично экспрессируемых при типах рака, и могут индуцировать сильную иммунную реакцию против указанных выше типов рака без индукции неблагоприятных эффектов у больных раком, и к применению этих пептидов для иммунотерапии опухолей. Настоящее изобретение дает возможность применения иммунотерапии у приблизительно 30% японцев, больных указанными выше типами рака, путем идентификации пептидов, которые происходят от белка, в высокой степени и специфично экспрессируемого в указанных выше типах рака, и презентируются Т-клеткам-киллерам с помощью HLA-A2.

[Способы осуществления]

В настоящем изобретении авторы индуцировали специфичные для пептида FOXM1 Т-клетки-киллеры путем стимуляции in vitro CD8-позитивных Т-клеток-киллеров человека с помощью их совместного культивирования с дендритными клетками, происходящими от моноцитов периферической крови человека, пульсированными пептидами FOXM1 человека, которые обладают HLA-A2-связывающим мотивом. Будет или нет происходить индукция Т-клеток-киллеров, специфичных для каждого пептида FOXM1, проверяли с помощью определения γ-интерферона (IFN-γ), продуцируемого Т-клетками-киллерами, активированными в результате узнавания пептида, презентируемого с помощью HLA-A2, с использованием теста ELISPOT. В результате были идентифицированы новые пептиды FOXM1, которые являются потенциальными кандидатными антигенами-мишенями, применимыми для иммунотерапии. Более того, было установлено, что CTL, отвечающие на FOXM1, индуцированные с использованием указанных выше пептидов, обладают специфической цитотоксичностью против раковых клеток, экспрессирующих эндогенные молекулы FOXM1 и HLA-A2, и что CTL узнают клетки-мишени способом, ограниченным классом I HLA.

Более конкретно, в настоящем изобретении предлагается следующее:

[1] пептид (А) или (В) ниже:

(A) пептид, включающий любую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:1-3;

(B) пептид, который включает любую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:1-3, где одна, две или несколько аминокислот заменены, удалены, вставлены и/или добавлены и где пептид проявляет активность, индуцирующую цитотоксические (киллерные) Т-клетки;

[2] пептид по [1], где вторая аминокислота с N-конца представляет собой лейцин или метионин;

[3] пептид по [1], где С-концевая аминокислота представляет собой валин или лейцин;

[4] средство для индукции иммунитета против рака, которое включает один или более пептидов по [1] в качестве активного ингредиента;

[5] средство для лечения и/или профилактики рака, которое включает один или более пептидов по [1] в качестве активного ингредиента;

[6] средство для индукции антигенпрезентирующей клетки, которое проявляет активность, индуцирующую цитотоксические (киллерные) Т-клетки, где указанное средство включает один или более пептидов по [1] в качестве активного ингредиента;

[7] средство для индукции антигенпрезентирующей клетки, который проявляет активность, индуцирующую цитотоксические (киллерные) Т-клетки, где указанное средство включает один или более полинуклеотидов, кодирующих пептид по [1], в качестве активного ингредиента;

[8] средство для индукции цитотоксической (киллерной) Т-клетки, где указанное средство включает один или более пептидов по [1] в качестве активного ингредиента;

[9] антитело против пептида по [1];

[10] цитотоксическая (киллерная) Т-клетка, хелперная Т-клетка или включающая их популяция иммуноцитов, которые индуцируются с использованием пептида по [1];

[11] антигенпрезентирующая клетка, которая презентирует комплекс, включающий пептид по [1] и антиген HLA;

[12] антигенпрезентирующая клетка по [11], которая индуцируется средством по [6] или [7];

[13] экзосома, которая презентирует комплекс, включающий пептид по [1] и антиген HLA;

[14] экзосома по [13], где антиген HLA представляет собой HLA-A2 (HLA-A*0201);

[15] способ индукции антигенпрезентирующей клетки, которая проявляет активность, индуцирующую цитотоксические (киллерные) Т-клетки, который включает стадию контактирования антигенпрезентирующей клетки с пептидом по [1];

[16] способ индукции антигенпрезентирующей клетки, которая проявляет активность, индуцирующую цитотоксические (киллерные) Т-клетки, который включает стадию введения полинуклеотида, кодирующего пептид по [1], в антигенпрезентирующую клетку;

[17] способ индукции цитотоксической (киллерной) Т-клетки, который включает стадию контактирования Т-клетки с пептидом по [1].

В настоящем изобретении также предлагается следующее:

[18] способ индукции иммунитета против рака, который включает стадию введения пептида по [1] индивидууму;

[19] способ лечения и/или профилактики рака, который включает стадию введения пептида по [1] индивидууму;

[20] применение пептида по [1] для получения средства для индукции иммунитета против рака;

[21] применение пептида по [1] для получения средства для лечения и/или профилактики рака;

[22] пептид по [1] для индукции иммунитета против рака;

[23] пептид по [1] для лечения и/или профилактики рака.

Краткое описание фигур

На фиг.1 представлены результаты теста ELISPOT и теста цитотоксичности. CD8-позитивные Т-клетки выделяли из периферической крови HLA-A2-позитивных здоровых индивидуумов и больных раком молочной железы. Т-клетки-киллеры, полученные в результате стимуляции происходящих из моноцитов дендритных клеток, пульсированных каждым пептидом FOXM1, проверяли с помощью метода ELISPOT для определения реагируют ли они специфически на пептиды FOXM1 и продуцируют ли IFN-γ. Более того, с помощью теста цитотоксичности проверяли, будут или нет экспрессирующие FOXM1 клетки специфически повреждаться ограниченным HLA-A2 образом. Клетки Т2-А2 использовали в качестве клеток-мишеней в методе ELISPOT. Клетки Т2-А2 представляют собой клеточную линию, полученную путем введения гена HLA-A2 в линию клеток Т2 мыши с дефицитом экспрессии гена ТАР. Благодаря дефициту ТАР в клетках Т2-А2 комплекс, образованный молекулой HLA-A2 и экзогенно добавленным пептидом, экспрессируется на клеточной поверхности только тогда, когда пептид обладает способностью связываться с молекулой HLA-A2. Для оценки цитотоксической активности использовали клетки Раnс-1, которые являются HLA-A2-позитивными и экспрессируют FOXM1, и клетки РК-8, которые являются HLA-A2-негативными и FOXM1-позитивными. В результате Т-клетки-киллеры от двух здоровых индивидуумов, индуцированные с использованием пептидов FOXM1 362-370, 373-382 и 640-649, продуцировали IFN-γ в результате узнавания пептидов 362-370, 373-382 и 640-649, связанных с HLA-А2 и экспрессируемых на клетках Т2-А2. Более того, Т-клетки-киллеры от больных раком молочной железы, которые были индуцированы с использованием указанных выше пептидов, проявляли сильную цитотоксическую активность против клеток panc-1, но не проявляли цитотоксической активности против клеток РК-8. Таким образом, индуцированные Т-клетки-киллеры, как обнаружено, проявляют сильную цитотоксическую активность против раковых клеточных линий в результате специфического узнавания FOXM1 ограниченным HLA-A2 образом. Из представленного выше выяснено, что пептиды FOXM1 362-370, 373-382 и 640-649 могут индуцировать специфические в отношении FOXM1 Т-клетки-киллеры человека ограниченным HLA-A2 образом и что такие Т-клетки-киллеры могут повреждать экспрессирующие FOXM1 раковые клетки.

Способ осуществления изобретения

Если не указано иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют такое же значение, что и обычно понимаемое специалистом в той области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение.

Пептиды по настоящему изобретению представляют собой эпитопы, ограниченные HLA-A2, который является аллелем HLA, часто обнаруживаемым в популяциях японцев и людей белой расы. Используя связывающее сродство к HLA-A2 в качестве индекса, отбирали кандидатные пептиды, связывающие HLA-A2, происходящие от FOXM1. Т-клетки-киллеры от двух здоровых индивидуумов, которые были индуцированы с использованием пептидов FOXM1 362-370, 373-382 и 640-649 продуцировали IFN-γ в результате узнавания пептидов FOXM1 362-370 (YLVPIQFPV (SEQ ID NO:1)), FOXM1-373-382 (SLVLQPSVKV (SEQ ID NO:2)) и FOXM1-640-649 (GLMDLSTTPL (SEQ ID NO:3)), связанных с HLA-A2 и экспрессируемых на клетках Т2-А2. Т-клетки-киллеры от больных раком молочной железы, которые были индуцированы с использованием указанных выше пептидов, проявляли сильную цитотоксическую активность против клеток раnс-1, но не проявляли цитотоксической активности против клеток РК-8. Таким образом, индуцированные Т-клетки-киллеры, как показано, специфически узнают FOXM1 ограниченным HLA-A2 образом и проявляют сильную цитотоксическую активность против раковых клеточных линий. Соответственно, обнаружено, что любой из пептидов FOXM1-362-370 (YLVPIQFPV (SEQ ID NO:1)), FOXM1-373-382 (SLVLQPSVKV (SEQ ID NO:2)) и FOXM1-640-649 (GLMDLSTTPL (SEQ ID NO:3)) может индуцировать специфические в отношении FOXM1 Т-клетки-киллеры человека ограниченным HLA-A2 образом и что такие Т-клетки-киллеры могут повреждать экспрессирующие FOXM1 раковые клетки. FOXM1, как показано, в высокой степени экспрессируется почти во всех случаях рака легких, рака мочевого пузыря и рака поджелудочной железы, сходно и в дополнение к раку внутрипеченочных желчных протоков. Более того, FOXM1 в высокой степени экспрессируется в 40% или более случаев широкого спектра типов рака, таких как рак шейки матки, рак яичников, злокачественная лимфома, рак молочной железы, рак желудка, рак пищевода, рак простаты, гепатоцеллюлярная карцинома, рак ободочной кишки и хронический миелоидный лейкоз. Эти факты показывают, что FOXM1 пригоден в качестве мишени для иммунотерапии различных типов рака.

(1) Пептиды по настоящему изобретению и включающие их средства для индукции иммунитета против рака

Пептид по настоящему изобретению является любым из от (А) до (D) ниже:

(A) пептид, содержащий любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1-3;

(B) пептид, который содержит любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1-3, где одна, две или несколько аминокислот заменены, удалены, вставлены и/или добавлены и где пептид проявляет активность, индуцирующую цитотоксические (киллерные) Т-клетки;

(C) пептид по (В), в котором вторая аминокислота с N-конца представляет собой лейцин или метионин; и

(D) пептид по (В), в котором С-концевая аминокислота представляет собой валин или лейцин.

В настоящем документе «пептид, который проявляет активность, индуцирующую цитотоксические (киллерные) Т-клетки», означает «пептид, обладающий индуцирующей Т-клетки активностью, который стимулирует Т-клетки-киллеры (цитотоксические Т-клетки/CTL)».

Пептид по настоящему изобретению является пептидом (эпитопным пептидом), содержащим менее 40 аминокислот, предпочтительно менее 20 аминокислот, более предпочтительно менее приблизительно 15 аминокислот, и включающим любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1-3 и проявляющим активность в виде индукции Т-клеток-киллеров. Альтернативно, пептиды по настоящему изобретению (эпитопные пептиды) могут включать пептид, содержащий любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1-3, где одна, две или несколько аминокислот заменены, удалены, вставлены и/или добавлены до тех пор, пока сохраняется способность индуцировать Т-клетки-киллеры. Количество замененных, удаленных, вставленных и/или добавленных остатков обычно составляет пять аминокислот или менее, предпочтительно четыре аминокислоты или менее, более предпочтительно три аминокислоты или менее, даже более предпочтительно одну аминокислоту или две аминокислоты.

Варианты пептидов (т.е. пептиды, содержащие аминокислотные последовательности, полученные в результате модификации исходных аминокислотных последовательностей путем замены, делеции, вставки и/или добавления одного, двух или нескольких аминокислотных остатков), как известно, сохраняют исходную биологическую активность (Mark DF et al., (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:5662-6; Zoller MJ and Smith M, (1982) Nucleic Acids Res 10:6487-500; Dalbadie-McFarland G et al. (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79:6409-13). Аминокислотная модификация предпочтительно сохраняет свойства исходных аминокислотных боковых цепей. Примеры свойств аминокислотных боковых цепей представлены ниже: аминокислоты с гидрофобными боковыми цепями (A, I, L, M, F, Р, W, Y, V); аминокислоты с гидрофильными боковыми цепями (R, D, N, С, Е, Q, G, Н, K, S, Т); и боковые цепи, обладающие следующими функциональными группами или характеристиками в целом: алифатические боковые цепи (G, А, V, L, I, P); боковые цепи, содержащие гидроксильные группы (S, Т, Y); боковые цепи, содержащие атом серы (С, М); боковые цепи, содержащие карбоновые кислоты и амиды (D, N, Е, Q); боковые цепи, содержащие основания (R, K, Н); и боковые цепи, содержащие ароматические кольца (Н, F, Y, W). Буквы в скобках представляют собой однобуквенные коды аминокислот.

В предпочтительном варианте осуществления пептиды по настоящему изобретению (иммуногенные пептиды) представляют собой нонапептиды (9-членные) или декапептиды (10-членные).

Для получения пептидов с высоким связывающим сродством и активностью, индуцирующей Т-клетки-киллеры, аминокислотная последовательность пептида - части природного FOXM1 может быть модифицирована путем замены, делеции, вставки и/или добавления одной, двух или нескольких аминокислот. В настоящем документе термин «несколько» относится к пяти или менее, предпочтительно к трем или менее, более предпочтительно к двум или менее. Более того, так как известна упорядоченность пептидных последовательностей, которые обладают высоким сродством к антигенам HLA (Kubo RT, et al., (1994) J. Immunol., 152, 3913-24; Rammensee HG, et al., (1995) Immunogenetics. 41:178-228; Kondo A, et al. (1995) J. Immunol. 155:4307-12), пептиды по настоящему изобретению (эпитопные пептиды) могут быть модифицированы на основе упорядоченности для того, чтобы повысить их сродство к антигенам HLA. Например, пептиды с высоким связывающим сродством к HLA-A2 могут быть получены путем замены второй аминокислоты с N-конца на лейцин или метионин. Сходно, пептиды с высоким связывающим сродством к HLA-A2 могут быть также получены путем замены С-концевой аминокислоты на валин или лейцин.

Когда последовательность эпитопного пептида идентична части аминокислотной последовательности эндогенного или экзогенного белка, обладающего отличной функцией, могут вызываться побочные эффекты, такие как аутоиммунные нарушения или аллергические симптомы против конкретного вещества. Для того чтобы избежать таких побочных эффектов модифицированный эпитопный пептид не должен быть идентичным аминокислотным последовательностям известных белков. Для этой цели необходимо осуществить поиск гомологии с использованием доступных баз данных для подтверждения того, что не существует эндогенного или экзогенного белка с отличной функцией, который имеет 100% гомологию с модифицированным эпитопным пептидом. С помощью этой процедуры можно избежать рисков, обусловленных указанной выше модификацией аминокислотной последовательности для повышения связывающего сродства к антигенам HLA и/или повышения активности, индуцирующей Т-клетки-киллеры.

Хотя указанные выше пептиды, обладающие высоким связывающим сродством к антигенам HLA, как предполагается, являются высокоэффективными в качестве вакцин против рака, кандидатные пептиды, отобранные с использованием в качестве показателя высокое связывающее сродство, необходимо проверить, обладают ли они действительно активностью, индуцирующей Т-клетки-киллеры. Активность, индуцирующая Т-клетки-киллеры, может быть подтверждена с помощью: индукции антигенпрезентирующих клеток, обладающих антигеном МНС человека (например, В-лимфоцитов, макрофагов и дендритных клеток), и более конкретно индукции дендритных клеток, происходящих от мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека; стимуляции их интересующим пептидом; затем смешивания их с CD8-позитивными клетками; и измерения цитотоксической активности в отношении клеток-мишеней. В качестве реакционной системы могут быть использованы трансгенные животные, которые экспрессируют антиген HLA человека (как описано, например, в BenMohamed L, et al. (2000) Hum. Immunol. 61 (8): 764-79, относящихся к этому статьях, книгах и адресах связи). Например, клетки-мишени могут быть помечены радиоактивным изотопом ⁵¹Cr или тому подобным, и цитотоксическая активность может быть рассчитана по радиоактивности, высвобождаемой из клеток-мишеней. Альтернативно, клетки-мишени могут быть проверены с помощью: измерения IFN-γ, продуцируемого и секретируемого Т-клетками-киллерами в присутствии антигенпрезентирующих клеток, обладающих иммобилизованным пептидом; и визуализации зоны продукции IFN-γ в культуральной среде с использованием моноклонального антитела против IFN-γ.

Как показано в примерах, данные по тестированию активности пептидов, индуцирующей Т-клетки-киллеры, продемонстрировали, что пептиды, обладающие высоким связывающим сродством к антигену HLA, не обязательно обладают высокой индуцирующей активностью. Однако нонапептиды, содержащие любую из аминокислотных последовательностей FOXM1-362-370 (YLVPIQFPV (SEQ ID NO:1)), FOXM1-373-382 (SLVLQPSVKV (SEQ ID NO:2)) и FOXM1 640-649 (GLMDLSTTPL (SEQ ID NO:3)) проявили особенно высокую активность, индуцирующую Т-клетки-киллеры.

Как описано выше, в настоящем изобретении предлагаются пептиды, проявляющие активность, индуцирующую Т-клетки-киллеры, более конкретно, пептиды, содержащие любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1-3 и их варианты (т.е. аминокислотные последовательности, в которых одна, две или несколько аминокислот заменены, удалены, вставлены и/или добавлены). Предпочтительно, аминокислотные последовательности пептидов, содержащие девять аминокислот любой из SEQ ID NO:1-3, или их варианты не идентичны последовательностям других эндогенных белков. Особенно пептиды с высоким связывающим сродством к HLA-A2 могут быть получены путем замены второй аминокислоты с N-конца на лейцин или метионин и/или путем замены С-концевой аминокислоты на валин или лейцин.

Пептиды по настоящему изобретению могут включать модификации, такие как гликозилирование, окисление боковой цепи и фосфорилирование, до тех пор, пока пептиды не потеряют свою активность, индуцирующую Т-клетки-киллеры. Другие модификации включают, например, D-аминокислоты и другие аминокислотные аналоги, которые могут быть использованы для повышения периода полужизни пептидов в сыворотке.

Методы получения и продукции пептидов по настоящему изобретению особенно не ограничены. Они могут представлять собой химически синтезированные пептиды или рекомбинантные пептиды, продуцируемые с помощью методов рекомбинации генов.

Химически синтезированные пептиды по настоящему изобретению могут быть синтезированы в соответствии с методами химического синтеза, такими как метод Fmoc (флуоренилметилоксикарбонильный метод) и метод t-Boc (трет-бутилоксикарбонильный метод). Пептиды по настоящему изобретению могут быть также синтезированы с использованием различных имеющихся в продаже пептидных синтезаторов.

Пептиды по настоящему изобретению могут быть получены в виде рекомбинантных белков с помощью получения ДНК, обладающих нуклеотидными последовательностями, кодирующими пептиды или их варианты или гомологи, и введения их в подходящую экспрессионную систему.

Используемые экспрессионные векторы могут быть предпочтительно любыми векторами, которые могут автономно дуплицироваться в клетках-хозяевах или могут быть включены в хромосому клеток-хозяев и содержат промотор в положении, подходящем для разрешения экспрессии гена, кодирующего пептид. Трансформированные клетки, обладающие геном, кодирующим пептид по настоящему изобретению, могут быть получены путем введения указанного выше экспрессионного вектора хозяину. Хозяин может представлять собой любое из бактерий, дрожжей, животных клеток и клеток насекомых, и экспрессионный вектор может быть введен хозяину с использованием известных способов в зависимости от хозяина.

В настоящем изобретении рекомбинантные пептиды могут быть выделены путем культивирования трансформированных клеток, полученных, как описано выше, продукции и накопления пептидов в культуре и получения пептидов по настоящему изобретению из культуры.

Когда трансформированной клеткой является прокариот, такой как Е.coli, или эукариот, такой как дрожжи, культуральная среда для этих микроорганизмов может быть либо природной, либо синтетической средой, до тех пор, пока она содержит источник углерода, источник азота, неорганические соединения и тому подобное, что может быть использовано микроорганизмами и позволяет эффективно культивировать трансформированную клетку. Условия культивирования могут быть условиями, традиционно используемыми для культивирования микроорганизмов. После культивирования пептиды по настоящему изобретению могут быть выделены из культуры трансформированных клеток и очищены с использованием общепринятых методов выделения и очистки пептидов.

Пептиды, содержащие аминокислотную последовательность, в которой одна, две или несколько аминокислот заменены, удалены, вставлены или добавлены в любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1-3, могут быть подходящим образом продуцированы или получены специалистом в данной области техники на основе информации о последовательности нуклеотидов в ДНК, кодирующей любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1-3. Конкретно, ген, который кодирует пептид, содержащий аминокислотную последовательность, в которой одна, две или несколько аминокислот заменены, удалены, вставлены и/или добавлены в любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1-3, и проявляющий активность, индуцирующую Т-клетки-киллеры, может быть получен с помощью любых методов, известных специалистам в данной области техники, таких как химический синтез, методы генной инженерии и мутагенез. Например, пригоден метод сайт-направленного мутагенеза, который является одним из методов генной инженерии, так как с его помощью можно вводить конкретную мутацию в конкретное положение. Он может быть осуществлен в соответствии с методами, описанными в руководствах Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 1989 (обозначаемом в настоящем документе далее как Molecular Cloning, 2^nd Ed.) и Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, John Wiley & Sons (1987-1997) (обозначаемом в настоящем документе далее как Current Protocols in Molecular Biology) и т.д.

Описанные выше пептиды по настоящему изобретению могут индуцировать иммунитет против рака, как показано в примерах ниже. Следовательно, в настоящем изобретении предлагаются средства для индукции иммунитета против рака, включающие один или более пептидов по настоящему изобретению в качестве активных ингредиентов.

Индуцирующие иммунитет средства по настоящему изобретению могут быть получены в виде смешанного состава, объединяющего с два или более эпитопных пептида. Индуцирующие иммунитет средства, приготовленные путем объединения множественных типов пептидов, могут представлять собой коктейль или могут быть совместно связаны с использованием стандартных методов. Эпитопные пептиды, предназначенные для объединения, могут представлять собой пептиды, обладающие различными аминокислотными последовательностями, происходящими от одного и того же гена, или могут представлять собой пептиды, обладающие аминокислотными последовательностями, происходящими от разных генов. Когда вводят пептиды по настоящему изобретению, вводимые пептиды презентируются на антигенах HLA антигенпрезентирующих клеток с высокой плотностью, и затем индуцируются Т-клетки-киллеры, которые специфически взаимодействуют с комплексами, образованными между вводимыми пептидами и антигенами HLA. Альтернативно, путем контактирования дендритных клеток, отобранных у индивидуума, с пептидами по настоящему изобретению (или путем пульсирования дендритных клеток, отобранных у индивидуума, пептидами по настоящему изобретению) могут быть получены антигенпрезентирующие клетки, которые презентируют пептиды по настоящему изобретению на своей клеточной поверхности. С помощью введения этих антигенпрезентирующих клеток обратно индивидууму в организме индивидуума могут быть индуцированы Т-клетки-киллеры, и в результате может быть увеличен иммунный ответ на клетки-мишени, презентирующие пептиды по настоящему изобретению.

При использовании in vitro или in vivo, предпочтительно in vitro, средства для индукции иммунитета против рака по настоящему изобретению могут индуцировать Т-клетки-хелперы, Т-клетки-киллеры или популяции иммуноцитов, включающие эти клетки, тем самым обеспечивая иммунитет против рака.

(2) Средства по настоящему изобретению для лечения и/или профилактики рака (вакцины против рака)

В примерах показано, что пептиды по настоящему изобретению могут индуцировать in vivo Т-клетки-киллеры, специфичные в отношении раковых клеток. С другой стороны, в предшествующем изобретении было показано, что FOXM1 в высокой степени экспрессировался в большинстве случаев рака легких, холангиоцеллюлярной карциномы, рака мочевого пузыря, почечно-клеточной карциномы, рака простаты, хронического миелогенного лейкоза, злокачественной лимфомы, рака шейки матки, остеосаркомы, рака молочной железы, саркомы мягких тканей, рака ободочной кишки и тому подобное. Соответственно, индуцирующие иммунитет средства, содержащие один или более пептидов по настоящему изобретению, как ожидается, являются эффективными в качестве активного ингредиента как средства для лечения и/или профилактики рака. Это значит, что можно ожидать индукцию и активацию Т-клеток-киллеров, атакующих опухоль, в результате введения в организм пептидов по настоящему изобретению совместно с подходящим адъювантом или в результате пульсирования антигенпрезентирующих клеток, таких как дендритные клетки, пептидами и затем их введения в организм. Таким образом, в конечном итоге могут ожидаться противоопухолевые эффекты. Более того, ген, кодирующий пептид по настоящему изобретению, может быть введен в подходящий вектор. Антигенпрезентирующие клетки человека (дендритные клетки и т.д.) и бактерии, такие как BCG, Mycobacterium tuberculosis, которые трансформированы рекомбинантной ДНК или вирусами, такими как вирусы коровьей оспы, которые содержат ДНК, кодирующую пептид по настоящему изобретению, включенную в их геном, можно эффективно использовать в качестве живых вакцин для лечения и/или профилактики рака человека. Дозировки и методы введения вакцин против рака являются такими же, что и для обычных вакцин против оспы и вакцин BCG.

В настоящем изобретении термин «вакцина» (также называемая «иммуногенной композицией») относится к веществу, которое индуцирует противоопухолевый иммунитет или подавляет различные типы рака при инокуляции животному. По настоящему изобретению предполагается, что пептид, содержащий любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1-3, представляет собой ограниченный HLA-A2 эпитопный пептид, который может индуцировать сильный и специфичный иммунный ответ против клеток, презентирующих FOXM1. Соответственно, настоящее изобретение также включает способы индукции противоопухолевого иммунитета с помощью использования пептидов, содержащих любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1-3 или их варианты, которые включают замену, делецию, вставку и/или добавление одной, двух или нескольких аминокислот. В целом, противоопухолевый иммунитет включает следующие иммунные ответы:

(1) индукцию Т-клеток-киллеров против опухолей, содержащих клетки, экспрессирующие FOXM1,

(2) индукцию антител, которые узнают опухоли, содержащие клетки, экспрессирующие FOXM1, и

(3) индукцию продукции противоопухолевых цитокинов.

Когда конкретный пептид индуцирует любой из этих иммунных ответов при инокуляции животному, пептид определяется как обладающий эффектом, индуцирующим противоопухолевый иммунитет. Индукция пептидом противоопухолевого иммунитета может быть определена по обнаружению in vivo или in vitro ответа иммунной системы хозяина на пептид.

Например, хорошо известны методы определения индукции Т-клеток-киллеров. Чужеродное вещество, которое вторгается в живой организм, презентируется Т-клеткам и В-клеткам под действием антигенпрезентирующих клеток (АРС). Т-клетки, которые отвечают на антигены, презентируемые антигенпрезентирующими клетками специфическим для антигена образом, дифференцируются в Т-клетки-киллеры (также называемые цитотоксическими Т-клетками или CTL) путем стимуляции антигенами и последующей пролиферации. В настоящем документе этот процесс называется «активацией» Т-клеток. Индукция Т-клеток-киллеров специфическим пептидом может быть оценена по презентации пептида Т-клеткам с использованием пульсированных пептидом антигенпрезентирующих клеток и последующего определения индукции Т-клеток-киллеров. Более того, антигенпрезентирующие клетки обладают эффектом в отношении активации CD4⁺ Т-клеток, CD8⁺ Т-клеток, макрофагов, эозинофилов и NK-клеток. Так как CD4⁺ Т-клетки важны для противоопухолевого иммунитета, действие пептида, индуцирующее противоопухолевый иммунитет, может быть оценено при использовании в качестве показателя действия на активацию этих клеток.

Метод оценки эффекта индукции Т-клеток-киллеров, которые индуцируются с использованием в качестве антигенпрезентирующих клеток дендритных клеток (DC), хорошо известен в данной области техники. Среди антигенпрезентирующих клеток DC обладают наиболее сильным эффектом в плане индукции Т-клеток-киллеров. При этом методе первоначально тестируемый пептид вводят в контакт с DC и затем DC вводят в контакт с Т-клетками. В Т-клетках, контактировавших с DC, определяют Т-клетки, которые обладают цитотоксическим эффектом на клетки-мишени. Если Т-клетки проявляют цитотоксическую активность против клеток-мишеней, это означает, что тестируемый пептид обладает активностью, индуцирующей цитотоксические Т-клетки. Активность Т-клеток-киллеров против клеток-мишеней, таких как клетки опухолей, может быть определена, например, с использованием в качестве показателя лизиса клеток опухолей, меченных ⁵¹Cr. Альтернативно, степень повреждения опухолевых клеток может быть оценена с использованием в качестве показателя активности включения ³H-тимидина или секреции LDH (лактатдегидрогеназы).

Тестируемые пептиды, для которых этими методами подтверждена проявляемая активность в отношении индукции Т-клеток-киллеров, представляют собой пептиды, которые проявляют эффект активации DC и последующую активность, индуцирующую Т-клетки-киллеры. Следовательно, пептиды, которые проявляют активность, индуцирующую Т-клетки-киллеры против опухолевых клеток, пригодны в качестве вакцин против типов рака, презентирующих FOXM1. Более того, антигенпрезентирующие клетки, которые приобрели способность (активность) индуцировать Т-клетки-киллеры против типов рака в результате контакта с пептидами, пригодны в качестве вакцин против типов рака. Кроме того, Т-клетки-киллеры, которые приобрели цитотоксичность в результате презентации пептидов антигенпрезентирующими клетками, также могут быть использованы в качестве вакцин против типов рака, презентирующих FOXM1. Методы лечения рака с использованием противоопухолевого иммунитета, вызываемого антигенпрезентирующими клетками и Т-клетками-киллерами, называются цитоиммунотерапией.

В целом, при использовании пептидов для цитоиммунотерапии эффективность индукции Т-клеток-киллеров может быть повышена путем объединения многих пептидов, имеющих различную структуру. Следовательно, при стимуляции DC фрагментами белка выгодно использовать смесь многих типов пептидных фрагментов.

Индукция противоопухолевого иммунитета пептидами может быть также оценена с помощью выявления индукции продукции антител против опухолей. Например, когда индуцируются антитела против пептидов путем иммунизации лабораторных животных пептидами, и они подавляют рост, пролиферацию и/или метастазирование опухолевых клеток, это свидетельствует о том, что пептиды индуцируют противоопухолевый иммунитет.

Противоопухолевый иммунитет может быть индуцирован путем введения вакцины по настоящему изобретению, и индукция противоопухолевого иммунитета дает возможность лечить и/или предотвращать типы рака. Эффекты лечения рака и/или профилактики развития рака могут включать ингибирование роста раковых клеток, регрессию раковых клеток и подавление развития раковых клеток. Снижение степени смертности индивидуумов от рака, снижение маркеров опухоли в крови и снижение определяемых симптомов, связанных с раком, также включаются в эффекты лечения и/или профилактики рака. Терапевтические и/или профилактические эффекты вакцины против рака являются предпочтительно статистически значимыми по сравнению с эффектами в контроле без введения вакцины. Например, наблюдаются эффекты предпочтительно с уровнем значимости 5% или менее. Для определения статистической значимости могут быть использованы статистические методы, такие как t-критерий Стьюдента, U-критерий Манна-Уитни, ANOVA или тому подобное.

В настоящем изобретении индивидуум представляет собой предпочтительно млекопитающее. Примеры млекопитающих включают людей, нечеловекообразных приматов, мышей, крыс, собак, кошек, лошадей и крупный рогатый скот, но не ограничиваются этим.

Пептиды по настоящему изобретению можно вводить индивидууму in vivo или ex vivo. Более того, для получения иммуногенной композиции для лечения и/или профилактики рака могут быть использованы иммуногенные пептиды по настоящему изобретению, которые представляют собой нонапептиды, выбранные из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1-3 и их мутантные пептиды.

Более конкретно, в настоящем изобретении предлагаются фармацевтические средства для лечения опухоли или профилактики опухолевого роста, метастазирования и тому подобное, которые включают в качестве активного ингредиента один или более пептидов по настоящему изобретению. Пептиды по настоящему изобретению особенно пригодны для лечения опухолей, таких как рак поджелудочной железы, холангиоцеллюлярная карцинома, рак желудка, рак ободочной кишки, немелкоклеточный рак легких, рак семенников, рак шейки матки, остеосаркома и саркома мягких тканей.

Пептиды по настоящему изобретению можно вводить непосредственно индивидууму в качестве фармацевтических средств, приготовленных с помощью традиционных методов составления. Такие составы могут при необходимости содержать в дополнение к пептидам по настоящему изобретению фармацевтически приемлемые носители, наполнители и тому подобное. Фармацевтические средства по настоящему изобретению можно использовать для лечения и/или профилактики различных опухолей.

Более того, для установления эффективного клеточного иммунитета можно смешивать адъюванты с фармацевтическими средствами для лечения и/или профилактики опухолей, включающими один или более пептидов по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента. Средства можно вводить совместно с другими активными ингредиентами, такими как противоопухолевые средства. Подходящие составы включают также гранулы. Подходящие адъюванты описаны в литературе (Johnson AG. (1994) Clin. Microbiol. Rev., 7:277-89). Примеры адъювантов включают неполный адъювант Фрейнда, BCG, трегалозы димиколат (TDM), липополисахарид (LPS), адъювант квасцовой муки, адъювант диоксида кремния, фосфат алюминия, гидроксид алюминия и квасцы, но не ограничиваются этим. Кроме того, можно легко использовать липосомные составы, гранулярные составы, в которых лекарство связано с шариками, имеющими диаметр несколько микрометров, и составы, в которых липиды связаны с упомянутыми выше пептидами. Методами введения могут быть пероральное введение, внутрикожная инъекция, подкожная инъекция, внутривенная инъекция или тому подобное и могут включать системное введение и местное введение рядом с опухолью-мишенью.

Доза пептидов по настоящему изобретению может быть приведена в соответствие с подлежащим лечению заболеванием, возрастом и массой тела больного, методом введения и тому подобным. Доза обычно составляет от 0,001 мг до 1000 мг, предпочтительно от 0,01 мг до 100 мг и наиболее предпочтительно от 0,1 мг до 10 мг. Предпочтительно введение производят от одного раза в несколько дней до одного раза в несколько месяцев, но специалисты в данной области техники могут легко выбрать подходящую дозу и метод введения; выбор и оптимизация этих параметров полностью входят в объем традиционных методов. Форма составов не является особенно ограниченной, и они могут быть высушенными замораживанием или гранулированными путем добавления наполнителей, таких как сахар.

К фармацевтическим средствам по настоящему изобретению могут быть добавлены вспомогательные средства для повышения индуцирующей киллерную Т-клеточную активность, которые включают бактериальные компоненты бактерий BCG и тому подобного, включающие мурамиловый дипептид (MDP), ISCOM, описанный в Nature, vol.344, р873 (1990), QS-21 ряда сапонина, описанный в J. Immunol. vol.148, р1438 (1992), липосому и гидроксид алюминия. Более того, в качестве вспомогательных средств также могут быть использованы иммуностимуляторы, такие как лентинан, сизофиран и пицибанил. В качестве вспомогательных средств также могут быть использованы цитокины и им подобное, которые повышают рост и дифференцировку Т-клеток, такие как ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-12, ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНО, а также α-галактозилцерамид, который активирует NKT-клетки, и CpG и липополисахариды (LPS), которые активируют систему врожденного иммунитета путем связывания с Toll-подобными рецепторами, и тому подобное.

Композиции вакцины по настоящему изобретению содержат компонент, который примирует киллерные Т-клетки. В качестве веществ, которые примируют против вирусных антигенов in vivo, были идентифицированы липиды. Например, остатки пальмитиновой кислоты могут связываться с ε-аминогруппой и α-аминогруппой остатка лизина и затем присоединяться к иммуногенному пептиду по настоящему изобретению. Содержащие липиды пептиды можно прямо вводить путем их включения в мицеллу или частичку или их инкапсулирования в липосому или их эмульгирования в адъюванте. Другим примером примирования липидом является примирование липопротеидом Е.coli, таким как трипальмитоил-S-глицерилцистеинил-серил-серин (P3CSS), ковалентно связанным с подходящим пептидом (Deres K., et al., (1989) Nature 342:561-4).

Иммуногенные пептиды по настоящему изобретению могут быть экспрессированы с помощью вирусных векторов или бактериальных векторов. Примеры подходящих экспрессионных векторов включают авирулентные вирусы-хозяева, такие как вирус коровьей оспы и птичьей оспы. Например, в качестве вектора для экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей пептид, может быть использован вирус коровьей оспы. Путем введения рекомбинантного вируса коровьей оспы в клетки-хозяева осуществляется экспрессия иммуногенных пептидов, вызывающих иммунный ответ. Метод иммунизации с использованием векторов коровьей оспы описан, например, в патенте США No. 4722848. Можно также использовать бациллу Кальметта-Герина (BCG). Векторы BCG описаны в Stover СК, et al., (1991) Nature 31:456-60. В данной области техники известно множество других векторов, пригодных для терапевтического введения или иммунизации, включая аденовирусные векторы и аденоассоциированные вирусные векторы, ретровирусные векторы, векторы бациллы тифа (Salmonella typhi) и детоксифицированные токсиновые векторы сибирской язвы. См., например, Shata MT, et al., (2000) Mol. Med. Today 6:66-71; Shedlock DJ and Weiner DB., et al., (2000) J. Leukoc. Biol. 68:793-806; и Hipp JD, et al., (2000) In Vivo 14:571-85.

Киллерные Т-клетки можно эффективно индуцировать в организме больного путем добавления in vitro антигенного пептида к клеткам, выделенным из организма больного, или клеткам от другого индивидуума, имеющим некоторые общие аллели HLA (аллогенным клеткам) и презентирующим антиген, с последующим введением клеток больному в сосуды, местно в опухоль или тому подобное. Альтернативно, после индукции in vitro киллерных Т-клеток добавлением пептида к лимфоцитам периферической крови больного и их культивирования in vitro клетки можно вводить больному в сосуды, местно в опухоль или тому подобное. Такое лечение переносом клеток уже проводилось в качестве противораковой терапии и является хорошо известным для специалистов в данной области техники методом.

Тип рака в настоящем изобретении не является особо ограниченным, и конкретные примеры включают рак пищевода, рак молочной железы, рак щитовидной железы, рак прямой кишки, рак поджелудочной железы, злокачественную меланому (меланому), злокачественную лимфому, остеосаркому, феохромоцитому, рак головы и шеи, рак матки, рак яичника, рак мозга, хронический миелогенный лейкоз, острый миелогенный лейкоз, рак почки, рак простаты, рак легкого, рак желудка, рак печени, рак желчного пузыря, рак семенника, рак щитовидной железы, рак мочевого пузыря, саркому и т.д. Примеры рака, к которому применимо настоящее изобретение, включают рак желчного пути, рак легкого, рак поджелудочной железы и рак мочевого пузыря.

(3) Антитела по настоящему изобретению

Настоящее изобретение также относится к антителам, которые узнают упомянутый выше полноразмерный пептид по настоящему изобретению или его часть в качестве эпитопа (антигена), и относится к киллерным Т-клеткам, которые индуцируются путем стимуляции in vitro белками или пептидами. В целом, киллерные Т-клетки проявляют большую противоопухолевую активность по сравнению с антителами.

Более того, подобно пептидам по настоящему изобретению, антитела по настоящему изобретению пригодны в качестве профилактических и/или терапевтических средств против типов рака, экспрессирующих FOXM1, поскольку они могут ингибировать активность ракового антигена FOXM1. При практическом использовании пептиды или антитела по настоящему изобретению можно вводить в том виде, в котором они находятся, или путем инъекции с фармацевтически приемлемым носителем и/или разбавителем вместе с адъювантом, если это необходимо. Альтернативно, их можно вводить путем чрескожного всасывания через мембраны слизистой с помощью метода распыления или тому подобного. Конкретнее, в настоящем описании примером носителей является человеческий сывороточный альбумин; a PBS, дистиллированная вода и тому подобное служат примерами разбавителей.

Антителами по настоящему изобретению могут быть поликлональные антитела или моноклональные антитела и их можно получать с помощью методов, известных специалистам в данной области техники.

Например, поликлональные антитела могут быть получены путем иммунизации видов млекопитающих или птиц пептидом по настоящему изобретению в качестве антигена, отбора крови от видов млекопитающих или птиц и отделения и очистки антител из собранной крови. Например, можно иммунизировать млекопитающих, таких как мышь, хомячок, морская свинка, цыпленок, крыса, кролик, собака, коза, овца и корова, или виды птиц. Методы иммунизации известны специалистам в данной области техники, и антиген можно вводить, например, два или три раза с интервалом, например, от 7 до 30 дней. Доза может составлять, например, приблизительно от 0,05 мг до 2 мг антигена на введение. Путь введения не является особо ограниченным и может быть подходящим образом выбран из подкожного введения, внутрикожного введения, внутрибрюшинного введения, внутривенного введения, внутримышечного введения и тому подобного. Более того, антиген можно использовать после растворения в подходящем буфере, например, буфере, содержащем традиционный адъювант, такой как полный адъювант Фрейнда и гидроксид алюминия.

Иммунизированные виды млекопитающих или птиц выращивают в течение определенного периода времени, во время которого происходит увеличение титра антитела, после чего их можно дополнительно иммунизировать, например, от 100 мкг до 1000 мкг антигена. Кровь у иммунизированных видов млекопитающих или птиц можно отбирать на протяжении от одного до двух месяцев после последнего введения, и кровь может быть отделена и очищена традиционными методами, такими как центрифугирование, осаждение сульфатом аммония или полиэтиленгликолем, хроматография, такая как хроматография гельфильтрацией, ионообменная хроматография, аффинная хроматография и тому подобное, для получения поликлональных антител, которые узнают пептиды по настоящему изобретению, в виде поликлональной антисыворотки.

С другой стороны, могут быть получены моноклональные антитела путем получения гибридом. Например, гибридомы могут быть получены слиянием клеток, продуцирующих антитело, с клеточными линиями миеломы. Гибридомы, которые продуцируют моноклональные антитела по настоящему изобретению, могут быть получены методами слияния клеток, такими, как указанные ниже.

В качестве продуцирующих антитело клеток используют клетки селезенки, клетки лимфатического узла, В-лимфоциты и тому подобное от иммунизированных животных. В качестве антигенов используют пептиды по настоящему изобретению. В качестве иммунизируемых животных можно использовать таких животных, как мышь и крыса, а введение антигенов этим животным производят традиционными методами. Например, животных иммунизируют введением суспензии или эмульсии пептида по настоящему изобретению, являющегося антигеном, с адъювантом, таким как полный адъювант Фрейнда и неполный адъювант Фрейнда, животным несколько раз внутривенно, подкожно, внутрикожно, внутрибрюшинно или тому подобное. Продуцирующие антитело клетки, такие как клетки селезенки, получают от иммунизированных животных, и они могут быть слиты с миеломными клетками с помощью известных методов (G. Kohler et al., Nature, 256, 495 (1975)) с образованием гибридом.

В случае мышей примеры линий клеток миелом, используемых для слияния клеток, включают, например, линии P3X63Ag8, P3U1, Sp2/0 и т.д. Для слияния клеток используют стимулирующее слияние средство, такое как полиэтиленгликоль и вирус Сендай, а для селекции гибридом с помощью традиционного метода после слияния клеток используют среду гипоксантин/аминоптерин/тимидин (HAT). Гибридомы, полученные слиянием клеток, клонируют методом серийных разведении или тому подобное. При необходимости клеточные линии, продуцирующие моноклональные антитела, которые специфически узнают пептиды по настоящему изобретению, могут быть получены с использованием пептидов по настоящему изобретению для скрининга с помощью иммуноферментного метода.

В дополнение к указанным выше методам иммунизированные клетки можно модулировать стимулирующими лимфоцитами человека, такими как инфицированные вирусом ЕВ лимфоциты, in vitro с использованием пептидов по настоящему изобретению, клеток, экспрессирующих пептиды, или их лизатов. Человеческие антитела, которые связывают пептиды по настоящему изобретению, могут быть получены слиянием иммунизированных лимфоцитов с клетками костного мозга от человека, такими как U266 (патентная заявка Японии, публикация Kokai No. (JP-A) S63-17688 (нерассмотренная опубликованная японская патентная заявка)).

Для получения представляющих интерес моноклональных антител из полученных таким образом гибридом гибридомы можно культивировать с помощью традиционных методов культивирования или методов образования асцитов, и моноклональные антитела могут быть очищены из культурального супернатанта или асцитов. Очистка моноклональных антител из культуральных супернатантов или асцитов может быть осуществлена традиционными методами. Например, могут быть подходящим образом объединены и использованы фракционирование сульфатом аммония, гельфильтрация, ионообменная хроматография, аффинная хроматография и тому подобное.

Трансгенных животных, содержащих группу генов человеческих антител, можно иммунизировать с использованием пептидов по настоящему изобретению, экспрессирующих пептиды клеток или их лизатов. Продуцирующие антитело клетки можно собрать из иммунизированных трансгенных животных и слить с описанными выше миеломными клеточными линиями для получения гибридом. Затем из гибридом можно получить интересующие моноклональные антитела (WO 92/03918; WO 94/02602; WO 94/25585; WO 94/33735; WO 96/34096).

Более того, продуцирующим антитело иммунным клеткам, таким как иммунизированные лимфоциты, может быть придано бессмертие с помощью онкогенов, и их можно использовать для получения моноклональных антител.

Полученные таким образом моноклональные антитела можно также модулировать с помощью методов генной манипуляции (Borrbaeck and Larrick, (1990) Therapeutic Monoclonal Antibodies). Например, рекомбинантные антитела могут быть получены клонированием ДНК, кодирующей антитело из продуцирующих антитело клеток, таких как гибридомы и иммунизированные лимфоциты, ее вставкой в подходящий вектор и его введением в клетки-хозяева.

Антителами по настоящему изобретению могут быть фрагменты антител или модифицированные антитела, если они связывают пептиды по настоящему изобретению. Фрагментами антител могут быть Fab, F(ab')₂, Fv или одноцепочечный Fv (scFv), где фрагменты Fv, берущие начало от Н и L цепей, соединены друг с другом с помощью походящего линкера (Huston et al., (1998) Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-83). Конкретнее, фрагменты антител могут быть получены обработкой антител ферментом, таким как папаин и пепсин (Со et al., (1994) J Immunol 152:2968-76; Better and Horwitz, (1989) Methods Enzymol 178: 476-96; Pluckthun and Skerra, (1989) Methods Emzymol 178:497-515; Lamoyi (1986) Methods Enzymol 121:652-63; Rousseaux et al., (1986) Methods Enzymol 121:663-9; Bird and Walker, (1991) Trends Biotech 9:132-7).

Антитела по настоящему изобретению включают модифицированные антитела, полученные путем присоединения антител к различным молекулам, таким как полиэтиленгликоль (ПЭГ). Антитела могут быть модифицированы традиционными методами химической модификации, известными в данной области техники.

Антитела по настоящему изобретению включают химерные антитела, содержащие вариабельную область, берущую начало от антитела, отличного от человеческого, и константную область из антитела человека, и гуманизированные антитела, содержащие область, определяющую комплементарность (CDR), берущую начало от антитела, отличного от человеческого, каркасную область (FR) из человеческого антитела и константную область из антитела человека. Такие антитела могут быть получены традиционными методами, известными в данной области техники. Гуманизированные антитела получают заменой области последовательности CDR антитела человека областью CDR грызуна, обладающей желаемой связывающей активностью (Verhoeyen ek al., (1988) Science 239:1534-6). Соответственно, по сравнению с химерными антителами гуманизированные антитела представляют собой антитела, в которых меньшая область человеческого антитела заменена соответствующей областью с происхождением, отличным от человеческого.

Может быть также получено полностью человеческое антитело, содержащее человеческую вариабельную область в дополнение к человеческим каркасным и константным областям. Например, в методе in vitro может быть проведен скрининг с помощью рекомбинантной библиотеки бактериофагов, в которой представлены фрагменты человеческих антител (Hoogenboom and Winter, (1992) J Mol Biol 227:381-8). Сходным образом человеческие антитела могут быть получены введением иммуноглобулиновых локусов человека трансгенным животным, у которых эндогенные иммуноглобулиновые гены были частично или полностью инактивированы (патенты США No. 6150584, 5545807, 5545806, 5569825, 5625126, 5633425 и 5661016).

Полученные как указано выше антитела могут быть очищены до гомогенности традиционными для данной области техники методами. Например, могут быть использованы общие методы выделения и очистки белков. Антитела могут быть выделены и очищены с помощью сочетания колоночной хроматографии, такой как аффинная хроматография, фильтрации, ультрафильтрации, высаливания, диализа, электрофореза в полиакриламидном геле с SDS, электрофокусирования и тому подобного; однако методы выделения и очистки этим не ограничиваются (Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow and David Lane, (1988) Cold Spring Harbor Laboratory). В качестве аффинных колонок могут быть использованы колонки протеина А и колонки протеина G. Примеры колонок протеина А включают HyperD, POROS, и сефарозу F.F (Pharmacia).

Примеры хроматографии, отличной от аффинной хроматографии, включают ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, гельфильтрацию, хроматографию с обращенной фазой, адсорбционную хроматографию и тому подобное (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. et al.). Для хроматографии может быть также использована жидкостная хроматография, такая как ВЭЖХ и FPLC.

Сродство связывания антигена антителами по настоящему изобретению может быть измерено с помощью, например, измерения поглощения, твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), иммуноферментного анализа (EIA), радиоиммунологического анализа (RIA) и иммунофлуоресцентного анализа; однако, методы этим не ограничиваются. Для ELISA антитела по настоящему изобретению иммобилизуют на планшете и добавляют пептиды по настоящему изобретению, после чего добавляют образец, содержащий культуральный супернатант продуцирующих антитело клеток или очищенные антитела. Затем добавляют меченое второе антитело, которое узнает и выявляет антитело, сродство которого к связываемому антигену измеряют. После промывки планшета добавляют реагенты для выявления метки второго антитела и измеряют поглощение или тому подобное. Например, в качестве метки для второго антитела могут быть использованы ферменты, такие как щелочная фосфатаза, а в качестве реагентов для выявления могут быть использованы субстраты ферментов, такие как п-нитрофенилфосфат. Для оценки активности антител может быть также использован BIAcore (Pharmacia).

Антитела по настоящему изобретению могут определять пептиды по настоящему изобретению, содержащиеся в образцах. Конкретно, наличие пептидов по настоящему изобретению в раковых тканях может быть подтверждено, например, введением в контакт биоптатов раковых тканей с антителами по настоящему изобретению.

Перед использованием пептидов по настоящему изобретению в терапии для лечения и/или профилактики рака возможно предсказание перспективности действия для тестируемого индивидуума до начала лечения путем оценки экспрессии пептидов по настоящему изобретению в раковой ткани, подлежащей лечению с помощью антител по настоящему изобретению.

Более того, поскольку антитела по настоящему изобретению узнают пептидные фрагменты FOXM1, экспрессия которого усилена в различных раковых клетках, ожидается, что их использование применимо не только для диагностики, но и для лечения.

(4) Хелперные Т-клетки, киллерные Т-клетки или включающие их популяции иммуноцитов

Настоящее изобретение также относится к киллерным Т-клеткам и хелперным Т-клеткам, индуцированным путем стимуляции in vitro с помощью пептидов по настоящему изобретению, а также к популяциям иммуноцитов, включающим киллерные Т-клетки и хелперные Т-клетки. Например, Т-клетки с активированным ответом на опухоль индуцируются, когда лимфоциты периферической крови или инфильтрированные в опухоль лимфоциты стимулируют in vitro с помощью пептидов по настоящему изобретению, и эти активированные Т-клетки могут быть эффективно использованы для адоптивной иммунотерапии, при которой клетки вводят больному раком внутрь сосудов, местно в опухоль или тому подобное. Альтернативно, дендритные клетки, которые являются эффективными антигенпрезентирующими клетками, могут быть пульсированы пептидами по настоящему изобретению или генетически трансформированы для экспрессии пептидов, и противоопухолевый иммунный ответ может быть индуцирован стимуляцией Т-клеток in vivo или in vitro с использованием дендритных клеток.

Киллерные Т-клетки, хелперные Т-клетки или включающие их популяции иммуноцитов могут быть предпочтительно индуцированы стимуляцией in vivo или in vitro с помощью пептидов по настоящему изобретению и адъювантов. Примеры используемых в настоящем описании адъювантов включают минеральное масло, гидроксид алюминия, составы Mycobacterium tuberculosis, гемолитические составы стрептококка, составы Polyporaceae, другие адъюванты, факторы роста клеток и цитокины.

Опухоли могут быть подавлены, и рак может быть предотвращен и/или излечен путем трансфузии полученных таким образом хелперных Т-клеток, киллерных Т-клеток или включающих их популяций иммуноцитов больному раком внутрь сосудов, местно в опухоль или тому подобного.

Киллерные Т-клетки, хелперные Т-клетки или включающие их популяции иммуноцитов, которые способны подавлять опухоли, как описано выше, могут быть получены с помощью пептидов по настоящему изобретению. Таким образом, в настоящем изобретении предлагаются среды клеточных культур, содержащие пептиды по настоящему изобретению. Киллерные Т-клетки, хелперные Т-клетки или включающие их популяции иммуноцитов, способные подавлять опухоли, могут быть получены с помощью сред клеточных культур. Более того, в настоящем изобретении предлагается набор для клеточной культуры, включающий упомянутую выше среду для клеточной культуры и сосуд для клеточной культуры, для получения киллерных Т-клеток, хелперных Т-клеток или включающих их популяций иммуноцитов.

(5) Антигенпрезентирующие экзосомы

В настоящем изобретении дополнительно предлагается эндоцитозная везикула, называемая «экзосомой», которая презентирует на своей поверхности комплекс, образованный из пептида по настоящему изобретению и антигена HLA. Экзосомы могут быть получены, например, с помощью методов, подробно описанных в Японских переводах патентных заявок Японии, публикации Kokai No. (JP-A) H11-510507 (нерассмотренной публикации национальной фазы, соответствующей отличной от Японской международной публикации) и JP-A (Kohyo) 2000-512161. Предпочтительно экзосомы получают с использованием антигенпрезентирующих клеток, полученных от индивидуума, подлежащего лечению и/или профилактике. Экзосомы по настоящему изобретению можно инъецировать в качестве противораковой вакцины способом, сходным с введением пептидов по настоящему изобретению.

Антигенный тип HLA, используемый в настоящем изобретении, должен совпадать с антигенным типом HLA индивидуума, нуждающегося в лечении и/или профилактике. Например, антигенный тип HLA представляет собой HLA-A2 и, предпочтительно, HLA-A2 (HLA-A*0201). "HLA-A2" означает белок, тогда как (HLA-A*0201)" означает ген, соответствующий сегменту белка, из-за отсутствия в настоящее время терминологии для экспрессии сегментов белка.

(6) Методы индукции антигенпрезентирующих клеток и киллерных Т-клеток

В настоящем изобретении предлагаются способы индукции антигенпрезентирующих клеток с использованием одного или более пептидов по настоящему изобретению. Антигенпрезентирующие клетки могут быть индуцированы путем введения в контакт дендритных клеток, индуцированных из моноцитов периферической крови, с одним или более пептидами по настоящему изобретению для стимуляции дендритных клеток. Когда пептиды по настоящему изобретению вводят индивидууму, антигенпрезентирующие клетки, презентирующие пептиды по настоящему изобретению на своей поверхности, могут быть индуцированы в организме индивидуума. Альтернативно, может быть использован метод ex vivo, в котором антигенпрезентирующие клетки вводят в контакт с пептидами по настоящему изобретению (или пульсируют антигенпрезентирующие клетки пептидами по настоящему изобретению), после чего клетки вводят индивидууму в качестве вакцины. Например, введение ех vivo может включать стадии:

(1) сбора антигенпрезентирующих клеток от индивидуума; и

(2) введения в контакт антигенпрезентирующих клеток со стадии (1) с пептидом по настоящему изобретению (или пульсирования антигенпрезентирующих клеток со стадии (1) пептидом по настоящему изобретению).

Антигенпрезентирующие клетки, полученные на стадии (2), можно вводить индивидууму в качестве вакцины.

В настоящем изобретении также предлагаются способы индукции антигенпрезентирующих клеток, которые проявляют индуцирующую киллерные Т-клетки активность. Методы включают стадию трансфекции антигенпрезентирующих клеток in vitro геном, включающим полинуклеотид, кодирующий один или более пептидов по настоящему изобретению. Предназначенный для трансфекции ген может представлять собой ДНК или РНК. Для трансфекции могут быть соответствующим образом использованы различные методы, традиционно применяемые в данной области техники, такие как липофекция, электропорация и метод фосфата кальция, но этим методы не ограничиваются. Конкретнее, трансфекцию можно произвести, как описано в Reeves ME, et al., (1996) Cancer Res., 56:5672-7; Butterfield LH, et al., (1998) J. Immunol., 161:5607-13; Boczkowski D, et al., (1996) J Exp.Med., 184:465-72; и опубликованном Японском переводе WO 2000/509281. Когда гены трансфицируют в антигенпрезентирующие клетки, они транскрибируются и транслируются в клетках. Полученные белки затем подвергаются процессингу через пути МНС класса I и класса II и презентируются на поверхности антигенпрезентирующих клеток в виде частичных пептидов посредством пути презентации антигена.

В настоящем изобретении также предлагаются способы индукции киллерных Т-клеток с использованием одного или более пептидов по настоящему изобретению. Путем введения одного или более пептидов по настоящему изобретению индивидууму киллерные Т-клетки могут быть индуцированы в организме индивидуума, что тем самым усиливает иммунную систему против раковых клеток, презентирующих FOXM1 в опухолевых тканях. Альтернативно, активированные киллерные Т-клетки могут быть индуцированы путем введения в контакт антигенпрезентирующих клеток и CD8-позитивных клеток от индивидуума с одним или более пептидами по настоящему изобретению in vitro и путем введения в контакт мононуклеарных лейкоцитов периферической крови с антигенпрезентирующими клетками in vitro для стимуляции клеток. В терапевтических методах ex vivo иммунная система, которая направлена против раковых клеток, презентирующих FOXM1 в опухолевых тканях у индивидуума, может быть усилена возвращением активированных киллерных Т-клеток в организм индивидуума. Например, методы включают стадии:

(1) сбора антигенпрезентирующих клеток от индивидуума;

(2) введения в контакт антигенпрезентирующих клеток со стадии (1) с пептидом по настоящему изобретению (или пульсирования антигенпрезентирующих клеток со стадии (1) пептидом по настоящему изобретению);

(3) смешивания и совместного культивирования антигенпрезентирующих клеток со стадии (2) с CD8⁺ Т-клетками для индукции цитотоксических Т-клеток; и

(4) сбора CD8⁺ Т-клеток из совместной культуры стадии (3).

CD8⁺ Т-клетки с цитотоксической активностью, полученные на стадии (4), могут быть введены индивидууму в качестве вакцины.

В настоящем изобретении также предлагаются выделенные киллерные Т-клетки, индуцированные с использованием одного или более пептидов по настоящему изобретению. Предпочтительно киллерные Т-клетки, индуцированные методом по настоящему изобретению, получают от индивидуума, который подвергается лечению и/или профилактике. Клетки можно вводить в сочетании с другими средствами, содержащими антигенпрезентирующие клетки или экзосомы, презентирующие один или более пептидов по настоящему изобретению. Полученные киллерные Т-клетки специфичны в отношении клеток-мишеней, презентирующих тот же пептид, который использовался для индукции. Клетками-мишенями являются клетки, эндогенно экспрессирующие FOXM1, или клетки, трансфицированные геном FOXM1. Путем стимуляции пептидом по настоящему изобретению клетки, презентирующие пептид по настоящему изобретению на своей поверхности, такие как раковые клетки из рака поджелудочной железы, холангиоцеллюлярной карциномы, рака желудка, немелкоклеточного рака легкого, рака семенника, рака шейки матки, остеосаркомы и саркомы мягких тканей могут стать мишенью для атаки.

В настоящем изобретении также предлагаются антигенпрезентирующие клетки, презентирующие комплекс, образованный антигеном HLA и одним или более пептидами по настоящему изобретению. Антигенпрезентирующие клетки, экспрессирующие один или более пептидов по настоящему изобретению или нуклеотиды, кодирующие такие пептиды, предпочтительно получают от индивидуума, подвергаемого лечению и/или профилактике. Пептиды по настоящему изобретению, антигенпрезентирующие клетки, презентирующие пептиды, экзосомы или активированные киллерные Т-клетки можно вводить в качестве вакцины в сочетании с другими лекарствами.

Настоящее изобретение будет дополнительно описано со ссылкой на примеры ниже; однако их не следует рассматривать ограничивающие его.

Все ссылки на предшествующий уровень техники, цитированные в настоящем описании, включены в настоящее описание в качестве ссылок.

Примеры

[Пример 1]

(1) Отбор пептидов FOXM1, которые проявляют сродство к HLA-А2

Аминокислотные последовательности FOXM1 человека анализировали с помощью системы BIMAS, и было отобрано 23 типа пептидов, обладающих предсказанным сродством связывания к HLA-А2, равным 20 или более.

Таблица 1
Положение пептида	Аминокислотная последовательность пептида	Показатель сродства связывания
FOXM1 42-50	NQAEASKEV (SEQ ID NO:4)	29
FOXM1 241-249	YMAMIQFAI (SEQ ID NO:5)	201
FOXM1 256-264	RMTLKDIYT (SEQ ID NO: 6)	30
FOXM1 288-296	NLSLHDMFV (SEQ ID NO:7)	383
FOXM1 290-299	SLHDMFVRET (SEQ ID NO:8)	53
FOXM1 355-363	LLPRVSSYL (SEQ ID NO:9)	200
FOXM1 355-364	LLPRVSSYLV (SEQ ID NO:10)	118
FOXM1 362-370	YLVPIQFPV (SEQ ID NO:1)	1856
FOXM1 366-375	IQFPVNQSLV (SEQ ID NO:11)	44
FOXM1 373-382	SLVLQPSVKV (SEQ ID NO:2)	70
FOXM1 374-382	LVLQPSVKV (SEQ ID NO:12)	38
FOXM1 409-418	LLAEEGIAPL (SEQ ID NO:13)	342
FOXM1 429-438	LLFGEGFSPL (SEQ ID NO:14)	255
FOXM1 545-553	LLFSEGPST (SEQ ID NO:15)	47
FOXM1 571-579	SQLSYSQEV (SEQ ID NO:16)	26
FOXM1 616-625	KVGGIDFSPV (SEQ ID NO:17)	40
FOXM1 640-649	GLMDLSTTPL (SEQ ID NO:3)	324
FOXM1 660-669	RLLSSEPLDL (SEQ ID NO: 18)	79
FOXM1 661-669	LLSSEPLDL (SEQ ID NO:19)	36
FOXM1 702-711	SLTEGLVLDT (SEQ ID NO:20)	70
FOXM1 711-719	TMNDSLSKI (SEQ ID NO:21)	71
FOXM1 719-728	ILLDISFPGL (SEQ ID NO:22)	1047
FOXM1 720-728	LLDISFPGL (SEQ ID NO:23)	28

Подчеркнуты выявленные в настоящем изобретении ограниченные HLA-A2 эпитопы киллерных Т-клеток.

[Пример 2]

Индукция киллерных Т-клеток человека связываемыми HLA-A2 пептидами FOXM1

(1) Сбор крови

Образцы крови (50 мл) отбирали с информированного согласия у здоровых индивидуумов и позитивных по HLA-A2 больных раком молочной железы, лечившихся в госпитале медицинского факультета университета Kumamoto. После этого выделяли мононуклеарные клетки периферической крови с помощью метода центрифугирования в градиенте плотности фиколла-конрей в соответствии с ранее сообщавшимся методом (Nakatsura, Т. et a1., Eur. J. Immunol. 32, 826-836, 2002).

(2) Выделение CD8-позитивных клеток из мононуклеарных клеток периферической крови и индукция киллерных Т-клеток

Киллерные Т-клетки, специфичные в отношении пептида FOXM1, индуцировали из выделенных мононуклеарных клеток периферической крови. Киллерные Т-клетки индуцировали в соответствии с сообщением Komori H et al. (Komori H et al. Clinical Cancer Research 12: 2689-2697, 2006). Во-первых, CD8-позитивные клетки в мононуклеарных клетках периферической крови отделяли с помощью MACS. CD8-негативные клетки культивировали в течение четырех дней в присутствии GM-CSF (100 нг/мл) и ИЛ-4 (20 нг/мл) для дифференцировки в дендритные клетки. После этого добавляли ОК-432 (0/1 КЕ/мл) для созревания дендритных клеток. На седьмой день добавляли каждый из пептидов FOXM1 (10 мкМ), и затем дендритные клетки совместно культивировали с CD8-позитивными клетками в присутствии ИЛ-7 (10 нг/мл). Через два дня совместного культивирования с CD8-позитивными клетками добавляли ИЛ-2 (20 МЕ/мл). Стимуляцию антигеном с помощью дендритных клеток, полученных из аутологичных CDS-негативных клеток, повторяли три раза с однонедельным интервалом для индукции специфичных в отношении пептида киллерных Т-клеток.

(3) Оценка специфичной в отношении FOXM1 активности киллерных Т-клеток с помощью анализа ELISPOT

Анализ ELISPOT использовали для определения того, действительно ли и специфично ли индуцированные пептидами FOXM1 киллерные Т-клетки продуцируют IFN-γ в ответ на эти пептиды из FOXM1. Анализ ELISPOT проводили в соответствии с ранее описанным методом (Komori H et al. Clinical Cancer Research 12: 2689-2697, 2006). В результате специфичная для пептидов FOXM1 активация киллерных Т-клеток наблюдалась для киллерных Т-клеток, индуцированных пептидами FOXM1 362-370, 373-382 и 640-649 (фиг.1). На фиг.1 представлены репрезентативные результаты анализа индуцированных пептидом FOXM1 киллерных Т-клеток.

(4) Оценка цитотоксической активности киллерных Т-клеток с помощью теста цитотоксичности

Цитотоксическую активность индуцированных, специфичных в отношении пептидов FOXM1 киллерных Т-клеток оценивали с помощью теста цитотоксичности с использованием позитивной в отношении HLA-A2 и экспрессирующей FOXM1 линии клеток раnс-1 и негативной в отношении HLA-A2 и экспрессирующей FOXM1 линии клеток рака поджелудочной железы РК-8 в качестве стимулирующих клеток. Цитотоксическую активность киллерных Т-клеток оценивали с помощью теста цитотоксичности по анализу высвобождения хрома. Анализ высвобождения хрома проводили с помощью ранее описанного метода (Monji, M. et al., Clin. Cancer. Res. 10: 6047-6057, 2004). В результате ограниченная HLA-A2 и специфичная в отношении FOXM1 цитотоксическая активность наблюдалась у киллерных Т-клеток, индуцированных пептидами FOXM1 362-370, 373-382 и 640-649 (фиг.1).

Промышленная применимость

В настоящем изобретении были разработаны противораковые пептидные вакцины, которые направлены против рака у приблизительно 30% японских больных раком желчного пути, раком легкого, раком поджелудочной железы и тому подобным с высокой экспрессией FOXM1, путем выявления пептидов FOXM1, которые связываются с HLA-A2 и активируют повреждающие раковые клетки киллерные Т-клетки. Если в современной медицине удастся продемонстрировать эффективность пептидов FOXM1, презентируемых киллерным Т-клеткам с помощью HLA-A2, может быть подтверждена возможность клинического применения для европейцев. Путем идентификации пептидов, презентируемых киллерным Т-клеткам с помощью HLA-A2, который встречается с высокой частотой у европейцев, пептиды могут быть применимы не только для приблизительно 30% японских больных раком с высокой экспрессией FOXM1, но и для многих больных раком европейцев.

1. Пептид для индукции цитотоксической Т-клетки при связывании с HLA-А2 согласно (А) или (В) ниже:
(A) пептид, состоящий из любой аминокислотной последовательности из SEQ ID NO:1-3;
(B) пептид, состоящий из любой аминокислотной последовательности из SEQ ID NO:1-3, в котором вторая аминокислота с N-конца замещена лейцином или метионином, и/или С-концевая аминокислота замещена валином или лейцином, и где пептид проявляет активность, индуцирующую цитотоксические (киллерные) Т-клетки.

2. Композиция для индукции иммунитета против рака, экспрессирующего FOXM1 и HLA-A2, которая содержит эффективное количество одного или более пептидов по п.1 в качестве активного ингредиента.

3. Композиция для лечения и/или профилактики рака, экспрессирующего FOXM1 и HLA-A2, которая содержит эффективное количество одного или более пептидов по п.1 в качестве активного ингредиента.

4. Композиция для индукции антигенпрезентирующей клетки, которая экспрессирует HLA-A2 и проявляет активность, индуцирующую цитотоксические (киллерные) Т-клетки, где указанная композиция содержит эффективное количество одного или более пептидов по п.1 в качестве активного ингредиента.

5. Композиция для индукции цитотоксической (киллерной) Т-клетки, где указанная композиция содержит эффективное количество одного или более пептидов по п.1 в качестве активного ингредиента, где указанная композиция применяется в присутствии антигенпрезентирующих клеток, экспрессирующих HLA-A2.

6. Применение пептида по п.1 для получения антитела, селективно связывающегося с пептидом по п.1.

7. Экзосома для индукции цитотоксических Т-клеток, специфичных в отношении раковых клеток, экспрессирующих FOXM1 и HLA-A2, которая презентирует комплекс, включающий пептид по п.1 и HLA-A2.

8. Способ индукции антигенпрезентирующей клетки, которая проявляет активность, индуцирующую цитотоксические (киллерные) Т-клетки, который включает стадию контактирования антигенпрезентирующей клетки, экспрессирующей HLA-A2, с пептидом по п.1.

9. Способ индукции цитотоксической (киллерной) Т-клетки, который включает стадию совместного культивирования антигенпрезентирующей клетки, подвергшейся контактированию с пептидом по п.1 и экспрессирующей HLA-A2, с CD8⁺Т-клетками.

10. Выделенная антигенпрезентирующая клетка для индукции цитотоксических Т-клеток, специфичных в отношении раковых клеток, экспрессирующих FOXM1 и HLA-A2, которая презентирует комплекс, включающий пептид по п.1 и HLA-A2.

11. Выделенная антигенпрезентирующая клетка по п.10, которая индуцируется способом по п.8.

12. Способ повреждения раковых клеток, экспрессирующих FOXM1 и HLA-A2, который включает стадию введения пептида по п.1 индивидууму.

13. Применение пептида по п.1 для получения средства для индукции иммунитета против рака, экспрессирующего FOXM1 и HLA-A2.

14. Применение пептида по п.1 для получения средства для лечения и/или профилактики рака, экспрессирующего FOXM1 и HLA-A2.