Гормон роста, модифицированный двухцепочечным полиэтиленгликолем, способ его получения и применение

Изобретение относится к области технологий изготовления биологических препаратов и может быть использовано в фармацевтической промышленности. Способ получения пегилированного человеческого гормона роста предусматривает пегилирование указанного белка двухцепочечным полиэтиленгликолем в одном сайте при рН не ниже 6,0. Полученный пегилированный гормон роста подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле в невосстанавливающих условиях и выделяют целевой продукт из полосы, соответствующей более низкой кажущейся молекулярной массе. Способ, предусматривающий пегилирование человеческого гормона роста при рН не ниже 8,0 и выделение полученного продукта, позволяет получить препарат, содержащий главным образом пегилированный человеческий гормон роста с более низкой кажущейся молекулярной массой. Пегилированный гормон роста с низкой кажущейся молекулярной массой и обогащенный им препарат применяют для изготовления медикамента для лечения заболевания, нуждающегося в лечении гормоном роста. Применение изобретения позволяет повысить биологическую активность гормона роста и увеличить период его метаболического полувыведения. 5 н. и 14 з.п. ф-лы, 10 ил., 3 табл., 6 пр.

 

Область техники

Настоящее изобретение относится к области технологий изготовления биологических препаратов, в частности к гормону роста (ГР) с высокой биологической активностью, модифицированному двухцепочечным полиэтиленгликолем (ПЭГ), способу его получения, а также к использованию полученного пегилированного гормона роста в фармацевтике.

Уровень техники

Гормон роста человека (ГРЧ) является белковым гормоном, секретируемьм передней долей гипофиза, прекурсор которого состоит из 217 аминокислотных остатков, где первые 26 аминокислотных остатков составляют сигнальный пептид, и 191 аминокислотный остаток составляет зрелую молекулу. Существуют две внутримолекулярные дисульфидные связи (Cys79 и Cys191, Cys208 и Cys215), и молекула не гликозилирована при молекулярной массе 22 кД. Последовательность ГРЧ изложена в SEQ ID NO:1 (NCBI: P01241, AAA72260; Деното Ф.М. и др. "ДНК-последовательность и структура мРНК гормона роста человека: возможный альтернативный сплайсинг", Nucleic Acids Res., 9: 3719-3730, 1981; Роскам У. и др. "Молекулярное клонирование и нуклеотидная последовательность структурного гена гормона роста человека". Nucleic Acids Res., 7: 305-320, 1979; Мартиал Дж.Э. и др. "Гормон роста человека: "Клонирование и экспрессия в бактериях комплементарной ДНК", Science, 205: 602-607, 1979; Чен Э.Й. и др. "Локус гормона роста человека: нуклеотидная последовательность, биология и эволюция", Genomics, 4: 479-497, 1989). Первичные функции ГРЧ включают промотирование росту клетки, органа или кости, и это тесно связано с анаболизмом организма (Иглесиас П. и др. "Терапия рекомбинантного гормона роста человека у плохо питающихся пациентов на диализе: рандомизированное контролируемое исследование", Am. J. Kidney Dis., 32(3): 454-463, 1998; Нили Э.К. "Использование гормона роста человека и злоупотребление им", Annu. Rev. Med., 45:407-410, 1994). После более чем 20 лет клинического применения рекомбинантного гормона роста человека (рГРЧ), полученного по технологии рекомбинантной ДНК, были продемонстрированы клиническая эффективность и безопасность рГРЧ.

Результаты многих исследований показывают, что рГРЧ проявляет значительные терапевтические эффекты при лечении низкорослости, ожогов, ран, переломов костей, кровоточащих язв, почечной недостаточности, СПИД, анаболических расстройств, низкорослости, вызванной дефицитом эндогенного гормона роста, синдрома Тернера и дефицитом гормона роста у взрослых, а также показывает значительный эффект в терапии против старения. В данной области хорошо известно, что пегилированный гормон роста может использоваться для лечения указанных заболеваний и против старения, например, информацию об использовании пегилированного гормона роста для лечения заболеваний и против старения можно найти на сайте http://en.wikipedia.org/wiki/Growth_hormone#Normal_functions_of_GH_produced_by_the_body. Специалист в данной области сможет определить дозировки пегилированного гормона роста по изобретению для лечения заболеваний и против старения. В настоящее время рГРЧ является единственным эффективным лекарством для лечения низкорослости. К марту 2001 года показания, которые одобрены Управлением США по контролю за лекарствами (FDA) для начала клинических исследований рГРЧ, включают: интенсивную терапию для удержания азота в тяжелом ожоге, синдром короткой кишки (назначается отдельно или в сочетании с глутамином), остановка роста в связи с СПИДом и т.д. В настоящее время показания рГРЧ, которые одобрены для продажи, включают: подростковую низкорослость, вызванную дефицитом эндогенного гормона роста, низкорослость в связи с синдромом Тернера, подростковую низкорослость, вызванную спонтанным или органным дефицитом гормона роста, синдром Прадера-Вилли, раннее расстройство роста, катаболическое нарушение в связи со СПИДом, замедление роста в связи с хронической почечной недостаточностью, дефицит гормона роста у взрослого человека и т.д.

Полиэтиленгликоль является инертным, нетоксичным и биоразлагаемым органическим полимером, имеющим большое значение в областях биотехнологии и фармацевтики. Технология ПЭГ-модифицирования заключается в связывании ПЭГ с активным белком посредством ковалентной связи. После полиэтиленгликолирования (пегилиро-вания) свойства белка могут быть значительно улучшены, например, продлен метаболический полураспад лекарства, снижена иммуногенность, повышена безопасность, повышена эффективность терапии, снижена частота доз, улучшена растворимость лекарства/растворимость в воде, повышена сопротивляемость к протеолизу, повышено контролируемое высвобождение лекарства и т.д. (Инада и др., J. Bioact. и Compatible Polymers, 5, 343, 1990; Делгадо и др. "Критические обзоры терапевтических систем носителей лекарств", 9, 249, 1992; Катре, "Современные системы доставки лекарств", 10, 91, 1993; и Дэвис и др., патент США №4179337). В патенте США №4179337 раскрыто, что после связывания ПЭГ с таким белком, как фермент или инсулин, иммуногенность белка снижалась при одновременном уменьшении активности белка, но в то же время модифицированный белок сохранял определенную долю активности первоначального не-модифицированного белка. Такой эффект также был обнаружен в G-CSF (Сатаке-Исикава и др. Cell Structure и Function, 17, 157-160, 1992), IL-2 (Катре и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1487, 1987), TNF-a (Цуцуми и др. Jpn. J. Cancer Res., 85, 9, 1994), IL-6 (Инуэ и др. J. Lab. Clin. Med., 124, 529, 1994) и CD4-IgG (Чамов и др. Bioconj. Chem., 5, 133, 1994).

В патенте США №5824784 раскрыто, что модификатор ПЭГ с альдегидной группой на конце использовали для получения ПЭГ-G-CSF, который модифицировали ПЭГ в фиксированном сайте (N-концевая аминокислота белка). Модификатор ПЭГ-NHS, синтезированный путем активации N-гидроксисукцинимида (NHS), может образовывать амидную связь с г-аминогруппой лизина в G-CSF. ПЭГ-NHS имеет высокую химическую активность, но плохую селективность, и, таким образом, трудно получить продукт, модифицированный одной молекулой ПЭГ, в фиксированном сайте. По сравнению с продуктом, модифицированным несколькими молекулами ПЭГ, продукт, модифицированный одной молекулой ПЭГ, является более однородным и лучше поддается разделению и очистке, что облегчает контроль качества и обеспечивает стабильность партий при крупномасштабном производстве.

В настоящее время некоторые типы пегилированных терапевтических белковых лекарств, таких как пегилированная аденозиндеаминаза (Adagen.RTM, Enzon Pharmaceuticals), пегилированная L-аспарагиназа (Oncapspar.RTM, Enzon Pharmaceuticals), пегилированный интерферон-α2b (PEG-Intron.RTM, Schering-Plough) и пегилированный интерферон-α2а (Pegasys, Roche), колониестимулирующий фактор пегилированного гранулоцита (Neulasta.RTM, Amgen) применяются клинически. Метаболизм in vivo доли ПЭГ в лекарстве (или самого ПЭГ) уже четко понят, и ПЭГ доказал, что он является хорошим и безопасным модификатором лекарств без какого-либо отрицательного действия.

ПЭГ, который может быть связан с белковым лекарством, обычно необходимо дериватировать так, чтобы одна или две концевые группы на концах ПЭГ могли быть химически активированы, чтобы иметь требуемую функциональную группу, которая проявляет активность к по меньшей мере одной функциональной группе лекарства, и таким образом может образовывать стабильную ковалентную связь с ней, с которой она должна быть связана. Например, ПЭГ может быть связан с ε-NH₂ остатка Lys в пептидной цепи белка или с α-NH₂ остатка N-концевой аминокислоты пептидной цепи белка. Есть три формы полиэтиленгликолей, которые используют для модифицирования белка: молекула с линейной цепью (ЕР 0593868; Ю-Сен Ван и др., Advanced Drug Delivery Reviews, 54: 547-570, 2002; Ю-Сен Ван и др., Biochemistry, 39, 10634-10640, 2000.), U-образная разветвленная молекула (ЕР 0809996) и Y-образная разветвленная молекула (CN1243779C, ЕР1496076). В европейском патенте №ЕР 0809996 описано пегилирование IFN-α.

В данной области обычно считается, что после ПЭГ-модифицирования в свойствах большинства белков произойдут следующие изменения: 1) иммуногенность и антигенность снижаются; 2) циклический период полувыведения продлевается; 3) растворимость возрастает; 4) белок становится толерантным к протеолизу; 5) биодоступность увеличивается; 6) токсичность снижается; 7) термостабильность и механическая стабильность возрастают; 8) изоэлектрическая точка, электрофоретическое поведение и динамические свойства изменяются и т.д. Кроме того, одним из наиболее важных аспектов является то, что ПЭГ-модифицирование приводит к снижению клеточной активности белка, что происходит из-за групп, введенных в конечный продукт, включая ПЭГ и связи между ПЭГ и модифицируемым белком, а также относится к состоянию связи и получаемому побочному продукту. Дорис Брюггер и др. (патент США, публикация №US 2004/0223950 А1) раскрыли, что продукты модификации интерферона-α2а, мономодифицированного одной U-образной молекулой ПЭГ с двумя цепями в одном из разных сайтов, показывают значительно отличающуюся in vitro противовирусную активность, причем продукт модификации одной U-образной молекулой ПЭГ в сайте Lys31 имеет самую высокую удельную активность, а продукт, модифицированный одной U-образной молекулой ПЭГ в сайте Lys121 имеет самую низкую удельную активность, и разница между обеими может быть пятикратной.

Ли Вейхуа и др. (патент КНР №CN 1477126A) раскрыли способ получения ПЭГ-модифицированного гормона роста. Предпочтительно, реакцию модификации гормона роста выполняют разветвленной молекулой ПЭГ (mPEGn-NHS) при pH 6.5-7.0, и биологическую активность очищенного гормона роста, модифицированного разветвленной молекулой ПЭГ в одном сайте, измеряют у крыс с удаленным гипофизом. Результаты показывают, что связанный с ПЭГ гормон роста (где ПЭГ является молекулой с двойной цепью ПЭГ-NHS с молекулярной массой 40 кД) имеет сравнимую массу, увеличивающую эффект по сравнению с равным количеством гормона роста, получаемым путем инъекций ежедневно.

Раскрытие изобретения

Изобретение предлагает способ получения гормона роста, модифицированного двухцепочечным ПЭГ, включающий:

a) в растворе с pH не ниже 6,0, предпочтительно не ниже 7,0, предпочтительно не ниже 8,0, предпочтительно не ниже 9,0, предпочтительно не ниже 9,5, предпочтительно не ниже 10,0, наиболее предпочтительно pH 10,5, введение U-образного или Y-образного разветвленного двухцепочечного ПЭГ в контакт с гормоном роста, предпоч тительно гормоном роста человека, причем молярное отношение гормона роста и двух цепочечного ПЭГ предпочтительно составляет 1:2;

b) анализ продукта, модифицированного ПЭГ, в одном сайте, полученном на этапе а), в SDS-PAGE подходящей концентрации, предпочтительно 12% SDS-PAGE, причем продукт показывает две полосы или является в основном одной полосой более низкой кажущейся молекулярной массы;

с) отделение и извлечение продукта с более низкой кажущейся молекулярной массой в упомянутых двух полосах, который модифицирован ПЭГ в одном сайте;

по выбору также включающий этап очистки, предпочтительно с использованием гель-хроматографии, такой как хроматография на Q Sepharose FF, хроматография на DEAE Sepharose FF или хроматография MacroCap SP.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение предлагает способ получения гормона роста, пегилированного двухцепочечным ПЭГ, где двухцепочечный ПЭГ является Y-образным разветвленным ПЭГ, имеющим следующую структурную формулу (I),

где: Р_а и P_b - те же или разные ПЭГ; j - целое число от 1 до 12; R_i - H, замещенный или незамещенный алкил С_1-12, замещенный арил, аралкил или гетероалкил; X₁ и X₂ - независимо связанная группа, где X₁-(CH₂)_n, X₂ выбирают из группы, состоящей из: (СН₂)_n, (СН₂)_nOCO, (CH₂)_nNHCO, (CH₂)_nCO, где n - целое число от 1 до 10; F - концевая группа, выбираемая из группы, состоящей из: гидроксила, карбоксила, эфирной группы, ацилхлорида, гидразида, малеинида, пиридиндисульфида, способного реагировать с амино-, гидроксильной или гидросульфидной группой терапевтического вещества или субстрата для формирования ковалентной связи.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение предлагает способ получения гормона роста, пегилированного двухцепочечным ПЭГ, причем Y-образный ПЭГ имеет следующую структурную формулу (II):

где: каждый из R и R¹ является независимым низкомолекулярным алкилом, предпочтительно алкилом С₁-С₄, наиболее предпочтительно метилом; m и m′ обозначают степень полимеризации и могут быть любым целым числом; m+m′ предпочтительно от 600 до 1500; j - целое число от 1 до 12; R_i - H, замещенный или незамещенный алкил С_1-12, замещенный арил, аралкил или гетероалкил; F - концевая группа, выбираемая из группы, состоящей из: гидроксила, карбоксила, эфирной группы, ацилхлорида, гидразида, ма-леинида, пиридиндисульфида, способного реагировать с амино-, гидроксильной или гидросульфидной группой терапевтического вещества или субстрата для формирования ковалентной связи.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение предлагает способ получения гормона роста, пегилированного двухцепочечным ПЭГ, где Y-образный ПЭГ имеет следующую структурную формулу (III):

где: каждый из R и R′ является низкомолекулярным алкилом, предпочтительно алкилом C₁-C₄, наиболее предпочтительно метилом; m и m′ обозначают степень полимеризации и могут быть любым целым числом; m+m′ предпочтительно от 600 до 1500, наиболее предпочтительно 910; средняя совокупная молекулярная масса Y-образного ПЭГ составляет приблизительно от 26 кД до 60 кД, предпочтительно 40 кД; j - целое число от 1 до 12.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение предлагает способ получения гормона роста, пегилированного двухцепочечным ПЭГ, где двухцепочечный ПЭГ является U-образным ПЭГ, имеющим следующую структурную формулу (IV),

где: каждый из R и R′ является низкомолекулярным алкилом, предпочтительно алкилом С₁-С₄; n и n′ обозначают степень полимеризации и могут быть любым целым числом; n+n′ предпочтительно от 600 до 1500, наиболее предпочтительно 910; средняя молекулярная масса U-образного ПЭГ приблизительно от 26 кД до 66 кД, наиболее предпочтительно около 40 кД.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение предлагает способ получения гормона роста, пегилированного двухцепочечным ПЭГ, включающий:

а) в растворе с pH 9,0 или 10,5 введение ПЭГ, имеющего следующую формулу (III), в контакт с гормоном роста человека, причем молярное отношение гормона роста с двухцепочечным ПЭГ составляет 1:2;

где: каждый из R и R′ является низкомолекулярным алкилом, предпочтительно алкилом C₁-C₄, наиболее предпочтительно метилом; m+m′=910; j - целое число от 1 до 12; средняя совокупная молекулярная масса ПЭГ составляет приблизительно 40 кД;

b) анализ продукта, модифицированного ПЭГ в одном сайте, полученном на этапе а) в 12% SDS-PAGE, причем продукт показывает две полосы;

c) очистку, отделение и извлечение продукта с более низкой кажущейся молеку лярной массой, который модифицирован в одном сайте, путем использования гель- хроматографии, выбираемой из хроматографии на Q Sepharose FF, хроматографии на DEAE Sepharose FF или хроматографии MacroCap SP.

Изобретение также предлагает пегилированный гормон роста, полученный вышеописанным способом, причем гормон роста извлекают из натурального источника, или он является рекомбинантным гормоном роста, полученным по рекомбинантной биотехнологии, предпочтительно гормон роста имеет последовательность SEQ ID NO:1.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение предлагает пегилиро-ванный гормон роста следующей формулы (VII), который получен вышеописанным способом и имеет молекулярную массу 62 кД:

где: каждый из R и R′ является низкомолекулярным алкилом, предпочтительно алкилом C₁-C₄, наиболее предпочтительно метилом; m+m′=910; и j - целое число от 1 до 12.

Изобретение также предлагает способ получения препарата пегилированного гормона роста, включающий:

a) в растворе с pH не ниже 8,0, предпочтительно не ниже 9,0, предпочтительно не ниже 9,5, предпочтительно не ниже 10,0, наиболее предпочтительно pH 10,5, введение U-образного или Y-образного разветвленного двухцепочечного ПЭГ в контакт с гормоном роста, предпочтительно гормоном роста человека, причем предпочтительно молярное отношение гормона роста и двухцепочечного ПЭГ составляет около 1:2;

b) анализ продукта, модифицированного ПЭГ в одном сайте, полученном на этапе а) в SDS-PAGE подходящей концентрации, предпочтительно 12% SDS-PAGE, причем продукт показывает две полосы;

c) отделение и извлечение продукта, модифицированного ПЭГ в одном сайте;

причем упомянутым извлекаемым продуктом является смесь, которая главным образом содержит продукт с более низкой кажущейся молекулярной массой, который модифицирован ПЭГ в одном сайте, причем содержание продукта с более низкой кажущейся молекулярной массой, который модифицирован ПЭГ в одном сайте, детектируемое SDS-PAGE, не ниже 70%, предпочтительно не ниже 80%, наиболее предпочтительно не ниже 90%,

по выбору включает этап очистки, предпочтительно с использованием гель-хроматографии, такой как хроматография на Q Sepharose FF, хроматография на DEAE Sepharose FF или хроматография MacroCap SP.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение предлагает способ получения препарата гормона роста, пегилированного двухцепочечным ПЭГ, причем двухцепочечным ПЭГ является Y-образный ПЭГ, имеющий следующую структурную формулу (I),

где: каждый из P_a и P_b является тем же или другим ПЭГ; j - целое число от 1 до 12; R_i - H, замещенный или незамещенный алкил C_1-12, замещенный арил, аралкил или гетероалкил; каждый из X] и Х₂ представляет связываемую группу, где X₁ - (СН₂)_n, X₂ выбирают из группы, состоящей из: (CH₂)n, (CH₂)_nOCO, (CH₂)_nNHCO, (CH₂)_nCO, где n - целое число от 1 до 10; F - концевая группа, выбираемая из группы, состоящей из: гидроксила, карбоксила, эфирной группы, ацилхлорида, гидразида, малеинида, пиридиндисульфида, способного реагировать с амино-, гидроксильной или гидросульфидной группой терапевтического вещества или субстрата для формирования ковалентной связи.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение предлагает способ получения препарата гормона роста, пегилированного двухцепочечным ПЭГ, причем Y-образный ПЭГ имеет следующую структурную формулу (II):

где: каждый из R и R′ является низкомолекулярным алкилом, предпочтительно алкилом С₁-С₄, наиболее предпочтительно метилом; шит' обозначают степень полимеризации и могут быть любым целым числом; m+m′ предпочтительно от 600 до 1500, наиболее предпочтительно 910; j - целое число от 1 до 12; R_i - Н, замещенный или незамещенный алкил C_1-12, замещенный арил, аралкил или гетероалкил; F - концевая группа, выбираемая из группы, состоящей из: гидроксила, карбоксила, эфирной группы, ацилхлорида, гидразида, малеинида, пиридиндисульфида, способного реагировать с амино-, гидроксильной или гидросульфидной группой терапевтического вещества или субстрата для формирования ковалентной связи.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение предлагает способ получения препарата гормона роста, пегилированного двухцепочечным ПЭГ, причем Y-образный ПЭГ имеет следующую структурную формулу (III):

где: каждый из R и R′ является низкомолекулярным алкилом, предпочтительно алкилом C₁-C₄, наиболее предпочтительно метилом; m и m′ обозначают степень полимеризации и могут быть любым целым числом; m+m′ предпочтительно от 600 до 1500, наиболее предпочтительно 910; j - целое число от 1 до 12; предпочтительно средняя совокупная молекулярная масса ПЭГ составляет приблизительно от 26 кД до 60 кД, предпочтительно 40 кД.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение предлагает способ получения препарата гормона роста, пегилированного двухцепочечным ПЭГ, причем двухцепочечным ПЭГ является U-образный ПЭГ, имеющий следующую структурную формулу (IV),

где: каждый из R и R′ является низкомолекулярным алкилом, предпочтительно алкилом C₁-C₄; n и n′ обозначают степень полимеризации и могут быть любым целым числом; n+n′ предпочтительно от 600 до 1500, наиболее предпочтительно 910; средняя молекулярная масса U-образного ПЭГ составляет приблизительно от 26 кД до 66 кД, наиболее предпочтительно около 40 кД.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение также предлагает способ получения препарата гормона роста, пегилированного двухцепочечным ПЭГ, включающий:

а) в растворе с pH 9,0 или 10,5 введение ПЭГ следующей формулы (III) в контакт с гормоном роста человека, причем молярное отношение гормона роста и двухцепочечного ПЭГ составляет предпочтительно 1:2;

где: каждый из R и R′ является низкомолекулярным алкилом, предпочтительно алкилом C₁-C₄; m+m′=910, j - целое число от 1 до 12; средняя совокупная молекулярная масса ПЭГ составляет приблизительно 40 кД;

b) анализ продукта, модифицированного ПЭГ в одном сайте, полученном на этапе а) в 12% SDS-PAGE;

c) отделение и извлечение продукта, модифицированного ПЭГ в одном сайте, путем использования гель-хроматографии, выбираемой из хроматографии на Q Sepharose FF, хроматографии на DEAE Sepharose FF или хроматографии MacroCap SP, и содержание SDS-PAGE продукта с более низкой кажущейся молекулярной массой, который модифицирован ПЭГ в одном сайте, в извлеченном продукте не ниже 70%, предпочтительно не ниже 80%, наиболее предпочтительно не ниже 90%.

Изобретение также предлагает препарат пегилированного гормона роста, полученный вышеописанным способом, причем гормон роста извлекают из натурального источника, или он является рекомбинантным гормоном роста, полученным по рекомбинантной технологии, предпочтительно гормон роста имеет последовательность SEQ ID NO:1. Предпочтительно, продукт модифицированного ПЭГ в одном сайте в препарате пегилированного гормона роста имеет следующую формулу (VII):

где: каждый из R и R′ является низкомолекулярным алкилом, предпочтительно алкилом С₁-С₄, наиболее предпочтительно метилом; m+m′ - 910, j - целое число от 1 до 12, причем содержание SDS-PAGE продукта с более низкой кажущейся молекулярной массой, который модифицирован ПЭГ в одном сайте, в препарате пегилированного гормона роста не ниже 70%, предпочтительно не ниже 80%, наиболее предпочтительно не ниже 90%.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения рекомбинантный гормон роста человека синтезируют искусственным путем или выражают из системы экспрессии, выбираемой из группы, состоящей из: прокариотной системы, такой как Е.coli., эукариотной системы, такой как дрожжи Pichia; системы клетки насекомого и системы клетки млекопитающего, такой как клетка CHO.

Изобретение также предлагает состав, содержащий фармацевтически эффективное количество вышеописанного пегилированного гормона роста или препарата пегилированного гормона роста и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель, предпочтительно содержащий маннитол, аминокислоту, хлорид натрия, уксусную кислоту или ацетат натрия, предпочтительно аминокислоту выбирают из группы, состоящей из аспартата, аспарагина, лизина и глицина.

Изобретение также предлагает использование вышеописанного пегилированного гормона роста или препарата пегилированного гормона роста или состава в производстве медикамента для лечения заболевания с необходимостью использования гормона роста или для лечения против старения, предпочтительно заболевание с необходимостью лечения гормоном роста выбирают из группы, состоящей из низкорослости, ожога, раны, перелома кости, кровоточащей язвы, почечной недостаточности, СПИД, низкорослости в связи с дефицитом эндогенного гормона роста, синдрома Тернера, анаболического нарушения и дефицита гормона роста у взрослых людей.

Изобретение также предлагает способ лечения пациента при заболевании, нуждающемся в лечении гормоном роста или для лечения против старения, причем способ включает назначение терапевтически эффективного количества вышеописанного пегилированного гормона роста или препарата пегилированного гормона роста или состава упомянутому пациенту, предпочтительно заболевание, нуждающееся в лечении гормоном роста, выбирают из группы, состоящей из низкорослости, ожога, раны, перелома кости, кровоточащей язвы, почечной недостаточности, СПИД, низкорослости в связи с дефицитом эндогенного гормона роста, синдрома Тернера, анаболического нарушения и дефицита гормона роста у взрослых людей.

Подробное описание изобретения

Изобретение предлагает гормон роста с высокой биологической активностью, модифицированный двухцепочечным полиэтиленгликолем (ПЭГ), и способ его получения. Существенный признак настоящего изобретения заключается в том, что после оптимизации состояния реакции и способа отделения содержание компонента с низкой клеточной активностью в гормоне роста, модифицированном ПЭГ в одном сайте, значительно снижается. В одном примере двухцепочечного ПЭГ с молекулярной массой 40 кД, продукт с низкой клеточной активностью, модифицированный в одном сайте, отличается тем, что этот продукт и продукт с высокой клеточной активностью, модифицированный в одном сайте, полностью разделены в две полосы в 12% SDS-PAGE, и кажущаяся молекулярная масса продукта с низкой клеточной активностью, модифицированного в одном сайте, больше чем таковая у продукта с высокой клеточной активностью, модифицированного в одном сайте. Используя крысу с удаленным гипофизом в качестве модели животного и рекомбинантный гормон роста человека в качестве положительного контроля, биологическую активность in vivo продукта с высокой клеточной активностью, модифицированного в одном сайте, анализировали согласно биологическому анализу гормона роста, описанному в Pharmacopoeia of the People′s Republic of China, version 2005, Volume 2, Appendix XII P. Продукт с высокой клеточной активностью, модифицированный в одном сайте, имеет значительно более высокую удельную биологическую активность, чем обычный гормон роста, проявляя более чем в 1,5 раза большую биологическую активность, чем обычный гормон роста, и при фармако-кинетических исследованиях на макаке-крабоеде (Масаса fascicularis) доказано, что он имеет средний период метаболического полувыведения лекарства в сыворотке более чем в 20 раз больше, чем таковой у обычного гормона роста и, таким образом, длительные эффекты.

В одном варианте осуществления изобретения реакцию модификации двухцепочечным ПЭГ-NHS для гормона роста выполняют при pH 8,0, используя электрофорез SDS-PAGE для анализа продуктов реакции и окрашивание серебром для визуализации. Удивительно, что продукт гормона роста, модифицированного ПЭГ в одном сайте, показывает две основные полосы, что отличается от предыдущих докладов (Росс Кларк, Кеннет Ольсон и др. "Гормоны роста длительного действия, продуцированные соединением с полиэтиленгликолем", J. Biol. Chem., 271:21969-21977, 1996. Ли Вейхуа, Донг Дзянь и др., "Гормон роста, эффективный в течение длительного времени и фармакологический состав", опубликованный патент КНР №CN1477126A). В дальнейших экспериментах были изучены модификации гормона роста двухцепочечным ПЭГ-NHS, выполненные в диапазоне pH 6,0-10,5, и с помощью SDS-PAGE выяснили, что все продукты, модифицированные в одном сайте, показывают две основные полосы. С увеличением pH также возрастает содержание полосы с более низкой кажущейся молекулярной массой. При pH≥10,0 продукт, модифицированный в одном сайте, показывает в сущности одну полосу более низкой кажущейся молекулярной массы.

В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения используются некоторые подходящие способы очистки гель-хроматографией для подготовки очищенного рекомбинантного гормона роста человека, модифицированного ПЭГ в одном сайте при pH 10,5 и pH 6,0, соответственно. Для детектирования использовали SDS-PAGE с 12% разделяющим гелем, и для визуализации использовали окрашивание серебром. Очищенный рекомбинантный гормон роста человека, модифицированный ПЭГ в одном сайте при pH 6,0, четко показывает две полосы. Очищенный рекомбинантный гормон роста человека, модифицированный ПЭГ в одном сайте при pH 10,5, показывает в основном полосу более низкой кажущейся молекулярной массы, содержание SDS-PAGE которой не ниже 80%. В обоих случаях детектировали только ничтожное количество белка (не более 0,5%). MALDI-TOF MS подтверждает, что модифицированные продукты при этих двух значениях pH в сущности являются продуктами гормона роста, модифицированного ПЭГ в одном сайте. Анализ клеточной активности показывает, что продукт, модифицированный в одном сайте при pH 10,5, имеет значительно более высокую клеточную активность, чем продукт, модифицированный в одном сайте при pH 6,0, причем удельная клеточная удельная клеточная активность первого приблизительно в два раза больше таковой у последнего.

В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения очищенный продукт модификации рекомбинантного гормона роста человека, который модифицирован ПЭГ в одном сайте при pH 6,0 и имеет более высокую кажущуюся молекулярную массу, подготовлен путем очистки хроматографией на Q Sepharose FF или путем очистки хроматографией MacroCap SP. Детектирование MALDI-TOF MS подтверждает, что рекомбинантный гормон роста человека, модифицированный ПЭГ, является продуктом, модифицированным ПЭГ в одном сайте, и анализ клеточной активности показал, что его удельная клеточная активность значительно ниже чем таковая у очищенного рекомбинантного гормона роста человека, модифицированного в одном сайте (с более низкой кажущейся молекулярной массой) при pH 10,5. Удельная клеточная активность последнего до 3 раз больше, чем таковая у первого.

В еще одном варианте осуществления изобретения, согласно биологическому анализу на гормон роста, который описан в Pharmacopoeia of the People′s Republic of China, version 2005, Volume 3, Appendix XII P, с использованием рекомбинантного гормона роста человека в качестве положительного контроля способ, примененный на крысе с удаленным гипофизом, использовали для анализа биологической активности in vivo продуктов модификации рекомбинантного гормона роста человека, модифицированного ПЭГ-NHS 40 кД в одном сайте при pH 10,5. Рекомбинантный гормон роста человека назначали один раз в сутки, всего 6 раз. Продукт рекомбинантного гормона роста человека, модифицированный ПЭГ в одном сайте, назначали один раз в дозе, равной сумме 6-разового назначения рекомбинантного гормона роста человека. Рекомбинантный гормон роста человека, модифицированный ПЭГ в одном сайте, имеет значительно более высокую биологическую активность, чем рекомбинантный гормон роста человека, и может достигать удельной биологической активности в 1,5 раза больше, чем у последнего. Его фармакология имеет длительный эффект. Фармакологические исследования на макаке-крабоеде показали, что период метаболического полувыведения рекомбинантного гормона роста человека, модифицированного ПЭГ в одном сайте, увеличивается более чем в 20 раз по сравнению с таковым для обычного рекомбинантного гормона роста.

Изобретение применяет разветвленные дериваты ПЭГ (U-образный разветвленный и Y-образный разветвленный) для модификации гормона роста. Y-образный разветвленный дериват ПЭГ, использованный в изобретении, является новым разветвленным дериватом ПЭГ, структура которого отличается от линейного ПЭГ или U-образного разветвленного ПЭГ, и его основное отличие от U-образного разветвленного ПЭГ заключается в том, что две разветвленные цепи ПЭГ Y-образного деривата ПЭГ настоящего изобретения связаны между собой через атом N, тогда как две разветвленные цепи ПЭГ U-образного деривата ПЭГ связаны между собой через атом С. Модификация с U-образным или Y-образным ПЭГ в основном происходит в N-концевой свободной α-аминогруппе белка или пептида или в s-аминогруппе боковой цепи остатка Lys. Y-образный дериват ПЭГ имеет следующую молекулярную формулу (I):

где: каждый из P_a и P_b - те же или разные ПЭГ; j - целое число от 1 до 12; R_i - H, замещенный или незамещенный алкил С_1-12, замещенный арил, аралкил или гетероалкил;

каждый из X₁ и X₂ - связывающая группа, соответственно, где X₁ - (CH₂)_n, X₂ выбирают из группы, состоящей из: (CH₂)n, (CH₂)_nOCO, (CH₂)_nNHCO, (CH₂)_nCO, где n - целое число от 1 до 10; F - концевая группа, выбираемая из группы, состоящей из: гидроксила, карбоксила, эфирной группы, ацилхлорида, гидразида, малеинида, пиридиндисульфида, способного реагировать с амино-, гидроксильной или гидросульфидной группой терапевтического вещества или субстрата для формирования ковалентной связи.

В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения P_a и P_b Y-образного деривата ПЭГ могут быть те ми же или разными ПЭГ, как показано в формуле (II):

где: каждый из R и R′ является низкомолекулярным алкилом, предпочтительно алкилом С₁-С₄, наиболее предпочтительно метилом; m и m′ обозначают степень полимеризации и могут быть любым целым числом; m+m' предпочтительно от 600 до 1500, наиболее предпочтительно 910; R_i - H, замещенный или незамещенный алкил Сип, замещенный арил, аралкил или гетероалкил; j - целое число от 1 до 12. F - концевая группа, выбираемая из группы, состоящей из: гидроксила, карбоксила, эфирной группы, ацилхлорида, гидразида, малеинида, пиридиндисульфида, способного реагировать с амино-, гидроксильной или гидросульфидной группой терапевтического вещества или субстрата для формирования ковалентной связи. Предпочтительно, средняя совокупная молекулярная масса ПЭГ составляет от 26 кД до 60 кД, наиболее предпочтительно 40 кД.

В одном варианте осуществления изобретение предлагает пегилированный гормон роста, имеющий следующую структурную формулу (VI):

где: каждый из R и R′ является низкомолекулярным алкилом, предпочтительно алкилом С₁-С₄, наиболее предпочтительно метилом; j - целое число от 1 до 12; m и m′ обозначают степень полимеризации и могут быть любым целым числом; m+m′ предпочтительно от 600 до 1500; R_i - Н, замещенный или незамещенный алкил Сип, замещенный арил, аралкил или гетероалкил; F - концевая группа, выбираемая из группы, состоящей из: гидроксила, карбоксила, эфирной группы, ацилхлорида, гидразида, малеинида, пиридиндисульфида, способного реагировать с амино-, гидроксильной или гидросульфидной группой терапевтического вещества или субстрата для формирования ковалентной связи. В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения структура молекулы Y-образного деривата ПЭГ (YPEG-NHS) показана в следующей формуле (III):

где: каждый из R и R′ является низкомолекулярным алкилом, предпочтительно алкилом С₁-С₄, наиболее предпочтительно метилом; j - целое число от 1 до 12; m и m′ обозначают степень полимеризации и могут быть любым целым числом; m+m′ предпочтительно от 600 до 1500, наиболее предпочтительно 910.

В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения структура молекулы U-образного деривата ПЭГ (UPEG-NHS) показана в следующей формуле (IV):

где: каждый из R и R′ является низкомолекулярным алкилом, предпочтительно алкилом C₁-C₄; n и n′ обозначают степень полимеризации и могут быть любым целым числом;

n+n′ предпочтительно от 600 до 1500, наиболее предпочтительно 910; средняя молекулярная масса ПЭГ составляет от 26 кД до 66 кД, наиболее предпочтительно около 40 кД.

В одном варианте осуществления изобретения для получения ГР, модифицированного Y-ПЭГ или U-ПЭГ, доля ПЭГ активированного деривата Y-ПЭГ и U-ПЭГ, такого как сукциминидный эфир ПЭГ (Y-ПЭГ-NHS) ковалентно связана с аминогруппой (-NH₂) белка посредством нуклеофильной замены, группа -NH₂ включает N-концевую α-NH₂ белка и ε-NH₂ остатка Lys. Уравнение реакции продуцирования Y-ПЭГ-ГР из ГР и Y-ПЭГ-NHS следующее:

Уравнение реакции продуцирования U-ПЭГ-ГР из ГР и U-ПЭГ-NHS следующее:

Предпочтительно, средняя совокупная молекулярная масса ПЭГ составляет от 26 кД до 66 кД, наиболее предпочтительно около 40 кД.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения пегилированный ГР согласно изобретению имеет следующую структурную формулу (VII):

где: каждый из R и R′ является низкомолекулярным алкилом, предпочтительно алкилом C₁-C₄, наиболее предпочтительно метилом; j - целое число от 1 до 12; m и m′ обозначают степень полимеризации и могут быть любым целым числом; m+m′ предпочтительно от 600 до 1500. В этой структуре Y-образный разветвленный ПЭГ связан с молекулой ГР в одном сайте, m и m′ могут быть одинаковым или разным целым числом. Молекулярная масса Y-ПЭГ-ГР в вышеприведенной формуле зависит от степени полимеризации m и m′. Если m+m′ предпочтительно от 600 до 1500, соответствующая средняя молекулярная масса Y-ПЭГ составляет приблизительно от 26 кД до 66 кД. Если m+m′ предпочтительно от 795 до 1030, соответствующая средняя молекулярная масса Y-ПЭГ составляет приблизительно от 35 кД до 45 кД. Если m+m′ в частности составляет предпочтительно от 885 до 1030, соответствующая средняя молекулярная масса Y-ПЭГ составляет приблизительно от 39 кД до 45 кД. Если m+m′ наиболее предпочтительно 910, соответствующая средняя молекулярная масса Y-ПЭГ составляет приблизительно 40 кД. Отношение m к m′ может быть в диапазоне от 0,5 до 1,5, предпочтительно от 0,8 до 1,2.

По выбору, ГР настоящего изобретения может быть извлечен из натурального источника или получен по рекомбинантной технологии. Предпочтительно, ГР является ГР человека, имеющим последовательность SEQ ID NO:1, который извлекают из натурального источника или получают по рекомбинантной технологии. Более предпочтительно, ГР человека является рекомбинантный ГР человека. ГР может быть синтезирован искусственно или экспрессирован из прокариотной системы, такой как Е.coli, или экспрессирован из дрожжевой системы, такой как Pichia pastoris, или экспрессирован из системы клетки насекомого или млекопитающего, такой как СНО. Способ получения натурального или рекомбинантного ГР и тесты на активность ГР и продуктов, модифицированных ПЭГ, хорошо известны в данной области.

Подобно ГР, Y-ПЭГ-ГР и U-ПЭГ-ГР настоящего изобретения могут быть использованы клинически для лечения низкорослости, ожога, раны, перелома кости, кровоточащей язвы, почечной недостаточности, СПИД, анаболического нарушения, дефицита гормона роста у взрослых людей и для лечения против старения. Y-ПЭГ-ГР и U-ПЭГ-ГР настоящего изобретения могут быть назначены пациенту в форме состава, содержащего фармацевтически эффективное количество Y-ПЭГ-ГР или U-ПЭГ-ГР и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. Поэтому, в другом аспекте изобретение предлагает состав, содержащий фармацевтически эффективное количество пегилиро-ванного ГР настоящего изобретения и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. Фармацевтически приемлемый носитель, используемый в изобретении, содержит фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или стабилизатор, который не токсичен для клетки или млекопитающему, который будет контактировать с ним в используемой дозировке или концентрации. Обычно физиологически приемлемым носителем является водный буферный раствор. Примеры физиологически приемлемого носителя включают буфер, такой как фосфатный, цитратный или другой буфер органической кислоты, антиоксидант, такой как аскорбиновая кислота, низкомолекулярный полипептид (не более 10 остатков), белок, такой как серальбумин, желатин или иммуноглобулин, гидрофильный полимер, такой как поливинилпирролидон, аминокислоту, такую как глицин, аспартат, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин, моносахарид, такой как глюкоза и манноза, другие сахариды, такие как дисахарид и декстрин и т.д., хелатор, такой как EDTA, сахарный спирт, такой как маннитол и сорбитол, солеобразующий противоион, такой как натрий, и/или неионное ПАВ, такое как TWEEN, PEG и PLURONICS. Наполнитель предпочтительно стерильный и обычно не содержит вредного вещества. Этот состав можно стерилизовать, используя обычные приемы стерилизации. В одном варианте осуществления изобретения состав кроме того содержит маннитол, аминокислоту, хлорид натрия, уксусную кислоту и ацетат натрия, причем аминокислоту предпочтительно выбирают из группы, состоящей из лизина, аспартата, аспарагина и глицина.

В другом аспекте изобретение также предлагает использование пегилированного ГР настоящего изобретения или состава, содержащего пегилированный ГР настоящего изобретения, в приготовлении лекарства для лечения заболевания при необходимости лечения с применением ГР и для лечения против старения. Предпочтительно, заболевание с необходимостью лечения с применением ГР выбирают из группы, состоящей из низкорослости, ожога, раны, перелома кости, кровоточащей язвы, почечной недостаточности, СПИД, низкорослости в связи с дефицитом эндогенного гормона роста, синдромом Тернера, анаболическим нарушением и дефицитом гормона роста у взрослых людей.

Описание чертежей

Фиг.1: Результаты не восстановительного SDS-PAGE образцов рГРЧ, модифицированного Y-ПЭГ-NHS 40 кД или U-ПЭГ-NHS 40 кД при pH 8,0. Концентрация разделяющего геля 12%, для визуализации использовали окрашивание серебром. Дорожка 1: маркер, LMW, GE Healthcare; Дорожка 2: образец рГРЧ, модифицированного Y-ПЭГ-NHS при pH 8,0, загруженное количество 2 мкг; Дорожка 3: образец рГРЧ, модифицированного Y-ПЭГ-NHS при pH 8,0, загруженное количество 5 мкг; Дорожка 4: образец рГРЧ, модифицированного U-ПЭГ-NHS при pH 8,0, загруженное количество 5 мкг.

Фиг.2: Результаты не восстановительного SDS-PAGE образцов рГРЧ, модифицированного Y-ПЭГ-NHS 40 кД при разных значениях pH. Концентрация разделяющего геля 12%, для визуализации использовали окрашивание серебром. Дорожка 1: образец рГРЧ, модифицированного Y-ПЭГ-NHS при pH 6,0; Дорожка 2: образец рГРЧ, модифицированного Y-ПЭГ-NHS при pH 7,0; Дорожка 3: образец рГРЧ, модифицированного Y-ПЭГ-NHS при pH 8,0; Дорожка 4: образец рГРЧ, модифицированного Y-ПЭГ-NHS при pH 9,0; Дорожка 5: образец рГРЧ, модифицированного Y-ПЭГ-NHS при pH 9,5; Дорожка 6: образец рГРЧ, модифицированного Y-ПЭГ-NHS при pH 10,0; Дорожка 7: образец рГРЧ, модифицированного Y-ПЭГ-NHS при pH 10,5; Дорожка 8: marker, LMW, GE Healthcare. Загруженное количество всех образцов - 5 мкг.

Фиг.3: Результаты не восстановительного SDS-PAGE образцов рГРЧ, модифицированного U-ПЭГ-NHS при разных значениях pH. Концентрация разделяющего геля 12%, для визуализации использовали окрашивание серебром. Дорожка 1: образец рГРЧ, модифицированного U-ПЭГ-NHS при pH 6,0; Дорожка 2: образец рГРЧ, модифицированного U-ПЭГ-NHS при pH 7,0; Дорожка 3: образец рГРЧ, модифицированного U-ПЭГ-NHS при pH 8,0; Дорожка 4: образец рГРЧ, модифицированного U-ПЭГ-NHS при pH 9,0; Дорожка 5: образец рГРЧ, модифицированного U-ПЭГ-NHS при pH 9,5; Дорожка 6: образец рГРЧ, модифицированного U-ПЭГ-NHS при pH 10,0; Дорожка 7: образец рГРЧ, модифицированного U-ПЭГ-NHS при pH 10,5; Дорожка 8: маркер, LMW, GE Healthcare. Загруженное количество всех образцов - 5 мкг.

Фиг.4: Результаты не восстановительного SDS-PAGE очищенных продуктов модификации рГРЧ, модифицированного У-ПЭГ-NHS 40 кД или U-ПЭГ-NHS 40 кД в одном сайте при pH 6,0 или pH 10,5. Концентрация разделяющего геля 12%, для визуализации использовали окрашивание серебром. Дорожка 1: U-ПЭГ-рГРЧ U 10,5, загруженное количество 10 мкг; Дорожка 2: U-ПЭГ-рГРЧ U 10,5, загруженное количество 2 мкг; Дорожка 3: U-ПЭГ-рГРЧ U6,0, загруженное количество 10 мкг; Дорожка 4: U-ПЭГ-рГРЧ U6,0, загруженное количество 2 мкг; Дорожка 5: маркер, LMW, GE Healthcare; Дорожка 6: Y-ПЭГ-рГРЧ Y10,5, загруженное количество 10 мкг; Дорожка 7: Y-ПЭГ-рГРЧ Y10,5, загруженное количество 2 мкг; Дорожка 8: Y-ПЭГ-рГРЧ Y6,0, загруженное количество 10 мкг; Дорожка 9: Y-ПЭГ-рГРЧ Y6,0, загруженное количество 2 мкг; Дорожка 10: рГРЧ, загруженное количество 100 нг; Дорожка 11: рГРЧ, загруженное количество 50 нг.

Фиг.5: Результаты анализа клеточной активности очищенных продуктов модификации рГРЧ, модифицированного U-ПЭГ-NHS 40 кД в одном сайте при pH 6,0 или pH 10,5, дублирующие пластинки.

Фиг.6: Результаты анализа клеточной активности очищенных продуктов модификации рГРЧ, модифицированного Y-ПЭГ-NHS 40 кД в одном сайте при pH 6,0 или pH 10,5, дублирующие пластинки.

Фиг.7: Молекулярные массы очищенных продуктов модификации рГРЧ, модифицированного Y-ПЭГ-NHS 40 кД или U-ПЭГ-NHS 40 кД в одном сайте при pH 6,0, pH 9,0 или pH 10,5, детектированные MALDI-TOF MS. а: Y-ПЭГ-рГРЧ, Y6; b: Y-ПЭГ-рГРЧ, Y9; с: Y-ПЭГ-рГРЧ, Y10.5; d: Y-ПЭГ-рГРЧ, Y6-1; е: U-ПЭГ-рГРЧ, U6; f: U-ПЭГ-рГРЧ, U9; g: U-ПЭГ-рГРЧ, U10,5; h: U-ПЭГ-рГРЧ, U6-1; i: Y-ПЭГ-NHS, 40 кД; j: U-ПЭГ-NHS, 40 кД; k: Белковый калибровочный стандарт II, BRUKER; l: рГРЧ; m: Белковый калибровочный стандарт I, BRUKER.

Фиг.8: Результаты не восстановительного SDS-PAGE очищенного продукта модификации рГРЧ с более высокой кажущейся молекулярной массой, модифицированного ПЭГ-NHS 40 кД в одном сайте при pH 6,0, и очищенного продукта модификации рГРЧ, модифицированного ПЭГ-NHS 40 кД в одном сайте при pH 10,5. Концентрация разделяющего геля 12%, для визуализации использовали окрашивание серебром. Дорожка 1: Y-ПЭГ-рГРЧ Y10,5, загруженное количество 2 мкг; Дорожка 2: Y-ПЭГ-рГРЧ Y6,0-l, загруженное количество 2 мкг; Дорожка 3: U-ПЭГ-рГРЧ Ш0,5, загруженное количество 2 мкг; Дорожка 4: U-ПЭГ-рГРЧ U6,0-l, загруженное количество 2 мкг; Дорожка 5: рГРЧ, загруженное количество 50 нг; Дорожка 6: рГРЧ, загруженное количество 100 нг; Дорожка 7: маркер, LMW, GE Healthcare; Дорожка 8: Y-ПЭГ-рГРЧ Y10,5, загруженное количество 10 мкг; Дорожка 9: Y-ПЭГ-рГРЧ Y6.0-1, загруженное количество 10 мкг; Дорожка 10: U-ПЭГ-рГРЧ U10,5, загруженное количество 10 мкг; Дорожка 11: U-ПЭГ-рГРЧ U6,0-1, загруженное количество 10 мкг.

Фиг.9: Кажущиеся молекулярные массы, детектированные невосстановительным SDS-PAGE очищенного продукта модификации pГPЧs (Y6-1, U6-1) с более высокой кажущейся молекулярной массой, модифицированного ПЭГ-NHS 40 кД в одном сайте при pH 6.0, и очищенного продукта модификации рГРЧ (Y10.5, U10.5), модифицированного ПЭГ-NHS 40 кД в одном сайте при pH 10,5. Дорожка 1: Y-ПЭГ-рГРЧ Y6-1+Y-ПЭГ-рГРЧ Y10.5, каждого 25 нг; Дорожка 2: Y-ПЭГ-рГРЧ Y6-1, 50 нг; Дорожка 3: Y-ПЭГ-рГРЧ Y10,5, 50 нг; Дорожка 4, 6: пустые; Дорожка 5: маркер, HMW, GE Healthcare; Дорожка 7: U-ПЭГ-рГРЧ U6-1+U-ПЭГ-рГРЧ U10.5, каждого 25 нг; Дорожка 8: U-ПЭГ-рГРЧ U6-1, 50 нг; Дорожка 9: U-ПЭГ-рГРЧ U10.5, 50 нг.

Фиг.10: Кривая средней концентрации лекарства в сыворотке против времени одной подкожной инъекции макаку-крабоеду 300 мкг·кг^-1 рГРЧ и Y-ПЭГ-рГРЧ (Y10,5), соответственно.

Описание конкретных вариантов осуществления изобретения

Далее настоящее изобретение будет описано посредством примеров, но любые примеры или их сочетания не должны рассматриваться как ограничивающие объем и варианты осуществления настоящего изобретения. Объем настоящего изобретения ограничен только прилагаемой формулой изобретения. Объединив настоящее описание с уровнем техники в данной области, специалист может четко понять объем, ограниченный формулой изобретения.

Пример 1

Модификация рекомбинантного ГР человека U-образным или Y-образным разветвленным ПЭГ 200 мг каждого из U-ПЭГ-NHS и Y-ПЭГ-NHS (средняя молекулярная масса 40 кД, равноплечие; партия №ZZ004P182 и ZZ004P167, соответственно) (Beijing Jen-Kern Technology Co., Ltd.) были отвешены и растворены в 2 мл 2 ммоль HCl (Guangdong Guanghua Chemical Factory Co., Ltd.) соответственно. 50 мг рГРЧ (Xiamen Amoy-top Biotech Co., Ltd.) и 50 ммоль буфера борной кислоты - буры, pH 8,0 (Sinopharm Shanghai Chemical Reagent Co., Ltd.) были добавлены соответственно к конечному совокупному объему реакции 10 мл. В системе реакции конечная концентрация рГРЧ составила 5 мг/мл, и молярное отношение реакции рГРЧ с ПЭГ-NHS составляло 1:2. Инкубирование проводили при <10°C в течение 2 часов при встряхивании, и ледяную уксусную кислоту (Shantou Xilong Chemical Co., Ltd.) добавили, чтобы сделать pH<4,0 для остановки реакции. Образец взяли для SDS-PAGE, и окрашивание серебром использовали для визуализации. Результаты SDS-PAGE показаны на Фиг.1. По результатам SDS-PAGE на Фиг.1 продукты модификации при pH 8,0 показывают две основных полосы, и образцы, модифицированные U-ПЭГ-NHS и Y-ПЭГ-NHS показывают те же характеристики электрофореза SDS-PAGE.

Пример 2

Модификации рекомбинантного ГР человека U-образным и Y-образным разветвленным ПЭГ при разных значениях pH200 мг каждого из U-ПЭГ-NHS и Y-ПЭГ-NHS (средняя молекулярная масса 40 кД, равноплечие; партия №ZZ004P182 и ZZ004P167 соответственно) (Beijing JenKem Technology Co., Ltd.) отвесили и растворили в 2 мл 2 ммоль HCl (Guangdong Guanghua Chemical Factor у Co., Ltd.) соответственно. 50 мг рГРЧ (Xiamen Amoytop Biotech Co., Ltd.) и соответствующий буфер добавили соответственно в конечный совокупный объем реакции 10 мл. Использовали 10 ммоль буфера PBNa (Sinopharm Shanghai Chemical Reagent Co., Ltd.) с соответствующим pH для реакции при pH 6,0, 7,0 или 8,0 и 50 ммоль буфера буры (Sinopharm Shanghai Chemical Reagent Co., Ltd.) с соответствующим pH для реакции при pH 9,0, 9,5, 10,0 или 10,5. В системе реакции конечная концентрация рГРЧ составила 5 мг/мл, и молярное отношение рГРЧ к ПЭГ-NHS составило предпочтительно 1:2. Инкубацию проводили при<10°С в течение 2 часов с встряхиванием, и ледяную уксусную кислоту (Shantou Xilong Chemical Co., Ltd.) добавили для того, чтобы сделать pH<4.0 и остановить реакцию. Образец был взят для SDS-PAGE, и окрашивание серебром использовали для визуализации. Систему визуализации геля (модель №: FR-200, Shanghai FURI Science & Technology Co., Ltd.) использовали для анализа результатов электрофореза. Результаты электрофореза SDS-PAGE показаны на Фиг.2 и Фиг.3, и результаты анализа системы визуализации геля показаны в таблице 1. По результатам электрофореза модифицированные продукты при pH 6,0-9,5 четко показывают две основных полосы, и с увеличением pH реакции содержание полосы более низкой кажущейся молекулярной массы также возрастает. Модифицированные продукты при pH 10,0 и 10,5 являются в сущности полосой более низкой кажущейся молекулярной массы. Образцы, модифицированные U-ПЭГ-NHS и Y-ПЭГ-NHS показывают такие же характеристики электрофореза SDS-PAGE.

Таблица 1.
Анализ системы визуализации геля на результатах SDS-PAGE рекомбинантных ГР человека, модифицированных U-образным и Y-образным разветвленным ПЭГ при разных значениях pH
pH реакции модификации	6,0	7,0	8,0	9,0	9,5	10,0	10,5
Y-ПЭГ	Содержание полосы 1 (%)	53,9	48,6	27,7	25,7	6,9	5,6	7,9
Содержание полосы 2 (%)	46,1	51,4	72,3	74,3	93,1	94,4	92,1
U-ПЭГ	Содержание полосы 1 (%)	47,5	41,8	30,1	27,4	24,4	18,9	7,5
Содержание полосы 2 (%)	52,5	58,2	69,9	72,6	75,6	81,1	92,5

Примечание: "содержание" - относительное процентное содержание полосы 1 (более высокая кажущаяся молекулярная масса) к полосе 2 (более низкая кажущаяся молекулярная масса) продуктов рГРЧ, модифицированного ПЭГ в одном сайте.

Пример 3

Изготовление, клеточная активность и молекулярная масса рекомбинантного ГР человека, модифицированного U-образным или Y-образным разветвленным ПЭГ в одном сайте при pH 6,0, 9,0 или 10,5

1. Модификация

Три образца массой 1200 мг каждого из и-ПЭГ-NHS и Y-n3F-NHS (средняя молекулярная масса 40 кД, равноплечие; партия №ZZ004P182 и ZZ004P167, соответственно) (Beijing JenKem Technology Co., Ltd.) отвесили и растворили в 12 мл 2 ммоль НС1 (Guangdong Guanghua Chemical Factory Co., Ltd.) соответственно. 300 мг рГРЧ (Xiamen Amoytop Biotech Co., Ltd.) и 50 моль буфера буры (pH 10,5) или 50 ммоль буфера борной кислоты/буры (pH 9,0) или 10 ммоль PBNa (pH 6,0) (Sinopharm Shanghai Chemical Reagent Co., Ltd.) добавляли в конечный совокупный объем реакции 60 мл. В системе реакции конечная концентрация рГРЧ составила 5 мг/мл, молярное отношение между рГРЧ и ПЭГ-NHS составило предпочтительно 1:2, и pH реакции был 10,5, 9,0 и 6,0, соответственно. Инкубирование проводили при <10°C в течение 2 часов при встряхивании, и ледяную уксусную кислоту (Shantou Xilong Chemical Co., Ltd.) добавили, чтобы сделать pH<4,0 и остановить реакцию. Взяли образец для SDS-PAGE, и окрашивание серебром использовали для визуализации.

2. Очистка

2.1 Очистка хроматографией на Q Sepharose FF

Образец ПЭГ-модификации рГРЧ разбавили 3 раза, используя сверхчистую воду, и pH разбавленного образца корректировали до 9,0 с помощью NaOH или НС1.

2.1.1 Очистка хроматографией на Q Sepharose FF образцов ПЭГ-модификации (pH 6,0) рГРЧ

Хроматографическая колонка (Shanghai Jinhua Chromatography Equipment Factory) имела диаметр 18 мм и длину 400 мм, набивка материала Q Sepharose FF (GE Healthcare) имела диаметр 18 мм и длину 240 мм, и объем слоя колонки (CV) составлял 61 мл. Колонку для хроматографии на Q Sepharose FF очистили на месте, используя 0,5 М NaOH при 5 мл/мин в течение 30 мин, элюировали 3 CV ddH₂O при 5 мл/мин, регенерировали 3 CV 1 М NaCl при 5 мл/мин и элюировали 5 CV 20 ммоль борной кислоты/буры - 17 ммоль NaCl (pH 9,0, раствор А) при 5 мл/мин. Разбавленные сверхчистой водой образцы ПЭГ-модифицированного рГРЧ загрузили при расходе 3 мл/мин, и элюэнт детектировали на 280 нм (АКТА Basic 100, GE Healthcare). Элюирование проводили, используя раствор А при расходе 5 мл/мин до полного детектирования первого пика; и 20 ммоль борной кислоты/буры - 100 ммоль NaCl (pH 9,0, раствор В) затем использовали для элюирования при расходе 5 мл/мин до полного детектирования второго пика. 20 ммоль борной кислоты/буры - 200 ммоль NaCl (pH 9.0, раствор С) затем использовали для элюирования при 5 мл/мин до полного детектирования третьего пика. Образец из второго пика взяли в качестве целевого образца. Буферную систему целевого образца изменили на 20 ммоль борной кислоты/буры (pH 9,0) посредством ультрафильтрации через ультрафильтр 5K (Millipore, материал полиэфирсульфон).

2.1.2 Очистка хроматографией на Q Sepharose FF образцов ПЭГ-модификации (pH 9,0 или 10,5) рГРЧ

Хроматографическая колонка (Shanghai Jinhua Chromatography Equipment Factory) имела диаметр 18 мм и длину 400 мм, набивка материала Q Sepharose FF (GE Healthcare) имела диаметр 18 мм и длину 240 мм, и объем слоя колонки (CV) составлял 61 мл. Колонку для хроматографии на Q Sepharose FF очистили на месте, используя 0,5 М NaOH при 5 мл/мин в течение 30 мин, элюировали 3 CV ddH₂O при 5 мл/мин, регенерировали 3CV 1 М NaCl при 5 мл/мин и элюировали 5 CV 20 ммоль борной кислоты/буры - 17 ммоль NaCl (pH 9,0, раствор А) при 5 мл/мин. Разбавленный сверхчистой водой образец ПЭГ-модифицированного рГРЧ загрузили при расходе 3 мл/мин, и элюэнт детектировали на 280 нм (АКТА Basic 100, GE Healthcare). Элюирование проводили, используя раствор А при расходе 5 мл/мин до полного детектирования первого пика; и 20 ммоль борной кислоты/буры - 40 ммоль NaCl (pH 9,0, раствор В) затем использовали для элюирования при расходе 5 мл/мин до полного детектирования второго пика. 20 ммоль борной кислоты/буры - 100 ммоль NaCl (pH 9,0, раствор С) затем использовали для элюирования при 5 мл/мин до полного детектирования третьего пика, и 20 ммоль борной кислоты/буры - 200 ммоль NaCl (pH 9,0, раствор D) использовали для элюирования при 5 мл/мин до полного детектирования четвертого пика. Образец из третьего пика взяли в качестве целевого образца. Буферную систему целевого образца изменили на 20 ммоль борной кислоты/буры (pH 9,0) посредством ультрафильтрации через ультрафильтр 5K (Millipore, материал полиэфирсульфон).

2.2 Очистка хроматографией на DEAE Sepharose FF

Хроматографическая колонка (Shanhai Jinhua Chromatography Equipment Factory) имела диаметр 18 мм и длину 400 мм, материал набивки DEAE Sepharose FF (GE Healthcare) имел диаметр 18 мм и длину 235 мм, 1 CV=60 мл.

Колонку для хроматографии на DEAE Sepharose FF очистили на месте, используя 0,5 М NaOH при расходе 5 мл/мин в течение 30 мин, элюировали 3 CV ddH₂O при 5 мл/мин, регенерировали 3 CV 1 M NaCl при 5 мл/мин и элюировали 3 CV 20 ммоль борной кислоты/буры (pH 9,0, раствор А) при 5 мл/мин. Очищенный Q Sepharose FF образец ПЭГ-рГРЧ загрузили с расходом 3 мл/мин, элюировали 3 CV раствора А при 5 мл/мин и элюировали 6 CV 20 ммоль борной кислоты/буры - 30 ммоль NaCl (pH 9,0, раствор В) при 5 мл/мин. 20 ммоль борной кислоты/буры - 100 ммоль NaCl (pH 9,0, раствор С) использовали для элюирования при 5 мл/мин до полного детектирования первого и второго пиков. Элюэнт детектировали на 280 нм (АКТА Basic 100, GE Healthcare). Образец из второго пика взяли в качестве целевого образца. Буферная система целевого образца была изменена на 5 ммоль PBNa (pH 8,5) и соответствующе концентрирована посредством ультрафильтрации через ультрафильтр 5К (Millipore, материал полиэфирсульфон).

2.3 Повышенная очистка с использованием хроматографии на Q Sepharose FF

Хроматографическая колонка (Shanhai Jinhua Chromatography Equipment Factory) имела диаметр 25 мм и длину 400 мм, материал набивки Q Sepharose FF (GE Healthcare) имел диаметр 25 мм и длину 200 мм, 1 CV=98 мл.

Колонку для хроматографии на Q Sepharose FF очистили на месте, используя 0,5 М NaOH при расходе 10 мл/мин в течение 30 мин, элюировали 3 CV ddH₂O при 10 мл/мин, регенерировали 3 CV I M NaCl при 10 мл/мин и элюировали 3 CV 5 ммоль PBNa (pH 8,5, раствор А) при 10 мл/мин. Очищенный DEAE Sepharose FF образец ПЭГ-рГРЧ загрузили при расходе 6 мл/мин и элюировали 3 CV раствора A at 10 мл/мин. 5 ммоль PBNa - 90 ммоль NaCl (pH 8,5, раствор В) использовали для элюирования при 10 мл/мин до полного детектирования первого пика, и 5 ммоль PBNa - 300 ммоль NaCl (pH 8,5, раствор С) использовали для элюирования при 10 мл/мин до полного детектирования второго пика. Элюэнт детектировали на 280 нм (АКТА Basic 100, GE Healthcare). Образец из первого пика взяли в качестве целевого образца. Буферная система целевого образца была изменена на 3 ммоль NaAc/HAc - 7 ммоль NaCl - 5 ммоль Lys (pH 5,0) посредством ультрафильтрации через ультрафильтр 5К (Millipore, материал полиэфирсульфон), и маннитол добавили к конечной концентрации 45 мг/мл. Образец стерилизовали посредством фильтрации 0,2 мкм. Образец взяли для электрофореза SDS-PAGE, и окрашивание серебром использовали для визуализации. Остальной образец хранили при -70°C. Продукт, модифицированный при pH 6,0 обозначали как Y6 или U6, причем полосу более высокой кажущейся молекулярной массы обозначали как Y6-1 или U6-1, а полосу более низкой кажущейся молекулярной массы обозначали как Y6-2 или U6-2. Продукт модификации при pH 9,0 обозначали как Y9 или U9, и продукт модификации при pH 10,5 обозначали как Y10,5 или U10,5.

Результаты SDS-PAGE показаны на фиг.4. По результатам электрофореза продукты модификации при pH 6,0 четко показывают две полосы, но продукты модификации при pH 10,5 в основном были полосой более низкой кажущейся молекулярной массы с содержанием SDS-PAGE не ниже 80%.

3. Клеточная активность

Используя национальный стандарт ГР в качестве контрольного, использовали ГРЧ-зависимую клеточную линию Nb2-11 лимфомы крысы для анализа клеточной активности каждого образца ПЭГ-рГРЧ.

Клетки Nb2-11 разбавили до конечной концентрации 5×10⁴ клеток/мл. Национальный стандарт ГР (партия №35-20002, 1 мг/мл/трубка, 3 МЕ/трубка; куплен у Национального института по контролю за фармацевтическими и биологическими продуктами) предварительно разбавили до 100 нг/мл (0,0003 МЕ/мл), и каждый образец ПЭГ-рГРЧ для анализа предварительно разбавили до 0,0003 МЕ/мл согласно результатам предварительных экспериментов. На основании предварительного разбавления каждый образец анализировали после разбавления до градиента полтора. Активность образца вычисляли по следующему уравнению:

$$Активностьобразцов\text{ для исследования}=\text{Активность стандартов x}\frac{\text{C1}}{\text{C2}}x\frac{D1}{D2}$$

где: C₁ - кратность разбавления образца для анализа, эквивалентная количеству стандарта для половины эффекта;

C₂ - кратность разбавления стандарта для половины эффекта;

D₁ - кратность предварительного разбавления образца для анализа;

D₂ - кратность предварительного разбавления стандарта.

Способ анализа:

(1) Были взяты клетки в фазе логарифмического роста, неоднократно пипетированы, центрифугированы и промыты. Клетки повторно суспендировали в разбавителе и скорректировали до концентрации 5×10⁴ клеток/мл.

(2) Каждый предварительно разбавленный образец для анализа был разбавлен вдвое на клеточной пластинке (пластинка с 96 лунками, Corning), всего 10 градиентов, и для каждого градиента были сделаны дублирующие лунки, 50 мкл/лунка. Положительный контроль был изготовлен в 8 градиентах таким же образом. Разбавитель использовали как отрицательный контроль.

(3) Клетки добавляли в плотности 100 мкл/лунка, поместили в инкубатор СО₂ и инкубировали при 37°C в течение приблизительно 70 часов. Раствор AlamarBlue™ (Bio-Source) добавили в количестве 30 мкл/лунка, перемешивали с встряхиванием в течение 1 мин. Инкубирование проводили в инкубаторе СО₂ при 37°C в течение 5 часов. После встряхивания при комнатной температуре в течение 5 мин, пластинку считывали (длина волны возбужденного света 530 нм; длина волны испускаемого света 590 нм).

(4) Метод регрессии по четырем параметрам использовали для нанесения на график стандарта и образца для анализа. Титры каждого образца для анализа вычисляли по уравнению графиков стандарта и образцов для анализа.

Результаты клеточной активности показаны в таблице 2 и на Фиг.5 и Фиг.6. Для каждого образца анализировали дублирующие образцы. Удельная клеточная активность У-ПЭГ-КНБ-модифицированного рГРЧ при pH 6,0 (Y6) составила 1,08×10^-1 МЕ/мг, удельная клеточная активность продукта, модифицированного при pH 9,0 (Y9) составила 1,66×10^-1 МЕ/мг, и удельная клеточная активность продукта, модифицированного при pH 10,5 (Y10,5) составила 2,09×10^-1 МЕ/мг, причем удельная клеточная активность Y10,5 была приблизительно вдвое больше таковой у Y6. Удельная клеточная активность U-ПЭГ-NHS-модифицированного рГРЧ при pH 6,0 (U6) составила 8.85×10^-2 МЕ/мг, удельная клеточная активность продукта, модифицированного при pH 9,0 (U9) составила 1,42×10^-1 МЕ/мг; и удельная клеточная активность продукта, модифицированного при pH 10,5 (U10,5) составила 1,82×10^-1 МЕ/мг, причем удельная клеточная активность U10,5 была приблизительно вдвое больше таковой у U6. С увеличением pH реакции модификации соответственно возрастала клеточная активность продукта, модифицированного ПЭГ в одном сайте (2 основных полосы).

Таблица 2.
Клеточная активность каждого образца Y-ПЭГ-рГРЧ и U-ПЭГ-рГРЧ*
Образец	Тип ПЭГ	Молекулярная масса ПЭГ (кД)	Удельная клеточная активность (×10-1 МЕ/мг)
Пластинка 1	Пластинка 2	Среднее
Y-ПЭГ-рГРЧ, Y6	Y разветвленный	40	1,04	1,12	1,08
Y-ПЭГ-рГРЧ, Y9	Y разветвленный	40	1,58	1,74	1,66
Y-ПЭГ-рГРЧ, Y10,5	Y разветвленный	40	2,06	2,12	2,09
U-ПЭГ-рГРЧ, U6	U разветвленный	40	0,88	0,89	0,88
U-ПЭГ-рГРЧ, U9	U разветвленный	40	1,38	1,46	1,42
U-ПЭГ-рГРЧ, U 10,5	U разветвленный	40	1,84	1,80	1,82
Примечание: * Национальный стандарт ГР использовали из партии №35-20002, 1 мг/мл/трубка, 3 МЕ/трубка, купленной у Национального института по контролю за фармацевтическими и биологическими продуктами.

4. Молекулярная масса, определяемая MALDI-TOF MS (масс-спектрометрией с матричной лазерной десорбцией/ионизацией)

Используя масс-спектроскоп Autoflex □ TOF/TOF (BRUKER, Германия), способ MALDI-TOF MS использовали для определения молекулярной массы каждого образца ПЭГ-рГРЧ. Синаповую кислоту (SA, C₁₁H₁₂O₅, молекулярная масса 224,22, номер партии 2006 236870 002, BRUKER) использовали в качестве матрицы, Белок-стандарт для калибровки I (№ по каталогу 206355) и Белок-стандарт для калибровки II (№по каталогу 207234) от компании BRUKER использовали в качестве стандарта молекулярной массы белка, для анализа использовали программное обеспечение flexAnalysis Ver.3.0.54.0. Результаты показаны на Фиг.7.

рГРЧ, модифицированные Y-II3r-NHS при pH 6,0 (Y6), pH 9,0 (Y9) и pH 10,5 (Y10,5), все имеют молекулярную массу, определенную масс-спектрометрией, в диапазоне 62012 Дальтон ±10%, что соответствует теоретической молекулярной массе продуктов рГРЧ, модифицированного Y-ПЭГ в одном сайте (молекулярная масса Y-ПЭГ-NHS составляет 40 кД ±10%), указывая, что Y6, Y9 и Y10.5 являются продуктами модификации рГРЧ, модифицированного Y-ПЭГ в одном сайте. рГРЧ, модифицированные U-ПЭГ-NHS при pH 6,0 (U6), pH 9,0 (U9) и pH 10,5 (U10.5) все имеют молекулярную массу, определенную масс-спектрометрией, в диапазоне 62012 Дальтон ±10%, что соответствует теоретической молекулярной массе продуктов рГРЧ, модифицированного U-ПЭГ в одном сайте (молекулярная масса U-ПЭГ-NHS составляет 40 кД ±10%), указывая, что U6, U9 и U10.5 являются продуктами модификации рГРЧ, модифицированного U-ПЭГ в одном сайте.

Пример 4

Приготовление, а также анализ клеточной активности и молекулярной массы продукта модификации рекомбинантного ГР человека с более высокой кажущейся молекулярной массой, модифицированного U-образным или Y-образным разветвленным ПЭГ в одном сайте при pH 6.0 (Y6-1, U6-1)

1. Модификация

Два образца по 1200 мг каждый U-ПЭГ-NHS и Y-ПЭГ-NHS (средняя молекулярная масса 40 кД, равноплечие; партии №ZZ004P182, ZZ004P167, соответственно) (Beijingng JenKem Technology Co., Ltd.) были отвешены и растворены в 12 мл 2 ммоль НС1 (Guangdong Guanghua Chemical Factory Co., Ltd.) соответственно. 300 мг рГРЧ (Xiamen Amoytop Biotech Co., Ltd.) и 10 ммоль PBNa (pH 6,0) (Sinopharm Shanghai Chemical Reagent Co., Ltd.) были соответственно добавлены в конечный совокупный объем реакции 60 мл. В системе реакции конечная концентрация рГРЧ составила 5 мг/мл, молярное отношение рГРЧ к ПЭГ-NHS составило предпочтительно 1: 2, и pH реакции 6,0. Инкубирование проводили при <10°C в течение 2 часов при встряхивании, и ледяную уксусную кислоту (Shantou Xilong Chemical Co., Ltd.) добавили, чтобы сделать pH<4,0 и остановить реакцию.

2. Очистка продукта с более высокой кажущейся молекулярной массой, модифицированного ПЭГ в одном сайте (Y6-1, U6-1)

2.1 Очистка хроматографией на Q Sepharose FF

Образец рГРЧ, модифицированного ПЭГ (pH 6,0) разбавили 3 раза, используя сверхчистую воду, и pH скорректировали до 9,0, используя NaOH.

Хроматографическая колонка (Shanhai Jinhua Chromatography Equipment Factory) имела диаметр 25 мм и длину 500 мм, и материал набивки Q Sepharose FF (GE Healthcare) имел диаметр 25 мм и длину 310 мм, 1 CV=152 мл. Колонку для хроматографии на Q Sepharose FF очистили на месте с использованием 0,5 М NaOH при расходе 10 мл/мин в течение 30 мин, элюирована 3 CV ddH₂O при 10 мл/мин, регенерирована 3 CV 1 М NaCl при 10 мл/мин и элюирована 5 CV 20 ммоль борной кислоты/буры - 17 ммоль NaCl (pH 9,0, раствор А) при 10 мл/мин. Разбавленный сверхчистой водой образец ПЭГ-модифицированного рГРЧ загрузили при расходе 6 мл/мин и элюировали, используя раствор А при 10 мл/мин до полного детектирования первого пика. Затем 20 ммоль борной кислоты/буры - 100 ммоль NaCl (pH 9,0, раствор В) использовали для элюирования при 10 мл/мин до полного детектирования второго пика, и 20 ммоль борной кислоты/буры - 200 ммоль NaCl (pH 9,0, раствор С) использовали для элюирования при 10 мл/мин до полного детектирования третьего пика. Элюэнт детектировали на 280 нм (АКТА Basic 100, GE Healthcare). Образец из второго пика взяли в качестве целевого образца. Буферная система целевого образца была изменена на 5 ммоль NaAc/HAc (pH 4,5) посредством ультрафильтрации через ультрафильтр 5К (Millipore, материал полиэфирсульфон).

2.2 Очистка хроматографией MacroCap SP

Хроматографическая колонка (Shanhai Jinhua Chromatography Equipment Factory) имела диаметр 12 мм и длину 300 мм, и материал набивки MacroCap SP (GE Healthcare) имел диаметр 12 мм и длину 180 мм, 1 CV=20 мл. Колонку для хроматографии MacroCap SP очистили на месте, используя 0,5 М NaOH при 1 мл/мин в течение 30 мин, элюировали 3 CV ddH₂O при 1 мл/мин, регенерировали 3 CV 1 M NaCl при 1 мл/мин и элюировали 5 CV 5 ммоль NaAc/HAc (pH 4,5, раствор А) при 1 мл/мин. Очищенный Q Sepharose FF образец пегилированного рГРЧ загрузили при расходе 1 мл/мин и элюировали 3 CV раствора А при 1 мл/мин. 5 ммоль NaAc/HAc - 100 ммоль NaCl (pH 4,5, раствор В) использовали для элюирования 5 CV в градиенте 0%-30% раствора В при 1 мл/мин, элюировали 10 CV в градиенте 30%-45% В и затем элюировали 5 ммоль NaAc/HAc - 1 М NaCl (pH 4,5, раствор С) при 1 мл/мин до полного детектирования первого и второго пиков. Элюэнт детектировали на 280 нм (АКТА Basic 100, GE Healthcare). Элюэнт между пятым и восьмым CV во время элюирования с градиентом 30% -45% раствором В взяли в качестве целевого образца. Буферная система целевого образца была изменена на 3 ммоль NaAc/HAc - 7 ммоль NaCl - 5 ммоль Lys (pH 5,0) посредством ультрафильтрации через ультрафильтр 5К (Millipore, материал полиэфир-сульфон), и маннитол добавили до конечной концентрации 45 мг/мл. Образец стерилизовали посредством фильтрации через фильтр 0,2 мкм. Образец взяли для электрофореза SDS-PAGE, и окрашивание серебром использовали для визуализации. Остальной образец хранили при -70°С.Образцы имели номера U6-1, Y6-1. Результаты электрофореза SDS-PAGE показаны на Фиг.8, и результаты электрофореза SDS-PAGE для кажущейся молекулярной массы показаны на Фиг.9.

В случае загрузки 10 мкг образца пегилированного рГРЧ небольшое количество продукта, модифицированного более чем в одном сайте было детектировано в каждом образце ПЭГ-рГРЧ, и содержание субстратного белка (рГРЧ) в каждом образце не превышало 0,5% (Фиг.8) при содержании основной полосы не ниже 80%. Кажущаяся молекулярная масса каждого образца ПЭГ-рГРЧ, определенная электрофорезом SDS-PAGE, показывает одну основную полосу, причем кажущаяся молекулярная масса Y6-1 явно больше таковой у Y10.5, и кажущаяся молекулярная масса U6-1 явно больше таковой у U10.5 (фиг.9).

3. Молекулярная масса, детектированная методом MALDI-TOF MS

Используя масс-спектроскоп Autoflex TOF/TOF (BRUKER, Германия), метод MALDI-TOF MS использовали для анализа молекулярной массы каждого образца ПЭГ-рГРЧ. Метод детектирования был таким же, как в Примере 3. Результаты показаны на Фиг.7.

Молекулярные массы Y6-1 и U6-1, определенные масс-спектроскопией, находятся в диапазоне 62012 Дальтон ±10%, что соответствует теоретической молекулярной массе рГРЧ, модифицированного ПЭГ в одном сайте (молекулярные массы У-ПЭГ-NHS и U-ПЭГ-NHS составляют 40 кД ±10%), указывая, что оба продукта модифицированы ПЭГ в одном сайте.

4. Анализ клеточной активности

Используя национальный стандарт ГР в качестве контроля, использовали ГРЧ-зависимую клеточную линию Nb2-11 лимфомы крысы для анализа клеточной активности каждого образца ПЭГ-рГРЧ, сравнивая различия в клеточной активности Y6-1 и Y10.5, U6-1 и U10.5. Способ анализа был таким же, как в Примере 3. Результаты показаны в таблице 3, по три для каждого образца.

Средняя удельная клеточная активность Y10.5 составляет 2,08×10^-1 МЕ/мг, средняя удельная клеточная активность Y6-1 составляет 5,50×10^-1 МЕ/мг; средняя удельная клеточная активность U10.5 составляет 2,28×10^-1 МЕ/мг, и средняя удельная клеточная активность U6-1 составляет 5,00×10^-2 МЕ/мг. Средняя удельная клеточная активность Y10.5/U10.5 явно выше чем таковая у Y6-1/U6-1 и может быть до 3 раз выше, чем у последнего.

Таблица 3.
Клеточная активность каждого из образцов Y-ПЭГ-рГРЧ и U-ПЭГ-рГРЧ1
Образец	Тип ПЭГ	Молекулярная масса ПЭГ (кД)	Количество сайтов ПЭГ-модификации	Удельная клеточная активность (×10-1 МЕ/мг)2
Y-ПЭГ-рГРЧ, Y10.5	Y разветвленный	40	один	2,08±0,10
Y-ПЭГ-рГРЧ, Y6-1	Y разветвленный	40	один	0,55±0,06
U-ПЭГ-рГРЧ, U10.5	U разветвленный	40	один	2,28±0,14
U-ПЭГ-рГРЧ, U6-1	U разветвленный	40	один	0,50±0,06
Примечания: 1 В качестве стандарта использовали национальный стандарт ГР. Номер партии стандарта: 35-20002, 1 мг/мл/трубка, 3 МЕ/трубка, куплен у Национального института по контролю за фармацевтическими и биологическими продуктами. Среднее из трех значений для каждого образца.

Пример 5

Анализ биологической активности in vivo Y-ПЭГ-рГРЧ (Y10.5) и U-ПЭГ-рГРЧ (U10.5)

Используя крыс с удаленным гипофизом в качестве животных моделей, анализировали биологическую активность Y-ПЭГ-рГРЧ (Y10.5) и U-ПЭГ-рГРЧ (U10.5) in vivo, способствующую росту животных, согласно биологическому анализу гормона роста, описанному в Pharmacopoeia of the People′s Republic of China, version 2005, Volume 3, Appendix XII P, т.е., наблюдая за влиянием на рост и развитие крыс с удаленным гипофизом (при отсутствии эндогенного ГР) через одну неделю после одного назначения.

Использовали крыс Уистара, уровня SPF, самцов, рожденных 26-28d, масса тела 60-80 г, предоставленных Центром экспериментальных животных Национального института по контролю за фармацевтическими и биологическими продуктами (№сертификации животных: SCXK(Jing)2005-0004). За 2-3 недели до эксперимента у крыс асептически удалили гипофиз путем хирургической операции, и затем крысы нормально восстанавливались в лаборатории S-2 для дальнейших экспериментов. Были выбраны подходящие крысы с удаленным гипофизом, которые были распределены на 10 групп по 10 крыс по массе тела, а именно: отрицательная контрольная группа (чистый растворитель); положительный контрольный рГРЧ (национальный стандарт ГР, подготовленный Национальным институтом по контролю за фармацевтическими и биологическими продуктами, 3 МЕ·мг^-1·трубка^-1), группы малой дозы (2,7 МЕ·кг^-1), средней дозы (5,3 МЕ-кг"¹) и большой дозы (10,7 МЕ·кг^-1), вводимой 6 раз в сутки, 6 последовательных введений; группы малой дозы (2,7 МЕ·кг^-1), средней дозы (5,3 МЕ·кг^-1) и большой дозы (10,7 МЕ·кг^-1) испытываемого образца Y10.5, группы малой дозы (2,7 МЕ·кг^-1), средней дозы (5,3 МЕ·кг^-1) и большой дозы (10,7 МЕ·кг^-1) испытываемого образца U 10.5, одно введение в первые сутки назначения стандарта. Y10.5 и U10.5 были подготовлены согласно оцененному титру 3 МЕ/мг. Введение осуществляли подкожной инъекцией 0,5 мл в шею животного. Отрицательной контрольной группе вводили только растворитель, один раз в сутки, всего 6 раз. Крыс умерщвляли через 24 часа после последнего введения в положительной контрольной группе, и измеряли массу тела и ширину ростковых хрящей. Данные обрабатывали согласно анализу гормона роста из Приложения XII P и статическому методу биологического анализа из Приложения XIV к Pharmacopoeia of the People′s Republic of China, version 2005.

Биологический титр Y-ПЭГ-рГРЧ (Y10.5) составлял 5,0 МЕ·мг^-1, биологический титр U-ПЭГ-рГРЧ (U10.5) составлял 5,2 МЕ·мг^-1, оба более чем в 1,5 раза превышали нормальный рГРЧ. Одно введение Y-ПЭГ-рГРЧ (Y10.5) или U-ПЭГ-рГРЧ (U10.5) имеет более высокую биологическую активность для содействия росту тела животного и более длительный фармацевтический эффект чем сумма ежедневно вводимых рГРЧ.

Пример 6

Период метаболического полувыведения в сыворотке Y-ПЭГ-рГРЧ (Y10.5) у макака-крабоеда

Были отобраны 6 макак-крабоедов, 3 самки и 3 самца, масса тела 3,24-5,48 кг (Guangxi Beihai Yu Qi Experiment Animal Technology Co. Ltd., сертификация №: SCXK(Gui)2005-0005). В эксперименте участвовали две группы из 3 макак-крабоедов: одна группа для подкожной инъекции Y-ПЭГ-рГРЧ (Y10.5) в дозе 300 мкг-кг^-1 (2♂, 1♀) и другая группа для подкожной инъекции рГРЧ (Saizen, Laboratoires Serono S.A., Швейцария) в дозе 300 мкг·кг^-1 (1♂, 2♀), одно введение. После введения венозную кровь регулярно отбирали из задней ноги напротив места введения, и отделяли сыворотку. Для анализа концентрации гормона роста человека в крови использовали набор ELISA, и кривую концентрации лекарства в крови вычерчивали для вычисления метаболического полувыведения лекарства. Результаты показаны на Фиг.10.

После подкожной инъекции Y-ПЭГ-рГРЧ (Y10.5) в дозе 300 мкг·кг^-1 макакам-крабоедам время до пика концентрации лекарства в сыворотке составило 8-24 часа. Лекарство медленно удалялось из организма. Средний период метаболического полувыведения составил 41,33 часа. После подкожной инъекции рГРЧ (Saizen) в дозе 300 мкг·кг^-1 макакам-крабоедам время до пика концентрации в сыворотке составило 1-2 часа и через 24 часа концентрация уменьшилась до уровня перед введением. Выведение происходило явно быстрее чем при Y-ПЭГ-рГРЧ (Y10.5). Средний период метаболического полувыведения из сыворотки составил 1,80 часа. Средний период метаболического полувыведения из сыворотки Y-ПЭГ-рГРЧ (Y10.5) более чем в 20 раз превысил таковой для рГРЧ.

1. Способ получения человеческого гормона роста, пегилированного двухцепочечным полиэтиленгликолем, включающий:
a) в растворе с рН не ниже 6,0, предпочтительно не ниже 7,0, предпочтительно не ниже 8,0, предпочтительно не ниже 9,0, предпочтительно не ниже 9,5, предпочтительно не ниже 10,0, наиболее предпочтительно с рН 10,5 введение U-образного или Y-образного разветвленного двухцепочечного полиэтиленгликоля (ПЭГ) в контакт с гормоном роста человека, причем молярное отношение гормона роста к двухцепочечному ПЭГ предпочтительно составляет приблизительно 1:2;
b) анализ продукта, модифицированного двухцепочечным ПЭГ в одном сайте, полученного на этапе а) в SDS-PAGE подходящей концентрации, предпочтительно 12% SDS-PAGE, причем продукт показывает две полосы;
c) отделение и извлечение продукта, модифицированного двухцепочечным ПЭГ в одном сайте, с более низкой кажущейся молекулярной массой в двух полосах;
по выбору, очистка извлеченного продукта предпочтительно с использованием гель-хроматографии, такой как хроматографии на Q Sepharose FF, хроматографии на DEAE Sepharose FF или хроматографии MacroCap SP.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что двухцепочечным ПЭГ является Y-образный разветвленный ПЭГ следующей формулы (I):

где каждый из Р_а и P_b тот же или разный ПЭГ; j - целое число от 1 до 12; R_i - Н, замещенный или незамещенный алкил С_1-12, замещенный арил, аралкил или гетероалкил; где каждый из X₁ и Х₂ является связывающей группой соответственно, причем X₁ - (СН₂)_n, Х₂ выбирают из группы, состоящей из: (CH₂)_n, (CH₂)_nOCO, (CH₂)_nNHCO, (CH₂)_nCO, где n - целое число от 1 до 10; F - концевая группа, выбираемая из группы, состоящей из: гидроксила, карбоксила, эфирной группы, ацилхлорида, гидразида, малеинида, пиридиндисульфида и .

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что Y-образный разветвленный ПЭГ имеет следующую формулу (II):

где каждый из R и R′ является низкомолекулярным алкилом, предпочтительно алкилом C₁-C₄, наиболее предпочтительно метилом; m и m′ обозначают степень полимеризации и могут быть любым целым числом; m+m′ предпочтительно от 600-1500, наиболее предпочтительно 910.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что Y-образный разветвленный ПЭГ имеет следующую формулу (III):

причем средняя совокупная молекулярная масса Y-образного разветвленного ПЭГ предпочтительно составляет приблизительно от 26 кД до 60 кД, предпочтительно 40 кД, наиболее предпочтительно Y-образный разветвленный ПЭГ является равноплечим.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что двухцепочечным ПЭГ является U-образный разветвленный ПЭГ следующей формулы (IV):

где каждый из R и R′ является низкомолекулярным алкилом, предпочтительно алкилом С₁-С₄; n и n′ обозначают степень полимеризации и могут быть любым целым числом; n+n′ от 600 до 1500, наиболее предпочтительно 910; средняя молекулярная масса U-образного разветвленного ПЭГ составляет приблизительно от 26 кД до 66 кД, предпочтительно около 40 кД, наиболее предпочтительно U-образный разветвленный ПЭГ является равноплечим.

6. Способ получения полиэтиленгликолированного (пегилированного) гормона роста по п.4, отличающийся тем, что включает следующие этапы: а) в растворе с рН 9,0 или 10,5 введение двухцепочечного ПЭГ следующей формулы (III)

где каждый из R и R' является низкомолекулярным алкилом, предпочтительно алкилом C₁-C₄; m+m′=910, средняя совокупная молекулярная масса двухцепочечного ПЭГ составляет приблизительно 40 кД; j - целое число от 1 до 12,
в контакт с гормоном роста человека, причем молярное отношение гормона роста к двухцепочечному ПЭГ составляет приблизительно 1:2;
b) анализ продукта, модифицированного двухцепочечным ПЭГ в одном сайте, полученного на этапе а), в 12% SDS-PAGE в невосстанавливающих условиях, причем пегилированный человеческий гормон роста представлен в двух полосах, и большая его часть содержится в полосе, соответствующей более низкой кажущейся молекулярной массе, и продукт имеет в основном одну полосу более низкой кажущейся молекулярной массы;
c) отделение и извлечение продукта с более низкой кажущейся молекулярной массой, модифицированного двухцепочечным ПЭГ в одном сайте, с использованием гель-хроматографии, выбираемой из хроматографии на Q Sepharose FF, хроматографии на DEAE Sepharose FF или хроматографии MacroCap SP.

7. Пегилированный человеческий гормон роста, имеющий более низкую кажущуюся молекулярную массу и подготовленный согласно способу по любому одному из пп.1-6, причем человеческий гормон роста является извлеченным натурального источника или полученным по рекомбинантной биотехнологии и предпочтительно имеет последовательность SEQ ID NO:1.

8. Пегилированный человеческий гормон роста по п.7, отличающийся тем, что его молекулярная масса составляет 62 кД, который имеет следующую формулу (VII):

где каждый из R и R′ является низкомолекулярным алкилом, предпочтительно алкилом C₁-C₄, наиболее предпочтительно метилом; m+m′=910; j - целое число от 1 до 12.

9. Пегилированный человеческий гормон роста по п.7 или 8, отличающийся тем, что гормон роста синтезирован искусственно или экспрессирован системой экспрессии, выбираемой из группы, состоящей из: прокариотической системы, такой как E.coli.; эукариотической системы, такой как Pichia; системы клетки насекомого и системы клетки млекопитающего, такой как СНО cell.

10. Способ получения препарата пегилированного гормона роста, включающий следующие этапы:
a) в растворе с рН не ниже 8,0, предпочтительно не ниже 9,0, предпочтительно не ниже 9,5, предпочтительно не ниже 10,0, наиболее предпочтительно с рН 10,5, введение U-образного или Y-образного разветвленного двухцепочечного ПЭГ в контакт с гормоном роста человека, причем молярное отношение гормона роста к двухцепочечному ПЭГ предпочтительно составляет приблизительно 1:2;
b) анализ продукта, модифицированного двухцепочечным ПЭГ в одном сайте, полученного на этапе а), в SDS-PAGE подходящей концентрации, предпочтительно 12% SDS-PAGE, причем продукт показывает две полосы;
c) отделение и извлечение продукта, модифицированного двухцепочечным ПЭГ в одном сайте;
отличающийся тем, что извлекают продукт, который является смесью, содержащей главным образом продукт, модифицированный двухцепочечным ПЭГ в одном сайте, с более низкой кажущейся молекулярной массой,
по выбору, включающий этап очистки предпочтительно с использованием гель-хроматографии, такой как хроматографии на Q Sepharose FF, хроматографии на DEAE Sepharose FF или хроматографии MacroCap SP.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что двухцепочечным ПЭГ является Y-образный разветвленный ПЭГ, имеющий следующую структурную формулу (I):

где каждый из Р_а и P_b тот же или разный ПЭГ; j - целое число от 1-12; R_i - Н, замещенный или незамещенный алкил С_1-12, замещенный арил, аралкил или гетероалкил; каждый из X₁ и Х₂ является связывающей группой, причем X₁ - (CH₂)_n, X₂ выбирают из группы, состоящей из: (СН₂)_n, (CH₂)_nOCO, (CH₂)_nNHCO, (CH₂)_nCO, где n - целое число от 1 до 10; F - концевая группа, выбираемая из группы, состоящей из: гидроксила, карбоксила, эфирной группы, ацилхлорида, гидразида, малеинида, пиридиндисульфида и

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что Y-образный разветвленный ПЭГ имеет следующую структурную формулу (II):

где каждый из R и R′ является низкомолекулярным алкилом, предпочтительно алкилом С₁-С₄, наиболее предпочтительно метилом; m и m′ обозначают степень полимеризации и могут быть любым целым числом; m+m′ предпочтительно от 600 до 1500, наиболее предпочтительно 910.

13. Способ по п.12, отличающийся тем, что Y-образный разветвленный ПЭГ имеет следующую структурную формулу (III):

причем средняя совокупная молекулярная масса Y-образного разветвленного ПЭГ предпочтительно составляет приблизительно от 26 кД до 60 кД, предпочтительно 40 кД, наиболее предпочтительно Y-образный разветвленный ПЭГ является равноплечим.

14. Способ по п.10, отличающийся тем, что двухцепочечным ПЭГ является U-образный разветвленный ПЭГ, имеющий следующую структурную формулу (IV):

где каждый из R и R′ является низкомолекулярным алкилом, предпочтительно алкилом C₁-C₄; n и n′ обозначают степень полимеризации и могут быть любым целым числом; n+n′ от 600 до 1500, наиболее предпочтительно 910; средняя молекулярная масса U-образного разветвленного ПЭГ составляет приблизительно от 26 кД до 66 кД,
наиболее предпочтительно около 40 кД, наиболее предпочтительно U-образный разветвленный ПЭГ является равноплечим.

15. Способ получения препарата пегилированного человеческого гормона роста по п.13, отличающийся тем, что включает следующие этапы:
а) в растворе с рН 9,0 или 10,5 введение двухцепочечного ПЭГ, имеющего структурную формулу (III),

где m+m′=910, средняя совокупная молекулярная масса двухцепочечного ПЭГ составляет приблизительно 40 кД; j - целое число от 1 до 12, в контакт с гормоном роста человека, причем молярное отношение гормона роста к двухцепочечному ПЭГ составляет приблизительно 1:2;
b) анализ продукта, модифицированного двухцепочечным ПЭГ в одном сайте, полученного на этапе а), в 12% SDS-PAGE в невосстанавливающих условиях, причем пегилированный человеческий гормон роста представлен в двух полосах, и большая его часть содержится в полосе, соответствующей более низкой кажущейся молекулярной массе;
c) отделение и извлечение продукта, модифицированного двухцепочечным ПЭГ в одном сайте, с использованием гель-хроматографии, выбираемой из хроматографии на Q Sepharose FF, хроматографии на DEAE Sepharose FF или хроматографии MacroCap SP.

16. Препарат пегилированного человеческого гормона роста, приготовленный согласно способу по любому одному из пп.10-15, причем гормон роста является извлеченным из натурального источника или полученным по рекомбинантной технологии и предпочтительно имеет последовательность SEQ ID NO:1.

17. Препарат пегилированного человеческого гормона роста по п.16, отличающийся тем, что продукт, модифицированный двухцепочечным ПЭГ в одном сайте, имеет следующую формулу (VII):

где каждый из R и R′ является низкомолекулярным алкилом, предпочтительно алкилом C₁-C₄, наиболее предпочтительно метилом; m+m′=910; j - целое число от 1 до 12, причем содержание SDS-PAGE продукта с более низкой кажущейся молекулярной массой, модифицированного двухцепочечным ПЭГ в одном сайте, в препарате пегилированного гормона не ниже 70%, предпочтительно не ниже 80%, наиболее предпочтительно не ниже 90%.

18. Препарат пегилированного человеческого гормона роста по п.16 или 17, отличающийся тем, что гормон роста синтезирован искусственно или экспрессирован системой экспрессии, выбираемой из группы, состоящей из: прокариотической системы, такой как E.coli.; эукариотической системы, такой как Pichia; системы клетки насекомого и системы клетки млекопитающего, такой как СНО cell.

19. Применение человеческого пегилированного гормона роста по любому одному из пп.7-9 или препарата пегилированного человеческого гормона роста по любому одному из пп.16-18 в производстве медикамента для лечения заболевания, нуждающегося в лечении гормоном роста, или для лечения против старения, причем заболевание, нуждающееся в лечении гормоном роста, предпочтительно выбирают из группы, состоящей из низкорослости, ожога, раны, перелома кости, кровоточащей язвы, почечной недостаточности, СПИД, низкорослости в связи с дефицитом эндогенного гормона роста, синдрома Тернера, анаболического нарушения и дефицита гормона роста у взрослых людей.