Способ репликации вируса гриппа в культуре

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Предложен способ выбора человеческого вируса гриппа для выращивания на клетках культуры ткани клонированием методом серийных разведений. Способ предусматривает: разведение вируса гриппа, смешивание его с трипсином, контактирование с клетками культуры тканей, выращивание вируса, его сбор. Данные стадии проводят 2-3 раза. Предложенный способ позволяет культивировать вирус гриппа на клеточных культурах. Также описан способ получения вакцины против вируса гриппа человека с использованием такого способа выбора вируса гриппа. 3 н. и 13 з.п. ф-лы, 2 ил., 5 табл., 11 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По данной заявке испрашивается приоритет к заявке США №60/875287, поданной 15 декабря 2006, и заявке США №60/882412, поданной 28 декабря 2006, обе из которых включены здесь в качестве ссылок.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Эпидемии и пандемии гриппа выявляются в течение нескольких веков и привели к значительным потерям. Вирус гриппа представляет собой сегментированный РНК-содержащий вирус, принадлежащий к семейству Orthomyxoviridae. Эпидемии и пандемии вызываются присутствием вирусов с новыми компонентами оболочек, иммунитет к которым у населения очень низкий. Эти новые компоненты часто являются результатом мутации и/или смешивания вирусов гриппа человека и животных.

В то время как капсид вируса гриппа некоторым образом является плеоморфным, внешняя поверхность является единообразной для всех вирусов и состоит из липидной оболочки, из которой выходят выступающие гликопротеиновые выступы двух типов: гемагглютинин (НА или Н) и нейраминидаза (NA или N). Существует три типа вирусов гриппа: A, B и C. Только вирусы гриппа А далее классифицированы по подтипам на основе двух основных поверхностных гликопротеинов НА и NA. Подтипы гриппа А далее классифицированы штаммами. Вирусы гриппа В поражают только млекопитающих и вызывают заболевания у человека, но обычно являются не такими тяжелыми, как типы А. Вирусы гриппа С также поражают млекопитающих, но вызывают только умеренное респираторное расстройство у детей. Они генетически и морфологически отличаются от типов А и В.

Вирусы гриппа А поражают множество видов животных, включая млекопитающих, например человека, лошадей, собак, свиней, хорьков, и птицу, например уток, кур и индеек. Существует 16 известных серотипов НА и 9 известных серотипов NA. Птицы являются особенно важными носителями, образуя множество генетически/антигенетически различных вирусов, которые переносятся обратно человеку через тесный контакт человека и животными. Свиньи являются пермиссивными для человеческих и птичьих штаммов. Благодаря этой необычной черте, свиньи считаются «смесительными сосудами», позволяющими генетический обмен между птичьими и человеческими вирусами, когда одни и те же клетки инфицированы обоими типами вируса.

Геном вируса гриппа состоит из одноцепочечной антисмысловой РНК в 8 сегментах (7 в гриппе С). Структура генома известна очень подробно благодаря огромному количеству генетических исследований (обычных и молекулярных), которые были проведены. Каждый сегмент кодирует один или два вирусных белка. Считается, что эпидемии и пандемии возникают из-за генетического изменения в НА и NA белках вируса гриппа двумя различными путями: антигенный дрейф и антигенная изменчивость. Антигенный дрейф возникает постоянно, в то время как антигенная изменчивость возникает только случайно. Вирусы гриппа типа А претерпевают оба вида изменений; вирусы гриппа В изменяются только более постепенным процессом антигенного дрейфа.

Антигенный дрейф относится к небольшим, постепенным изменениям, которые возникают через точечные мутации в двух генах, которые составляют генетический материал, с получением основных поверхностных белков, НА и NA. Антигенная изменчивость относится к внезапным основным изменениям с получением нового подтипа вируса гриппа А у человека, который в данный момент не распространен среди людей. Антигенная изменчивость может возникать либо через прямую передачу животное (птица)-человек или через смешивание генов вируса гриппа А человека и вируса гриппа А животного с получением нового подтипа вируса гриппа А человека через процесс, называемый рекомбинация. Антигенная изменчивость дает новый подтип вируса гриппа человека. Генетическая рекомбинация возникает, когда два различных вируса гриппа заражают одну и ту же клетку и разделяют или обменивают один или более сегментов РНК. Если переносимым сегментом является НА, например, это может дать возникновение нового вирусного штамма, который является антигенно новым при попадании в популяцию, имеющую слабый или не имеющую иммунитет. Результатом может быть эпидемия и/или пандемия.

Попадание вирусов гриппа в клетки способствует связыванию выступов НА с микропротеинами, содержащими концевые группы N-ацетилнейраминовой кислоты (NANA = сиаловой кислоты). После связывания частицы поглощаются эндоцитозом через окаймленные ямки в эндоцитные везикулы и, наконец, эндосомы. Они окисляются клеткой и при рН около 5,0 НА мономеры расщепляются трипсиноподобными ферментами в эндосоме для активации их для интернализации. После интернализации возникает репликация вируса и вызывает симптомы гриппа.

Существует значительный интерес к недавним вспышкам гриппа. Тяжелый тип респираторного заболевания был идентифицирован у собак, который возникает из-за вируса гриппа собаки (ВГС). Было доказано, что это респираторное заболевание является высоко заразным. Более того, ВГС может вызывать 100% заражение с 80% смертностью, и вплоть до 5-8% смертности среди тяжелых инфекций. С тех пор, как в первый раз его выявили в 2004 у собак породы грейхаунд (Crawford et al., Science 310(5747): 482-485 (2005)) ВГС быстро распространился по Соединенным Штатам, где, по крайней мере, в 25 штатах были отмечены вспышки ВГС, и в двадцати семя штатах было отмечено превалирование серотипа ВГС.

Серотип ВГС, вызвавший недавнюю вспышку, был H3N8. Этот серотип ВГС изначально был обнаружен у лошадей, и полагают, что он преодолел видовой барьер в собак. Вероятно, что отсутствие эффективной вакцины против вируса гриппа собаки сыграло основную роль в быстром и обширном распространении у собак этого вируса.

Вирус гриппа A (H5N1, птичий грипп), также называемый "вирус H5N1", является подтипом вируса гриппа А, который возникает в основном у птиц, и может быть смертельным для них. Вирус H5N1 обычно не поражает людей, но инфекции с присутствием этого вируса возникали у человека. До настоящего времени более 200 подтвержденных случаев у человека, вызвавшие около 150 смертей, были описаны в 10 странах, в основном в Азии. К счастью, пока еще вирус нелегко передается от птицы к человеку и от одного человека к другому. Однако это может случиться, что приведет к эпидемии или пандемии. Наилучшей стратегией профилактики смертности, связанной с эпидемией или пандемией, является вакцинация.

Вакцины гриппа в настоящее время вводят людям в случае высокого соотношения польза-риск в смысле профилактики госпитализации и смерти, однако мировая ежегодная мощность производства сезонной вакцины ограничена и не реалистично снижает глобальный высокий риск для населения. Современные вакцины получены в яйцах с применением вируса, полученного от Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) или Центров контроля за заболеваемостью (ЦКЗ), которые предоставляют исходные вакцинные вирусы для производства вакцин каждый год. Изменения в НА распространенных вирусов (антигенный дрейф) требуют периодической замены штаммов вакцин во время интерпандемических периодов. ВОЗ опубликовала полугодовые рекомендации для штаммов, включенных для Северного и Южного полушарий. Для того чтобы было достаточное время для производства, ВОЗ определяет в феврале, какие штаммы вакцин должны быть включены в вакцины следующей зимы. В общем, 1 доза для взрослого содержит эквивалент 45 мкг НА (15 мкг каждого для 3 вирусов). Эта доза приблизительно равна количеству очищенного вируса, полученного из аллантоисной жидкости зараженных оплодотворенных яиц. Если получают 100 миллионов доз вакцин из убитого вируса гриппа, производитель должен произвести 100 миллионов оплодотворенных яиц. Это ставит производство вакцины в зависимость от временной доступности оплодотворенных яиц хорошего качества и штаммов исходных вакцинных вирусов от ВОЗ/ЦКЗ. Большинство прототипов исходных штаммов нелегко вырастить до высокого титра даже в оплодотворенных яйцах. Для преодоления этой проблемы правительственные агентства, прежде всего, создают высокорезультативные лабораторные штаммы через классическую рекомбинацию высокорезультативного лабораторного штамма A/PR/8/34 (в 6:2 рекомбинации получая 6 сегментов из A/PR/8/34 штамма). К сожалению, этот процесс может быть трудным в исполнении и может влиять на антигенность полученной вакцины. Поэтому существует необходимость в получении альтернативных способов производства вакцин, которые защищают от клинических заболеваний, вызванных гриппом, особенно высоко патогенными штаммами, такими как H5N1. Более того, остается необходимость в получении способов производства больших количеств жизнеобеспечивающих вакцин гриппа в достаточно короткий период времени для эффективной профилактики возможных эпидемий и/или пандемий. Данное изобретение отвечает этой и другим потребностям.

Цитирование любой ссылки не должно пониматься как признание, что данная ссылка является «известным уровнем техники» для данной заявки.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к вакцинам для профилактики заражения гриппом А и В. Вакцины и относящиеся к ним способы в соответствии с данным изобретением предоставляют множество преимуществ по отношению к вакцинам и способам известного уровня техники. Например, вакцины в соответствии с данным изобретением получают с применением клеток культуры ткани вместо оплодотворенных яиц. Способы производства в соответствии с данным изобретением выдерживают критическое время благодаря обходу классического метода производства вакцины. Кроме того, вакцины в соответствии с данным изобретением применяются у тех, кто страдает аллергией на компоненты яиц. В данном изобретении также представлены новые иммуногенные композиции, которые могут применяться в качестве вакцин. Эти новые композиции могут применяться для иммунизации животных, включая птиц, против вируса гриппа. В конкретных вариантах данного изобретения пациентом для вакцинации является млекопитающее. В одном аспекте в данном изобретении представлена вакцина, которая защищает собак от респираторных заболеваний у собак вследствие заражения вирусом гриппа у собак (ВГС). В другом аспекте в данном изобретении представлена вакцина, которая защищает человека от штаммов вируса гриппа, полученных естественным путем через генетическую рекомбинацию.

В данном изобретении представлены штаммы вируса гриппа, которые были специально адаптированы для выращивания в клетках культуры ткани. В конкретном варианте адаптированные штаммы вируса гриппа выбирают по их способности расти в выбранной колонии клеток культуры ткани с применением клонирования методом серийных разведении. В одном конкретном варианте субпопуляцию вируса гриппа, адаптированного для выращивания в колонии культивированных клеток, выделяют серийным разведением во множестве аликвот, количестве вируса гриппа, которое включает множество субпопуляций гриппа. Затем множество аликвот подвергают контакту с и/или выращивают в колонии культивированных клеток. Субпопуляцию вируса гриппа во множестве субпопуляций гриппа идентифицируют как ту, которая растет в культивированных клетках при низкой множественности заражения (МЗ) и выбирают как субпопуляцию вируса гриппа, которая адаптирована для роста в колонии культивированных клеток. В родственных вариантах данное изобретение представляет способы, которые включают контакт адаптированного к культуре клеток штамма с клетками культуры ткани, выращивание в течение времени, достаточного для получения цитопатического эффекта (ЦПЭ). Этот способ также может включать сбор вируса гриппа. В некоторых подобных вариантах клонирование методом серийных разведении включает серийное разведение штамма вируса гриппа и контакт каждого разведения с культивированными клетками, выращивание клеток в течение времени, достаточного для получения цитопатического эффекта (ЦПЭ), сбор вируса из наивысшего разведения, которое вызывает ЦПЭ, и повтор процесса с собранным вирусом. В некоторых вариантах способ также включает смешивание штамма вируса гриппа с эффективным количеством трипсина до контакта с культивированными клетками. В некоторых вариантах смеси инкубируют в течение времени, достаточного для расщепления трипсином вирусных белков, без отделения клеток от субстрата. Трипсин, применяемый для расщепления вирусных белков, может быть трипсином IX типа. В некоторых случаях стадию контакта штамма, адаптированного к культуре клеток, с клетками культуры ткани проводят при множественности заражения (МЗ) менее около 0,01, включая менее около 0,001 и/или менее около 0,0001. В других случаях штамм вируса гриппа сначала тестируют на клетках культуры ткани для определения оптимальной МЗ. Клетки культуры ткани могут быть клетками мезонефроса человека, такими как клетки мезонефроса человека. Вирусом гриппа может быть вирус гриппа А, В или С. В одном конкретном варианте вирусом гриппа А является штамм H5N1. Штамм вируса гриппа может быть получен из любого количества источников, включая мазки из носа, ткань легких, и/или может быть получен от третьей стороны, например ВОЗ. В некоторых вариантах, штамм вируса гриппа изначально выращивают в оплодотворенных яйцах для получения большого инокулята для адаптации к культуре ткани. Некоторые способы включают очистку собранного вируса. В одном таком способе стадию очистки проводят с применением гель-хроматографии. Способы в соответствии с данным изобретением также могут включать смешивание второго штамма вируса гриппа и первым штаммом до, во время или после очистки, так чтобы второй штамм отличался от первого штамма. В некоторых способах анализ титрования дозы проводят до смешивания двух штаммов вируса для определения смеси, которая позволит равную иммуногенность вирусных белков. В некоторых способах грипп активирован. В некоторых вариантах этого типа, вирус гриппа обрабатывают количеством бинарного этиленимина, эффективного для его активации. В некоторых способах сбор проводят, когда содержание белка гемагглютинина является максимальным.

Другие варианты включают вакцину, полученную сбором штамма вируса, полученного способом выбора вируса гриппа для выращивания в клетках культуры ткани через титрование штамма вируса гриппа с применением клонирования методом серийных разведений таким образом, что выбирают штамм вируса гриппа, адаптированный к клеткам культуры ткани. В некоторых вариантах вирус получают инокуляцией оплодотворенных, не содержащих конкретного патогена, куриных яиц через инокуляцию в хориоаллантоисную (также называемой аллантоисной полостью) или амниотическую оболочку до клонирования методом серийных разведении. В одном варианте вирус гриппа реплицируют сначала инокуляцией через амниотическую оболочку оплодотворенных яиц с получением инокулята для адаптации к клеткам культуры ткани.

Кроме того, в данном изобретении представлены способы выбора вируса гриппа для выращивания в клетках мезонефроса человека. В одном из таких способов штамм вируса гриппа титруют с применением клонирования методом серийных разведений так, чтобы выбрать штамм вируса гриппа, который адаптирован к клеткам НЕК. Этот способ может включать контакт штамма, адаптированного к НЕК с клетками НЕК, и выращивание клеток в течение времени, достаточного для получения цитопатического эффекта (ЦПЭ). В конкретном варианте этого типа полученный вирус гриппа собирают. В данном изобретении также представлена вакцина, которая включает штамм вируса гриппа, полученный этими способами. Способ также может включать смешивание штамма вируса гриппа с эффективным количеством трипсина IX типа до контакта с культивированными клетками, в течение времени, достаточного для того, чтобы трипсин расщепил вирусные белки, без отсоединения клеток от субстрата. В одном варианте стадия контакта адаптированного к НЕК штамма с клетками НЕК проводят при МЗ менее около 0,001.

В некоторых вариантах в данном изобретении также представлены вакцины, содержащие вирус гриппа человека в количестве менее 4 мкг НА человеческого гриппа на дозу. В родственном варианте в данном изобретении представлены вакцины, содержащие вирус гриппа человека в количестве менее 3 мкг НА человеческого гриппа на дозу. В другом варианте в данном изобретении представлены вакцины, содержащие вирус гриппа человека в количестве менее 2 мкг НА человеческого гриппа на дозу. В еще одном варианте в данном изобретении представлены вакцины, содержащие вирус гриппа человека в количестве 1,5-3,5 мкг НА человеческого гриппа на дозу. В особенно предпочтительном варианте вакцины адъювантом является ISCOM. В других вариантах вакцины, по крайней мере, 70% вирусов содержат НА, который имеет одинаковую последовательность аминокислот. В еще одном варианте вакцин, по крайней мере, 80% вирусов содержат НА, который имеет одинаковую последовательность аминокислот. В еще одном варианте вакцины, по крайней мере, 90% вирусов содержат НА, который имеет одинаковую последовательность аминокислот. В еще одном варианте вакцин более 95% вирусов содержат НА, который имеет одинаковую последовательность аминокислот.

В данном изобретении также представлены комбинированные вакцины для усиления защитного иммунитета против вируса гриппа, например вируса гриппа собаки (ВГС), и других заболеваний, например других инфекционных заболеваний собак. В данном изобретении также представлен способ иммунизации млекопитающих, например собак, кошек или лошадей, от гриппа. Также представлены способы получения и применения вакцин для инфекционных заболеваний, например инфекционных заболеваний собак.

В конкретном варианте иммуногенная композиция в соответствии с данным изобретением содержит иммуногенную композицию, содержащую неактивированный ВГС H3N8 и адъювант. Обычно адъювант включает эмульсию масло в воде. В одном таком варианте адъювант также содержит гидроксид алюминия. В конкретном варианте этого типа адъювантом является Emunade®. В другом варианте иммуногенной композицией является вакцина.

Композиция вакцины может включать от около 100 единиц гемагглютинации (ЕГА) до около 1500 ЕГА на дозу. Это может широко варьироваться в зависимости от размера и других параметров состояния здоровья пациента, получающего лечение. Композиция обычно содержит от 250 до 750 ЕГА на дозу. В одном варианте композиция вакцины содержит около 500 ЕГА на дозу.

Необязательно, вакцины в соответствии с данным изобретением также могут включать фармацевтически приемлемый иммуностимулятор, например цитокины, факторы роста, хемокины, надосадочные жидкости из культур клеток лимфоцитов, моноцитов или клеток из лимфоидных органов, клеточных препаратов и/или экстрактов из растений, бактерий или паразитов, или мутогенов.

Вакцины в соответствии с данным изобретением могут вводиться таким путем, как: парентеральное введение, внутримышечная инъекция, подкожная инъекция, внутрибрюшинная инъекция, чрескожная инъекция, пероральное введение, интраназальное введение, скарификация или их сочетание. В предпочтительном варианте вакцины вводят внутримышечной инъекцией.

В изобретении также представлена сыворотка, полученная от вакцинированных животных, которая содержит антитела, которые связываются с ВГС H3N8 и самими очищенными антителами. В конкретном варианте данного изобретения очищенное антитело, которое связывается с ВГС H3N8, является химерным антителом.

В данном изобретении также представлено сочетание вакцин, которые включают один или более штаммов инактивированного ВГС, например ВГС H3N8, в сочетании с одним или более патогенами и/или иммуногенами собак, включая, например, иммуногены для вызова иммунитета к вирусу чумки собак; аденовирусу собак; аденовирусу 2 типа у собак; парвовирусу собак; вирусу парагриппа собак; коронавирусу собак; вирусу гриппа собак; и/или сероваров Leptospira kirschneri, например гриппотифозный серовар Leptospira interrogans, лептоспирозный серовар Leptospira interrogans, иктерогеморрагический серовар Leptospira interrogans, и/или серовар Помона Leptospira interrogans. Дополнительные патогены собак, которые могут быть добавлены в комбинированную вакцину в соответствии с данным изобретением, включают Bordetella bronchiseptica; организмы Leishmania, такие как Leishmania major и Leishmania infantum; виды Borrelia (spp.) спирохет, включая B. burgdorferi в буквальном смысле (ss), B. burgdorferi, B. garinii и B. afzelii; виды Mycoplasma (например, Mycoplasma); вирус бешенства; и Ehrlichia canis.

В данном изобретении представлены способы выращивания ВГС H3N8 в культивированных клетках. В некоторых вариантах культивированными клетками являются клетки почек не собачьих млекопитающих. В одном варианте клетками являются клетки почек коров Madin-Darby (MDBK). В другом варианте клетками являются клетки Vero.

В некоторых вариантах в данном изобретении также представлены вакцины, содержащие ВГС H3N8 в количестве, по крайней мере, 500 ЕГА на дозу. В этих вариантах адъювантом обычно является гидроксид алюминия, и, по крайней мере, 70%, обычно, по крайней мере, 90% НА имеют одинаковую последовательность аминокислот. В других вариантах вакцины, по крайней мере, 80% вирусов содержат НА, который имеет одинаковую последовательность аминокислот. В других вариантах вакцины более 95% вирусов содержат НА, который имеет одинаковую последовательность аминокислот.

Эти и другие аспекты данного изобретения будут более понятны из представленных ниже фигур и подробного описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фигуре 1 показаны средние значения клинической оценки после заражения ВГС у собак. Невакцинированную контрольную группу и вакцинированных собак заражают ВГС и отслеживают ежедневно с -2 дня до 10 дней после заражения для определения клинических признаков, таких как выделения из носа, чихание, кашель, депрессия и затруднение дыхания. Клинические признаки оценивают по инструкции, описанной в примере 1, и среднюю клиническую оценку для каждой леченной группы наносят как функцию от дней.

На фигуре 2 показано распространение назального ВГС у собак после контрольного заражения. Невакцинированную контрольную группу и вакцинированных собак заражают ВГС. Мазки из носа получают за день до заражения (день -1) для подтверждения отсутствия ВГС у собак. Распространение назального вируса отслеживают у зараженных собак сбором мазков из носа ежедневно в течение 10 дней (день 1-10 после заражения) и проведением титрования на монослоях MDCK. Средние значения титра вируса для каждой леченной группы, выраженные как Log₁₀ TCID₅₀/мл, рассчитывают и наносят как функцию от дней после заражения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Традиционные способы получения вакцин гриппа включают выращивание выделенного штамма в оплодотворенных куриных яйцах, по крайней мере, частично, так как применение яиц является дешевым и эффективным, и так как не существует очевидной альтернативы для выращивания гриппа в больших количествах. Это относится особенно к человеческому гриппу, так как многие колонии клеток, которые могут применяться для репродуцирования вируса гриппа, не были одобрены FDA для производства вакцин для человека и только очень низкие титры были получены в культуре ткани.

Когда вакцину получают в яйцах, это обычно делают следующим образом. Сначала вирус выделяют из мазка из зева или подобного источника и выделяют в яйцах. Исходное выделение в яйцах является трудным, но вирус адаптируется к яйцу и дальнейшее репродуцирование проходит относительно легко. После выращивания в яйце, вирус очищают и инактивируют формалином или бета-пропиолактоном. Все больше фактов говорят о том, что яйцо не является оптимальным для репродуцирования вируса. Например, обычные стада несушек, которые дают яйца для производства, также имеют высокий риск примешивания к препарату вируса эндогенных вирусов, обычно находящихся у таких источников. Также отдельная инокуляция и сбор миллионов яиц, а также усложненная последующая обработка дают огромные возможности для попадания природных примесей в препараты вируса и, похоже, являются причиной отзыва вакцины в 2004. Как указано выше, трудно полностью удалить яичный материал, и это может вызвать чувствительность к вакцине. Кроме того, процесс является абсолютно не гибким при неожиданном увеличении потребности в вакцине, из-за проблемы осуществления поставок из-за недоступности больших количеств подходящих яиц. Также существуют доказательства, что выращивание в яйцах может понизить антигенность вируса. Следовательно, выращивание вирусов гриппа А или В в яйцах дает гетерогенный вирусный продукт, который имеет ряд НА мутаций. Наоборот, соответствующее выращивание в клетках млекопитающего хозяина дает вирусы гриппа, которые структурно идентичны тем, которые первоначально выделены (Rocha, et al. J. Gen. Virol 1993:74:2513-2518). Более того, вирусы гриппа, выращенные в клетках млекопитающих, вызывают нейтрализацию и антитела, ингибирующие НА, в человеческой сыворотке более легко и с большим титром, чем выращенные в яйцах (Oxford, et al. Bull WHO 1987; 65: 181-187).

К сожалению, ввиду того, что все штаммы вируса гриппа выращивают в яйцах, многие из них не растут хорошо в клетках культуры тканей, а те, которые растут в клетках культуры ткани, не растут с количествах, необходимых для получения эффективной вакцины. Авторы данного изобретения обнаружили, что если вирус гриппа выращивать в культуре ткани с применением клонирования методом серийных разведении, могут быть получены штаммы, которые адаптированы к культуре ткани. Неожиданно авторы данного изобретения обнаружили, что репликация вируса, получаемая при инокуляции через амниотическую оболочку оплодотворенных яиц, дает популяцию вируса, которая может реплицировать и производить высокие уровни НА при репродуцировании на клетках культуры ткани (например, клетках Vero). Полученный вирусный штамм вырабатывает НА титр, который практически идентичен тому, который получают с применением оплодотворенных яиц, и НА титр является одним из важных показателей мощности вакцины. Поэтому один из важных объектов данного изобретения связан со способами получения вирусных штаммов вируса гриппа, которые адаптированы к культуре ткани и подходят для применения в производстве вакцин от гриппа, особенно вакцин для человека. Способы включают применение клонирования методом серийных разведений для выделения и идентификации адаптированных к культуре ткани вирусов. Полученный штамм может быть обработан с получением вакцины. Таким образом, данное изобретение также относится к способам получения улучшенных вакцин от вируса гриппа.

Наконец, представлены способы выбора адаптированного к культуре ткани вируса гриппа титрованием вируса с применением клонирования методом серийных разведении, повторяя этот процесс 2 или более раз. В некоторых способах применяемой культурой клеток являются НЕК клетки. Трипсин или эквивалентная протеаза могут применяться для увеличения эффективности внедрения вируса в клетку. Другие способы включают титрование трипсина для идентификации наилучшей концентрации для применяемого трипсина и для применяемых клеток. Идентификация наибольшей множественности заражения (МЗ) для каждого применяемого вируса гриппа и для конкретных клеток также способствует успешной репродукции в культуре ткани. Выделенный адаптированный к культуре ткани вирус может применяться для получения вакцины стандартными способами. В некоторых вариантах вакцины включают применение адъюванта ISCOM. В некоторых вариантах вакцины включают применение адъюванта гидроксида алюминия. Если в вакцину включено более одного вирусного штамма или изолята, способы могут включать смешивание двух в иммунологически равных количествах. Способы и композиции представлены здесь для адаптированных к культуре ткани вирусных штаммов и для полученных из них вакцин.

I. Способы выбора вируса, адаптированного к культуре ткани

Источник вируса, применяемого в способах в соответствии с данным изобретением, не является критическим для данного изобретения. Например, вирус может быть получен выделением из инфицированного животного или пациента, в виде исходных вакцинных вирусов от ВОЗ, покупкой у подходящего агентства (например, АТСС) или от исследовательских лабораторий. В частности, известно, что ВГС вызывает тяжелое респираторное заболевание, включая пневмонию. Таким образом, собаки, имеющие эти симптомы, являются полезными источниками. Подходящие образцы для выделения вируса включают: промывку/аспират из носа, носоглоточный мазок, мазок из горла, бронхоальвеолярный лаваж, аспират из трахеи, пункцию плевральной жидкости, слюну, мазки из клоаки и образцы аутопсии. Образцы от живых животных оптимально должны быть собраны рано, и в некоторых случаях в течение 4 дней после наступления болезни. Образцы могут быть собраны в подходящую транспортную среду для хранения до применения, или применяться немедленно. Если их хранят, вирус может храниться при пониженной температуре, например, такой как 4°С, для сохранения жизнеспособности. Для выделения вируса гриппа из образца, необходимо удалить большое количество примесей (например, центрифугированием), и надосадочную жидкость инокулируют во множество клеток при множестве разведении. Альтернативно, вирус от животного изначально может быть выращен в куриных яйцах. В любой момент процесса могут применяться способы подтверждения того, что вирусный штамм действительно является гриппом.

Для подтверждения присутствия желаемого вируса гриппа в любой момент времени в процессе получения адаптированного к культуре ткани штамма, может применяться множество способов скрининга. Вирус может быть отобран анализом с применением любого известного и/или подходящего анализа для вируса гриппа. Такие анализы включают (отдельно или в сочетании) репликацию вируса, количественное и/или качественное измерение инактивации (например, антисывороткой), транскрипцию, репликацию, введение вириона, вирулентность, НА или NA активность, выход вируса и/или морфгенез, с применением таких методов, как обратная генетика, рекомбинация, комплементация и/или инфекция.

А. Клетки культуры тканей

Любые клетки млекопитающих, в которых возможно выращивание вируса гриппа, могут применяться в представленных здесь способах. Обычно клетки хозяина подходящим образом исключают непредусмотренные агенты и имеют количество пассажей, которое может быть сертифицировано согласно требованиям ВОЗ для производства вакцины. Множество колоний клеток может применяться для выделения и репродуцирования вирусов гриппа. Некоторые колонии клеток, которые могут применяться, включают: клетки Vero (клетки почек обезьяны), клетки MDCK (клетки почек собаки Madin-Darby), клетки ВНК-21 (почки детенышей хомяка) и BSC (клетки почек обезьяны) и клетки НЕК (клетки мезонефроса человека). Таким образом, могут применяться любые клетки культуры тканей, которые позволяют выращивать вирус гриппа. Подходящие клетки включают, но не ограничены ими: Vero, MDBK, BK21, CV-I и любые клетки эмбрионов млекопитающих (например НЕК). В некоторых вариантах применяют клетки Vero или клетки мезонефроса человека. В некоторых вариантах применяют клетки мезонефроса человека (клетки НЕК).

Подходящая среда для культуры клеток для репродуцирования указанных выше колоний клеток известна специалистам в данной области техники. Такая среда может содержать подходящую сыворотку (например, фетальную бычью сыворотку) в концентрации вплоть до 20% об./об. Специалисту в данной области техники будет понятно, что среда, содержащая менее 20% об./об. сыворотки (2-5% об./об.), может применяться для репродуцирования указанных выше колоний клеток.

В. Оптимизация трипсина для клеток

Для выращивания высокого титра штамма вируса в культуре клеток, подходящее количество протеазы может применяться для активации гемагглютинина для интернализации в клетки. Раствор, содержащий протеазу, может быть добавлен непосредственно к изоляту, или изолят может быть разведен в протеазе для выращивания изолята для производства вакцины. Протеаза может применяться для разведения вируса до подходящей МЗ для роста.

Протеазой может быть любая протеаза, которая способна активировать НА для интернализации без повреждения вирусных белков так, что они не могут расти и/или заражать клетки. Такие протеазы включают, но не ограничены ими, прокариотическую протеазу, проназу, трипсин и субтилизин (А), например трипсин IX.

Применяемое количество протеазы должно быть достаточным для активации вируса с очень незначительным токсическим воздействием на клетки. Токсическое действие может быть проанализировано через идентифицирующие характеристики повреждения клетки, такие как отслойка от слоя питательной среды или субстрата, присутствие продуктов распада клеток, появление мертвых клеток и отсутствие живых клеток. Таким образом, «эффективное количество трипсина» является таковым, которое, при применении в течение достаточного количества времени, позволяет трипсину расщеплять вирусные белки, не отслаивая клетки от субстрата и не вызывая другие токсические эффекты. Титрование протеазы также может применяться для повышения производства активного вируса в культуре ткани. Титрование включает идентификацию максимального количества трипсина, которое минимально повреждает клетки. Это количество может варьироваться в зависимости от применяемой культуры клеток и от партии протеазы. Поэтому новые партии протеазы могут быть титрованы для установления оптимального уровня перед применением, и каждая протеаза может быть титрована для каждой культуры клеток. Титрование включает инокуляцию клеток культуры ткани с серийными разведениями протеазы, и инкубацию их в течение подходящего количества времени. Например, могут применяться полушаговые разведения (10^-0,5) протеазы. Время инкубации может варьироваться в зависимости от колонии клеток, но обычно могут составлять от около 2 дней до 7 дней. Уровень протеазы может быть определен с применением типового времени инкубации для применяемых клеток. Например, если 4-дневная инкубация является наилучшей для вируса гриппа, протеаза может быть тестирована инкубацией в течение около 4 дней в присутствии только протеазы. Может применяться наименьшее разведение протеазы, которое не является токсичным или является практически нетоксичным для клеток. Интервал концентрации трипсина, который может применяться в клетках культуры тканей млекопитающих, например, клетках Vero, составляет от около 0,5 мкг/мл до около 10 мкг/мл, но более предпочтительно около 2,5 мкг/мл среды.

Как только идентифицирован оптимальный уровень протеазы, вирус может быть разведен в инфекционной среде с подходящим количеством протеазы (например, трипсина) так, что оптимальный уровень достигается, когда вирус добавляют в клеточную среду. Оптимальное количество трипсина может применяться для клонирования методом серийных разведении с получением адаптированного к культуре ткани изолята, а также роста и сбора изолята.

С. Клонирование методом серийных разведений

Типовая культура вируса является гетерогенной. Таким образом, например, отдельные вирусные частицы в лунке титровального микропланшета может варьироваться в зависимости от инфекционности, репликации и подобных. Серийное разведение применяют для выбора субпопуляций вирусов в культуре, субпопуляций, которые наилучшим образом адаптированы к клеткам, например. Серийное разведение включает разведение в вирусной культуре серийно, вплоть до угасания, например, для определения наилучшей МЗ. Обычно оно включает серию 10-кратных разведений, но может варьироваться в зависимости от титра вируса.

Обычно серийное разведение применяют для идентификации наивысшего разведения, которое оказывает вирусный эффект на клетку. Вирусным эффектом может быть цитопатический эффект (ЦПЭ). Цитопатические эффекты включают любое действие на клетки, вызванное инфекцией вируса гриппа. Они включают, но не ограничены ими: закругление клеток, дегенерацию, отторжение, апоптоз, индуцирование реакционноспособных видов кислорода (РВК), гранулирование и последующее фрагментирование клеток, и отслоение клеток от подложки (такой как чашка Петри). Ячейку с наивысшим разведением собирают. Этот собранный вирус затем разводят до затухания и процесс повторяют. Обычно серийные 10-кратные разведения получают в подходящей среде (с или без трипсина) и 0,2 мл каждого разведения добавляют в планшет или лунки титровального микропланшета, содержащего клетки культуры ткани, и инкубируют в течение времени, достаточного для идентификации ЦПЭ клеток. Так как сыворотка инактивирует трипсин, среда обычно не содержит сыворотку. Лунку или планшет, содержащие наивысшее разведение, которое вызывает ЦПЭ, собирают, затем разводят и процесс повторяют. Процесс обычно повторяют, по крайней мере, два раза, но его можно повторять вплоть до 5 раз. В некоторых случаях процесс повторяют 3 раза.

Культуры вируса, полученные способами в соответствии с данным изобретением, характеризуются гомогенностью последовательности НА белков в вирусах. Множество способов сожжет быть использовано для измерения степени гомогенности последовательности. Например, последовательность самих НА белков или секвенирование РНК, кодирующее такие белки. Обычно препараты вирусов, полученные способами в соответствии с данным изобретением, содержат вирусы, в которых, по крайней мере, 70% НА белков имеют одинаковую последовательность аминокислот. В некоторых вариантах 80% или, по крайней мере, 90% НА белков имеют одинаковую последовательность аминокислот.

D. Способы тестирования вируса гриппа

Тесты могут проводиться для подтверждения активности и присутствия вируса гриппа в любой момент процесса для применяемых здесь способов. Например, гемагглютинация может быть идентифицирована следующим образом. Если вирус имеет поверхностный НА белок, он может присоединяться к ККК и агглютинировать их. Если концентрация вируса в образце высока, когда образец смешивают с ККК, может быть образована решетка из вирусов и ККК. Этот феномен называется гемагглютинация. Она является простым путем определения присутствия и титра вирусов, которые гемагглютинируют как вирусы гриппа. Если вируса в образце недостаточно для гемагглютинации ККК, они образуют лепешку на дне лунки. Наивысшее разведение показывает полную гемагглютинацию, принимаемую как конечная точка. Вирусный титр выражают в единицах НА (ЕГА), которые являются обратными к разведению на миллилитр. Например, если в лунке имеется полная гемагглютинация, при 1/32 разведении в 50 мкл, но не в лунке со следующим более высоким разведением, титр вируса имеет 32 ЕГА на 50 мкл или 640 ЕГА на мл.

Другие анализы, которые могут применяться для идентификации и подсчета вируса гриппа, включают идентификацию ЦПЭ (как описано здесь), вестерн-блоттинг, ELISA, ПЦР и другие методы идентификации вируса гриппа с применением антител и/или проб, которые являются специфическими к некоторой части вируса, особенно НА антигену.

II. Способы выращивания и сбора

После получения изолята вируса изолят может быть собран. Могут применяться стандартные методы. Собранный изолят может храниться на будущее или применяться для получения вакцины с применением стандартных методов. Вирус может быть собран при получении максимального количества вируса; при получении максимального количества гемагглютинина, измеренного анализом НА; и/или когда клетки лизированы.

После получения адаптированного к культуре ткани изолята изолят может быть выращен и собран. Способ выращивания и сбора адаптированного к культуре ткани вируса не является критичным для данного изобретения, и могут применяться стандартные методы. Однако в некоторых вариантах лучше адаптировать вирус, выращенный в клетке культуры ткани. Собранный вирусный изолят может храниться на будущее или применяться для производства вакцины с применением стандартных способов. Вирус может быть выращен в подходящих клетках культуры ткани добавлением вируса при подходящей МЗ в подходящем количестве протсазы (например, трипсина) к клеткам в течение времени, достаточного для получения высокого титра вируса и/или до тех пор, пока клетки лизированы. Вирус может быть собран, когда произведено максимальное количество вируса, когда произведено максимальное количество гемагглютинина и/или когда клетки лизированы. Было обнаружено, что оптимальное предварительное выращивание вируса в яйцах (в аллантоисной полости или инокуляцией через амниотическую оболочку) может повышать адаптацию вируса в клетках культуры ткани.

А. Предварительное выращивание в яйцах

Было показано, что пассажи в яичных культурах способствуют адаптации вируса в клетке культуры ткани. Таким образом, может быть желательно предварительно выращивать вирусный изолят в оплодотворенных куриных яйцах по стандартной методике. Например, вирус впрыскивают в аллантоисную полость через амниотическую оболочку в 9-12-дневные оплодотворенные яйца и позволяют ему размножаться в течение трех дней. Затем аллантоисную или амниотическую жидкость собирают, и собранный материал может выращиваться в культуре ткани при подходящей МЗ для применения в производстве вакцины. Альтернативно, собранный материал может применяться непосредственно для клонирования методом серийных разведении. Было обнаружено, что инокуляция яиц через амниотическую оболочку обогащает вирус, который может реплицироваться и может давать высокие уровни НА белка при выращивании в клетках Vero.

В. МЗ

Было идентифицировано, что низкая МЗ дает лучший и/или более высокий титр вирусного изолята. Не ограничиваясь конкретной теорией, полагают что низкая МЗ снижает количество дефективных частиц вируса и дает более эффективный процесс заражения. В некоторых вариантах применяемая МЗ составляет менее около 0,01 (одного вируса на 100 клеток). В других вариантах МЗ составляет менее около 0,003. В некоторых вариантах МЗ составляет менее около 0,001. МЗ может быть выбрана как самая низкая МЗ, которая дает высокий титр вируса и/или которая лизирует клетки в течение около 3-4 дней.

III. Производство вакцины

Как только получен желаемый изолят из адаптированного к культуре ткани вируса, вирус может применяться для производства вакцины. Известно множество типов вирусных вакцин, включая, но не ограничиваясь ими, ослабленные, инактивированные, субъединичные и сплит-вакцины.

А. Способы получения ослабленного вируса

Ослабленные вакцины представляют собой живые вирусные вакцины, которые ослаблены или изменены так, чтобы больше не вызывать заболевание. Они могут быть получены многими методами, например выращиванием в культуре ткани для воспроизводимых поколений и генетических манипуляций для мутации или удаления генов, включенных в патогенность. Адаптированный к культуре ткани изолят может применяться для производства ослабленного вируса с применением стандартных методов. Например, как только идентифицированы вирусные гены и/или белки, которые включены в патогенность или включены в проявление заболевания, они могут быть мутированы или изменены таким образом, что вирус все еще способен заражать и реплицироваться внутри клетки, но не может вызывать заболевание. Примером этого является мутагенизация места расщепления НА1/НА2. Адаптированный к культуре ткани вирус может быть ослаблен с применением любых стандартных методов, например холодной адаптации вируса.

После получения ослабленного вируса вакцина может быть приготовлена стандартными методами (например, описанными здесь способами). Вирус может быть очищен стандартными методами, например с применением гель-хроматографии. Затем может быть приготовлена вакцина с применением стандартных адъювантов и препаратов вакцины, например ISCOM, наношарики, минеральное масло, растительное масло, гидроксид алюминия, сапонин, неионные детергенты, сквален и блок-сополимеры, которые могут применяться отдельно или в сочетании как адъюванты. Имеющиеся в настоящее время вакцины в Соединенных Штатах и Европе не содержат адъювант (живые и убитые вакцины), и это частично объясняет, почему высокие концентрации НА (15 мкг НА на штамм вируса, 45 мкг НА для трехвалентной композиции) необходимы в вакцине.

В. Способы получения инактивированной, субъединичной и сплит-вакцины вируса

Как только получен желаемый вирус, он может применяться для получения иммуногенной композиции, например вакцины. Примеры «убитых» вакцин включают инактивированные, сплит- и субъединичные вакцины. Они могут быть получены для лечения гриппа с применением стандартных методов.

Например, субъединичные вакцины обычно включают выделение только части вируса, которая активирует иммунную систему. В случае гриппа субъединичные вакцины получают с применением очищенного НА и NA, но любая смесь вирусных белков может применяться в качестве субъединичной вакцины. Обычно вирусный белок, такой как НА, экстрагируют из рекомбинантного вируса и получают субъединичную вакцину, содержащую смесь этих вирусных белков из штаммов, рекомендованных ВОЗ. Например, в 1995-1996 вакцины содержали НА и NA от двух А штаммов и одного В штамма (A/Singapore/6/86 (H1N1); A/Johannesburg/33/94 (H3N2); and B/Beijing/84/93). Для H3N8 ВГС могут применяться Н3 и/или N8 антигены.

В общем, вирусный белок (белки) экстрагируют из вируса и получают субъединичную вакцину, содержащую смесь этих вирусных белков. Белки могут быть выделены из адаптированного к культуре ткани вирусного изолята для субъединичной вакцины с применением стандартных методов. Альтернативно, белки могут быть получены с применением рекомбинантных методик. Методики получения конкретного белка известны в данной области техники.

Сплит-вакцины обычно включают обработку вирусов с оболочкой детергентом для солюбилизации их белков. В случае вируса гриппа НА и NA становятся солюбилизированными. Например, неионные детергенты, такие как Triton Х-100, могут применяться для получения сплит-вакцин.

Инактивированные вирусные вакцины получают инактивацией собранного вируса и его обработки с применением известных методов для применения в качестве вакцины, вызывающей иммунную реакцию у млекопитающего. Стадию инактивации, очистки субъединиц и/или гидролиза можно проводить до или после очистки вируса гель-фильтрацией. Например, получение инактивированной вакцины может включать удаление клеточного материала, инактивацию вируса, очистку и солюбилизацию вирусной оболочки. Другие варианты включают очистку вируса с последующей инактивацией, например, с применением формальдегида.

После получения любая вакцина (например, ослабленная, сплит-, субъединичная или инактивированная) может быть тестирована для идентификации того, что вирус и/или вакцина поддерживают похожую антигенность, вызывает серологическую реакцию у млекопитающего и/или обеспечивает защиту от заболевания у млекопитающего.

С. Дальнейшая обработка собранного вируса

1. Очищение собранного вируса

После сбора и/или после инактивации собранного вируса клеточный материал и другие посторонние материалы могут быть удалены, например, осаждением для удаления микроносителей, и концентрацией надосадочной жидкости ультрафильтрацией. Грипп, выращенный в клетках культуры ткани, будет содержать белки клеток хозяина. Может понадобиться некоторое дальнейшее очищение надосадочной жидкости. Клеточные ДНК могут быть удалены ферментной обработкой (например, Бензоназой). После исходного удаления постороннего материала вирус может быть инактивирован с применением стандартных методов. Альтернативно, инактивация может быть проведена после дальнейшей очистки, например, гель-хроматографией.

2. Инактивация вируса

Вирус гриппа может быть инактивирован любым количеством путей и любым количеством агентов. Способ инактивации не является критичным для данного изобретения. Инактивация может проводиться после удаления посторонних материалов. Инактивация может включать применение известных инактивирующих агентов. Такие инактивирующие агенты включают, но не ограничены ими: УФ облучение, формальдегид, глутаровый альдегид, бинарный этиленимин (БЭИ) и бета-пропиолактон. В некоторых вариантах применяют БЭИ, так как известно, что он разрушает нуклеиновую кислоту вируса, не повреждая вирусные белки. Кроме того, на БЭИ не влияет содержание белка и температура. Инактивирующие агенты применяют в концентрации, достаточной высокой для инактивации каждой частицы в растворе. Например, БЭИ может применяться в конечной концентрации от около 0,5 до 10 мМ, включая, но не ограничиваясь: 1,5, 3, 4, 5 и 6 мМ, и включая интервалы от около 1 до 6, и от 1 до 3 мМ. В одном варианте БЭИ применяют в концентрации около 6 мМ. Обычно БЭИ применяют в концентрации около 1,5 мМ и инкубируют при 37°С в течение 48 часов. При получении вакцин к ВГС, БЭИ может применяться в конечной концентрации от около 0,5 до 10 мМ, обычно от 4 до 8, и часто от 5 до 7 мМ. В одном варианте БЭИ применяют в концентрации около 6 мМ. В некоторых вариантах инактивация проходит при подходящих рН и температуре для инактивирующего агента. рН и температура могут быть выбраны так, чтобы получаемый инактивированный вирус все еще являлся иммуногенным. Инактивация может проходить при подходящем перемешивании, чтобы обеспечить контакт агента со всеми частицами вируса в растворе.

После инактивации инактивирующие агенты могут быть удалены с применением методов, включающих, но не ограниченных ими, инактивацию инактивирующего агента, осаждение инактивирующего агента, фильтрацию инактивирующего агента и хроматографию или сочетание этих методов. Например, БЭИ может быть инактивирован тиосульфатом натрия. Остаточный БЭИ также может быть отделен от вируса/вирусных белков с применением гель-фильтрации. Как только подтверждена безвредность (отсутствие вируса), вирусный раствор может быть далее обработан с получением вакцины.

3. Дальнейшая обработка

Вирусный раствор может быть обработан далее, например, для удаления примесей, дальнейшей концентрации вируса и получения более сильной иммунной реакции. Некоторые примеры дальнейшей обработки включают исходное удаление клеточного материала, удаление клеточной ДНК, концентрацию и смешивание с адъювантом с применением стандартных методов. Грипп, выращенный в клетках культуры ткани, содержит белки клеток хозяина. Например, грипп, репродуцированный в клетках мезонефроса человека (НЕК), содержит белки НЕК или содержит бычьи или обезьяньи белки, если выращен в MDBK или VERO клетках соответственно. Эти белки могут быть определены методами, известными специалистам в данной области техники. Известно множество способов удаления ДНК, включая добавление множества ферментов ДНКазы, которые разрушают клеточную ДНК, например, Бензоназа. Стадия исходной концентрации может быть проведена для получения вирусного раствора в концентрации, в наибольшей степени подходящей для дополнительной очистки хроматографией. Она может осуществляться любыми стандартными методами, включая, но не ограничиваясь ими, ультрафильтрацию с применением мембраны, имеющей обрезанную молекулярную массу около 100 К (например, полисульфоновой мембраны с ОММ 100 К). Вирусный раствор может быть концентрирован вплоть до 100 раз, включая, но не ограничиваясь, 90 раз, 80 раз, 70 раз, 60 раз, 50 раз, 40 раз, 30 раз, 20 раз, 10 раз и 5 раз. В некоторых вариантах вирусный раствор концентрируют вплоть до около 50 раз, но более часто, в 20 раз и 30 раз.

4. Очистка

Вирус может быть очищен с применением стандартных методов, таких как центрифугирование в градиенте плотности. В некоторых вариантах вирус очищают гель-хроматографией. Одним из преимуществ применения гель-хроматографии является более хороший выход, чем при центрифугировании в градиенте плотности. Может применяться гель любого размера, который дает очистку вируса. Может применяться любой стандартный гель, включая гель Sepharose (например, Sepharose CL-2B). В некоторых вариантах, колонки длиной от около 70 до 120 см дают требуемое отделение, включая, но не ограничиваясь, около 80, 90, 100 и 110. В других вариантах колонка имеет длину от около 80 до 100 см, например, длину около 90 см. В некоторых вариантах длину получают объединением нескольких колонок в ряд, например двух колонок длиной 45 см или трех колонок длиной 30 см (например, колонок длиной 30-32 см и диаметром 30 см). Концентрированный вирус может быть нанесен с применением стандартных методов, например вирус наносят в количестве 5-10% от объема колонки (ОК), обычно 5-7% ОК. Вирусный пик из колонки затем может быть собран и далее концентрирован с применением стандартных методов, например, ультрафильтрации. В некоторых вариантах применяют 2-3 колонки в ряд общей длиной 90 см и конечные пики объединяют и концентрируют ультрафильтрацией.

5. Солюбилизация белков оболочки

Материал пиков концентрации вируса может быть солюбилизирован с применением стандартных методов, таких как применение неионных детергентов. Солюбилизация может проводиться для получения материала для композиции с ISCOMS (см. ниже). Примеры неионных детергентов включают, но не ограничены ими, нонаноил-N-мутилфукамид (Mega 9), Triton X-100, Октилглюкозид, Дигитонин, С12Е8, Lubrol, Nonidet P-40 и Tween (например, Tween 20, 80 или 120). После солюбилизации вирус может применяться для производства вакцины и/или может быть добавлен адъювант. Например, для производства ISCOM адъюванта, липидная смесь может быть добавлена для способствования образованию ISCOM. Липидная смесь может включать фосфатидилхолин и синтетический холестерин. В некоторых вариантах вирус разрушается Mega 9 при комнатной температуре при перемешивании, затем добавляют липидную смесь (фосфатидилхолин или холестерин) и перемешивание продолжают.

6. Получение адъювантов

Подходящие адъюванты могут быть добавлены к вакцине и/или фармацевтической композиции. Примеры адъювантов включают такие, которые содержат эмульсию масло и вода, а также такие, которые также включают гидроксид алюминия. В последнем случае может применяться гидроксид алюминия из коммерческого источника, например, Alhydrogel (Superfos Biosector, Frederikssund, Denmark) и Rehydrogel (Reheis Inc.). Эмульсия масло и вода обычно содержит минеральное масло или преобразующиеся в ходе обмена вещества масла (например, растительное масло, рыбий жир). Неионные детергенты или поверхностно-активные вещества могут применяться в качестве эмульгаторов. Примеры эмульгаторов включают Tween 80/Span 80, Arlecel 80/Tween 80 и Montanides (Seppic, Paris, France). В случае эмульсий адъювантов обычно 5-25% объема составляет масло и 75-95% объема составляет вода. В некоторых вариантах эмульсия адъюванта содержит 20% масла и 80% воды по объему. Количество гидроксида алюминия обычно составляет от около 5% до 15% водной фазы. В некоторых вариантах адъювантом является Emunade®.

Для некоторых вариантов в качестве адъюванта применяют ISCOM. ISCOM является аббревиатурой Иммуностимулирующего Комплекса, и его технология описана у Morein et al. (Nature 308:457-460 (1984)). ISCOM является новой системой доставки вакцины и не похож на обычные методики с применением адъювантов. ISCOM может быть получен одним из двух способов. В некоторых вариантах антиген физически вводят в структуру во время ее получения. В других вариантах ISCOM-матрица (поставляемая, например, Isconova) не содержит антиген, но смешана с антигеном, выбранным конечным потребителем до иммунизации. После смешивания антигены присутствуют в ISCOM-матрице, но физически не введены в структуру.

В общем, в ISCOM очищенные антигены присутствуют в мультимерной форме, основанной на способности Quil А спонтанно формировать мицеллы при критической концентрации и гидрофобной/гидрофильной связью, улавливать очищенные иммуногены. Эти мицеллярные структуры имеют размер порядка 35 нм и легко распознаются иммунной системой. В отличие от обычных депо-адъювантов, ISCOMS легко очищаются от места инъекции и запрещают местные, гуморальные и опосредованные клетками реакции. В конкретных вариантах ISCOM получают следующим образом. Вирус солюбилизируют с применением стандартных методов, таких как неионный детергент (например, Mega-9, Triton X-100, Октилглюкозид, Дигитонин, Nonidet P-40, C₁₂E₈, Lubrol, Tween-80). Липидную смесь добавляют для облегчения образования ISCOM. Липидная смесь может включать фосфатидилхолин и синтетический холестерин. В некоторых вариантах смесь сначала обрабатывают неионным детергентом при комнатной температуре при перемешивании, затем добавляют липидную смесь (равные части фосфатидилхолина и синтетического холестерина, например) и перемешивание продолжают. Quil А (очищенный гликозид сапонина) добавляют в вирусную липидную смесь и перемешивание продолжают. Quil А может быть добавлен до конечной концентрации Quil А от около 0,01 до 0,1%, включая, но не ограничиваясь, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08 и 0,09. В некоторых вариантах конечная концентрация составляет около 0,05%. Неионный детергент удаляют (например, диафильтрацией с ацетатом аммония). Матрицу ISCOM образует Quil А. Морфология частицы ISCOM, видимая через электронный микроскоп, показывает типичную клеткоподобную структуру размером приблизительно 35 нм. Стадия образования ISCOM может быть проведена с применением диафильтрации с тангенциальным потоком. ISCOM содержат очищенные антигены в мультимерной форме на основе Quil А для спонтанного образования мицелл при критической концентрации и с помощью гидрофобной/гидрофильной связи, которые улавливают очищенные антигены. Образование ISCOM может быть подтверждено электронной микроскопией для подтверждения образования типовой клеткоподобной структуры. Было показано, что иммунная реакция от присутствия ISCOM, по крайней мере, в десять раз лучше, чем от подобной антигенной нагрузки, присутствующей в виде мицелл чистого агрегированного мембранного белка. Также было обнаружено, что ISCOM вызывает опосредованную клеткой реакцию, не появляющуюся при применении обычных вирусных вакцин. В некоторых вариантах конечная концентрация составляет около 0,05%.

Иммунные стимуляторы также могут быть добавлены к вакцине и/или фармацевтической композиции. Иммунные стимуляторы включают: цитокины, факторы роста, хемокины, надосадочные жидкости клеточных культур лимфоцитов, моноциты или клетки из лимфоидных органов, препараты клеток и/или экстракты из бактерий, паразитов или митогенов, и новые нуклеиновые кислоты, полученные из других вирусов и/или других источников (например, РНК с двойной нитью, CpG), блок-сополимеры, наношарики или другие соединения, известные в данной области техники, отдельно или в сочетании.

Конкретные примеры адъювантов и других иммунных стимуляторов включают, но не ограничены ими: лизолецитин; гликозиды (например, сапонин и производные сапонина, такие как Quil А или GPI-0100); катионные поверхностно-активные вещества (например DDA); галогениды четвертичного углеводородного аммония; плюрониковые полиолы; полианионы и полиатомные ионы; полиакриловые кислоты, неионные блокполимеры (например, Pluronic F-127); и MDP (например, N-ацетилмурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-ацетилнормурамил-L-аланил-D-изоглютамин, N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглютаминил-L-аланин-2-(1'-2'дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксипропилфосфорилокси)этиламин).

D. Эффективность вакцин

В данной области техники хорошо известны методы определения того, поддерживает ли субъединичная, ослабленная, сплит- и/или инактивированная вирусная вакцина одинаковую антигенность с клиническим изолятом или полученным из него адаптированным к культуре ткани изолятом. Такие известные методы включают применение антисыворотки или антител, НА и NA активность и ингибирование и ДНК скрининг (такой как гибридизационные зонды или ПЦР) для подтверждения того, что донорные гены, кодирующие антигенные детерминанты, присутствуют в инактивированном вирусе. Методы определения того, вызывает ли вакцина серологическую реакцию, известны в данной области техники и включают иммунизацию тестируемых животных вакциной с последующей инокуляцией вызывающего заболевание вируса и идентификацией присутствия или отсутствия симптомов заболевания. Таким образом, эффективность вакцины гриппа может быть тестирована на животных, обычно хорьках, мышах и морских свинках. Титр антител может быть тестирован с применением ингибирования геммаглютинатина (HI) или ингибирования нейраминидазы (NI) или тестированием нейтрализующих вирус антител (тест микронейтрализации) в культуре клеток, и такие методы обычно известны. Анализ контрольного заражения может дать важную информацию для оценки вакцины.

Фармацевтические композиции и/или вакцины, подходящие для лечения, включают вирус или вирусные субъединицы в смеси со стерильными водными или неводными растворами. Способ получения фармацевтической композиции и/или вакцины может включать выделение адаптированного к культуре ткани изолята, выращивание и очистку вирусного изолята, инактивацию и/или ослабление вируса и смешивание подходящего титра с физиологически приемлемым разбавителем и иммуностимулирующим агентом. Альтернативно, вирусные белки могут быть очищены для субъединичной вакцины, и подходящее количество может быть смешано с физиологически приемлемым разбавителем и иммуностимулирующим агентом. Вирус может быть очищен так, чтобы не содержать загрязняющий материал или вещество, которое может препятствовать стадии инактивации и/или иммуногенности вируса.

Подходящий титр вируса или концентрация вирусных белков могут быть смешаны с разбавителем и иммуностимулирующим агентом. Измерение TCID₅₀ является одним из способов изменения вирусного титра (доза, инфицирующая 50% культуры ткани). Например, может применяться титр от около 10⁵ до 10¹² TCID₅₀ (на основе пред-активированных титров), включая, но не ограничиваясь, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰ и 10¹¹. Необязательно, титр может быть проанализирован НА титром и может содержать от около 1 до 30 мкг НА на вирус, включенный в вакцину, включая, но не ограничиваясь, от 1 до 10 мкг для адъювированных композиций, и от 1 до 30 мкг для неадъювированных вакцин. В некоторых вариантах титр составляет около 15 мкг. Таким образом, например, если 3 вируса включены в неадъювированную вакцину, 1 доза для взрослых содержит эквивалент 45 мкг НА (15 мкг для каждого из 3 штаммов вируса). В других вариантах количество для каждого штамма может отличаться (например, в зависимости от антигенности), но конечная концентрация составляет от около 1 до около 60 мкг НА, включая 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 и 55 мкг. В другом варианте адъювированные вакцины содержит количества НА от около 1 до 30 мкг, включая 2, 5, 10 и 20 мкг. Вакцина обычно имеет объем от около 50 мкл до 5000 мкл, включая 100, 500, 1000, 2000 и 5000 мкл.

Могут применяться стандартные физиологически приемлемые разбавители, включая, например, ЕМЕМ, уравновешенный солевой раствор Хенка и физиологический раствор с фосфатным буфером (ФРФБ) и обычный физиологический раствор.

Подходящие иммуностимулирующие адъюванты могут быть добавлены в вакцину и/или фармацевтическую композицию. Примеры иммуностимулирующих адъювантов включают, но не ограничены ими, минеральное масло, растительное масло, гидроксид алюминия, сапонин, неионные детергенты, сквален, блоксополимеры, наношарики, ISCOM, ISCOM матрицу или другие соединения, известные в данной области техники, отдельно или в сочетании.

В дополнение к адъюванту, любой подходящий противовирусный агент, который применяют против гриппа, также может быть включен в фармацевтическую композицию. Такие противовирусные агенты включают, например, римантадин, амантадин, ингибиторы нейраминидазы (такие как занамивир и осельтамивир), гамма-интерферон, гуанидин, гидроксибензимидазол, интерферон-альфа, интерферон-бета, тиосемикарбазоны, метизазон, рифампин, рибавирин, пиримидин или аналоги пурина, и фоскамет.

Вакцины, имеющие более одного вируса или штамма вирусных белков, могут быть получены с применением представленных здесь способов. Смеси могут быть иммуногенетически титрованы с получением приблизительно одинаковой иммуногенности. Иммуногенетическое титрование означает, что конечный продукт не имеет различий в иммуногенности. Например, если получают смесь штамма А и штамма В, и штамм А является в 5 раз более иммуногенным, штаммы смешивают в соотношении штамм А: штамм В 1:5.

IV. Введение вакцины

Введение композиции вакцины и/или фармацевтической композиции может иметь профилактические цели. В профилактических целях композиции вводят до возникновения каких-либо симптомов вирусной инфекции гриппа. Профилактическое введение композиции служит для профилактики или ослабления любой последующей инфекции. Фармацевтическая композиция и/или вакцина может вводиться любым способом, известным в данной области техники, включая ингаляции, интраназальное введение (например, ослабленных вакцин), пероральное введение и парентеральное введение. Примеры парентеральных способов включают чрескожное, внутримышечное, внутривенное и подкожное введение. В некоторых вариантах вакцину вводят внутримышечно или глубокой подкожной инъекцией в плечо. Вторая доза может быть введена через 2-4 недели некоторым детям, которые ранее не были вакцинированы или не перенесли грипп (непримированным). Одна или более ревакцинаций может вводиться в подходящее время после начальной иммунизации.

Вводят эффективное количество вакцины и/или фармацевтической композиции. Эффективным количеством является количество, достаточное для достижения желаемого биологического эффекта, такого как достаточный гуморальный или клеточный иммунитет. Оно может зависеть от типа вакцины, возраста, пола, состояния здоровья и массы тела пациента. Примеры желаемого биологического эффекта включают, но не ограничены ими, отсутствие симптомов, ослабление симптомов, снижение вирусного титра в тканях или носовом секрете, полную защиту против заражения вирусом гриппа и частичную защиту от заражения вирусом гриппа.

В некоторых вариантах иммунологически эффективное количество ВГС вакцины составляет от около 100 ЕГА до около 1500 ЕГА на дозу. Композиция обычно включает от 250 до 750 ЕГА на дозу. В одном варианте композиция вакцины включает около 500 ЕГА на дозу.

При введении в виде раствора вакцина может быть получена в виде водного раствора, сиропа, эликсира или настойки. Такие композиции известны в данной области техники, и их получают растворением антигена и других подходящих добавок в подходящую систему растворителей. Такие растворители включают воду, физиологический раствор, этанол, этиленгликоль, глицерин и А1 жидкость, например. Подходящие добавки включают сертифицированные красители, вкусовые добавки, подсластители и противомикробные консерванты, такие как тимеросал (этилмеркуитиосалицилат натрия). Такие растворы могут быть стабилизированы с применением стандартных методов, например добавлением частично гидролизованного желатина, сорбита или культуральной среды для выращивания клеток, с применением, например, реагентов, таких как гидрофосфат натрия, дигидрофосфат натрия, гидрофосфат калия и/или дигидрофосфат калия. Жидкие композиции также могут включать суспензии эмульсии. Суспензии получают, например, с применением коллоидной мельницы, и эмульсии получают, например, с применением гомогенизатора.

V. Вирусные штаммы и ВОЗ

Для получения времени для производства достаточных запасов вакцины решение должно быть принято задолго до сезона гриппа, касающееся штаммов гриппа А и В, которые будут применяться в вакцинах этого года (для зимнего сезона). Существуют тщательно разработанные и современные системы эпидемиологического мониторинга по всему миру, которые помогают принимать такие решения. Кроме того, ВОЗ обычно готовит исходные вакцинные вирусы для производства вакцин.

Существует 16 известных подтипов НА и 9 известных подтипов NA. Возможно множество различных сочетаний НА и NA белков. Только некоторые подтипы гриппа А (т.е. H1N1, H1N2 и H3N2) в настоящее время циркулируют среди людей. Другие подтипы в большом количестве найдены у других животных. например, H7N7 и H3N8 вирусы вызывают заболевание у лошадей, и H3N8 также вызывает заболевание у собак согласно полученным недавно данным.

Известно, что три известных подтипа птичьего вируса гриппа А заражают и птиц и животных, и инфекции вирусами гриппа А Н5-Н5, такими как вирусы НРА1 H5N1, грипп А Н7 и грипп А Н9. Однако другие штаммы, которые будут заражать людей и вызывать эпидемии или пандемии, могут возникнуть из любых подтипов.

Вирус может быть получен с применением стандартных методов, например от пациентов. Американской коллекции типовых культур (или другой коллекции) или от определенных лабораторий, работающих над вирусами. В некоторых вариантах вирус получают от ВОЗ или ЦКЗ, включая сезонные вирусы и возможные пандемические штаммы.

VI. Определение серологической реакции

Способы идентификации того, вызывает ли вакцина серологическую реакцию, также хорошо известны в данной области техники. Например, можно делать тестируемому животному инъекцию иммуногенного соединения/вакцины и идентифицировать антивирусные антитела в сыворотке крови. Способы идентификации того, является ли вакцина защищающей, хорошо известны специалистам в данной области техники и включают иммунизацию тестируемого животного вакциной с последующей инокуляцией вызывающего болезнь вируса и идентификацией присутствия или отсутствия симптомов заболевания.

Тест ингибирования гемагглютинации может быть проведен для идентификации наличия серологической реакции на гемагглютинин. Анализ ингибирования гемагглютинации (ИГА) может быть проведен с красными клетками крови индейки (ККК) для всех тестируемых образцов сыворотки, например, с применением известного подтипа гриппа, такого как ВГС (H3N8). Коротко, серийное двукратное разведение тестируемой сыворотки осуществляют в ФРФБ в 96-луночных титровальных микропланшетах с V-образным дном. Равный объем суспензии вируса, содержащий 4-8 ЕГА/50 мкл ВГС, добавляют в каждую лунку, содержащую тестируемую сыворотку, и планшеты инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем добавляют равный объем 0,5% суспензии ККК индейки. Затем планшеты инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин и считывают результаты ИГА. Противоположность самого высокого разведения сыворотки, показывающего ингибирование НА, считается ИГА титром тестируемого образца.

Другие способы определения присутствия антител к вирусу гриппа включают тест на ингибирование нейраминидазы, вестерн-блоттинг, ELISA, ПЦР и другие методы идентификации антител к вирусу гриппа. Эти анализы известны в данной области техники.

VII. Примеры

В представленных ниже примерах представлены методики выделения, адаптации и очистки вируса гриппа для получения гомологичной популяции вируса для производства исходного вакцинного вируса. В примерах применяются клетки Vero (Американская коллекция типовых культур, CCL 81), но может применяться любой другой тип клеток, который разрешен для вируса гриппа.

ПРИМЕР 1: Химические и биологические соединения

Применяемая среда для заражения содержит 1 литр DMEM (Cambrex, Catalog No. 04-096) или эквивалент, хранится при 2-7°С, 20 мл L-Глутамина (Cellgro, Catalog No. 25-005-OK) или эквивалент, хранится замороженным при -10°С или меньше. После оттаивания, его хранят при 2-7°С в течение вплоть до 4 недель, и Трипсин IX типа (Sigma Product No. TO3O3, CAS No. 9002-07-7) или эквивалент; аликвотируют и хранят замороженным при -5 - -30°С. Среду для заражения готовят свежую непосредственно перед заражением клеток.

Культуральную среду для клеток готовят следующим образом: 1 литр DMEM, 20 мл L-Глутамина, 50 мл фетальной бычьей сыворотки (Gibco Catalog No. 04-4000DK) или эквивалент (примечание: поставляют из стран, в которых не отмечена ГЭКРС). Готовую среду хранят при 2-7°С в течение более 30 дней после получения.

ЭДТК-Трипсин (Cellgro Catalog No. 98-102-ОК или эквивалент), применяемый для переноса клеток, хранят при -5 - -30°С, срок годности указан производителем.

ПРИМЕР 2: Получение культуры клеток

Так как разведение протеазы, применяемой на стадии заражения вирусом, может варьироваться в зависимости от партии, новые партии трипсина титруют для установления оптимального уровня перед применением. Примером титрования является серийное разведение трипсином IX типа в DMEM, содержащей L-глютамин, с применением полулогарифмических разведении (10^-1, 10^-1,5, 10^-2, 10^-2,5 и т.д.). Применяют 96-луночный планшет, содержащий свежий слившийся монослой клеток Vero, промывая каждую лунку 2 раза 280 мкл ФРФБ. Сразу же после промывки добавляют 200 мкл каждого разведения трипсина IX типа на ряд планшета. Затем планшет инкубируют при 37°С±2°С с 5% CO₂ и клетки наблюдают через 4 дня. Самое низкое разведение трипсина, которое не показывает или показывает незначительное действие на здоровье клеток, выбирают как подходящую концентрацию трипсина для применения для выделения и оптимизации заражения гриппом. Желательно и общепринято видеть незначительное или отсутствие различия между лунками для каждой концентрации.

Для клонирования методом серийных разведении вируса в клетках Vero, применяют слившийся монослой, обычно 3-4-дневный; выращенный в 96-луночных планшетах для микроанализа Falcon. Клетки получают от АТСС CCL 81 и применяют между переносами 132 и 156.

Получение клеток Vero из жидкого азота (LN₂) проводят следующим образом: одну ампулу клеток Vero вынимают из LN₂ и оттаивают на водяной бане с температурой 36°С±2°С. Все содержимое ампулы переносят пипеткой в 25 см² колбу для культивирования ткани, содержащую 10 мл культуральной среды для выращивания клеток с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки. Колбу инкубируют при 36°С±2°С в 4-6% CO₂. Через приблизительно 1 час надосадочную жидкость и неприсоединенные клетки удаляют и добавляют 10 мл свежей среды для культуры клеток. Клетки инкубируют при 36°С±2°С в 4-6% СО₂ до достижения 90-100% конфлюэнтности.

Перенос клеток Vero проводят следующим образом: монослои промывают с применением 10-20 мл ФРФБ в течение приблизительно 3 минут. ФРФБ декантируют и заменяют 3 мл ЭДТК-трипсина (Cellgro, Catalog No. 98-102-OK), монослой инкубируют в течение приблизительно 3 минут до тех пор, пока клетки не отслоятся от колбы, суспензию разбавляют добавлением 17 мл полученной среды для выращивания (содержащей ФБС) для разведения и нейтрализации трипсина. Затем клетки подсчитывают с применением гемоцитометра для определения количества клеток на мл суспензии. Количество колб, которые могут быть приготовлены с применением этой суспензии, рассчитывают так: клетки на мл (суспензия) × мл желаемой суспензии = мл пластинок для каждого сосуда. Клетки на мл (желаемые) Общее количество мл суспензии, где общее количество мл суспензии должно быть минимальным доступным объемом. Если нет, то плотность клеточных пластин может быть скорректирована для приведения в соответствии с ним, однако необходимо отметить, что период времени, в течение которого клетки остаются слившимися, будет больше, при более низкой плотности клеток при посеве. Сосуды обычно засевают суспензиями клеток с плотностью клеток 1×10⁴-1×10⁵ клеток на мл. Клетки инкубируют в течение 3-4 дней или до тех пор, пока они остаются слившимися.

Эти методики сохранения и репродуцирования клеток Vero также применяют для других клеток, таких как Madin Darby Canine Kidney (MDCK) и НЕК 293.

Клетки НЕК 293 особенно подходят для размножения клонированных вирусных изолятов. Такой субклон НЕК 293, обозначенный GT-D22 (или D22), выделяют из исходного препарата клеток НЕК 293 (АТСС No. CRL-1573; ATCC Batch No. F-11285 at Passage 33). Клетки НЕК 293 субклонируют и выбирают на основе улучшенной производительности рекомбинантного аденовируса типа 5, имеющего ген для экспрессии р53. Клоны, имеющие нормальную морфологию и адекватные скорости роста, трипсинизируют и засевают в количестве 1-2×10⁶ клеток на лунку для дальнейшего анализа. Клоны с наивысшей производительностью подвергают дальнейшему субклонированию и отбору. Субклон D22 наконец выбирают. Способность субклона D22 репродуцировать грипп демонстрируют с применением вируса свиного гриппа (ВСГ).

Меры биологической предосторожности применяют при работе с живым вирусом гриппа. Грипп является этиологическим агентом 2 класса, и рекомендации по обращению с вирусом в лаборатории можно найти в CDC-NIH, HHS Publication No. (CDC) 88-8395 (Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories).

ПРИМЕР 3: Клонирование способом серийных разведении

Получение пробирок с разведениями и разведение образцов для клонирования методом серийных разведении осуществляют следующим образом. Тестируемые пробирки (12×75 мм) помещают в держатели и помечают. В одной чашке обрабатывают 1 образец, и серия разведений для каждого образца составляет 10^-1 до 10^-10. Среду для разведения распределяют в количестве 1,8 мл в каждую тестируемую пробирку с применением серологической пипетки. Первую пробирку помечают идентификацией вируса. Несколько дополнительных пробирок получают для применения в качестве контроля разведения и для замены, если во время разведения будут допущены ошибки. Образцы встряхивают в течение приблизительно 5 секунд, затем получают исходное разведение пипетированием 200 мкл образца в пробирку с 10^-1 разведением. Серийное разведение продолжают до 10^-10. Для каждого разведения образец встряхивают и кончик пипетки меняют между разведениями.

Разведения переносят в клеточные планшеты следующим образом. Непосредственно перед применением среду асептически выливают из клеточных планшетов. Каждую ячейку промывают с применением 12-канального пипет-дозатора 2-3 раза 280 мкл стерильного ФРФБ. Пластинки асептически опустошают, но не позволяют высыхать. На планшете отмечают идентификацию вируса, дату и схему разведения. Каждое разведение немного встряхивают перед добавлением в планшет. С применением механизированного Finnpipette или другого подходящего пипет-дозатора со 1000 мкл наконечниками, 200 мкл на лунку образца инокулируют в один ряд планшета. Образцы загружают согласно концентрации вируса. Сначала 2 ряда контроля разведения добавляют в планшет, затем добавляют наибольшее разведение вируса (10^-10) и затем оставшиеся образцы. Образцы загружают в последовательности от 10^-10 до 10^-1.

ПРИМЕР 4: Получение вируса

Вирус собирают и ЦПЭ оценивают следующим образом. Через 4 дня инкубации цитопатический эффект (ЦПЭ) считывают с применением микроскопического исследования. Присутствие продуктов распада клеток, присутствие мертвых клеток и отсутствие живых клеток применяют для характеристики ЦПЭ, так как он является типичным для вируса гриппа. Периодически неспецифическую интерференцию наблюдают в исходных разведениях вируса, поэтому важно исследовать серийные разведения на ЦПЭ. При оценке ЦПЭ важно определять степень ЦПЭ в ячейках с самым высоким разведением, демонстрирующих ЦПЭ. Наибольший успех достигается при выборе лунок с наибольшим разведением образца, которые демонстрируют ЦПЭ, но среди этих лунок предпочтение отдается лунке или лункам, который демонстрируют наименьшую степень ЦПЭ. После выбора содержимое лунок собирают с применением одноканальной 1000 мкл пипетки для отсоса жидкостей. Обычно жидкости пипетируют несколько раз для удаления плохо присоединенных клеток со дна лунки и для разбивания каких-либо скоплений клеток или вируса в суспензии. Собранные жидкости затем применяют для проведения дополнительного цикла или циклов клонирования методом серийных разведении, или иногда применяют для инокуляции свежего монослоя для получения пост-клонированного посева. Обычно проводят 2-3 цикла клонирования методом серийных разведении друг за другом для получения однородной популяции вируса. НА титр анализируют на каждой стадии процесса, результаты показаны в таблице 1.

A/Indonesia/05/2005 (IND0H5N1), A/Vietnam/I 203/04 (VNH5N1), A/New Caledonia/20/99 (A/NC/20/99(R)) и A/Wisconsin/67/05 (A/Wis/67/05R) являются рекомбинированными вирусами гриппа, полученными от ЦКЗ. Для рекомбинации вирусов, кодирующие гены поверхностные гликобелки НА и NA получают из штамма гриппа (INDOH5N1, VNH5N1, A/New Caledonia/20/99 и A/Wis/67/05), a оставшиеся внутренние гены из A/PR/8/34. Клонирование методом серийных разведении также применяют к дикому типу (без PR8 рекомбинации) штаммов гриппа A/New Caledonia/20/99 (A/NC/20/99), A/Wisconsin/67/05 (A/Wis/67/05) и B/Malaysis/2506/04. Вирусы получают с применением обратных генетических методик и переносят в оплодотворенные яйца. Яичный материал применяют непосредственно для клонирования методом серийных разведении в клетках Vero (А методика для НА титрования показана в примере 5).

ТАБЛИЦА 1
НА титр* до и после клонирования методом серийных разведении (КСР)
штамм гриппа	Исходные** материалы	До*** КСР	После 2 КСР	После 3 КСР	роллерный флакон	биореактор
IndoH5N1	20,480	160	1,280	2,560	5,120	7,680
VNH5N1	2560	<40	640	1,280	5,120	7,680
A/NC/20/99	5,600	640	1,280	-	-	-
A/NC/20/99 (R)	10,240	1,280	1,280	-	2,560	10,240
A/Wis/67/05 (Н3)	2,560	640	1,280	-	-	-
A/Wis/67/05 (H3R)	7,680	640	1,280	-	2,560	5,120
B/Malaysia/2506/04	2,560	<40	640	-	-	5,120
*НА титр выражен в единицах/мл. **НА титр в оплодотворенном яичном материале представлен ЦКЗ. ***НА титр из клеток Vero заражают непосредственно оплодотворенным яичным материалом от ЦКЗ.

Как видно из представленной выше таблицы 1, система клеточной культуры может давать титр вируса такой же высокий, как в яйцах. Кроме того, штаммы вируса, которые не показывают определяемый рост в клетках на начальном этапе, VNH5N1 и B/Malaysia/2506/04, могут быть адаптированы для выращивания в клетках Vero клонированном методом серийных разведении. Репродуцирование VNH5N1 и B/Malaysia/2506/04 в амниотической оболочке яиц до клонирования методом серийных разведении улучшает адаптацию этих вирусов к выращиванию в клетках Vero.

С применением ОРИД (одномерной радиальной иммунодиффузии) для количественной оценки гемагглютинина, вплоть до 132 мкг/мл гемагглютинина в белке получают для B/Malaysia/2506/04 в концентрированной культуральной среде для клеток Vero. Выход в мкг НА/мл культуры в 10 раз лучше, чем в известных опубликованных методах с применением клеток Vero. В настоящее время доза человеческой вакцины эквивалентна около 15 мкг/штамм вируса. Поэтому из одного мл концентрированной культуральной среды для клеток Vero может быть получено 8-9 доз.

ПРИМЕР 5: Перенос гриппа через амниотическую оболочку для того, чтобы улучшить способность вируса расти в клетках культуры ткани

Вирус гриппа VNH5N1-PR8/ЦКЗ-RG получают от ЦКЗ. Он представляет собой рекомбинированный вирус, состоящий из Н5 и N1 генов из вьетнамского штамма птичьего H5N1 вируса гриппа на PR8 вирусной основной цепи. Этот вирус может быть размножен в 11-дневных оплодотворенных яйцах, инокулированных через аллантоисную полость. Аллантоисные жидкости собирают через 2-3 дня после инокуляции, и выход вируса составляет 2560 единиц гемагглютинина (ЕГА)/мл.

Аллантоисные жидкости (~200 мкл) разводят в 5 мл DMEM, содержащей 1,25 мкг/мл Трипсина IX типа и позволяют абсорбироваться в слитый монослой клеток Vero (ATCC CCL No. 81, пассаж 147) в течение 60 минут при 36±2°С. К культурам добавляют 25 мл DMEM, содержащей 1,25 мкг/мл Трипсина IX типа, и инкубируют в течение 3 дней, и собирают надосадочные жидкости культур. В собранных жидкостях активность гемагглютинина не наблюдается.

Содержащие вирус аллантоисные жидкости разводят 1:10000 и 100 мкл инокулируют в аллантоисную полость и амниотическую оболочку 11-дневных оплодотворенных яиц. Яйца инкубируют при приблизительно 39°С в течение трех дней, и аллантоисную и амниотическую жидкости собирают отдельно.

Клетки Vero (пассажи 132-152) засевают в 96-луночные планшеты в концентрации 1×10⁴-1×10⁵ клеток/мл, 200 мкл/лунку в DMEM, содержащей 5% фетальную бычью сыворотку, и инкубируют в течение 3-4 дней (пока конфлюентные) при 36±2°С, 3-5% СО₂. VNH5N1 вирус в аллантоисной и амниотической жидкостях серийно разводят от 10^-1 до 10^-10 в DMEM, содержащей 1,25 мкг/мл трипсина IX типа. Среду удаляют от клеток Vero, лунки промывают 280 мкл физиологического раствора с фосфатным буфером и затем 200 мкл каждого разведения вируса инокулируют в 8 повторных лунок. Планшеты инкубируют в течение 4 дней при 36±2°С, 3-5% CO₂. Амниотические жидкости дают вирус, который растет до более высоких титров в клетках Vero, что подтверждается цитопатическими эффектами вплоть до 10^-9 разведением для вируса из амниотического источника, по сравнению с 10^-7 разведением для вируса из аллантоисного источника (см. таблицу 2). Вирус из одной лунки с наиболее высоким разведением, демонстрирующий цитопатический эффект, собирают и клонируют методом серийных разведении во второй раз. Снова вирус из амниотической жидкости показывает цитопатический эффект при более высоких разведениях, чем для вируса из аллантоисного источника (приблизительно в 10 раз больше вируса).

ТАБЛИЦА 2
Серийное разведение, пассаж 1
Вирус из аллантоисной жидкости		Вирус из амниотической жидкости
↓разведение цитопатический эффект (+ присутствует)	↓разведение цитопатический эффект (+ присутствует)
10-10	-	-	-	-	-	-	-	-		10-10	-	-	-	-	-	-	-	-
10-9	-	-	-	-	-	-	-	-		10-9	-	-	-	-	-	-	+	-
10-8	-	-	-	-	-	-	-	-		10-8	-	-	-	-	-	-	+	+
10-7	+	+	-	+	-	-	+	+		10-7	+	+	+	+	+	+	+	+
10-6	+	+	+	+	+	+	+	+		10-6	+	+	+	+	+	+	+	+
10-5	+	+	+	+	+	+	+	+		10-5	+	+	+	+	+	+	+	+
10-4	+	+	+	+	+	+	+	+		10-4	+	+	+	+	+	+	+	+
10-3	+	+	+	+	+	+	+	+		10-3	+	+	+	+	+	+	+	+
10-2	+	+	+	+	+	+	+	+		10-2	+	+	+	+	+	+	+	+
10-1	+	+	+	+	+	+	+	+		10-1	+	+	+	+	+	+	+	+
	А	В	С	D	Е	F	G	Н			А	В	С	D	Е	F	G	Н
Собирают вирус из лунки Н7		Собирают вирус из лунки 09
Серийное разведение, пассаж 2
Аллантоисный Н7 клон		Амниотический G9 клон
↓разведение цитопатический эффект (+ присутствует)	↓разведение цитопатический эффект (+ присутствует)
10-10	-	-	-	-	-	-	-	-		10-10	-	-	-	-	-	-	-	-
10-9	-	-	-	-	-	-	-	-		10-9	-	-	-	-	-	-	-	-
10-8	-	-	-	-	-	-	-			10-8	-	-	-	-	-	-	-	-
10-7	-	-	-	-	-	-	-	-		10-7	-	-	-	-	-	-	-	-
10-6	-	-	-	-	-	-	-	-		10-6	-	-	-	-	-	-	-	-
10-5	-	-	-	-	-	-	-	-		10-5	-	-	-	-	-	-	-	-
10-4	-	-	-	-	-	+	-	-		10-4	+	+	+	+	+	+	+	+
10-3	+	+	+	+	+	+	+	+		10-3	+	+	+	+	+	+	+	+
10-2	+	+	+	+	+	+	+	+		10-2	+	+	+	+	+	+	+	+
10-1	+	+	+	+	+	+	+	+		10-1	+	+	+	+	+	+	+	+
	А	В	С	D	Е	F	G	Н			A	В	С	D	Е	F	G	Н
Собирают вирус из лунки Н3		Собирают вирус из лунки G4
Серийное разведение, пассаж 3
Аллантоисный Н7Н3 клон		Амниотический G9G4 клон
↓разведение цитопатический эффект (+ присутствует)	↓разведение цитопатический эффект (+ присутствует)
10-10	-	-	-	-	-	-	-	-		10-10	-	-	-	-	-	-	-	-
10-9	-	-	-	-	-	-	-	-		10-9	-	-	-	-	-	-	-	-
10-8	-	-	-	-	-	-	-	-		10-8	-	-	-	-	-	-	-	-
10-7	-	-	-	-	-	-	-	-		10-7	-	-	-	-	-	-	-	-
10-6	-	-	-	-	-	-	-	-		10-6	-	-	-	-	-	-	-	-
10-5	-	-	-	-	-	-	-	-		10-5	-	-	-	-	-	-	-	-
10-4	-	+	+	+	+	+	+	+		10-4	+	+	+	+	+	+	+	+
10-3	+	+	+	+	+	+	+	+		10-3	+	+	+	+	+	+	+	+
10-2	+	+	+	+	+	+	+	+		10-2	+	+	+	+	+	+	+	+
10-1	+	+	+	+	+	+	+	+		10-1	+	+	+	+	+	+	+	+
	A	B	C	D	E	F	G	H			A	B	C	D	E	F	G	H
Собирают вирус из лунок В4 и F4		Собирают вирус из лунок С5 и G5

Клоны гриппа в таблице 2 идентифицируют на основе сочетания обозначений столбцов А-Н и рядов 1-10 (серии разведения 10^-1-10^-10 соответственно). Например, название клона В4 означает вирус, выращенный в лунке, найденной в столбце В и ряду 4 (10^-4 разведение).

Вирус, собранный из третьего серийного разведения (~100 мкл) разводят в 5 мл DMEM, содержащей 1,25 мкг/мл трипсина IX типа и инокулируют в влитые клетки Vero (переносы 132-152) и инкубируют в течение 60 минут при 36±2°С. После абсорбции добавляют 45 мл DMEM, содержащей 1,25 мкг/мл трипсина IX типа и культуры инкубируют в течение четырех дней при 36±2°С. Собранные надосадочные жидкости культуры тестируют на гемагглютининин, и оба клона, полученные из выращенного вируса, дают в 4-8 большие выходы НА (см. таблицу 3).

ТАБЛИЦА 3
Источник вируса	Обозначение клона	Выход (ЕГА/мл)
Аллантоисная жидкость	H7H3F4	320
	Н7Н3В4	160
Амниотическая жидкость	G9G4C5	1280
	G9G4G5	1280

Вирус G9G4C5 затем выбирают для выращивания в клетках Vero в роллерных флаконах (получают 5120 ЕГА/мл) и 5-литровых биорсакторах (получают 7680 ЕГА/мл).

Похожие результаты получают с вирусом гриппа типа В, B/Malaysia/2506/04. Этот вирус также не дает измеримый гемагглютинин при получении вируса из аллантоисной жидкости, репродуцированный в клетках Vero. Однако, вирус, полученный из амниотической жидкости, дает 640 ЕГА/мл после двух клонирований методом серийных разведений и 5120 ЕГА/мл после выращивания в 5-литровом биореакторе.

ПРИМЕР 6: Количественная оценка гемагглютинина

Целью этой методики является количественно оценить активность гемагглютинина вируса гриппа в вирусных жидкостях в конечном продукте.

Применяемый материал включает: ФРФБ, Cambrex, 517-16Q или эквивалент, Alsevers Solution, E8085 или эквивалент, свежие эритроциты Rooster в растворе Alsevers Solution (соотношение 1:1). Оставляют осаждаться на ночь в Alsevers для стабилизации рецепторов. Промывают 2 раза и хранят в виде 10% суспензии в ФРФБ, или в виде 50% суспензии в Alsevers. Применяют в течение 4 дней после сбора, титровальные микропланшеты, планшеты с U-образным дном Falcon, Catalog No. 3911 или эквивалент, 8-канальная микропипетка, 5-50 мкл, или эквивалент, центрифуга Beckman TJ-6 или эквивалент, 20-200 мкл микропипетка или эквивалент, одноразовые наконечники для пипетки 200 мкл, вирус для Положительного контроля с известным титром, инактивированный антиген. Хранят при 2-7°С и применяют как есть в день тестирования.

А. Суспензию стандартизированных 0,5% красных клеток крови самцов птиц (сККК) в ФРФБ готовят сначала уравновешиванием раствора сККК при комнатной температуре (15-30°С). ККК самцов птиц в Alseveres имеют 4-дневный срок годности, начиная с даты сбора. Достаточный объем сККК в Alsevers переносят в 50 мл коническую центрифужную пробирку. сККК промывают заполнением пробирки до отметки 45 мл ФРФБ или Alsevers и смешивают переворачиванием трубки несколько раз, затем центрифугируют при 400g, при 4°С в течение 10 минут. Надосадочную жидкость удаляют пипеткой. Если в надосадочной жидкости присутствует гемолиз, стадию промывки повторяют вплоть до трех раз. После конечной промывки 0,25 мл насыщенных ККК самцов птиц добавляют к 49,75 мл ФРФБ и переворачивают для смешивания. Суспензию клеток помечают датой приготовления, номером применяемой партии ФРФБ, и 0,5% красные клетки крови самцов птиц в ФРФБ хранят при 2-7°С (максимальное время хранения 4 дня).

В. Определяют количество титровальных микропланшетов, необходимое для тестирования образцов. Все тестируемые образцы тестируют с применением двух рядов для каждой схемы разведения 1:2 и 1:3. Также применяют два ряда положительного контроля вируса в разведении 1:2 и два ряда контроля ФРФБ. Другие образцы тестируют при необходимости. Ряды титровального микропланшета обозначают черным перманентным маркером. Пример показан ниже в таблице 2.

Таблица 2:

титровальный микропланшет

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

Серийное разведение 1:2

А

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

В

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

Серийное разведение 1:3

С

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

D

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

Положительный контроль вируса, разведение 1:2

Е

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

F

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

ФРФБ

G

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

ФРФБ

Н

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

50 мкл ФРФБ добавляют в каждую лунку титровального микропланшета. Дополнительные 50 мкл ФРФБ добавляют в лунку с номером один этих рядов с применением схемы разведения 1:3 и в контрольные ряды ФРФБ. Каждый титровальный микропланшет от момента добавления образца до момента добавления сККК заполняют полностью перед переходом к другому титровальному микропланшету. 50 мкл образца и положительного контроля вируса добавляют в лунку один обозначенных рядов. Серийные двукратные разведения образцов готовят с применением многоканального пипет-дозатора, перенося 50 мкл аликвоты. Подходящие наконечники асептически надевают на многоканальный пипет-дозатор, удостоверяясь, что пипет-дозатор установлен на 50 мкл. Содержимое лунок в одной колонке смешивают всасыванием и выталкиванием материала минимум семь раз. Наконечники, применяемые для смешивания, выбрасывают. Другие наконечники надевают и 50 мкл материала в каждой лунке переносят в следующую колонку лунок. Эти стадии повторяют до тех пор, пока все ряды не будут последовательно разведены. Обеспечивают удаление 50 мкл из двенадцатого ряда титровального микропланшета. 50 мкл 0,5% суспензии сККК добавляют в каждую лунку с применением многоканального пипет-дозатора. Суспензию сККК добавляют из лунок в наиболее высоким разведением в лунки с наиболее низким разведением. Каждый планшет осторожно встряхивают для смешивания содержимого. Титровальный микропланшет закрывают крышкой и планшеты складывают и инкубируют при комнатной температуре (приблизительно 20-25°С) в течение 45-60 минут.

После инкубации планшеты устанавливают на микропланшетный ридер для считывания и определения того, являются ли лунки с контролем ФРФБ приемлемыми (лунки с ФРФБ не должны показывать гемагглютинацию). Также определяют характеристики. сККК должны выпасть в осадок как единая лепешка без экрана. Реакция экранирования представляет собой дисперсию сККК. Если ФРФБ контрольные лунки приемлемы, другие лунки оценивают на гемагглютинацию. Если ФРФБ контрольные лунки не приемлемы, тест считается не пройденным и его повторяют. Результаты гемагглютинации записывают как положительные (+) для гемагглютинации, частичные (+/-) и отрицательные (0). Положительная реакция показывает полное экранирование сККК или полную дисперсию клеток. Отрицательная реакция показывает цельную лепешку, образованную сККК. Лунки, которые демонстрируют "+/-", считаются отрицательными в целях конечного подсчета. Наивысшее разведение, при котором возникает агглютинация (отсутствие лепешки), идентифицируют для каждого из повторов каждого разведения (т.е. 1:2 и 1:3) и титры заносят в компьютер как обратное от последнего разведения, демонстрирующего полную агглютинацию. Уровень титра образцов и положительный контроль тестируемого вируса идентифицируют. Определяют среднее арифметическое для конечного титра каждого набора дубликатов разведении. Определяют НА единицы на 0,5 мл (50 мкл) образца, ФРФБ и положительного контроля вируса. НА единицы на 1 мл рассчитывают умножением 0,05 мл значения на 20.

Расчет осуществляют следующим образом: для каждого из 1:2 и 1:3 разведения тестируемого образца записывают среднее арифметическое из двух повторов. Записывают наивысший титр. Умножают НА/0,05 мл × 20=НА/1 мл. Записывают дату окончания теста и результаты как НА единицы на 1 мл (вирусной жидкости) или НА единицы на дозу (конечный продукт). Пройденный тест для объемов или конечных продуктов включает полную агглютинацию (отсутствие лепешки) при наименьшем разведении, и отсутствие агглютинации (лепешка) при наивысшем разведении. Положительный контроль должен быть в установленных пределах. Пределы титра вне указанных параметров означают «отсутствие тестирования» или непрохождение теста, и тестирование необходимо повторить без систематической ошибки.

ПРИМЕР 7: Получение вакцины

Штамм вируса является пандемическим штаммом или сезонными штаммами, обозначенными ВОЗ, ЦКЗ или другими правительственными организациями. В целях подтверждения процесса производства человеческой вакцины применяют реассортант вируса гриппа VNH5N1-PR8/ЦКЗ-RG, ссылочный штамм, предоставленный ЦКЗ. Физиологический раствор с фосфатным буфером применяют в качестве разбавителя для препарата вакцины, и адъювантом является ISCOM. Липидную смесь из равных частей холестерина и фосфатидилхолина применяют для способствования процессу образования гидрофильных/гидрофобных комплексов при формировании ISCOM. Неионный детергент, который применяют для разрушения вируса, удаляют диальфильтрацией. Формирование ISCOMS подтверждают электронной микроскопией. Бинарный этиленимин (БЭИ) применяют для инактивации вируса, и затем БЭИ нейтрализуют тиосульфатом натрия. Процесс более подробно описан в стадиях 1-19 ниже.

Штамм гриппа получают в клетках Vero (почек африканских зеленых макак), инактивируют соединением азиридина бинарным этиленимином (БЭИ), концентрируют, очищают и очищают гель-хроматографией. Вирус смешан с адъювантом Quit А и липидной смесью с получением лекарственного средства.

Стадия 1А - клетки Vero регенерируют из Рабочего банка клеток (РБК). Количество пассажей ограничено до 20 пассажей от подходов Главного банка клеток (ГБК). Одну ампулу от РБК оттаивают в жидком азоте и высевают при 4-5×10⁴ клеток/см² в модифицированной по методу Дульбекко среде Игла (DMEM), содержащей 20% об./об. облученной фетальной бычьей сыворотки происходящей из Новой Зеландии или Австралии, 4 мМ L-глютамина в (обычно) 25 см² колбе Nunc. Колбу инкубируют при 36°С±2°С, надосадочную жидкость и присоединенные клетки удаляют примерно через 1 час и колбу загружают свежей средой и инкубируют как раньше.

Стадия 2А - Размножение клеток продолжают сбором слитых монослоев с применением раствора Трипсин/ЭДТК и повторно засевают клетки в более статичные колбы или роллерные флаконы. Дальнейшее размножение может быть проведено в биореакторах с применением микроносителей при 20-30 г/л.

Стадия 3А - Когда желаемый уровень производительности культурального субстрата достигнут в биореакторе или роллерных флаконах, клетки промывают дважды модифицированной по методу Дульбекко средой Игла (DMEM) для удаления остаточной сыворотки, это будет инактивировать трипсин в среде для заражения.

Стадия 1В - Рабочую затравку вируса (РЗВ) получают отдельно и замораживают для будущего крупномасштабного производства. Главную затравку вируса или Рабочую затравку вируса (ГЗВ+1) хранят при -70°С, оттаивают и разводят в среде для заражения вирусом, содержащей свиной трипсин IX типа для достижения желаемой МЗ. Предварительно определенный объем инокулируют в слитый монослой клеток Vero в роллерных флаконах или биореакторе при 36°С±2,0°С, обычно в течение 40-72 часов, если идентифицирован цитопатический эффект (ЦПЭ) вплоть до 100%. Вирус собирают и замораживают при -50°С или меньше.

Стадия 4 - Рабочую затравку вируса (не больше чем пассаж ГЗВ+2) оттаивают и разводят в среде для заражения вирусом, содержащей 0,5-5,0 мкг/мл свиного трипсина IX типа для получения желаемой множественности заражения. Применение трипсина в среде способствует присоединению и проникновению вируса в клетки.

Стадия 4А - получение вируса гриппа с применением биореактора. 5-литровый биореактор готовят с SoloHill Plastic Plus микроносителями при плотности 30 г/л. Биореактор засевают 2×10⁵ клетками Vero/мл в модифицированной по методу Дульбекко среде Игла с 5% об./об. облученной фетальной бычьей сывороткой из Новой Зеландии или Австралии, 4 мМ L-глютамина, и инкубируют при 36°С±2°С. После достижения конфлюентности клеток 80-100%, микроносители, содержащие клетки Vero, осаждают и промывают дважды 2 литрами на промывку не содержащей сыворотки DMEM. В биореактор добавляют среду для заражения, содержащую 2,5 мкг/мл трипсина IX. Вирусную затравку, например VNH5N1, также добавляют в биореактор при МЗ 0,0001-0,0003. Получение вируса продолжают в течение 5 дней. Из биореактора отбирают образцы ежедневно для наблюдения ЦПЭ и титрования НА. Вирус собирают после достижения 80-100% ЦПЭ.

Стадия 5 - Бинарный этиленимин (БЭИ) добавляют в собранный вирус до конечной концентрации 1,5 мМ и хранят при 36°С±2°С в течение 1 часа (при перемешивании) при рН 7,3±0,3.

Стадия 6 - После завершения стадии 5, сбор переносят во второй сосуд, и инактивацию продолжают при 36°С±2°С в течение 48 часов (при перемешивании). После этого добавляют тиосульфат натрия до конечной концентрации 3 мМ для нейтрализации остаточного БЭИ.

Стадия 7 - Культуру очищают через 7 мк и 1 мк фильтры и хранят при 2°С-8°С, ожидая очистки для безвредности. Тестирование безвредности занимает десять дней.

Стадия 8 - Антиген концентрируют с применением системы ультрафильтрации с тангенциальным потоком, с применением полсульфоновой мембраны с отрезком молекулярной массы (ОММ) 100 К. Получают вплоть до приблизительно 50-кратную концентрацию.

Стадия 9 - Полученные концентрированные культуральные жидкости уравновешивают в подходящем буфере и обрабатывают ДНКазой (бензоазой) для разрушения клеточной ДНК.

Стадия 10 - Концентрат очищают с применением гель-хроматографии. Применяемым гелем является поперечно-сшитый Sepharose (CL-2B, Pharmacia). Колонка имеет длину 90 см для достижения требуемого разделения. CL-2B представляет собой «мягкий» гель, который опирается на стенки колонки для поддержки. Обычно длину 90 см получают соединением 2×45 см или 3×30 см колонок (например, 30-32 см высотой и 30 см в диаметре). Концентрированный вирус наносят в количестве приблизительно 5-7% от объема колонки.

Стадия 11 - Пиковый материал вируса концентрируют повторно с применением лабораторной системы ультрафильтрации с тангенциальным потоком с 100 К ОММ полисульфоновой мембраной.

Стадия 12 - Повторно концентрированный пиковый материал вируса солюбилизируют добавлением 5 мл 10% (масс./об.) раствора детергента (нонаноил-N-метилглюкамид) Mega 9 до 200 мл антигенного раствора. Раствор медленно перемешивают магнитной мешалкой в течение 1 часа при 20-25°С в стеклянном контейнере.

Стадия 13 - Липидную смесь добавляют в количестве 50 мкл на 20 мл повторно концентрированного вирусного пика. Липидная смесь содержит 10 мг/мл каждого из фосфатидилхолина и холестерина из яиц. Перемешивание продолжают при 20-25°С для равномерного распределения липидов в повторно концентрированном вирусе. Quit А (от 10% масс./об. сток-раствора) добавляют с получением конечной концентрации 0,05%. Раствор перемешивают в течение приблизительно 30 минут при 20-25°С.

Стадия 14 - Детергент Mega 9 удаляют из этой смеси (для формирования ISCOM) диафильтрацией с 50 мМ ацетатом аммония. Ее проводят с применением лабораторной системы ультрафильтрации с тангенциальным потоком с 100 К ОММ полисульфоновой мембраной. Объем ацетата аммония составляет минимум около 10Х от объема смеси повторно концентрированного вирусного пика. Диафильтрацию проводят при сохранении постоянного объема через уравновешивание входящего и проникающего потоков. Детергент мешает образованию ISCOM. Электронная микроскопия подтверждает, что образована типичная клетокообразная структура.

Стадия 15 - ISCOM повторно концентрируют в качестве конечной стадии диафильтрации.

Стадия 16 - После удовлетворительного прохождения КК партии ISCOM составляют для получения вакцины с от 1 до 20 мкг НА человеческого гриппа на 1 мл дозу. Физиологический раствор с фосфатным буфером (ФРФБ) применяют в качестве разбавителя.

Стадия 17 - Смешанную вакцину заполняют в стандартные конечные контейнеры согласно условиям Класса А. Берут образцы на стерильность, безопасность для лабораторных животных, экстрагируемый объем и внешний вид. На вакцины клеят этикетки и упаковывают и хранят в карантине при температуре от 2° до 7°С.

Стадия 18 - После конечной очистки QA продукт переносят в холодильник для готовых продуктов (2-7°С) в ожидании отгрузки.

ПРИМЕР 8: Эффективность полученной в клетках Vero вакцины на хорьках

Оценивают способность полученной в Vero вакцины от гриппа видоизменять серологическую специфичность у хорьков. Трехвалентную вакцину вируса гриппа человека на основе сезонных штаммов гриппа 2006-2007 (A/NC/20/99, A/Wis/67/05 обе репликации PR8 и B/Malaysia, все от ЦКЗ) получают в клетках Vero после клонирования методом серийных разведении. Полученную вакцину, "SPflu0607," с или без ISCOM адъюванта, вводят в левую заднюю лапу 4-6-месячным самкам хорька. В качестве контроля тестируют коммерчески доступные вакцины от человеческого гриппа Fluzone® (производства Sanofi-Pasteur) и Fluvirin® (производства Chiron) вместе с SPflu0607. Одинарную радиальную иммунодиффузию (ОРИД) применяют для измерения количества белка гемагглютинина (НА) в вакцине. Видоизменение серологической специфичности у хорьков измеряют через ингибирование гемагглютинина (HI). HI титры более или равные 1:40 считаются положительными. (см. таблицу 3)

Таблица 3
Дни после вакцинации →	14 дней	28 дней	60 дней	90 дней
Вакцина	GMT	% положит.	GMT	% положит.	GMT	% положит.	GMT	% положит.
SPflu0607+ISCOM
7,5 мкг/мл	403	100	118	89	40	56	29	56
3,8 мкг/мл	1186	100	254	100	127	100	54	67
1,9 мкг/мл	274	100	93	89	50	67	25	44
SPflu0607
15 мкг/мл	118	67	43	67	29	56	20	33
7,5 мкг/мл	137	89	52	78	23	44	16	44
Chiron
15 мкг/мл	131	89	66	78	27	56	16	33
7,5 мкг/мл	148	78	63	67	32	56	29	56
Sanofi
15 мкг/мл	101	89	101	89	25	44	15	22
7,5 мкг/мл	135	88	80	88	28	50	12	25
Только ФРФБ	7	0	6	0	6	0	5	0
GMT - стреднегеометрический титр антител % положит. - процент животных с уровнем антител HI≥1:40

Указанные выше результаты означают, что вакцина, полученная в клетках Vero, сравнима с коммерчески доступными вакцинами, полученными из яиц.

ПРИМЕР 9: Способ репродукции вируса гриппа собаки для получения ВГС вакцины

Собачий грипп был выделен из носовых выделений больных собак. Были взяты мазки из носа и помещены в 2 мл культуральной среды для тканей, содержащей гентамицин и амфотерицин. 0,8 мл полученного мазка инокулируют в слитые клетки почек собак Мадин-Дарби (MDCK) в 10 мл DMEM культуральной среде для тканей, содержащей 1,3 мкг/мл трипсина IX типа, и инкубируют в течение 2 дней при 36±2°С. Колбу собирают декантированием среды, и вирус идентифицируют как H3N8 в лаборатории Национальной ветеринарной службы с применением стандартной антисыворотки. Перенесенный в MDCK вирус содержит 160 единиц гемагглютинина на мл. Вирус клонируют инокуляцией 10-кратных серийных разведении в слитые клетки MDCK в 96-луночных планшетах и собирают в одной лунке с наивысшим разведением, показывающим цитопатический эффект (культуральной средой для ткани является DMEM, содержащая 1,3 мкг/мл трипсина IX типа). Эту методику повторяют второй раз. Затем клон размножают в клетках MDCK в 75 см² колбе. Полученный вирус (пассаж 4) дает 640 единиц гемагглютинина на мл. Затем вирус переносят в клетки почек быка Мадин-Дарби инокуляцией 0,23 МЗ в слитый монослой в 1050 см² роллерном флаконе с применением 300 мл DMEM, содержащей 0,8 мкг/мл трипсина IX типа. Роллерный флакон инкубируют в течение 3 дней при 36±2°С. Собранный вирус дает 2560 ЕГА/мл. Из-за повышенного выхода НА в клетках MDBK, эта колония клеток выбрана для масштабного производства вирусной вакцины. Вирус размножают в биореакторе. 5-литровый биореактор засевают клетками MDBK в количестве 3,0×10⁵ клеток/мл, присоединенными к микроносителям Cytodex III в количестве 5 граммов на литр. Клетки выращивают в течение 4 дней в DMEM, содержащей 5% фетальной бычьей сыворотки без антибиотиков при 36±2°С. После осаждения микроносителей 90% среды удаляют и заменяют не содержащей сыворотки DMEM. Трипсин IX типа добавляют до концентрации 10 мкг/мл до конечных 5000 мл. Клетки заражают вирусом при МЗ 0,01. Вирус инкубируют с клетками MDBK на микроносителях в течение 2 дней при 36±2°С и затем надосадочную жидкость собирают. Полученный вирус дает 10240 ЕГА/мл.

ПРИМЕР 10: Клонирование методом серийных разведении клинического изолята без переноса в яйца дает однородную популяцию и улучшает TCID₅₀/мл и НА титр

Вирус гриппа собак H3N8 (дикий тип) получают из диагностической лаборатории и выделяют из мазка из носа. После получения мазок из носа обрабатывают и применяют для инокуляции 25 см² колбы, содержащей слитый монослой клеток MDCK. Инфекционная среда состоит из: DMEM, 4 мМ L-глютамина/мл, 1,3 мкг/мл типа IX и гентамицина. Колбу инкубируют при 36±2°С с 3-5% CO₂ и собирают при наступлении ЦПЭ. НА анализ проводят для собранных жидкостей с результатом 160 ЕГА/мл и TCID₅₀/мл титр 7,94.

Клетки MDCK засевают в 96-луночные планшеты при 1×10⁴-1×10⁵ клеток/мл, 200 мкл/лунку в DMEM, содержащей 5% фетальной бычьей сыворотки, и инкубируют в течение 3-4 дней (пока слитые) при 36±2°С, 3-5% CO₂. ВГС H3N8 вирус разводят как указано в разделе: серийное разведение, цикл 1. Разведение проводят в DMEM, содержащей 1,3 мкг/мл трипсина IX типа, 4 мМ L-глютамина и гентамицин. Среду удаляют из клеток MDCK, лунки промывают 280 мкл физиологического раствора с фосфатным буфером и затем 200 мкл каждого разведения вируса инокулируют в 8 дублирующих лунок. Планшеты инкубируют в течение 4 дней при 36±2°С, 3-5% CO₂. Осуществляют два цикла клонирования методом серийного разведения, цикл серийного разведения 2 сразу же после цикла серийного разведения 1. Способ дает вирусный изолят, которые имеет высокий TCID₅₀/мл и титры гемагглютинации. Вирус из лунки с самыми высокими разведениями, который демонстрирует самую низкую степень цитопатического эффекта, собирают и клонируют методом серийных разведении второй раз.

Серийное разведение, цикл 1

Материал из 1 прохода титруют с результатом 7,5 TCID₅₀/мл основываясь на этом значении, вирус разводят с получением 5 образцов.

А. 10^-4

В. 10^-5

С 10 частиц вируса/лунку (10^-6,5)

D. 3 частицы вируса/лунку (10^-7,02)

Е. 1 частица вируса/лунку (10^-7,5)

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
А	Контроль разбавителя	10-4	10-5	10-6,5	10-7,02	10-7,5
В
С
D
Е
F
G
Н

Лунку A11 собирают в препарате в цикле 2 клонирования методом серийного разведения.

Серийное разведение, цикл 2

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
А	Контроль разбавителя	10-10	10-9	10-8	10-7	10-6	10-5	10-4	10-3	10-2	10-1	Контроль разбави-теля
В
С
D
Е
F
G
Н

Вирус из лунки А5 собирают

Вирус, собранный во втором цикле клонирования методом серийных разведении (~200 мкл) применяют для инокуляции 75 см² колбы, содержащей слитый монослой клеток MDCK и DMEM с добавлением 1,3 мкг/мл трипсина IX типа, 4 мМ L-глютамина/мл и 25 мкг/мл гентамицина. Собранные надосадочные жидкости культуры титруют для определения TCID₅₀/мл и титра гемагглютинации (см. таблицу 4).

ТАБЛИЦА 4
Пассаж вируса	TCID50/мл	ЕГА/мл
Пассаж 1 из полевого изолята	7,94	160 ЕГА/мл
Пассаж 4, предосновная затравка	7,69	640 ЕГА/мл

В лабораторных экспериментах, проводимых в исследованиях иммуногенности, вирус выращивают в клетках MDBK в 5-литровом биореакторе с получением титра гемагглютинации 10,240 ЕГА/мл.

ПРИМЕР 11: Эффективность инактивированной вакцины вируса собак у собак

Вирус гриппа собак (ВГС) серотип H3N8 вызывает тяжелое респираторное заболевание у собак. Однако в настоящее время не существует эффективной вакцины против ВГС. Объектом этого исследования является оценка эффективности инактивированной вакцины ВГС, полученной серийным разведением и репродуцированием ВГС в клетках культуры ткани, в профилактике клинического заболевания и патологических изменений в легких, вызванных вирулентным контрольным заражением ВГС. Вакцина состоит из бинарного этиленимина (БЭИ)-инактивированного ВГС антигена в сочетании с адъювантом Emunade® при входном уровне антигена 500 единиц гемагглютинации (ЕГА) на дозу. Группу из восьми 7-недельных ВГС серонегативных собак вакцинируют внутримышечно вакциной, и повторную дозу вводят через 21 день после первичной вакцины. Две недели после повторной вакцинации, вакцинированные собаки демонстрируют значительно более высокие уровни титра НА ингибирующих антител по сравнению с невакцинированными собратьями, что демонстрирует стимулирование вакциной иммунной реакции у собак. Невакцинированных контрольных и вакцинированных собак заражают гетерогенным вирулентным ВГС изолятом через 16 дней после повторной вакцинации, и отслеживают ежедневно в течение 10 дней после заражения на наличие клинических признаков, ректальной температуры и носового распространения ВГС. Все контрольные собаки (100%) имеют клинические признаки, включая течение из глаз и носа, чиханье и кашель, что показывает вирулентность испытываемого вируса. Вакцинированная группа демонстрирует значительное меньшие клинические признаки (средняя оценка = 4,3) по сравнению с контрольной группой (средняя оценка = 6,8; р=0,0051). Только одна из собак вакцинированной группы (12,5%) имеет носовое распространение ВГС и только в течение одного дня, в то время как все собаки контрольной группы (100%) имеют значительное более высокое распространение вируса по сравнению с вакцинированными (р=0,0003). Распространение вируса длится в течение 7 дней после заражения контрольной группы. Всех собак умерщвляют через 10 дней после заражения, и проводят аутопсию для оценки повреждений легких. Все собаки в контрольной группе (100%) показывают разную степень уплотнения в легких, в то время как только одна собака в вакцинированной группе (12,5%) демонстрирует мягкую степень уплотнения в легких. Оценка легких значительно выше у контрольных собак (средняя оценка = 4,9) по сравнению с вакцинированными собаками (средняя оценка = 0; р=0,0005). Эти результаты однозначно демонстрируют, что композиция вакцины, тестированная в этом исследовании, защищает собак от инфекции ВГС, значительно снижая клинические признаки, снижая распространение вируса и предотвращая вызванное ВГС уплотнение легких.

Обзор исследования

Объектом исследования является тестирование эффективности Emunade®-адъювированной композиции вакцины ВГС для защиты от заражения ВГС у собак.

Собак сначала акклиматизируют в течение восьми дней. Для тестируемой группы первую вакцинацию проводят на 0 день, и повторную вакцинацию проводят на 21 день. Контрольную группу не вакцинируют. Заражение ВГС проводят в обеих группах на 37 день. Собак наблюдают и оценивают в течение всего исследования, как описано ниже. Собак умерщвляют через 10 дней после заражения и проводят аутопсию.

Тестируемые животные

Тестируемые животные имеют возраст 48,25 дней на 0 день. В контрольной группе 8 собак и в тестируемой группе 8 собак. Средний вес собаки составляет 1,8 кг. Собаки, применяемые в исследовании, не имеют истории респираторной инфекции или ВГС вакцинации. Для подтверждения того, что собаки являются отрицательными к ВГС антителам (НА титр <10), образцы крови собирают на день -1 и тестируют в анализе ингибирования гемагглютинации. Мазки из носа также отбирают в день -1 для того, чтобы убедиться в том, что собаки не имеют ВГС во время вакцинации.

Отслеживание перед вакцинацией

Образцы крови собирают от всех собак в пробирках для отделения сыворотки с откачанным воздухом за день до введения первой вакцины для подтверждения того, что собаки являются отрицательными к ВГС антителам. Мазки из носа берут в тот же день для подтверждения того, что собаки не имеют ВГС.

Общее состояние здоровья собак оценивают физическим исследованием собак за два дня до первой вакцинации. Клинические оценки и ректальную температуру оценивают за два дня до первой вакцинации и повторной вакцинации вплоть до дня вакцинации.

Вакцинация

Вакцина вируса гриппа собак ВГС H3N8-Emunade® применяют в этом исследовании. Вирус гриппа собак (H3N8) изначально выделен у собак с тяжелым респираторным заболеванием. Клетки почек быка Мадин-Дарби (MDBK)-KC при MCS+19 уровне пассажа, т.е. после 19 пассажей исходного клеточного сырья, применяют для репродуцирования ВГС H3N8. Затем вирус инактивируют добавлением 6 мМ БЭИ в течение 60 часов при 36°С. БЭИ нейтрализуют 60 мМ тиосульфата натрия.

Вакцину для этого исследования готовят в 800 мл исходного раствора для аликвотирования в 800 доз по одному мл. 800 мл раствора готовят как показано в таблице 5.

Таблица 5
Компонент	Применяемый объем
Водная фаза:
Инактивированный ВГС (2560 ЕГА/мл)	156 мл
Физиологический раствора	342 мл
Гидроксид алюминия (2,1% оксид алюминия)	77 мл
Этиловый спирт	16 мл
Глицерин	40 мл
HEPES1M	8 мл
1% раствор красного красителя	0,8 мл
Масляная фаза:
Минеральное масло	107 мл
Tween 80	34,5 мл
Span 80	18,4 мл
Консервант:
Гентамицин	0,373 мл
Общий объем	800,0 мл

Инактивированный ВГС H3N8 вирус разводят в нормальном физиологическом растворе и затем смешивают с гидроксидом алюминия. Оставшиеся компоненты в водной фазе добавляют к адъювированному антигену. Масляную фазу готовят отдельно и затем добавляют к водной фазе в течение 10 минут при постоянном перемешивании в течение одного часа. Серию гомогенизируют с применением гомогенизатора Silverson в течение 30 минут.

Флаконы с вакциной ВГС, хранящиеся при 2-7°С, уравновешивают до комнатной температуры в течение минимум 30 минут. Вакцину загружают в 3-мл шприцы (1 мл на шприц) и применяют для иммунизации. Первую дозу вакцины вводят внутримышечно в правую заднюю лапу в 0 день и вторую дозу вводят внутримышечно в левую заднюю лапу на 21 день.

Процедуры после вакцинации

Полную клиническую оценку, включая ректальные температуры и место инъекции, проводят для всех собак через 3-6 часов после каждой вакцинации для измерения каких-либо немедленных реакций. Клиническую оценку проводят ежедневно в течение 7 дней после каждой вакцинации и оценивают согласно Инструкции по клинической оценке, представленной ниже. У собак берут кровь на 20 и 36 день исследования, и образцы сыворотки применяют для измерения ВГС антител через ингибирование гемагглютинации.

Процедуры перед заражением

Клинические оценки проводят и ректальные температуры записывают для всех собак в течение двух дней до заражения (дни 35 и 36) и в день заражения (день 37) перед введением вируса. Клинические признаки оценивают согласно Инструкции по клинической оценке.

Заражение

Материал для заражения: ВГС14-06А вирус, выделенный из клеток MDCK и применяемый для заражения вакцинированных собак, изначально выделен из полевых образцов, собранных у собак, страдающих респираторным заболеванием собак. Средний титр заражающего вируса составляет 7,7 Log₁₀TCID₅₀/мл. В день заражения материал для заражения разводят до 1:4 в стерильной холодной модифицированной методом Дульбекко среде Игла (DMEM) для получения заразной дозы 7,4 Log₁₀TCID₅₀ на собаку.

Введение вируса: всем собакам вводят вирус на 37 день. Четырех собак помещают в клетку из Плексигласа, и 8 мл заразного вируса применяют для получения аэрозоля в течение приблизительно 20 минут. Собак обрабатывают аэрозолем в течение 40 минут.

Мониторинг после заражения

Ректальную температуру записывают, и клиническую оценку проводят для каждой собаки в течение 10 дней после заражения. Мазки из носа собирают ежедневно у каждой собаки в течение 10 дней после заражения. Мазки из носа обрабатывают и титруют ежедневно после каждого сбора, как описано здесь. Образцы крови собирают в пробирки для отделения сыворотки с отсосанным воздухом на 10 день после заражения непосредственно перед умерщвлением.

Аутопсия

Всех зараженных собак умерщвляют на 10 день после заражения (день 47) с применением AVMA одобренного способа (Кетаминовые коктейли и Beuthanasia-D), и проводят аутопсию. Сразу же после умерщвления оценивают легкие. Области видимого уплотнения оценивают как процент уплотнения каждой легочной доли. Проценты преобразуют в массовые коэффициенты, и рассчитывают общую оценку для каждой собаки. Во время аутопсии ткань легких собирают для выделения и титрования вируса, и для гистопатологии.

Титрование вируса

Анализ гемагглютинации (НА) проводят для титра вируса. Вирус серийно двукратно разводят в титровальном микропланшете с V-образным дном и равное количество 0,5% суспензии красных клеток крови индейки (ККК) добавляют к суспензии вируса. Планшеты инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин и считывают результаты НА. Наибольшее разведение вируса, показывающее активность НА, считается как 1 единица НА. Все анализы проводят два раза и измеряют конечный титр НА.

Для подтверждения мощности материала для заражения и для измерения распространения вируса у зараженных собак, титр вируса в материале для заражения, мазке из носа и ткани легких определяют титрованием в клетках MDCK. Клетки MDCK высевают в 96-луночный планшет для культивирования ткани в течение двух дней и инокулируют десятикратным серийным разведением суспензии вируса или образцами, полученными из ткани легких или мазка из носа. Планшеты инкубируют Т при температуре 36±2°С и 5% CO₂. Через 7 дней после заражения планшеты осматривают для определения цитопатического эффекта (ЦПЭ), и 50% конечное значение для инфекционности рассчитывают с применением метода Спирмана-Карбсра. Титры вируса выражают как Log₁₀TCID₅₀/мл.

Определение серологической реакции

Антитела к ВГС в образцах сыворотки собак измеряют через анализ ингибирования гемагглютинации (ИГА). Вкратце, серийное двукратное разведение тестируемой сыворотки готовят в ФРФБ в 96-луночных титровальных микропланшетах с V-образным дном. Равный объем вирусной суспензии, содержащей 4-8 ЕГА ВГС25-06 В, добавляют в каждую лунку, содержащую тестируемую сыворотку, и планшеты инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин для реакции антиген-антитело. Затем равный объем 0,5% суспензии ККК индейки добавляют. Планшеты инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин и считывают результаты ИГА. Обратное значение наибольшего разведения сыворотки, показывающего ингибирование НА, считается титром ИГА тестируемого образца. Все анализы проводят дважды и определяют конечный титр ИГА.

Результаты: клиническая оценка

Всех собак отслеживают ежедневно, от двух дней до заражения до 10 дней после заражения, для определения клинических признаков, включая течение из глаз, течение из носа, чихание, кашель, затруднение дыхания и депрессию. Ежедневная клиническая оценка течения из глаз, течения из носа, чихания, кашля, депрессии и затруднения дыхания в течение 10 дней после заражения суммируют с получением суммарной клинической оценки для каждой собаки. Суммарные клинические оценки для вакцинированных и контрольных собак сравнивают с применением тестов Wilcoxon Exact Rank Sum и рассчитывают двусторонние р-значения.

Собаки и в контрольной и в вакцинированной группе демонстрируют ряд клинических признаков, начиная со второго дня после заражения (фигура 1). Все восемь собак (100%) в контрольной группе демонстрируют различную степень кашля, который длится вплоть до пяти дней в течение 10-дневного периода наблюдения после заражения. С другой стороны, только две собаки (25%) в вакцинированной группе демонстрируют слабый кашель только в течение одного дня во время 10-дневного периода после заражения. Кашель является преобладающим признаком, демонстрируемым собаками в контрольной группе. Наоборот, только незначительное течение из глаз является преобладающим клиническим признаком, демонстрируемым вакцинированными собаками. Клинические оценки значительно выше (р=0,0051) в контрольной группе (средняя оценка=6,8), по сравнению с вакцинированными собаками (средняя оценка=4,3). Эти данные подтверждают, что ВГС вакцина защищает собак от вызванных ВГС клинических признаков.

Результаты: носовое распространение вируса

Носовое распространение вируса отслеживают у всех собак сбором и обработкой мазков из носа за один день до заражения (день -1) и затем ежедневно с 1 по 10 день после заражения. Титры вируса (Log₁₀TCID₅₀/мл) мазков из носа определяют и наносят на график как функцию от времени. Площадь под кривой сравнивают между контрольной и вакцинированной группами с применением тестов Wilcoxon Exact Rank Sum. Средний титр вируса для каждой группы, выраженный как Log₁₀TCID₅₀/мл, наносят как функцию от дней после заражения (фигура 2).

У контрольной группы начинается распространение вируса через 1 день после заражения. Распространение вируса достигает своего пика на 5 день после заражения (1,25 Log₁₀TCID₅₀/мл) с последующим резким падением на 7 день (фигура 2). Все собаки в контрольной группе являются положительными к распространению вируса в один или более моментов времени в течение 10-дневного периода после заражения. С другой стороны, только одна собака (12,5%) в вакцинированной группе (ID No CXTAMM) распространяет вирус в носовом секрете только в течение одного дня (день 3). Невакцинированные контрольные собаки демонстрируют значительно более высокое распространение вируса в носу по сравнению с вакцинированными собаками (р=0,0003). Эти результаты ясно показывают, что ВГС вакцина значительно ингибирует распространение вируса в носу у вакцинированных собак.

Результаты: серологическая реакция

Среднегеометрические титры антител (СГТ) из анализа ИГА рассчитывают после первичной и повторной вакцинации. Записывают степень повышения в титрах между вакцинациями. Титры антител сравнивают в контрольной и вакцинированной группах с применением тестов Wilcoxon Exact Rank Sum. Все 16 собак, участвующих в исследовании, являются здоровыми и сероотрицательными (т.е. отрицательными к ВГС антителам) (ИГА титр <10) в момент первичной вакцинации. Мазки из носа, собранные за день до вакцинации (день -1) подтверждают, что собаки не имеют распространения вируса в носу. Контрольные собаки остаются сероотрицательными во время заражения.

Титры антител ИГА сводят в таблицу и сравнивают для контрольной и вакцинированной групп. Все вакцинированные собаки образуют измеримые уровни титров антител после первой вакцинации. Титры антител ИГА варьируются от 10 до 40 при СГТ 22, и титры являются значительными по сравнению с контрольными собаками (р=0,0070). Вторая вакцинация увеличивает титры антител в шесть раз (СГТ=135), что значительно выше, чем в контрольной группе (р=0,0002). Титры антител варьируются от 80 до 160, где большинство собак демонстрируют титр ИГА 160 (75%). Все контрольные собаки не имеют ВГС антител до момента заражения (титр ИГА <10). После заражения титры антител у вакцинированных собак достигают очень высоких уровней (СГТ=546), что демонстрирует эффективность вакцины в примировании иммунной системы против вирулентного ВГС. Титры ИГА у этих собак варьируются от 120 до 1920. У невакцинированных контрольных собак также образуются антитела после заражения ВГС при СГТ 149.

Результаты: уплотнение легких, выделение вируса и гистопатология

Уплотнение в легких/пневмония является основным патологическим повреждением при всех инфекциях гриппа. В предыдущем исследовании развития модели заражения мы наблюдали тяжелые уплотнения у собак на 6 и 14 дни после заражения. Поэтому для оценки того, защищает ли вакцина ВГС от вызванного ВГС уплотнения в легких, всех собак в контрольной и вакцинированной группах умерщвляют на 10 день после заражения и проводят аутопсию. Повреждения легких оценивают и подсчитывают как процент уплотнения в каждой легочной доле. Процент уплотнения в каждой доле легкого, определенный во время аутопсии, преобразуют в взвешенные оценки на основе системы оценки легких для собак (также как в системе оценки легких для свиного вируса гриппа в Diseases of the Swine (1999) 8th Ed., Ch. 61, p.913-940). Средние оценки легких для вакцинированных и контрольных групп сравнивают с применением тестов Wilcoxon Exact Rank Sum и записывают двусторонние р-значения. Уменьшенные доли позволяют оценить эффективность вакцины по сравнению с контрольной группой, и интервал доверия 95% для оценки также записывают.

Все собаки в контрольной группе (100%) демонстрируют различную степень уплотнения легких, в то время как только одна собака в вакцинированной группе показывает слабое уплотнение в легких (12,5%). Повреждения легких у не вакцинированных собак характеризуются кровотечениями и красноватыми уплотнениями и гепатизацией. Оценка легких у контрольной группы варьируется от 0,10 до 14,70 при средней оценке легких 4,9. Оценки легких в контрольной группе намного выше, чем в вакцинированной группе (р=0,0005; оценка уменьшенной доли 93,5%). Оценка легких однозначно демонстрирует, что ВГС вакцина, применяемая в этом исследовании, защищает собак от вызванного ВГС уплотнения легких.

В дополнение к оценке повреждений во время аутопсии, ткани легких также асептически собирают для выделения вируса и помещения в формалин для гистопатологии. Не найдено определимого ВГС в ткани легких вакцинированных и контрольных собак, что соответствует отсутствию распространения вируса в носу. Это было ожидаемо, так как вирусы гриппа вызывают острую инфекцию с пиковым распространением вируса и клиническими признаками в течение первых семи дней. Вирус полностью вычищается из легочной ткани на 10 день после заражения. Эти результаты согласуются с результатами предыдущего исследования. Гистопатологическое исследование показало различные степени гистопатологических изменений позволяющих предположить воспаление в тканях легких у контрольных и вакцинированных собак. Это открытие не было неожиданным, так как иммунная реакция на любой патоген скорее всего вызывает определенную степень воспаления даже в присутствии специфического к патогену иммунитета. Более того, тяжесть гистопатологических повреждений легких у контрольных и вакцинированных собак не может быть сравнима, так как ткани не отбирали селективно из областей с повреждениями легких. Поэтому гистопатология не может применяться как критерий для оценки эффективности вакцины в этом исследовании.

Выводы

Вакцинация вызывает значительно более сильную реакцию антител, что определяется анализом ИГА, после первой (СГТ=22) и второй вакцинаций (СГТ=135), что указывает на стимулирование иммунной реакции вакциной.

Вакцина значительно снижает вызванные ВГС клинические симптомы, особенно кашель, в дозе 500 ЕГА на собаку, что демонстрирует эффективность вакцины в контроле вызванных ВГС клинических заболеваний.

Вакцина значительно снижает распространение вируса в носу у вакцинированных собак, что демонстрирует эффективность вакцины для снижения инфекции.

Вакцина успешно защищает собак от вызванного ВГС уплотнения легких, что доказывает эффективность вакцины против наиболее тяжелого клинического проявления, пневмонии.

Вакцина не вызывает значительных побочных реакций у собак, что демонстрирует безопасность вакцины.

Инструкция по клинической оценке

Выделения из носа

0 = Отсутствуют

0,5 = Серозные выделения: капли жидкости из ноздрей. Жидкости вытекают из носа.

1 = Слизисто-гнойные выделения, от слабых до умеренных: мутная жидкость, смешанная со слизистыми выделениями, проходящие, по крайней мере, половину пути от носа до рта.

2 = Слизисто-гнойные выделения, сильные: слизь течет ниже рта.

Выделения из глаз

0 = Отсутствуют: незначительное количество сухого коркового материала в углах глаз не считается выделениями из глаз.

0,5 = Серьезные выделения: прозрачная жидкость, текущая из глаз.

1 = Слизисто-гнойные выделения, от слабых до умеренных: мутная жидкость, смешанная со слизистыми выделениями, текущие, по крайней мере, половину пути от глаза до рта.

2 = Слизисто-гнойные выделения, сильные: Жидкость или слизь течет на половину к носу или ободку глаза и пропитывает шерсть во внутреннем или внешнем углу глаза.

Кашель

0 = Отсутствует

0,5 = Слабый: только один короткий кашель.

1,0 = Умеренный: кашель постоянный, возникает неоднократно в течение одного периода наблюдения.

2,0 = Тяжелый: кашель сопровождается звуками першения или позывами на рвоту.

Чихание

0 = Отсутствует

2 = Присутствует

Затруднение дыхания

0 = Отсутствует (нормальное дыхание)

2 = Присутствует (одышка)

Депрессия

0 = Отсутствует (нормальная активность)

2 = Присутствует: собака менее активна или игрива, чем обычно. Собак записывают, если они находятся в летаргическом состоянии или лежат и неохотно встают при проведении исследования.

Хотя представленное выше изобретение подробно описано для целей ясности понимания, очевидно, что определенные модификации могут быть проведены на практике в пределах объема формулы изобретения. Все публикации и патентные документы, цитированные здесь, включены в качестве ссылок полностью для всех целей до той степени, до которой каждая из них отдельно указана.

Из представленного выше описания очевидно, что данное изобретение имеет множество областей применения. Например, данное изобретение предназначено для применения с любыми недавно идентифицированными штаммами вируса гриппа для получения адаптированных к культуре клеток изолятов и/или для вакцин, а также известных патогенных штаммов. В данном изобретении представлено применением любой недавно идентифицированной культуры клеток, которые позволяют выращивание вируса гриппа. В данном изобретении представлено получение адаптированных к культуре ткани штаммов в вакцинах, содержащих, по крайней мере, ослабленный, субъединичный, сплит- или убитый вирус, но также включающих адъюванты, носители, наполнители, лекарственные средства против гриппа и другие агенты, которые повышают иммунную реакцию на вирус. Вакцины могут применяться до контакта с гриппом или после контакта.

1. Способ выбора человеческого вируса гриппа для выращивания на клетках культуры ткани клонированием методом серийных разведений, где способ включает:
(а) серийное разведение количества вируса гриппа человека для получения серии разведений с понижающейся концентрацией вируса гриппа;
(b) смешивание количества вируса гриппа с эффективным количеством трипсина;
(с) контактирование каждого разведения вируса гриппа человека из серии разведений с культивированными клетками культуры ткани;
(d) выращивание вируса гриппа человека, который был приведен в контакт с клетками на стадии (с) в течение времени, достаточного для получения цитопатического эффекта (ЦПЭ);
(е) сбор вируса гриппа человека, выращенного на стадии (d), из клеток культуры ткани, с которыми был приведен в контакт вируса гриппа человека, с наибольшего разведения из серии разведение, которое вызывает ЦПЭ; и
(f) повторение стадий (а) - (е) с количеством вируса гриппа человека, собранного на стадии (е), где стадии (а) - (f) выполняются от двух до трех раз.

2. Способ по п.1, где трипсином является трипсин IX типа.

3. Способ по п.1, где контактирование на стадии (b) проводят при множественности заражения (МЗ) менее чем приблизительно 0,01.

4. Способ по п.1, где клетками культуры ткани являются клетки почек эмбриона млекопитающих.

5. Способ по п.4, где клетки почек эмбриона млекопитающих представляют собой клетки почек эмбриона человека.

6. Способ по п.4, где клетки почек эмбриона млекопитающих представляют собой клетки почек быка Мадин-Дарби (MDBK).

7. Способ по п.1, где вирусом гриппа человека является вирус гриппа A, B или C.

8. Способ по п.7, где вирусом гриппа А является штамм H5N1.

9. Способ по п.1, где вирус гриппа человека сначала выращивают в оплодотворенных яйцах для получения большого количества вируса гриппа человека.

10. Способ по п.1, где вирус гриппа сначала выращивают на амниотической оболочке для получения большого количества вируса гриппа человека.

11. Способ получения вакцины вируса гриппа человека, включающий:
(а) серийное разведение количества вируса гриппа человека для получения серии разведений с понижающейся концентрацией вируса гриппа;
(b) контактирование каждого разведения вируса гриппа человека из серии разведений с культивированными клетками культуры ткани;
(с) выращивание вируса гриппа человека, который был приведен в контакт с клетками на стадии (b) в течение времени, достаточного для получения цитопатического эффекта (ЦПЭ);
(d) сбор вируса гриппа человека, выращенного на стадии (с), из клеток культуры ткани, с которыми был приведен в контакт вируса гриппа человека, с наибольшего разведения из серии разведений, которое вызывает ЦПЭ;
(e) повторение стадий (a) - (d) с количеством вируса гриппа человека, собранного на стадии (d), где стадии (а) - (е) выполняются от двух до трех раз, и затем
(f) очистку вируса, собранного на стадии (e), для получения вакцины вируса гриппа человека.

12. Способ по п.11, где стадию очистки проводят с применением гель-хроматографии.

13. Способ по п.11, дополнительно включающий обработку вируса бинарным этиленимином (БЭИ) в количестве, эффективном для инактивации вируса.

14. Способ выбора вируса гриппа человека для выращивания на клетках культуры ткани клонированием методом серийных разведений, где способ включает:
(а) серийное разведение количества вируса гриппа человека для получения серии разведений с понижающейся концентрацией вируса гриппа;
(b) смешивание вируса гриппа человека с эффективным количеством трипсина IX типа;
(c) контактирование каждого разведения вируса гриппа человека из серии разведений с клетками почек эмбриона млекопитающих;
(d) выращивание вирусов гриппа человека, которые были приведены в контакт с клетками на стадии (с) в течение времени, достаточного для получения цитопатического эффекта (ЦПЭ);
(e) сбор вируса гриппа человека, выращенного на стадии (d), из клеток почек эмбриона млекопитающих, с которыми был приведен в контакт вируса гриппа человека, с наибольшего разведения из серии разведений, которое вызывает ЦПЭ;
(f) серийное разведение количества вируса гриппа человека, собранного на стадии (е) для получения серии разведений с понижающейся концентрацией вируса гриппа человека;
(g) смешивание вируса гриппа человека, собранного на стадии (е), с эффективным количеством трипсина IX типа;
(h) контактирование каждого разведения вируса гриппа человека из серии разведений с клетками почек эмбриона млекопитающих;
(i) выращивание вирусов гриппа человека, которые были приведены в контакт с клетками на стадии (h) в течение времени, достаточного для получения цитопатического эффекта (ЦПЭ); и
(j) сбор вируса гриппа человека, выращенного на стадии (i), из клеток почек эмбриона млекопитающих, с которыми был приведен контакт вируса гриппа человека, с наибольшего разведения из серии разведении на стадии (f), которое вызывает ЦПЭ.

15. Способ по п.14, где клетки почек эмбриона млекопитающих представляют собой клетки почек эмбриона человека.

16. Способ по п.15, где вирус гриппа человека представляет собой штамм H5N1.