Штамм дрожжей saccharomyces cerevisiae, используемый для получения спирта
Владельцы патента RU 2492229:
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Прикаспийский институт биологических ресурсов Дагестанского научного центра Российской академии наук (RU)
Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Saccharomyces cerevisiae №8 Спиртовой (8-С), обладающий высокой генеративной активностью, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ В-3855 и может быть использован при производстве спирта. Изобретение позволяет повысить выход спирта и снизить образование побочных продуктов. 3 табл., 2 ил.
Изобретение относится к спиртовой промышленности и представляет собой новый штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae В - 3855, используемый для производства спирта.
В производстве спирта из мелассы дрожжи должны обладать высокой бродильной энергией с анаэробным типом дыхания, переносить большую концентрацию солей и сухих веществ, быть устойчивыми к продуктам обмена посторонних микроорганизмов.
В производстве спирта из мелассы применяются различные штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae и среди них наиболее распространенной является производственная раса Я, с хорошими технологическими свойствами [1, 2] - аналог. Однако, эта раса имеет сравнительно невысокую генеративную активность, обладает повышенной потребностью к стимуляторам роста, чувствительностью к вредным примесям мелассной среды. В морфологическом отношении штамм неоднороден по величине и форме, с наличием в популяции удлиненных клеток, имеющих замедленную скорость роста, более длительное время генерации по сравнению с овальными клетками.
Известно также, что традиционной средой для выращивания дрожжей S. cerevisiae, используемых в спиртовой промышленности является мелассная питательная среда. Создание современных прогрессивных технологий пищевого спирта диктует необходимость получения физиологически активных рас дрожжей, обеспечивающих эффективное сбраживание концентрированного мелассного сусла. Нами установлено, что минеральные и органические вещества геотермальной воды нефенольного класса можно рассматривать как новый источник питания дрожжей. Установлено также, что интенсификация синтеза этанола на 25% и значительное снижение весьма нежелательных примесных соединений с использованием штамма S. cerevisiae Y-503 обусловлены возможностью изменения метаболизма дрожжей на основе влияния биологически активных веществ геотермальной воды [3, 4]. В связи с этим, новый штамм получают на мелассной питательной среде, где в качестве минерального и органического питания используют геотермальную воду нефенольного класса с общей минерализацией 5.2-5.4 г/л, разбавленную водопроводной водой до минерализации 4.0-5.2 г/л. Наличие таких важных минеральных веществ, необходимых для жизнедеятельности живых организмов, как K, Na, Mg, Ca, Fe, Mn, а также борная, кремниевая кислоты, органические вещества, в частности, гумусовые, являющиеся стимуляторами мембранных перестроек в живой клетке, создают благоприятные условия в среде культивирования для выращивания дрожжевых организмов.
Задачей изобретения является создание стабильного штамма спиртовых дрожжей для эффективного сбраживания мелассной питательной среды с использованием геотермальной воды нефенольного класса с концентрацией углеводов 21.0 г / 100 см3, способного сохранять спиртоустойчивость, высокие биохимические и технологические свойства в результате селекции при длительном пассажировании его на твердых и жидких средах. Технический результат направлен на повышение выхода спирта.
Предлагаемый штамм дрожжей имеет следующую характеристику. Морфолого-культуральные признаки. Клетки в суточной культуре на мелассной питательной среде с геотермальной водой (МПСГВ) имеют округло-овальную форму, размером 6-8×11-13 мкм; на МПСГВ + агар - овальная, яйцевидная, размером 6-7×11-12 мкм. Культура размножается вегетативным путем, образует сумки со спорами (среда Городковой, гипсовые блоки, голодный агар). Микроколонии на МПСГВ + агар - округлые, гладкие, слегка блестящие с ровным краем, размером 4-7 мм, палевого цвета. Макроколонии (20-ти суточная)- округлой формы, размером 2.9×2.7 см, поверхность радиально исчерченная с концентрическими кругами, слегка блестящая, светло-палевая, край волнистый, профиль слегка выпуклый с небольшими конусом, структура однородная, консистенция мажущаяся (рис.1,2).
Физиолого-биохимические признаки. Штамм S. cerevisiae В - 3855 полностью сбраживает: глюкозу, фруктозу, сахарозу, лактозу, мальтозу, раффинозу, простые декстрины; не сбраживает и не усваивает лактозу и инулин. Усваивает уксусную, молочную, не усваивает янтарную, яблочную, винную, лимонную кислоты [5]. Сбраживает высококонцентрированные рассиропки с содержанием углеводов 21.0 г / 100 см3, синтезируя 12.4 об.% спирта. Оптимальная температура роста 20-30°С, однако может расти и при температуре 32-33°С. Оптимальными значениями рН среды являются 4.5-5.5.
Предлагаемый штамм S. cerevisiae В - 3855 хранится в ВКПМ ГНИИгенетика под коллекционным номером В - 3855 и в дрожжевой коллекции Прикаспийского института биологических ресурсов Дагестанского научного центра РАН г.Махачкала. Пример получения штамма.
Исходной культурой для получения штамма S. cerevisiae В - 3855 служил штамм S. cerevisiae Y-503 [4]. Для получения дрожжей с требуемыми свойствами была проведена адаптация штамма S.cerevisiae Y-503 к мелассной питательной среде с геотермальной среднеминерализованной, сульфатно-хлоридно-гидрокарбонатной натриевой водой из скважины №26 Махачкалинского месторождения. По мере воздействия состава питательной среды микроорганизмы адекватно изменились, что привело к возникновению новых форм. При этом немаловажное значение имела и частота пересевов на свежие среды.
На первом этапе исследований из отдельных многочисленных микроколоний (95), путем поиска полезных морфофизиологических свойств был проведен скрининг активных популяций исследуемых рас. В результате было выделено 6 монокультур путем рассева отобранных клонов на питательные среды с повышенной концентрацией сухих веществ. Наблюдения за динамикой брожения всех культур выявили идентичность выделения углекислого газа в течении первых 24 ч после инокуляции. Значительный рост бродильной активности проявился на 3-8-е сутки, который в большей мере отмечен у 3-х вариантов. На втором этапе адаптированную дрожжевую суспензию высевали на плотную мелассную питательную среду с геотермальной водой. Каждая выросшая колония отсевалась на скошенное агаризированное мелассное сусло. На всех этапах исследования осуществлялся контроль за функциональной морфологией дрожжевых клеток. Наблюдения велись за скоростью и характером почкования, ростом, размножением, формой и величиной клеток. Из них наибольшей бродильной способностью, лучшими морфофизиологическими свойствами обладала культура В - 3855. Концентрация этанола в бражке увеличилась и составила 12.4 об %. Сравнительное исследование динамики сбраживания мелассного сусла с концентрацией углеводов 21.0 г / 100 см3 селекционным штаммом В - 3855, исходным Y-503 и промышленным - Я, показали перспективность использования отобранного штамма.
Предлагаемый штамм хранится на скошенном МПСГВ+агар в холодильнике при температуре 0±6°С.
Пример использования штамма.
Выращивание дрожжей с использованием предлагаемого штамма S. cerevisiae В - 3855 осуществляют в течение 72 ч глубинным методом в периодическом режиме в анаэробных условиях в лабораторной установке при температуре 30°С±1, рН 5.0 на мелассной питательной среде с геотермальной водой (МПСГВ) и содержанием углеводов 21.0 г / 100 см3 следующего состава (г/л):
- меласса 488.74
- гидроортофосфат аммония 2.58
- геотермальная вода с минерализацией 4.0-4.2 г/л с определенным качественным и количественным составом необходимым для выращивания дрожжей остальное
К мелассе добавляют разбавленную водопроводной водой геотермальную воду до содержания в среде углеводов 21.0 г/100 см3, гидроортофосфат аммония - 2.58 г/л, концентрированную серную кислоту, для достижения в среде рН 5.0, из расчета 0.4-0.6 мл на 100 г мелассы. Содержимое хорошо перемешивают. Стерильную питательную среду разливают по 1.5 л. в сосуды вместимостью 3 л., затем засевают вегетативной культурой указанного штамма в количестве 150 мл. из дрожжевой суспензии последней стадии адаптации на МПСГВ, 1 мл которой содержится 95.6 млн/мл клеток. В качестве пеногасителя используют структол 0.1 мл/1.5 л среды. По окончании 72-х часового эксперимента дрожжи отделяют от культуральной жидкости центрифугированием (5000g, 15 мин) на лабораторной стационарной центрифуге ЦЛС-344.2. По завершению эксперимента в сброженном субстрате определены остаточный сахар, накопление спирта и содержание примесных соединений. Наибольшее количество спирта отмечено в образце S. cerevisiae В - 3855 при минимальном содержании остаточного сахара (табл.1).
Усвоение раффинозы данной культурой (предлагаемый штамм) происходит в большей степени, чем исходным S. cerevisiae Y-503 и производственной расой Я (на 1/3), что обусловлено активацией фермента α-галактозидазы, катализирующего сбраживание этого углевода. Видимо, органические компоненты геотермальной воды (гуминовые кислоты), влияя на коллоиднохимические свойства протоплазмы и эффективность использования клеткой из питательной среды биологически активных веществ, усиливают тем самым ферментативную активность живой клетки.
Установлено, что опытный вариант имеет более высокий уровень активности β-фруктофуранозидазы, который проявляется с первых минут брожения. Обнаружено, что уровень активности альдолазы у штамма S. cerevisiae В - 3855 превышает показатели исходного и контрольного на 6 и 25% соответственно. Ключевым веществом анаэробного расщепления глюкозы и метаболизма Сахаров является пировиноградная кислота, разложение которой на ацетальдегид и СО2 катализируется пируватдекарбоксилазой. Полученные данные позволяют говорить о более высокой активности фермента в опытной живой биомассе на 27 и 37% по сравнению с исходной культурой и контролем. Заключительный этап брожения катализирует алкогольдегидрогеназа, восстанавливающая ацетальдегид до этанола. Активность данного фермента в клетках опытного варианта S. cerevisiae В - 3855 намного превышает данный показатель у исходного и контрольного (табл.2).
Анализ хроматограмм летучих примесей выявил идентичный качественный состав, причем штамм S. cerevisiae В - 3855 отличался количеством синтезируемых побочных метаболитов - 30.18% меньше по сравнению с S. cerevisiae Y-503, что является результатом изменения регуляторных функций клетки (табл.3). Так, S. cerevisiae В - 3855 синтезирует ацетальдегида почти вдвое меньше, чем штамм S. cerevisiae Y-503. Ацетон (на 29.16% меньше в опыте) может служить необходимым продуктом для образования высших спиртов, что нежелательно для получения основного продукта - этанола. С использованием культуры S. cerevisiae В - 3855 спирты: пропанол-1, изобутанол, бутанол-1, изоамилол и гексанол обнаружены в значительно меньшем количестве по сравнению со штаммом Y-503 (8518.24:10947.20 мг/дм3, опыт: исходный). В большей степени присутствие пропанола-1 и изоамилола в контроле на 30 и 14%, соответственно, ухудшает технологическую характеристику субстрата с приобретенным сивушным запахом. Увеличение концентрации кротональдегида, как сильного лакриматора, в контроле на 40% сообщает горечь, ухудшает пробу спирта на окисляемость. Содержание фенилалкоголя и бензальдегида - гликозида с запахом горького миндаля, превышает пороговые концентрации в субстратах, но с использованием культуры S. cerevisiae В - 3855 они меньше на 19.5% и 32.9% соответственно. Очевидно, положительные результаты исследований обусловлены биохимическими изменениями в клетке в результате проведенной адаптации и селекции к соответствующим условиям культивирования.
Таким образом, использование штамма дрожжей S.cerevisiae В - 3855, способного сбраживать мелассное сусло с концентрацией углеводов 21.0 г/100 см3, позволит интенсифицировать технологический процесс получения спирта до 12.4 об.%, снизить на 30% образование побочных метаболитов.
Библиография
1. Маринченко В.А., Метюгиев Б.Д., Щвец В.Н. Технология спирта из мелассы // Издательское объединение «Вища школа», Киев. 1975. С.75-153.
2. Микелов А.Н., Соболев Э.М., Боярский В.М. Бродильная способность рас дрожжей // Известия вузов. Пищ. технол. 1995. №5, 6. С.14-16.
3. Патент РФ №2329302 Способ сбраживания мелассного сусла / Ш.А.Абрамов, Э.А.Халилова // Б.И. 2008. №20.
4. А.с СССР №1284998 Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae Y-503, используемый в производстве хлебобулочных изделий / Ш.А.Абрамов, С.Ц.Котенко, Б.И.Далгатова, А.Т.Маммаев // Б.И. 1986, №3.
5. Кудрявцев В.И. Систематика дрожжей. М.: Из-во АНСССР.1954, 212 с.
| Таблица №2 | ||||
| Культура | Ферменты(Е/мг) | |||
| β-фруктофура нозидаза | Альдолаза | Пируватдекар боксилаза | Алкогольдегид рогеназа | |
| S.cerevisiae Y-503 (исходный) | 29.3±1.96 | 0.33±0.03 | 15.2±1.19 | 0.55±0.05 |
| S.cerevisiae В - 3855 (опыт) | 33.4±1.59 | 0.38±0.02 | 18.1±1.30 | 0.74±0.06 |
| S.cerevisiae Я (контроль) | 27.4±1.78 | 0.26±0.02 | 12.3±1.15 | 0.45±0.03 |
| Таблица 3 | |||
| Продукт брожения | Единица измерения | Мелассная питательная среда с геотермальной водой | |
| Штамм Saccharomyces cerevisiae В - 3855 | Штамм Saccharomyces cerevisiae Y-503 | ||
| 1. Ацетальдегид | мг/дм3 | 2318.74 | 4637.48 |
| 2. Ацетон | = | 55.95 | 78.98 |
| 3. Этилацетат | = | 26.95 | 54.67 |
| 4. Пропанол-1 | = | 3700.84 | 5253.26 |
| 5. Изобутанол | = | 1116.52 | 1299.47 |
| 6. Бутанол-1 | = | 100.42 | 122.44 |
| 7. Изоамилол | = | 3593.68 | 4244.99 |
| 8. Гексанол | = | 6.78 | 27.04 |
| 9. Кротональдегид | = | 27.28 | 68.47 |
| 10. Фенилалкоголь | = | 580.33 | 720.88 |
| 11. Бензальдегид | = | 62.81 | 93.62 |
| Сумма примесных соединений | = | 11590.3 | 16601.3 |
Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ В - 3855, используемый для получения спирта.
