Наноантитело, специфически связывающее белок muc1, способ детекции белка muc1 с помощью наноантител

Настоящее изобретение относится к области иммунологии и медицины. Предложено однодоменное антитело (наноантитело), специфически связывающее белок муцин 1 (MUC1) человека и охарактеризованное через полную аминокислотную последовательность. Также рассмотрен способ детекции белка MUC1 в биологических жидкостях человека с использованием наноантитела по изобретению. Изобретение может найти дальнейшее применение в диагностике и терапии рака. 2 н. и 1 з. п. ф-лы, 3 ил., 4 пр.

 

Область техники

Настоящее изобретение относится к области молекулярной иммунологии, биотехнологии и медицины, в частности к получению и использованию специфических однодоменных антител (наноантител) для узнавания (детекции) и связывания белка MUC1 человека.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Один из наиболее перспективных опухолевых маркеров Муцин-1 (MUC1) представляет собой сильно гликозилированный белок, присутствующий в норме во многих типах клеток человека (может выявляться как ассоциированный с поверхностной клеточной мембраной, а также как секретируемый или внутриклеточный белок). Экспрессия этого белка значительно повышена в большинстве злокачественных новообразований эпителиального генеза. Повышенную экспрессию MUC1 в опухолях и деполяризацию распределения антигена в клетках расценивают как фактор неблагоприятного течения заболевания. Особое значение придают существованию патологически измененных форм муцина, экспрессия которых является следствием нарушений в процессах гликозилирования молекулы в злокачественных клетках. Высокое содержание секретируемой формы MUC1 в кровотоке онкологических больных со злокачественными новообразованиями эпителиального генеза прямо коррелирует с распространенностью опухолевого процесса и неблагоприятным прогнозом заболевания. Предполагают, что муцин задействован в процессах межклеточной адгезии, в том числе в процессах взаимодействия опухолевых клеток с клетками иммунной системы. Таким образом, MUC1 традиционно рассматривается как потенциально эффективная мишень для иммунотерапии.

Муцин-1 является крупным белком из 1232 аминокислот, который включает 42 повторяющиеся последовательности из 20 аминокислот. Причем количество повторов может варьировать и является одной из причин высокой полиморфности гена MUC1. Участок между аминокислотами 1097-1098 является аутолизирующимся. В результате гидролиза этой связи образуются две субъединицы, которые после протеолиза образуют друг с другом нековалентный гетеродимер. Внеклеточная альфа-субъединица муцина-1 (фрагмент 24-1097) содержит адгезивные повторы, за счет которых связывается с 1САМ1 и участвует в клеточной миграции и метастазировании опухолевых клеток. Альфа-субъединица муцина-1 обладает свойствами клеточной адгезии, причем белок может действовать как адгезивный, так и антиадгезивный. Обеспечивает защитный слой эпителиальных клеток против бактерий и повреждающих ферментов. Цитоплазматическая бета-субъединица муцина-1 (фрагмент 1098-1255) содержит большое количество участков связывания с регуляторными белками и определяет участие муцина-1 в нескольких сигнальных путях. Бета-субъединица связывает SRC, CTNNB1 и белки группы ERB. Бета-субъединица играет роль в передаче сигнала клеткой, что опосредовано фосфорилированием белка и белок-белковыми взаимодействиями. Муцин-1 модулирует передачу сигнала через ERK, SRC и NF-κВ. В активированных Т-клетках оказывает влияние на Ras/MAPK сигнальный путь. Усиливает рост опухолей. Клетки более 80% карцином характеризуются высокой экспрессией муцина-1, изменением профиля гликозилирования и потерей поляризации. [Карцинома - вид злокачественной опухоли, развивающейся из клеток эпителиальной ткани различных органов (кожи, слизистых оболочек и многих внутренних органов)].

Высокий уровень гликозилирования MUC1 и высокий уровень его экспрессии приводит к тому, что он образует на поверхности раковых клеток слой, который мешает проникновению, как правило, гидрофобных, хемотерапевтических препаратов. С другой стороны, муциновый слой задерживает многочисленные факторы роста из окружающей клетку среды, что приводит к их концентрированию на поверхности клеток и ускорению роста раковых клеток.

Очевидно, что MUC1 является одним из важнейших факторов, стимулирующих метастазирование опухолей, что является следствием его суммарного стимулирующего действия на процессы повышения мобильности и инвазивности клеток, а также на процесс ангиогенеза. Многочисленные исследования последних лет убедительно продемонстрировали, что белок MUC1 является важным диагностическим маркером и важной мишенью для разработки новых терапевтических препаратов.

В последние годы все большее внимание при создании новых диагностических и терапевтических препаратов для выявления и лечения многих болезней уделяется препаратам на основе антител, как правило моноклональных классических антител. Антитело способно специфически связывать определенный антиген/белок как свободный или находящийся в комплексе с другими молекулами, так и белок, оверэкспрессированный и локализующийся на поверхности клетки определенного типа. Такое связывание может блокировать важный биологический процесс, каскад, а также стимулировать иммунную систему пациента атаковать клетки, с которыми связалось антитело. Антитело может быть также средством специфической доставки других терапевтических молекул, субстанций или радиоизотопов. Наконец, возможно использование ди- и полифункциональных и многокомпонентных конструкций на основе получаемых антител или их производных. В принципе, потенциально возможно получить антитела, специфичные практически к любой внеклеточной или ассоциированной с клеточной поверхностью мишени.

Антитела, связывающие муцин 1, могут препятствовать развитию опухоли, восстанавливая межклеточные взаимодействия, нарушенные опухолеассоциированным MUC1, тем самым предотвращая метастазирование и противодействуя иммунной супрессии. Некоторые анти-MUC1 антитела могут способствовать уничтожению опухолевых клеток с помощью антителозависимой цитотоксичности (с помощью клеток иммунной системы) (von Mensdorff-Pouilly et al. Natural and Induced Humoral Responses to MUC1. Cancers 2011, 3: 3073-3103. - Естественный и индуцированный гуморальные ответы на MUC1).

Ранее неоднократно уже предпринимались попытки получить антитела, связывающиеся с белком MUC1. В качестве ближайшего аналога технического решения, составляющего основу настоящего изобретения, можно привести следующий пример.

Известно однодоменное антитело для муцинового антигена-1 (заявка WO №2011099684, публ. 18.08.2011, Single domain antibody for Much antigen 1). Здесь заявлено получение особых однодоменных антител, связывающих белок MUC1 на поверхности опухолевых клеток, с целью выявления (диагностики) этих клеток, а также для использования полученного антитела в качестве мишени (MUC1) специфического противоопухолевого препарата.

Данное техническое решение как наиболее близкое к заявляемому по составу действующего вещества и способу его использования выбрано авторами настоящего изобретения за прототип.

Недостатками прототипа являются:

1. Однодоменное антитело получали на основе последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина мыши путем генно-инженерного варьирования строго определенных аминокислотных позиций в гипервариабельных комплементарность определяющих участках (в CDR1: 24-30, в CDR2: 31-37, в CDR3: 38-44). Таким образом, способ получения антитела был трудоемким и малоэффективным, так как получаемые антитела

а) не проходили важного этапа получения высокоаффинных антител - их аффинного дозревания in vivo,

б) обычно такая вырванная из контекста традиционного моноклонального антитела белковая последовательность плохо растворима и склонна к агрегации.

2. Структурные особенности вариабельного антиген-узнающего домена традиционного антитела (в отличие от наноантител) делают невозможным формирование особых паратопов, способных узнавать некоторые «скрытые» эпитопы, такие как находящиеся в углублениях, щелях малого размера в структуре белков.

3. Полученные антитела, скорее всего, могут быть относительно плохо растворимы, так как обычно такая вырванная из контекста традиционного моноклонального антитела белковая последовательность плохо растворима и склонна к агрегации.

Таким образом, в уровне техники существует потребность в разработке новых антител (антиген-узнающих молекул), лишенных указанных выше недостатков и специфически узнающих белок MUC1.

Задачей настоящего изобретения явилось создание новых особых антител, способных эффективно связывать белок MUC1. Эти новые особые антитела должны обладать следующими преимуществами по отношению к прототипу (однодоменному антителу, являющемуся производным тяжелой цепи классического иммуноглобулина мыши): производство и хранение должны быть более экономичны, эффективны и относительно просты; их получение должно обязательно включать стадию иммунизации и аффинного дозревания in vivo, что должно способствовать более высокой аффинности и существенному повышению эффективности селекции заданных антител, они должны быть хорошо растворимы, они должны обладать новыми структурными особенностями, в принципе позволяющими им узнавать некоторые «скрытые» для обычных антител эпитопы.

Поставленная задача решается за счет того, что создано наноантитело, специфически связывающее белок муцин 1 (MUC1) человека и имеющее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. При этом способ детекции белка MUC1 в биологических жидкостях человека включает приведение в контакт указанной биологической жидкости с заявленным наноантителом и детектирование связывания этого наноантитела с белком MUC1.

При этом детекцию белка MUC1 с помощью наноантитела осуществляют как в свободном виде в биологических жидкостях, так и на поверхности клеток, например опухолевых, где этот белок оверэкспрессирован.

В основе настоящего изобретения находятся не однодоменные производные классических бивалентных антител, которые рассматриваются в качестве прототипа, а малые, исходно в норме существующие в организме животного (верблюда) однодоменные наноантитела, которые имеют ряд преимуществ по сравнению с классическими моноклональными антителами для практического применения в области терапии заболеваний. Поскольку наноантитела (молекулярная масса около 12-15 кДа) на порядок меньше по размеру традиционных антител, они приобретают ряд новых положительных качеств, имеющих практическую значимость. Существуют эффективные способы получения (и селекции) таких антител в отношении различных (в том числе низкоиммуногенных) антигенов муцина, а благодаря своей низкой иммуногенности наноантитела могут применяться для лечения инфекций, вызванных патогенами данной группы.

Полным эквивалентом термина "однодоменные наноантитела" для целей настоящего изобретения является вошедшее в широкое употребление обозначение «нанотело», введенное фирмой ABLYNX (NANOBODY), а также «однодоменное мини-антитело».

Рекомбинантные однодоменные наноантитела получают на основе особых неканонических одноцепочечных антител, существующих в норме наряду с классическими антителами у животных семейства верблюдовых (и у некоторых видов хрящевых рыб). Эти особые антитела состоят из димера только одной укороченной (без первого константного района СН1) тяжелой цепи иммуноглобулина и полнофункциональны в отсутствие легкой цепи иммуноглобулина. Для собственно специфического узнавания и связывания антигена при этом необходим и достаточен лишь один вариабельный домен (VHH, «наноантитело», «nanobody» или однодоменное наноантитело) этого антитела. Организация вариабельных доменов (VHH) неканонических антител в значительной степени подобна той, что у вариабельных доменов (VH) классических антител (у человека VH-домены иммуноглобулинов подкласса IgG3 имеют особо выраженную гомологию с VH и VHH верблюдовых). В обоих случаях V-домены состоят из четырех консервативных каркасных участков (FR, «framework regions»), окружающих три гипервариабельных участка (определяющие комплементарность, CDR, от «complementarity determining regions»). В обоих случаях домены формируют типичную для V-домена иммуноглобулина пространственную структуру из двух бета-слоев (листов), один - из четырех аминокислотных цепочек, и второй - из пяти (Padlan Е.А. X-Ray crystallography of antibodies. Adv. Protein Chem., 1996; 49, 57-133. Muyldermans S., Cambillau C., Wyns L. Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains, TIBS 2001; 26, 230-235. - Узнавание антигенов фрагментами однодоменных антител: избыточная роскошь спаренных доменов). В этой структуре все три гипервариабельных участка кластеризуются с одной стороны V-домена (где они участвуют в узнавании антигена) и располагаются в петлях, соединяющих бета-структуры. Однако имеются и важные отличия, связанные с функционированием VHH в формате одного домена. Так, гипервариабельные участки CDR1 и CDR3 заметно увеличены в случае VHH. Часто в гипервариабельных участках VHH обнаруживаются цистеиновые остатки, причем присутствующие сразу в двух участках (чаще всего в CDR1 и CDR3, реже - в CDR2 и CDR3).

По сравнению с традиционными и чисто рекомбинантными антителами верблюжьи наноантитела обладают рядом преимуществ, что позволяет предполагать большой потенциал их будущего использования в различных исследованиях и при создании новых биотехнологических устройств, а также в клинических целях для диагностики и лечения заболеваний.

Характерными особенностями однодоменных наноантител, определяющими большой потенциал их использования для самых разнообразных практических приложений в иммунобиотехнологии (см. обзор: Тиллиб С.В. Верблюжьи наноантитела - эффективный инструмент для исследований, диагностики и терапии. Молекулярная биология, 2011; 45(1), 77-85), является следующее.

1. Наличие высокоэффективного способа генерирования и селекции наноантител.

2. Малый размер, ~2×4 нм, 13-15 кДа (улучшенная проницаемость клеток).

3. Структурные особенности (способность образовывать необычные для классических антител паратопы, позволяющие связываться с углублениями и активными центрами белков); могут использоваться для выявления «скрытых» эпитопов или эпитопов, которые не могут быть узнаны существенно более крупными обычными антителами.

4. Высокий экспрессионный выход, экономичность наработки в больших количествах. Обычно наноантитела нарабатывают в периплазме бактерий E.coli (в количестве 1-10 мг из 1 л культуры). Продемонстрирована возможность их эффективной наработки в дрожжах, растениях и клетках млекопитающих.

5. Простота всевозможных генно-инженерных манипуляций, адаптации для конкретных задач, возможность создания многовалентных и многофункциональных производных.

6. Низкая иммуногенность; возможность экономично «гуманизировать» антитела без заметной потери их специфической активности.

Возможность получения рекомбинантных однодоменных наноантител с заданной специфичностью определяется существованием у представителей семейства Camelidae функциональных и обладающих достаточно широким спектром узнавания неканонических антител. Неканонические антитела состоят из димера только одной укороченной тяжелой цепи иммуноглобулина (без легких цепей), специфичность узнавания которых определяется лишь одним вариабельным доменом (Hamers-Casterman С, Atarhouch Т, Muyldermans S, et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains, Nature, 1993; 363: 446-448. - Существующие в природе антитела без легких цепей). Техническая реализация отбора однодоменных наноантител, являющихся генно-инженерными производными антиген-распознающих доменов одноцепочечных антител верблюда, основана на высокоэффективной процедуре селекции антиген-узнающих полипептидов, экспонированных на поверхности частицы нитчатого фага (фаговый дисплей).

Метод фагового дисплея является весьма эффективной и широко используемой технологией для функционального отбора из больших рекомбинантных библиотек последовательностей ДНК, кодирующих пептиды и белки, обладающие заданными свойствами и экспрессирующиеся в составе поверхностного белка нитчатых фагов (Brissette R & Goldstein NI. The use of phage display peptide libraries for basic and translational research. - Использование пептидных фагово-дисплейных библиотек для фундаментальных исследований и исследований трансляции. Methods Mol Biol. 2007; 383:203-13; Sidhu SS & Koide S. Phage display for engineering and analyzing protein interaction interfaces Curr Opin Struct Biol., 2007; 17:481-7. - Фаговый дисплей для конструирования и анализа взаимодействий белковых доменов).

Одно из особо важных приложений этой технологии - генерирование специфических рекомбинантных антител для самых различных антигенов (Hoogenboom MR. Selecting and screening recombinant antibody libraries. Nat Biotechnol., 2005; 23:1105-16. - Селекция и анализ библиотек рекомбинантных антител. Обычно вместо больших целых молекул классических антител для экспонирования на поверхности фага используют гибридные рекомбинантные одноцепочечные белки, представляющие собой случайные комбинации клонированных последовательностей вариабельных районов тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов, соединенные короткой серин/глицин-богатой линкерной последовательностью. Такая химерная молекула, в случае правильного сочетания доменов, способна сохранять специфичность исходного иммуноглобулина, несмотря на введенные по сравнению с нативной молекулой антител изменения. Одной из проблем традиционных рекомбинантных технологий является необходимость работы с очень большими библиотеками рекомбинантных антител, в которых должны быть представлены всевозможные комбинации двух случайных вариабельных районов (тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов), соединенных линкерной последовательностью. Помимо проблемы представленности здесь также очевидна и проблема формирования правильной относительной конформации этих двух доменов, а также проблема растворимости индивидуальных вариабельных доменов, которые часто имеют тенденцию к агрегации. Упомянутые проблемы возможно избежать при использовании однодоменных наноантител, так как практически каждый клонированный вариабельный домен одноцепочечных антител будет в этом случае обладать определенной антиген-узнающей специфичностью, соответствующей одному из антител иммунизированного животного, и можно эффективно проводить селекцию из относительно небольших библиотек таких доменов.

Однодоменные наноантитела с заданной специфичностью или их производные могут использоваться, как и классические антитела, в различных приложениях, включающих в себя, но не ограниченных, детекцией антигенов (как в исследовательских, так и в диагностических целях), блокированием активности белка-антигена, специфической доставкой за счет связывания с антигеном желаемых молекул, конъюгированных с антителом. Также, однодоменные наноантитела могут быть исходными модулями (блоками) более сложных многомодульных препаратов. Возможно объединение в одном мультивалентном производном двух, трех и более моновалентных первичных однодоменных наноантител. Эти объединяемые в одну конструкцию однодоменные наноантитела могут связываться как с одним и тем же эпитопом антигена-мишени, так и с его разными эпитопами или даже с различными антигенами-мишенями. Возможно также комбинированное объединение в одну конструкцию однодоменных наноантител и других молекул или лекарств с получением многофункциональных препаратов (Conrath КЕ, Lauwereys M, Wyns L, Muyldermans S. Camel single-domain antibodies as modular building units in bispecific and bivalent antibody constructs. - Верблюжьи однодоменные антитела в качестве модулярных строительных единиц в биспецифичных и бивалентных конструкциях антител. J Biol Chem., 2001, Mar 9; 276 (10): 7346-50; Zhang J, Tanha J, Hirama T, Khieu NH, To R, Tong-Sevinc H, Stone E, Brisson JR, MacKenzie CR. Pentamerization of single-domain antibodies from phage libraries: a novel strategy for the rapid generation of high-avidity antibody reagents. - Пентамеризация однодоменных антител из фаговых библиотек: новая стратегия быстрого получения реагентов антител с высокой авидностью; J Mol Biol. 2004, Jan 2; 335 (1): 49-56; Cortez-Retamozo V, Backmann N, Senter PD, Wernery U, De Baetselier P, Muyldermans S, Revets H. Efficient cancer therapy with a nanobody-based conjugate. - Эффективная раковая терапия конъюгатами на основе нанотел; Cancer Res., 2004 Apr 15; 64 (8): 2853-7; Baral TN, Magez S, Stij'lemans B, Conrath K, Vanhollebeke B, Pays E, Muyldermans S, De Baetselier P. Experimental therapy of African trypanosomiasis with a nanobody-conjugated human trypanolytic factor., Nat. Med., 2006, May; 12 (5): 580-4. - Экспериментальная терапия африканской трипаносомии с помощью человеческого трипанолитического фактора, конъюгированного с наотелом.; Coppieters К, Dreier Т, Silence К, Haard HD, Lauwereys М, Casteels P, Beirnaert E, Jonckheere H, Wiele CV, Staelens L, Hostens J, Revets H, Remaut E, Elewaut D, Rottiers P. Formatted anti-tumor necrosis factor alpha VHH proteins derived from camelids show superior potency and targeting to inflamed joints in a murine model of collagen-induced arthritis., Arthritis Rheum., 2006, Jun; 54 (6): 1856-66. - Форматированные анти-TNFalpha VHH-белков, выделенные из верблюдовых, демонстрируют высокое сродство к воспаленным суставам в мышиной модели коллаген-индуцированного артрита); мультимеризация с помощью введения дополнительных аминокислотных последовательностей, взаимодействующих белковых доменов, таких как лейциновые зипперы (Harbury P.В., Zhang Т., Kirn P.S., et al. A switch between two-, three- and four-stranded coiled coils in GCN4 leucine zipper mutants. - Перключение между двух-, трех- и четырехцепочечными спиральными структурами в мутантах ССМ4 - «лейциновой молнии»; Science, 1993, 262:1401-1407; Shirashi Т., Suzuyama k., Okamoto H. et al. Increased cytotoxicity of soluble Fas ligand by fusing isoleucine zipper motif. - Усиленная цитотоксичность растворимого Fas-лиганда вследствие его соединения с мотивом «изолейциновой молнии»; Biochem. Biophys. Res. Communic. 2004, 322: 197-202; ChenchikA., Gudkov A., Komarov A., Natarajan V. Reagents and methods for producing bioactive secreted peptides, 2010, заявка на выдачу патента США №20100305002, Реагенты и методы для получения биоактивных секретируемых пептидов; или последовательностей небольших белков, образующих стабильные комплексы (Deyev SM, Waibel R, Lebedenko EN, Schubiger AP, Pluckthun A. Design of multivalent complexes using the barnase*barstar module. Nat Biotechnol., 2003, 21(12):1486-92. - Дизайн мультивалентных комплексов, используя модуль барназа-барстар).

Также было показано (Vincke С., Loris R., Saerens D., et al.; J. Biol. Chem., 2009. V., 284, №5. 3273-3284), что можно «гуманизировать» такие верблюжьи наноантитела без заметной потери их специфической активности, проведя небольшое число точечных замен аминокислот. Это открывает потенциальную возможность широкого использования наноантител в качестве средств пассивной иммунизации для предотвращения развития различных опасных инфекционных заболеваний [Wesolowski J., Alzogaray V., Reyelt J. et al. Single domain antibodies: promising experimental and therapeutic tools in infection and immunity. / «Однодоменные антитела: многообещающие экспериментальные и терапевтические инструменты в области инфекции и иммунитета». Med. Microbiol. Immunol. 2009; 198, 157-174.].

Раскрытие настоящего изобретения

Способ получения наноантитела, связывающего антигенный эпитоп белка MUC1, включает следующие принципиальные этапы:

1) индукция образования специфических антител в результате иммунизации представителя семейства верблюдовых (в частности, двугорбого верблюда) смешанной субстанцей, приготовленной на основе нативного муцина, выделенного из женского молока, а также опухолевого муцина;

2) клонирование последовательностей антиген-узнающих доменов - наноантител - особых одноцепочечных антител, синтезирующихся в лимфоцитах иммунизированного животного, в фагмидном векторе (использующемся в последующей процедуре фагового дисплея), получение специфически обогащенной библиотеки последовательностей, кодирующих наноантитела;

3) селекция методом фагового дисплея (функционального отбора фаговых частиц, несущих на поверхности экспрессируемое наноантитело, а внутри - ДНК, кодирующую это наноантитело) клонов наноантител, связывающихся с заданным антигеном, белком MUC1, из полученной библиотеки наноантител;

4) проведение переклонирования и генно-инженерных модификаций кодирующих последовательностей отобранных наноантител с целью их эффективной наработки в бактериальной системе экспрессии и последующей эффективной очистки (в качестве продуцента действующего вещества используются бактерии E.coli).

В качестве MUC1-содержащего антигенного материала использовали смешанную субстанцию, приготовленную на основе нативного муцина, выделенного из плазмы и мембран жировых глобул женского молока, а также опухолевого муцина (гомогенат ткани опухоли молочной железы, а также препарат культуральных клеток эпидермоидного рака гортаноглотки, НЕр2, в которых происходит повышенная экспрессия поверхностного муцина).

Способ получения однодоменных наноантител описан в примерах 1 и 2.

Наноантитела (молекулярная масса около 12-15 кДа) на порядок меньше по размеру традиционных антител и являются полнофункциональными антиген-узнающими единицами, обладающими рядом новых положительных качеств практической значимости. Наноантитело представляет собой однодоменный белок, который хорошо растворим и обладает повышенной стабильностью (в широком диапазоне температур и рН). Это позволяет избегать проблем с растворимостью и правильным сворачиванием молекул антител при продукции прокариотическими клетками и ведет к существенному снижению затрат на их производство по сравнению с традиционными способами получения терапевтических моноклональных антител в эукариотических системах экспрессии. Существенно облегчается также процедура сохранения и транспортировки антител по сравнению с заметно менее стабильными традиционными антителами. В силу меньшего размера наноантитела характеризуются лучшей способностью проникать в ткани. Наконец, наноантитела позволяют легко проводить генно-инженерные манипуляции с целью последующей продукции биспецифических наноантител или химер, в состав которых помимо наноантитела входит другой белок с желаемыми свойствами.

Несмотря на то что, главным образом, в иллюстративных целях автором настоящего изобретения делается акцент на продукции антител с использованием бактерии E.coli, среднему специалисту в данной области техники будет очевидно, что под объем настоящего изобретения подпадают и другие варианты систем реализации настоящего изобретения, прямо не заявленные в настоящем документе. Например, в качестве эукариотического продуцента могут быть использованы дрожжевые культуры или любые другие системы, очевидные в данной области техники.

Выбор путей реализации с целью получения наноантител с заявляемыми свойствами из прокариотической системы экспрессии в соответствии с одним из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения обусловлен следующими факторами:

1. Высокий экспрессионный выход, экономичность наработки в больших количествах, обеспечивающийся экспрессией наноантител в периплазму бактерий E.coli (в количестве 1-10 мг из 1 л культуры).

2. Простота всевозможных генно-инженерных манипуляций, адаптации для конкретных задач, возможность создания многовалентных и многофункциональных производных.

3. Высокая экономическая рентабельность производства. Автор настоящего изобретения исходит из того, что, как известно среднему специалисту в данной области техники, первичные, исходно получаемые последовательности однодоменных наноантител могут быть затем адаптированы или «форматированы» различным образом для последующего практического использования.

Так, однодоменные наноантитела могут быть исходными модулями (блоками) более сложных многомодульных препаратов. Возможно объединение в одном мультивалентном производном двух, трех и более моновалентных первичных однодоменных наноантител. Эти объединяемые в одну конструкцию однодоменные наноантитела могут связываться как с одним и тем же эпитопом антигена-мишени, так и с его разными эпитопами или даже с различными антигенами-мишенями. Возможно также комбинированное объединение в одну конструкцию однодоменных наноантител и других молекул или лекарств с получением многофункциональных препаратов; мультимеризация с помощью введения дополнительных аминокислотных последовательностей, взаимодействующих белковых доменов, таких как лейциновые зипперы или последовательностей небольших белков, образующих стабильные комплексы. Для модулирования свойств препарата однодоменного наноантитела, например увеличения времени жизни или совершенствования способа очистки, в состав конечного соединения могут быть введены дополнительные аминокислотные последовательности. Среднему специалисту в данной области техники будет очевидно, что такие модификации и прочие варианты антител, лежащих в основе настоящего изобретения, подпадают под объем настоящего изобретения, поскольку являются структурными и функциональными вариантами однодоменных наноантител. Таким образом, автор настоящего изобретения понимает под термином "однодоменные наноантитела" как первичные, исходно получаемые, "минимальные" аминокислотные последовательности однодоменных наноантител, так и их модификации, полученные в результате упомянутых адаптаций или «форматирования» и их варианты. Термин «вариант антитела» для целей настоящего изобретения означает полипептид, который содержит изменения в аминокислотной последовательности, а именно делеции, вставки, добавления или замены аминокислот, при условии, что при этом сохраняется необходимый уровень активности белка, например как минимум 10% от активности исходного однодоменного наноантитела. Ряд изменений в варианте белка зависит от положения или от типа аминокислотного остатка в трехмерной структуре белка. Количество изменений может составлять, например, от 1 до 30, более предпочтительно, от 1 до 15, и наиболее предпочтительно, от 1 до 5 изменений в последовательности исходного однодоменного наноантитела. Эти изменения могут иметь место в областях полипептида, которые не являются критичными для его функции. Это становится возможным благодаря тому, что некоторые аминокислоты обладают высокой гомологией друг с другом, и поэтому третичная структура или активность белка не нарушаются при таком изменении. Поэтому в качестве варианта белка может выступать белок, который характеризуется гомологией не менее 70%, предпочтительно, не менее 80%, более предпочтительно, не менее 90%, и наиболее предпочтительно, не менее 95% по отношению к аминокислотной последовательности исходного однодоменного наноантитела при условии сохранения активности полипептида. Гомология между аминокислотными последовательностями может быть установлена с использованием хорошо известных методов, например с помощью выравнивания последовательностей в компьютерной программе BLAST 2.0, которая вычисляет три параметра: счет, идентичность и сходство.

Замена, делеция, вставка, добавление или замена одного или нескольких аминокислотных остатков будут представлять собой консервативную мутацию или консервативные мутации при условии, что активность белка при этом сохраняется. Примером консервативной мутации(ий) является консервативная замена(ы). "Консервативная аминокислотная замена" представляет собой замену, при которой аминокислотный остаток заменяется аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. В данной области техники определены семейства аминокислот, имеющих сходные боковые цепи. Эти семейства включают в себя аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Поскольку гипервариабельные районы наноантител определяют их специфическое взаимодействие с антигеном, то именно гомологичные замены аминокислот в этих участках могут приводить к получению несколько различающихся по последовательности наноантител, которые обладают идентичными или близкими свойствами. Таким образом, среднему специалисту в данной области техники будет очевидно, что под объем настоящего изобретения подпадают не только указанные в приложении последовательности наноантител, но и те, которые могут быть получены путем замен аминокислот в гипервариабельных участках (указанных в перечне последовательностей как CDR) на другие, но очень близкие по свойствам, аминокислоты (консервативных замен).

Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу тот же функциональный полипептид, могут быть получены, например, путем модификации нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК, кодирующего исходное однодоменное наноантитело, например, посредством метода сайт-направленного мутагенеза, так, что один или несколько аминокислотных остатков в определенном сайте будут делегированы, заменены, вставлены или добавлены. Фрагменты ДНК, модифицированные как описано выше, могут быть получены с помощью традиционных методов обработки с целью получения мутации.

Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу тот же функциональный полипептид исходного однодоменного наноантитела, могут быть получены путем экспрессирования фрагментов ДНК, имеющих мутацию, описанную выше, и установления активности экспрессируемого продукта.

Замена, делеция, вставка или добавление нуклеотидов, описанных выше, также включают мутации, которые имеют место в природе и, например, обусловлены изменчивостью.

Полипептиды однодоменных наноантител согласно настоящему изобретению могут кодироваться большим множеством молекул нуклеиновых кислот, что является результатом хорошо известного в данной области техники явления вырожденности генетического кода. Суть феномена состоит в том, что любая аминокислота (за исключением триптофана и метионина), входящая в состав природных пептидов, может кодироваться более чем одним триплетным нуклеотидным кодоном. Любая из этих вырожденных кодирующих молекул нуклеиновых кислот может входить в состав кассет, экспрессирующих наноантитела, заявленные в соответствии с настоящим изобретением и подпадающие под объем настоящего изобретения.

Получение функционально-активного наноантитела анти-MUC1, которое может быть использовано для специфического связывания и детекции белка MUC1 человека как находящегося в свободном состоянии, так и оверэкспрессированного на поверхности опухолевой клетки, показано в примерах 3 и 4.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 - нуклеотидная последовательность кДНК, кодирующая полученное однодоменное наноантитело aMUC1 (SEQ ID NO:1).

Из нее была выведена соответствующая аминокислотная последовательность наноантитела (SEQ ID NO:2).

В указанной последовательности подчеркнуты соответственно (слева направо, от N- к С-концу) гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3, которые являются определяющими для специфического узнавания наноантителом анти-MUC1 белка MUC1.

На фиг.2 представлены результаты иммуноферментного анализа узнавания отобранным однодоменным наноантителом анти-MUC1 иммобилизованного в лунках иммунологической плашки белка MUC1, выделенного из женского молока.

На фиг.3 представлены результаты иммуноферментного анализа узнавания отобранным однодоменным наноантителом анти-MUC1 иммобилизованных в лунках иммунологической плашки клеток НЕр2, содержащих на поверхности оверэкспрессированный белок MUC1.

Примеры осуществления настоящего изобретения

Пример 1

Получение библиотеки вариабельных доменов одноцепочечных антител

Иммунизация

Двугорбого верблюда Camelus bactrianus последовательно иммунизировали 5 раз путем подкожного введения антигенного материала, смешанного с равным объемом полного (при первой инъекции) или неполного (при остальных инъекциях) адъюванта Фрейнда. Вторую инъекцию проводили через 3 недели после первой, затем с интервалом в две недели проводили еще четыре иммунизации.

В качестве MUC1-содержащего антигенного материала использовали смешанную субстанцию, приготовленную на основе нативного муцина, выделенного из плазмы и мембран жировых глобул женского молока, а также опухолевого муцина (гомогенат ткани опухоли молочной железы, а также препарат культуральных клеток эпидермоидного рака гортаноглотки, НЕр2, в которых происходит повышенная экспрессия поверхностного муцина). Антигенный материал был получен из отделения проф. Якубовской Р.И. (МНИОИ им. П.А.Герцена). Нативный муцин MUC1 выделяли методом иммуноаффинной хроматографии на BrCN-сефарозе 4В, конъюгированной с МКА ИК025 (моноклональные антитела против муцина), из частично очищенной методом ионообменной хроматографии плазмы женского молока. Концентрацию муцина в растворе оценивали по величине оптического поглощения раствора, измеренной против контрольного образца буферного раствора, принимая 1 отн.ед. поглощения за 10000 ЕД/мл антигена. В ходе трех последовательных выделений на иммуноаффинном сорбенте с иммобилизованными на сефарозе 4В моноклональными антителами ИК025 наработано 6 мл раствора высокоочищенного препарата нативного антигена MUC1 из обезжиренного женского молока по описанной выше методике. Оптическое поглощение раствора приведено к 0,2 отн.ед. (2000 ЕД/мл). Специфическая активность антигена протестирована методом ингибиторного ИФА с использованием МКА ИК025. Полученный раствор антигена был заморожен и оставлен на хранение при -20°С.

Гомогенат ткани опухоли молочной железы получали размельчением ткани в механическом гомогенизаторе. Образцы тканей опухоли 5 пациентов с клиническим диагнозом рак молочной железы получены при оперативном вмешательстве. Сразу после поступления каждый образец ткани максимально освобождали от жировой клетчатки, измельчали ножницами и замораживали при -20°С с добавлением физиологического раствора, содержащего 0,01% тимеросал (1 мл раствора на 1 г ткани). Все манипуляции проводили с использованием стерильной одноразовой пластиковой посуды и/или с предварительной дезинфекцией металлических инструментов. После набора требуемого количества материала образцы были разморожены, объединены и подвергнуты дополнительному измельчению с использованием металлического сита и механического гомогенизатора, также с добавлением физиологического раствора (1/1 по объему). Полученные гомогенаты центрифугировали при 3000 об/мин для осаждения крупных фрагментов ткани и отделения тканевого жира. Надосадок отбирали, аликвотировали и хранили при -80°С. Получено 3,5 мл осветленного гомогената. Наличие MUC1 подтверждено методом ИФА по ингибированию связывания МКА ИК025 с иммобилизованным антигеном.

Клетки культуры эпидермоидного рака гортани человека НЕр2 получены из банка культур НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского, РАМН, Москва. Клетки культивировали в 25 см²-флаконах на среде Игла-МЕМ с добавлением 2 мМ L-глутамина и 8% эмбриональной телячьей сыворотки, при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% двуокиси углерода. Пассирование клеток осуществляли дважды в неделю. Выращенные в несколько этапов в культуральных флаконах примерно 150 млн клеток культуры эпидермоидного рака гортаноглотки, НЕр2, были разделены на 5 равных частей (соответственно количеству инъекций) и заморожены с 10% ДМСО.

Взятие крови (150 мл) проводили через 5 дней после последней инъекции. Для предотвращения свертывания взятой крови добавляли 50 мл стандартного фосфатно-солевого раствора (PBS), содержащего гепарин (100 Ед/мл) и ЭДТА (3 мМ).

Кровь разводили в 2 раза раствором PBS, содержащим 1 мМ ЭДТА. 35 мл разбавленного раствора крови наслаивали на ступеньку специальной среды (Histopaque-1077, Sigma) с плотностью 1,077 г/мл объемом 15 мл и проводили центрифугирование в течение 20 мин при 800g. Мононуклеарные клетки (лимфоциты и моноциты) отбирали из интерфазной зоны плазма/Histopaque, после чего промывали раствором PBS, содержащим 1 мМ ЭДТА.

Суммарную РНК из В-лимфоцитов выделяли с помощью реагента TRIzol (Invitrogen). Затем на колонке с олиго(dT)-целлюлозой из тотальной РНК очищали поли(А)-содержащую РНК. Концентрацию РНК определяли с помощью биофотометра (Eppendorf) и проверяли качество выделенной РНК с помощью электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле с формальдегидом.

Реакцию обратной транскрипции проводили по стандартному протоколу (Sambrook et al., 1989) с использованием обратной транскриптазы M-MuLV (Fermentas) и праймера onnro(dT)₁₅ в качестве затравки.

Продукты обратной транскрипции использовали в качестве матрицы в двухступенчатой полимеразной цепной реакции и полученные продукты амплификации клонировали по сайтам NcoI(PstI) и NotI в фагмидный вектор, как описано ранее (Hamers-Casterman et al., 1993; Nguyen et al., 2001; Saerens et al., 2004; Rothbauer et al., 2006). Процедуру селекции проводили также аналогично тем, что в указанных работах. Она базировалась на методе фагового дисплея, в котором в качестве фага-помощника использовали бактериофаг M13KO7 (New England Biolabs, США).

Пример 2

Селекция однодоменных наноантител, специфически узнающих MUC1

Селекцию однодоменных наноантител проводили методом фагового дисплея с использованием, в первую очередь, того же, что и для иммунизации, препарата нативного муцина MUC1, выделенного из женского молока. MUC1 (10 мкг в 100 мкл на 1 лунку) иммобилизовали на дне лунок 96-луночного ИФА-планшета. Использовали полистироловые иммунологические плашки с высокой сорбцией MICROLON 600 (Greiner Bio-One). Для блокировки использовали 1% БСА (Sigma-Aldrich, США) и/или 1% обезжиренное молоко (Bio-Rad, США) в PBS. Процедуру селекции и последующей амплификации отбираемых фаговых частиц (содержащих ген однодоменного наноантитела внутри, а экспрессирующееся однодоменное наноантитело - в составе поверхностного фагового белка pill) повторяли, как правило, последовательно три раза. Все манипуляции проводили как описано в публикациях (Тиллиб С.В., Иванова Т.И., Васильев Л.А. 2010. Фингерпринтный анализ селекции наноантител методом фагового дисплея с использованием двух вариантов фагов-помощников. Acta Naturae 2010; 2 (3): 100-108; Hamers-Casterman С., Atarhouch Т., Muyldermans S. et al. Nature 1993; 363: 446-448.; Nguyen V.K., DesmyterA., Muyldermans S. Adv. Immunol. 2001; 79: 261-296; Saerens D., Kinne J., Bosmans E., Wernery U., Muyldermans S., Conrath K. J Biol Chem. 2004; 279: 51965-51972; Rothbauer U., Zolghadr K., Tillib S., et al. Nature Methods 2006; 3: 887-889].

Последовательности клонов отобранных наноантител группировали согласно схожести их фингерпринтов, получаемых при электрофоретическом разделении продуктов гидролиза амплифицированных последовательностей однодоменных наноантител параллельно тремя частощепящими рестрикционными эндонуклеазами (HinfI, MspI, RsaI). Последовательность кДНК однодоменного наноантитела анти-MUC1 (SEQ ID NO:1) была определена (фиг.1). Из нее была выведена соответствующая аминокислотная последовательность наноантитела (SEQ ID NO:2). В указанной последовательности подчеркнуты соответственно (слева направо, от N- к С-концу) гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3, которые являются определяющими для специфического узнавания наноантителом анти-MUC1 белка MUC1.

Продукция нанонтител

Последовательности кДНК отобранных наноантител переклонировали в экспрессионный плазмидный вектор-модифицированный вектор pHEN6 (Conrath KE, Lauwereys M, Galleni M, Matagne A, Frere JM, Kinne J, Wyns L, Muyldermans S. Beta-lactamase inhibitors derived from single-domain antibody fragments elicited in the Camelidae. Antimicrob Agents Chemother. 2001; 45:2807-12 - Бэта-лактомазные ингибиторы, происходящие из фрагментов однодоменных антител, индуцированных у верблюдовых), позволяющий присоединение к С-концу однодоменного наноантитела (His)₆-эпитопа (сразу вслед за НА-эпитопом). Благодаря наличию на N-конце экспрессируемой последовательности сигнального пептида (peIB) нарабатываемый рекомбинантный белок (однодоменное наноантитело) накапливается в периплазме бактерий, что позволяет эффективно его выделять методом осмотического шока, не разрушая собственно бактериальные клетки. Продукцию однодоменных наноантител проводили в Е. coli (штамм BL21). Экспрессию индуцировали добавлением 1 мМ индолил-бета-D-галактопиранозида и клетки инкубировали при интенсивном перемешивании в течение 7 часов при 37°С или в течение ночи при 29°С. Однодоменное наноантитело выделяли из периплазматического экстракта с использованием аффинной хроматографии на Ni-NTA-агарозе с использованием системы для очистки QIAExpressionist (QIAGEN, США).

Пример 3

Детекция белка MUC1 человека с помощью отобранного наноантитела анти-MUC1

Способность наноантитела анти-MUC1 связываться с иммобилизованным в лунке иммунологической плашки белком MUC1 человека проверяли с использованием стандартного протокола метода иммуноферментного анализа. В качестве контроля использовали лунки с иммобилизованным белком овальбумином кур или бычьим сывороточным альбумином (неспецифические белки).

В качестве вторичных антител к НА-тагу, присутствующему на С-конце проверяемого наноантитела анти-MUC1, использовали конъюгированные с пероксидазой хрена анти-НА-моноклональные антитела (CHGT-45P-Z, ICL, Inc., США). Активность пероксидазы хрена определяли, используя в качестве хромогенного субстрата ABTS (2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфонат). Оптическую плотность измеряли при длине волны 405 нм с помощью планшетного флуориметра. Контрольные лунки (с иммобилизованным неспецифическим белком, бычьим сывороточным альбумином белком или овальбумином кур) не содержали антиген и далее были блокированы и процессированы параллельно с экспериментальными ячейками (с антигеном).

На фиг.2 представлен результат иммуноферментного анализа, из которого следует, что наноантитело анти-MUC1 специфически связывается с иммобилизованным белком MUC1 человека. Наноантитело брали в четырех последовательных разведениях (1:2), начиная с концентрации 100 нг/мл и заканчивая концентрацией 12,5 нг/мл. Четкий специфический сигнал получали для наноантител в концентрации 25 нг/мл, что соответствует антителам с хорошей аффинностью. Величина столбцов на чертеже соответствует относительным величинам поглощения при длине волны 405 нм, количественно отражающим эффективность связывания наноантитела анти-MUC1.

Таким образом, наноантитело анти-MUC1 способно специфически и эффективно узнавать (детектировать) белок MUC1 человека.

Пример 4

Детекция белка MUC1, экспрессированного на поверхности иммобилизованных клеток линии НЕр2, с помощью отобранного наноантитела анти-MUC1

Узнавание наноантителами изолированного белка MUC1 еще не означает, что узнаваемый эпитоп этого белка будет также доступен, когда этот белок локализуется на поверхности клетки. Для проверки возможности использования полученного наноантитела анти-MUC1 для детекции MUC1, оверэкспрессированного на поверхности опухолевой клетки, был проведен иммуноферментный анализ на культуре клеток эпидермоидного рака гортани человека НЕр2. Клетки культуры НЕр2 получены из банка культур НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского, РАМН, Москва. Клетки культивировали в 25 см²-флаконах на среде Игла-МЕМ с добавлением 2 мМ L-глутамина и 8% эмбриональной телячьей сыворотки, при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% двуокиси углерода. Пассирование клеток осуществляли дважды в неделю. В качестве негативного контроля использовали клетки яичников китайского хомячка СНО, которые культивировали на среде DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Клетки растили в лунках 96-луночного планшета до достижения 80% конфлуэнтности, затем 3 раза промывали раствором стандартного фосфатно-солевого раствора (PBS) и фиксировали в 3,7% растворе забуференного формальдегида в течение 10 минут, фиксацию останавливали, добавляя раствор глицина до концентрации 125 мМ, фиксированные клетки промывали 3 раза раствором PBS. Фиксированные клетки блокировали в растворе 1% БСА, 1×PBS в течение 2 часов, после чего споласкивали 1×PBS и добавляли раствор (1×PBS, 0,1% БСА) с наноантителом анти-MUC1 в четырех разведениях (с фактором 2), начиная со 100 нг/мл и заканчивая концентрацией 12,5 нг/мл.

В качестве вторичных антител к НА-тагу (присутствующему на С-конце проверяемого наноантитела анти-MUC1) использовали конъюгированные с пероксидазой хрена анти-НА-моноклональные антитела (CHGT-45P-Z, ICL, Inc., США). Активность пероксидазы хрена определяли, используя в качестве хромогенного субстрата ABTS (2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфонат). Оптическую плотность измеряли при длине волны 405 нм с помощью планшетного флуориметра. Контрольные лунки (с иммобилизованными клетками СНО) были блокированы и процессированы параллельно с экспериментальными ячейками.

На фиг.3 представлены результаты описанного иммуноферментного анализа узнавания наноантителом анти-MUC1 иммобилизованных в лунках иммунологической плашки клеток НЕр2, содержащих на поверхности оверэкспрессированный белок MUC1. Видно, что подобно детекции изолированного белка MUC1 наноантитело анти-MUC1 и в этом случае эффективно работает в концентрации 25 нг/мл. Специфическое узнавание клеток НЕр2, скорее всего, связано с повышенной экспрессией в этих клетках белка MUC1, который располагается на поверхности этих клеток. Напротив, в контрольных клетках СНО белок MUC1 практически не экспрессируется, и этому соответствует фоновое значение оптической плотности в соответствующих ячейках.

Таким образом, наноантитело анти-MUC1 способно специфически и эффективно узнавать (детектировать) белок MUC1 человека, экспрессированный на поверхности опухолевой клетки.

Приведенные примеры с иллюстрациями доказывают выполнение поставленной данным изобретением задачи. Созданы новые особые наноантитела, способные эффективно связывать белок MUC1. Эти новые особые наноантитела обладают следующими преимуществами по отношению к прототипу (однодоменному антителу, являющемуся производным тяжелой цепи классического иммуноглобулина мыши): их получение, производство и хранение более экономично, эффективно и относительно просто; их получение включает стадию иммунизации и аффинного дозревания in vivo, что способствует более высокой аффинности и существенному повышению эффективности селекции заданных наноантител, они хорошо растворимы, обладают новыми структурными особенностями, позволяющими им узнавать некоторые «скрытые» для обычных антител эпитопы. На базе создаваемых наноантител появятся новые возможности для более эффективного таргетирования белка MUC1 и влияния на связанные с ним биологические процессы и заболевания.

1. Наноантитело, специфически связывающее белок муцин 1 (MUC1) человека и имеющее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.

2. Способ детекции белка MUC1 в биологических жидкостях человека, включающий приведение в контакт указанной биологической жидкости с наноантителом по п.1 и детектирование связывания наноантитела по п.1 с белком MUC1.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что детекцию белка MUC1 с помощью наноантитела по п.1 осуществляют как в свободном виде в биологических жидкостях, так и на поверхности клеток, например опухолевых, где этот белок оверэкспрессирован.